Молекулярные механизмы ответа растений льна на стресс от дисбаланса элементов питания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Коробан Надежда Викторовна

• Коробан Надежда Викторовна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Коробан Надежда Викторовна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Систематика льна

1.2. Происхождение льна

1.3. Лен в текстильной промышленности

1.4. Лен как источник масла

1.5. Растениеводство льна

1.6. Молекулярно-генетические исследования льна

1.6.1. Структура генома Ь. тЫайзътит

1.6.2. Генетические маркеры Ь. тЫайъътит

1.6.3. Устойчивость Ь. тЫайъътит к фитопатогенам

1.6.4. Молекулярно-генетический контроль промышленных свойств Ь. тиайъътит

1.6.5. Ответ Ь. тиайъътит на абиотический стресс

1.6.6. Генотрофы

1.6.7. Роль 5 БрРНК в формировании генотрофов

1.7. Роль миРНК в ответе на абиотический стресс у растений

1.7.1. Биогенез микроРНК

1.7.2. Методы идентификации миРНК

1.7.3. МиРНК, участвующие в ответе на недостаточное или

22

несбалансированное питание

1.7.4. МиРНК, участвующие в ответе на засуху, засоление и другие

абиотические стрессы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал

2.2. Выделение ДНК

2.3. Выделение РНК

2.4. ПЦР на LIS-1

2.5. SSAP анализ

2.6. Подготовка библиотек миРНК для секвенирования

2.7. Подготовка библиотек мРНК для секвенирования

2.8. Секвенирование на библиотек кДНК на приборе Illumina Genome

45

Analyzer IIx

2.9. Биоинформатическая обработка данных секвенирования

2.10. Обработка данных секвенирования миРНК

2.11. Идентификация миРНК, кодируемых LIS-1

2.12. Анализ экспрессии миРНК

2.13. Обработка данных секвенирования мРНК

2.14. Обратная транскрипция миРНК

2.15. Обратная транскрипция мРНК

2.16. Количественная ПЦР миРНК и мРНК

2.17. Выбор контрольных генов и обработка данных количественной ПЦР

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Генотрофы льна

3.2. SSAP анализ

3.3. МиРНК 56 3.3.1. Консервативные миРНК

3.3.2. Потенциальные уникальные миРНК

3.3.3. МиРНК, кодируемые Ь1Б-1 и фланкирующими ее участками

3.3.4. Анализ экспрессии миРНК на основе данных

64

высокопроизводительного секвенирования

3.4. Выбор контрольных генов для количественной ПЦР

3.5. Анализ экспрессии миРНК методом количественной ПЦР

3.6. Потенциальные целевые гены исследованных миРНК

3.7. Секвенирование мРНКрастений льна, выращенных в N, P и NPK условиях.

3.8. Анализ уровня мРНК на основе данных высокопроизводительного секвенирования

3.9. Анализ экспрессии мРНК методом количественной ПЦР

3.10. Поиск мРНК, потенциально экспрессирующихся с инсерции LIS-1 и

79

фланкирующих ее последовательностей ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

72

72

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат ед/мкл - единиц на микролитр

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛКП - локусы количественных признаков

миРНК - микро рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

мМ - миллимоль

мкМ - микромоль

пикоМ - пикомоль

н - нуклеотид

об./мин - обороты в минуту

п. о. - пара оснований

т.п.о. - тысяча пар оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

ABA - абсцизовая кислота

AFLP - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов, Amplified Fragment

Length Polymorphism

LIS-1 - Linum Insertion Sequence

mQ - деионизованная вода

Pl - Plastic line

RAPD - случайно амплифицируемая полиморфная ДНК, Random Amplified Polymorphic DNA

RPM - количество прочтений из одного миллиона, reads per million SNP - однонуклеотидный полиморфизм, single nucleotide polimorphism SSR - простые повторы, Simple Sequence Repeats

5

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы ответа растений льна на стресс от дисбаланса элементов питания»

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день лен является важнейшей сельскохозяйственной культурой. Различные сорта льна представляют собой источник сырья для текстильной, пищевой и фармацевтической промышленностей. С молекулярно-генетической точки зрения растения льна обладают уникальным свойством - в условиях абиотического стресса некоторые сорта способны претерпевать наследуемые фенотипические и генотипические изменения [1], формируя линии, названные генотрофами. Впервые данное явление было описано в 1927 году [2], как формирование адаптивного наследуемого фенотипа. С развитием молекулярно-генетических методов было показано, что при формировании линий генотрофов в геноме растения происходят изменения, в том числе изменение содержания ДНК в клетках; изменение числа копий повторяющихся последовательностей генома, например, генов, кодирующих рибосомную РНК и сателлитных последовательностей; а также появление в геноме инсерции LIS-1 (Linum Insertion Sequence) [3]. Наиболее подробно изучено появление в опрделенном сайте в геноме льна инсерции последовательности LIS-1 длиной 5,7 т.п.о. [4]. Однако молекулярные механизмы формирования адаптивного фенотипа генотрофов и механизмы участия инсерции LIS-1 в данном процессе остаются неизвестны.

Одним из возможных механизмов формирования адаптивного ответа генотрофов льна на абиотический стресс является регуляция молекулярных механизмов в клетке растения с участием микроРНК (миРНК). МиРНК это класс некодирующих малых РНК длиной 20-24-нуклеотида, которые участвуют в регуляции экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне [5]. Изменение уровня экспрессии миРНК в клетке в ответ на стрессовое воздействие приводит к репрессии или дерепрессии целевого гена и его продукта, что в свою очередь может запускать каскад реакций, формирующих устойчивый к стрессу фенотип растения. Помимо регуляции миРНК, на фенотип растения могут влиять изменения в экспрессии генов, продукты которых играют роль транскрипционных

факторов, или непосредственно генов, продукты которых являются компонентами путей формирования ответа на стрессовое воздействие.

Данная работа посвящена изучению молекулярных механизмов формирования адаптивного ответа на стресс линий генотрофов льна. На основе данных высокопроизводительного секвенирования в работе впервые идентифицированы экспрессирующиеся миРНК льна, определены консерванвные и потенциальные миРНК, проведена оценка их экспрессии в зависимоти от условий роста растения. Также проведена валидация полученных данных с помощью количественной ПЦР на расширенной выборке образцов и оценена экспрессия потенциальных целевых генов миРНК. Кроме того, выявлены гены с дифференциальной экспрессией при выращивании льна в условиях избыточного или недостаточного питания. На основе выполненной работы предложены молекулярные механизмы формирования адаптивного ответа растений генотрофов льна на дисбаланс питания. Полученные данные имеют как фундаментальную, так и практическую значимость, представляя собой основу для селекционной и генно-инженерной работы по улучшению хозяйственно ценных характеристик сортов льна и других видов растений.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

«Малыш-малышок в сыру землю зашел, синю шапку нашел»

1.1. Систематика льна

Отдел - MAGNOLIOPHYTA (ПОКРЫТОСЕМЕННЫЕ или ЦВЕТКОВЫЕ) Класс - MAGNOLIOPSIDA (DIœTYLED0NES)(ДВУД0ЛЬНЫЕ) Порядок - Malpighiales Mart. (Мальпигиецветные) Семейство - Linaceae (Льновые) Род - Linum L. (Лен)

Лен обыкновенный, Лен культурный или Лен посевной (Linum usitatissimum L.) - вид растений рода Лен (Linum) семейства Льновые (Linaceae). В это семейство входит 22 рода, из которых для практических целей используется преимущественно один (род - Linum). Род Linum по разным данным, включает от 100 до 200 видов. База данных The Plant List насчитывает 169 действительных названий видов рода Linum [www.theplantlist.org] - однолетних или многолетних травянистых растений и даже полукустарников. Виды льна распространены главным образом в субтропических и умеренных областях всех частей света. Большая часть видов льна - дикорастущие растения, а некоторые дикие однолетние и многолетние виды (L. grandiflorum, L. flavum, L. narbonense, L. orientale, L. hyperecifolium, L. austriacum, L. perenne и др.) культивируются как декоративные. Хозяйственное значение имеет культурный лен - L. usitatissimum [6]. В настоящее время Linum usitatissimum L. - представляет собой полиморфный вид, включающий огромное количество разнообразных сортов. Современные систематики выделяют у вида L. usitatissimum две основные разновидности: var. usitatissimum - лен-долгунец, var. humile Mill. - лен-кудряш или масличный и подвид - subsp. intermedium Czer. - лен промежуточный или межеумок [7].

1.2. Происхождение льна

Лен обыкновенный - однолетнее травянистое растение. Linum

(существительное среднего рода) - в латинском языке имеет несколько значений:

лен, нить, рыболовная леска или сеть, ткань или одежда из льна, парус, вкревка,

фитиль светитильника или сам светильник [8]. Слово происходит от

8

праиндоевропейского (общий предок индоевропейских языков, включая кельтский) 11п - «лен» [www.dic.academic.ru]. Так, что не вполне понятно, что от чего происходит: лен от нити, или нить от льна. ивйайББтит - превосходная степень прилагательного среднего рода: шйаШт - общеупотребительный, общепринятый, обычный [8]. Таким образом, Ыпит шкайББтит переводится как: Лен наиболее общеупотребительный, или наиболее общепринятый, или самый обычный, или наиболее часто используемый.

Помимо волокон, лен выращивают для получения льняного масла. Растениеводами культивируются две формы льна обыкновенного: масличный лен, выращиваемый для получения масла - это относительно короткие растения, образующие большое количество вторичных ветвей; и лен-долгунец, культивируемый с целью получения волокна, эта форма льна более длинная, с меньшим количеством ветвей [9].

Лен - отличный пример полифункциональной сельскохозяйственной культуры, он считается одной из восьми «культур-основателей» растениеводства наряду с зерновыми и бобовыми. С доисторических времен и по сегодняшний день признана экономическая значимость льна [10].

Согласно археологам, первые упоминания о льне, как о доместицированном растении относятся к Ближнему Востоку и датируются более 8 000 лет назад [11]. Происхождение доместицированной формы Ь. шиаИ88тит точно не установлено. Предполагается, что он мог произойти от дикого узколистного вида - Ь. angustifolium Huds., который до сих пор встречается в Средиземноморье. Допускается, что могли возникнуть 2 географические группы: льны-долгунцы в Турции, Египте, Алжире, Тунисе, Испании, Италии и Греции; масличные льны - в Юго-Западной Азии, Афганистане и Индии [12].

1.3. Лен в текстильной промышленности

Наиболее ценные свойства льняной ткани - высокая прочность и

способность впитывать влагу при сравнительно большой воздухо- и

теплопроницаемости, а также стойкость против гниения. Льняные ткани весьма

носки и дают сравнительно небольшую усадку при увлажнении, масса 1 м2

9

льняной ткани колеблется от 100 г (батист) до более 1000 г (брезент). Получение длинных прочных волокон из льна - самый ранний успех человечества в области создания тканей [13]. В древнем Египте большинство тканей изготавливалось изо льна, и, хотя не сохранилось информации о том, как люди научились выделять волокна изо льна, до наших дней дошло множество документов, описывающих процессы его выращивания и обработки в древнем Египте [14]. На европейской территории самые древние льняные волокна были обнаружены в станинных жилищах вокруг швейцарских озер, возраст найденных волокон - около 10 000 лет. Производство и использование льняных тканей распространялось через средиземноморские страны в центральную и северную Европу, и достигло Великобритании 2 000 лет назад [13]. Льняная ткань была широко распространена в Европе на протяжении средневековья и эпохи возрождения. В России производство льняной ткани играло важную экономическую роль [15]. В России лен всегда был любимым растением и разводится с незапамятных времен, что подтверждается летописями. В древнерусском земледелии лен был не только прядильным, но и масличным растением. Преподобный Нестор в жизнеописании св. Феодосия Печерского рассказывает, что, когда не хватало у печерских монахов деревянного масла для лампад, они наливали в них масло льняное. Та же летопись подтверждает употребление льняного волокна на ткани. Печерские монахи обрабатывали лен на пряжу, ткали холсты и шили из них рубахи. В начале лен на Руси разводился исключительно для домашнего употребления, но скоро он стал предметом торговли, сначала внутренней, потом и внешней [16]. Начиная с 19 века до 20 века лен стал основным экспортным продуктом для России. В то время Россия производила около 80% льна и до 1936 года была самым крупным экспортером в мире [17].

1.4. Лен как источник масла

Диетологи рекомендуют включать в диету льняные семена или полученное

из них льняное масло. Причина в том, что в масле льняных семян высоко

содержание полиненасыщенных жирных кислот, лигнанов [18], фенолокислот и

флавоноидов (Таблица 1). Льняное масло особенно ценно благодаря содержанию

10

необходимых человеку полиненасыщенных жирных кислот, в особенности а-линоленовой кислоты, полезной не только для питания, но и полимер которой используется при производстве линолеума, красок и других продуктов [19]. Значение а-линоленовой кислоты для здоровья человека сложно переоценить, показано, что ее потребление снижает риск развития рака [20] и сердечнососудистых заболеваний [21]. Помимо а-линоленовой кислоты в состав льняного масла входят, лигнаны, например дигликозид секоизоларициресинола -антиоксидант и предшественник прогестеронов [19]. Комплексное воздействие компонентов льняного масла на организм снижает риск развития диабета [22], имеет противовоспалительное действие [23], а также улучшает состояние пациента при различных заболеваниях почек [24].

Таблица 1. Химический состав семян льна

Компонент Количество/ 100 г семян Компонент Количество/ 100 г семян

Углеводы 29,0 г Биотин 6 мг

Белки 20,0 г а-Токоферол 7 мг

Жиры 41,0 г 5-Токоферол 10 мг

Линоленовая кислота 23,0 г у-Токоферол 552 мг

Клетчатка 28,0 г Кальций 236 мг

Лигнаны 10-2600 мг Медь 1 мг

Аскорбиновая кислота 0,50 мг Магний 431 мг

Тиамин 0,53 мг Марганец 3 мг

Рибофлавин 0,23 мг Фосфор 622 мг

Ниацин 3,21 мг Калий 831 мг

Пиридоксин 0,61 мг Натрий 27 мг

Пантотеновая кислота 0,57 мг Цинк 4 мг

Фолиевая кислота 112 мг

Примечание: Данные согласно [25].

1.5. Растениеводство льна

Лен культивируется почти на всех континентах. Однако специфика условий выращивания культуры, ее требований к почвенно-климатическим условиям довольно резко ограничивает число стран-производителей льняной продукции, конкурентоспособной на мировом рынке. Основными лидерами по возделыванию льна являются: западноевропейский регион (Франция, Великобритания, Бельгия, Нидерланды), страны постсоветского пространства (Россия, Беларусь, Украина, Литва) и Китай. Значительное количество мировых посевных площадей льна находится в Канаде, Аргентине, Чили, США, Индии [26].

1.6. Молекулярно-генетические исследования льна

Благодаря своему сельскохозяйственному значению, лен являлся популярным объектом генетических исследований на протяжении всего 20 го века.

1.6.1. Структура генома L. usitatissmum

Число хромосом у L. usitatissmum равно 30 (2п=30) [27]. Согласно современным оценкам размер ядерного генома L. usitatissimum составляет около 373 миллионов п.о. на 1С [19]. С помощью различных методов исследования было выявлено, что геном льна посевного возник в результате полногеномной дупликации которая произошла примерно 5 - 9 миллионов лет назад [28][19].

Около 35% ядерной ДНК L. usitatissmum представллено тандемными повторами высокой копийности. Фракция последовательностей ДНК со средней копийностью составляет лишь 15% ядерного генома, что ниже, чем у других высших растений. Низкокопийные последовательности составляют оставшиеся 50% ядерной ДНК [28]. На основе результатов полногеномного секвенирования в геноме L. usitatissmum было предсказано существование 43484 генов. Это количество сравнимо с аналогичными оценками для сои, тополя и риса, однако, значительно превосходит количество предсказанных генов для арабидопсиса и огурца [29]. Распределение длин экзонов в предсказанных генах L. usitatissimum соответствует другим видам растений, при этом, длина интронов и матричной

РНК (мРНК) в среднем короче, чем у других изученных видов растений.

12

Пропорция генов L. usitatissimum имеющих гомологи в геноме арабидопсиса составляет 89,4% [19].

1.6.2. Генетические маркеры L. usitatissimum

Так как на сегодняшний день количество генетических маркеров L. usitatissimum ограничено, проводится мало исследований локусов количественных признаков (ЛКП) и генетических карт генома [30].

Для L. usitatissimum разработан ряд RAPD (случайно амплифицируемая полиморфная ДНК, Random Amplified Polymorphie DNA) и AFLP (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов, Amplified Fragment Length Polymorphism) маркеров [31][32], однако, эти маркерные системы являются методически чувствительными и отличаются низкой воспроизводимостью.

Большое количество публикаций посвящено разработке и внедрению SSR (простые повторы, Simple Sequence Repeats) маркеров. Микросателлитные или SSR последовательности ДНК содержат тандемные повторы коротких мотивов длиной 2-6 нуклеотида. Маркеры SSR основаны на амплификации полиморфных по длине тандемных повторов в определенном локусе ДНК. Такие маркерные системы отличаются высокой воспроизводимостью и подходят для генетического картирования и изучения генетического разнообразия [33]. На сегодняшний день разработано 508 SSR маркеров L. usitatissimum [34]. Помимо выше перечисленного, SSR маркеры отлично подходят для составления «скелета» генетической карты объекта, на которую впоследствии могут быть нанесены SNP (однонуклеотидный полиморфизм, single nucleotide polimorphism) маркеры [35].

Еще один подход к исследованию внутривидовой хромосомной изменчивости льна - идентификация мелких хромосом льна с помощью методов С-, DAPI-окрашивания хромосом и FISH (флуоресцентная гибридизация in situ, fluorescence in situ hybridization) с зондами генов 26S и 5S рибосомной РНК (рРНК) [36].

За последние несколько лет появились работы по полногеномному

секвенированию L. usitatissimum, которые позволили выявить SNP во всем геноме

растения. Полученные масштабные данные, безусловно, поспособствуют

13

созданию более детальных генетических карт L. usitatissmum и проведению более подробных филогенетических исследований [37].

1.6.3. Устойчивость L. usitatissmum к фитопатогенам

Молекулярно-генетические исследования L. usitatissimum в основном

направлены на изучение молекулярных механизмов, связанных с сельскохозяйственными и промышленными свойствами растения. Так, популярным объектом изучения является механизм развития устойчивости к ржавчине льна. Возбудителем данного заболевания является гриб Melampsora Нт (M. Нт). Локус в геноме L. usitatissimum, отвечающий за устойчивость к этому грибу называется Ь и может быть представлен 12 различными аллельными вариантами. Продукты транскрипции этого локуса, нуклеотид связывающие, лейцин богатые белки, специфично узнают различные Луг (avirulence) белки, которые экспрессируются патогенным грибом, в результате чего запускаются защитные механизмы, включающие локальную клеточную гибель или гиперчувствительный ответ, локализующий инфекцию [38]. Так, например, продукты аллельных вариантов Ь5 и Ь6 специфически узнают эффектор ЛугЬ567 М. 1т [39].

Способность выявлять патоген на ранней стадии заражения - важное адаптивное свойство. Удивительно, что механизм узнавания патогенных белков L. usitatissimum был успешно реализован в другом, не родственном льну, культурном растении. Исследователями были получены трансгенные растения табака, трансформированные последовательностью аллеля Ь6 локуса Ь L. usitatissimum. Полученные растения имели ослабленный фенотип, однако проявляли повышенную, но не полную, устойчивость к двум различным фитопатогенам табака [40].

1.6.4. Молекулярно-генетический контроль промышленных свойств L. usitatissmum

Помимо устойчивости к патогенам, подробному изучению подвергаются молекулярные механизмы синтеза промышленно важных компонентов льна. В

частности, уровень содержания жирных кислот в семенах льна.

В семенах современных сортов L. usitatissimum содержится до 50% масла [41] и основные жирные кислоты в этом масле, это пальмитиновая (около 6%), стеариновая (около 4,4%), олеиновая (около 24,2%), линолевая (около 15,3%) и линоленовая (около 50,1%) [42]. Ключевыми ферментами, вовлеченными в биосинтез жирных кислот, являются элонгазы и десатуразы жирных кислот [43]. В процессе биосинтеза масла в растении, процесс последовательной десатурации жирных кислот определяет соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в конечном продукте и, как следствие, область его промышленного применения [44]. Дисатуразы жирных кислот FAD2 (FATTY ACID DESATURASE 2) и FAD3 (FATTY ACID DESATURASE 3) являются мембрана связывающими белками [45], десатураза SAD (STEAROYL ACYL CARRIER PROTEIN DESATURASE) растворима [46]. Гены, кодирующие FAD2, FAD3, SAD хорошо изучены и были выявлены у многих видов растений и бактерий [47]. В клетках L. usitatissimum десатураза SAD превращает стеароил-АЦП в олеоил-АЦП, таким образом, способствуя увеличению количества ненасыщенных жирных кислот в масле [48]. Десатураза FAD 2 формирует дополнительные связи в олеиновой кислоте, тем самым превращая ее в линолевую [49]. Белки FAD3 превращают линолевую кислоту в линоленовую, путем образования дополнительной связи. В геноме L. usitatissimum было идентифицировано три гена fad3: fad3a, fad3b [50], а также, позднее, fad3c [51]. Показано, что десатуразы FAD3A и FAD3B играют основную роль в контроле содержания линоленовой кислоты в семенах льна, сорта льна с низким содержанием линоленовой кислоты несут мутации, приводящие к образованию стоп кодонов в генах fad3a и fad3b [50], при этом роль десатуразы FAD3C остается не выясненной [52].

Помимо питательных свойств семян, активно изучается генетический

контроль и молекулярные механизмы формирования волокон льна. Флоэму

волокон льна составляют одни из самых длинных и прочных клеток, найденных в

растительном мире, их средняя длина составляет 77 мм и на растяжение они

выдерживают 1100 МПа [53]. Механические свойства волокон зависят от состава

их вторичной клеточной стенки. Высокое содержание целлюлозы, ее

15

пространственная ориентация и низкое содержание ксиланов и лигнинов -отличительные характеристики волокон льна [53]. Процесс созревания вторичной клеточной стенки L. usitatissimum сопряжен с экспрессией в-галактозидазы. Ключевая роль в-галактозидазы в процессе созревания вторичной клеточной стенки была показана в результате исследования трансгенной мутантной линии L. usitatissimum, в которой была подавлена активность в-галактозидазы. Волокна, полученные из трансгенных растений, были менее прочными на разрыв и содержали меньше целлюлозы, по сравнению с нормой [54].

Вероятно, не только в-галактозидаза участвует в формировании свойств волокон льна. С помощью анализа на микрочипах было показано, что в клетках волокон L. usitatissmum уровень экспрессии примерно 13% генов достоверно отличается от уровня их экспрессии в других частях растения [55].

1.6.5. Ответ L. usitatissmum на абиотический стресс

Помимо молекулярно-генетических механизмов жизнедеятельности и формирования промышленно важных свойств сельскохозяйственного растения, научно-практический интерес представляет изучение регуляции механизмов ответа растения на абиотические стрессы. Стоит отметить, что на согодняшний день существует очень мало опубликованных работ, посвященных ответу растений льна на абиотический стресс. При этом подобные исследования активно ведутся на других видах растений.

Засуха - глобальный феномен, влияющий на рост, формирование биомассы,

всхожесть и выживаемость сельскохозяйственных растений. Дегидратация,

вызванная засухой, влияет на ряд ключевых процессов жизнедеятельности

растений, включая открытие и закрытие устьиц, снижение фотосинтетической

активности, дыхание и другие процессы, нарушение которых может привести к

подавлению роста или даже смерти растения [56]. Несмотря на актуальность

проблемы влияния засухи на культивируемые растения, сведения о молекулярных

механизмах адаптации льна к засухе очень ограничены. На основе анализа на

микрочипах были выявлены 183 гена, экспрессия которых достоверно изменяется

в растениях L. usitatissimum, подверженных дегидратации, по сравнению с

16

растениями того же вида, выращенными в нормальных условиях. В это число вошли гены, продукты которых участвуют в различных биофизиологических и метаболических процессах. Наибольшее изменение на уровне экспрессии было выявлено у генов, связанных с процессом фотосинтеза. Так, например, было показано изменение экспрессии генов, кодирующих протеинкиназу APK1A (ARABIDOPSIS PROTEIN KINASE 1A) и цитохром P450. При этом экспрессия некоторых генов индуцируется в корнях, но не в наземной части растения, что может свидетельствовать об особой роли корня в формировании адаптивного ответа L. usitatissimum на засуху [57].

В другом исследовании было показано как изменяется состав метаболитов и питательных веществ в листьях растений L. usitatissimum в ответ на дегидратацию. В результате исследования было выявлено изменение содержания 32 метаболитов (в частности, повышение количества фруктозы, глюкозы и пролина) и 6 питательных веществ (в частности, снижение количества калия и азота) [58].

1.6.6. Генотрофы

Изменения в геноме L. usitatissimum в ответ на определенные условия

окружающей среды были описаны у сорта льна Stromont Cirrus (далее Pl, Plastic

line). Выращивание растений Pl в различных по питательному составу или

температуре условиях может приводить к фенотипическим и генотипическим

изменениям, передаваемым по наследству следующему поколению. При этом

следующее поколение успешнее развивается в аналогичных стрессовых условиях,

чем контрольные растения той же линии. Такие линии, с образующимися

стабильными изменениями в геноме под воздействием определенных условий

роста были названы «генотрофы» [1]. Первые работы по изучению свойств

генотрофов были выполнены еще в 1927 году, однако они были посвящены лишь

описанию фенотипических проявлений, ввиду методических ограничений того

времени [2]. Позднее было показано, что изменения, происходящие в геноме

генотофов включают: изменение содержания ДНК в клетках; изменение числа

копий повторяющихся последовательностей генома, например, генов,

17

кодирующих рибосомную РНК и сателлитных последовательностей; а так же появление в геноме инсерции LIS-1 [3].

Среди перечисленных генетических изменений, происходящих с генотрофами, наиболее подробно охарактеризовано появление инсерции последовательности LIS-1. Последовательность LIS-1 имеет размер 5,7 т.п.о. и появляется в виде инсерции в определенном участке генома в процессе роста растения в условиях недостатка питательных элементов. Локус инсерции LIS-1 расположен между генами ING1 (INHIBITOR OF GROWTH 1) и KRP2 (KIP-RELATED CYCLINE-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 2). Постепенно под действием стрессовых условий участок генома, несущий LIS-1 становится гомозиготным и стабильно наследуется. Последовательность LIS-1 секвенирована, в ней содержатся короткие участки, совпадающие с отдельными участками генома льна, а также биоинформатически предсказанные последовательности, предположительно кодирующие миРНК. При этом в последовательности LIS-1 не обнаружено протяженных открытых рамок считывания или участков, гомологичных транспозонам или другим мобильными генетическими элементами [59]. На сегодняшний день источник происхождения и механизм инсерции LIS-1 в геном Pl остаются не известными. Так же, как роль LIS-1 в молекулярных механизмах адаптации льна к абиотическому стрессу.

1.6.7. Роль 5SрРНК в формировании генотрофов

Гены, кодирующие 5S субъединицу рРНК (5S ДНК) составляют до 3% генома льна. В геноме линий-генотрофов льна наблюдаются значительные изменения в количестве копий этих генов [60]. Показано, что набор длин рестрикционных фрагментов, полученных при рестрикции по сайту, характерному последовательности 5S ДНК для линий-генотрофов отличается от аналогичного набора исходных линий льна. При этом паттерн не зависел от стрессовых условий, в которых формировалась линия-генотроф. Однако, механизм влияния данного полиморфизма на адаптивные свойства растений не известен [61].

1.7. Роль миРНК в ответе на абиотический стресс у растений

Регуляция молекулярных механизмов в клетке растения с участием миРНК является одним из возможных механизмов формирования адаптивного ответа генотрофов льна на абиотический стресс. Стрессовые факторы окружающей среды отрицательно влияют на рост и развитие растений и могут приводить к снижению урожайности, а также качества получаемой сельскохозяйственной продукции. К основным абиотическим факторам внешней среды, оказывающим негативное влияние на растения, относятся: засуха, холодовой стресс, солевой стресс, окислительный стресс, гипоксия и недостаток питательных веществ [62]. Показано, что абиотический стресс препятствует прорастанию семян, синтезу хлорофилла, фотосинтезу и развитию корневой системы, [63][64]. У растений есть ряд защитных механизмов для того чтобы справляться с неблагоприятными условиями. Одним из механизмов ответа на стресс является регуляция уровня экспрессии генов посредством миРНК. МиРНК - это малые регуляторные РНК, выявленные у различных эукариот. МиРНК у растений можно условно разделить на две группы: консервативные миРНК, встречающиеся у разных семейств (таких миРНК немного, они характеризуются высоким уровнем экспрессии), и видоспецифичные миРНК (таких миРНК большинство, для них характерен низкий уровень экспрессии) [62][65-71].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коробан Надежда Викторовна, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Durrant A: The environmental induction of heritable changes in Linum. Heredity 1962, 17:27-61.

2. Bolley HL: Indications of the Transmission of an Acquired Character in Flax. Science 1927, 66(1709):301-302.

3. Bickel CLL, M., Cullis CA: The loci controlling plasticity in flax. Research and Reports in Biology 2012, 3:1-11.

4. Schneeberger R: Characterization of DNA polymorphisms associated with environmentally induced heritable changes in flax. Case Western Reserve University; 1992.

5. Carrington JC, Ambros V: Role of microRNAs in plant and animal development. Science 2003, 301(5631):336-338.

6. Рогаш АР: Льноводство. Москва: Колос; 1967.

7. Егорова ТВ: Сем. Linaceae DC. ex S. F. Gray - льновые. Флора Восточной Европы 1996, 9:346-361.

8. Дворецкий ИХ: Латинско-русский словарь, 2 edn: Москва; 1976.

9. Gill KS: Linseed. In. New Delhi: Publications and Information Division, Indian Council of Agricultural Research

1987: 386.

10. Zohary D, Hopf M: Domestication of plants in the Old World, 3 edn. Oxford: Oxford Univ. Press; 2000.

11. Helbaek H: Domestication of food plants in the Old World. Science 1959, 130:365-372.

12. Вавилов НИ: Избранные произведения В двух томах, vol. 1: Наука; 1967.

13. Hamilton IT: Linen. Textiles 1986, 15:30-34.

14. Franck RR: The history and present position of linen. In: The Biology and Processing of Flax. Edited by Sharma HSS, F SvC. Belfast: M. Publications; 1992: 1-9.

15. Pfefferkorn R: Oregon Fiber Flax for an American Linen Industry. Corvallis, Ore, USA, : O. S. C. Cooperative Association, 1944.

83

16. имуществ Дсхмг: Исследование о состоянии льняной промышленности в России. СПб: Издание департамента сельского хозяйства министерства государственных имуществ; 1847.

17. Akin DE: Linen most useful: perspectives on structure, chemistry, and enzymes for retting flax. ISRN biotechnology 2013, 2013:186534.

18. Toure A, Xueming X: Flaxseed lignans: source, biosynthesis, metabolism, antioxidant activity, Bio-active components, and health benefits. Compr Rev Food Sci Food Saf2010, 9:261-269.

19. Wang Z, Hobson N, Galindo L, Zhu S, Shi D, McDill J, Yang L, Hawkins S, Neutelings G, Datla R et al: The genome of flax (Linum usitatissimum) assembled de novo from short shotgun sequence reads. The Plant journal : for cell and molecular biology 2012, 72(3):461-473.

20. Berquin IM, Edwards IJ, Chen YQ: Multi-targeted therapy of cancer by omega-3 fatty acids. Cancer letters 2008, 269(2):363-377.

21. Pellizzon MA, Billheimer JT, Bloedon LT, Szapary PO, Rader DJ: Flaxseed reduces plasma cholesterol levels in hypercholesterolemic mouse models. Journal of the American College of Nutrition 2007, 26(1):66-75.

22. Fukumitsu S, Aida K, Ueno N, Ozawa S, Takahashi Y, Kobori M: Flaxseed lignan attenuates high-fat diet-induced fat accumulation and induces adiponectin expression in mice. The British journal of nutrition 2008, 100(3):669-676.

23. Westcott ND, Muir AD: Flax seed lignan in disease prevention and health promotion, Phytochem 2003, 2:401-417.

24. Ogborn MR, Nitschmann E, Bankovic-Calic N, Weiler HA, Aukema HM: Effects of flaxseed derivatives in experimental polycystic kidney disease vary with animal gender. Lipids 2006, 41(12):1141-1149.

25. Goyal A, Sharma V, Upadhyay N, Gill S, Sihag M: Flax and flaxseed oil: an ancient medicine & modern functional food. Journal of food science and technology 2014, 51(9):1633-1653.

26. Карпович ВФ: Конъюнктура мирового, европейского и внутреннего рынка сельскохозяйственной продукции и продовольствия. РНУП «Институт системных исследований в АПК НАНБеларуси» 2010 86.

27. Joshi KK, S. CM: Cytological studies in some species of Linum L. J Cytol Genet 1980, 15:128-133.

28. Cullis CA: DNA sequence organization in the flax genome. Biochimica et biophysica acta 1981, 652(1):1-15.

29. Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, Dhingra A, Cestaro A, Kalyanaraman A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio M, Pruss D et al: The genome of the domesticated apple (Malus x domestica Borkh.). Nature genetics 2010, 42(10):833-839.

30. Cloutier S, Ragupathy R, Miranda E, Radovanovic N, Reimer E, Walichnowski A, Ward K, Rowland G, Duguid S, Banik M: Integrated consensus genetic and physical maps of flax (Linum usitatissimum L.). TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2012, 125(8):1783-1795.

31. Everaert I, Riek JD, Loose MD, Waes JV, Bockstaele EV: Most similar variety grouping for distinctness evaluation of flax and linseed (Linum usitatissimum L.) varieties by means of AFLP and morphological data. Plant Var Seeds 2001, 14:69-87.

32. Bolsheva NL, Zelenin AV, Nosova IV, Amosova AV, Samatadze TE, Yurkevich OY, Melnikova NV, Zelenina DA, Volkov AA, Muravenko OV: The diversity of karyotypes and genomes within section Syllinum of the Genus Linum (Linaceae) revealed by molecular cytogenetic markers and RAPD analysis. PloS one 2015, 10(4):e0122015.

33. Soto-Cerda BJ, Carrasco RA, Aravena GA, Urbina HA, Navarro CS: Identifying novel polymorphic microsatellites from cultivated flax (Linum usitatissimum L.) following data mining. Plant Mol Biol Rep 2011, 29:753-759.

34. Cloutier S, Miranda E, Ward K, Radovanovic N, Reimer E, Walichnowski A, Datla R, Rowland G, Duguid S, Ragupathy R: Simple sequence repeat marker development from bacterial artificial chromosome end sequences and expressed

85

sequence tags of flax (Linum usitatissimum L.). TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2012, 125(4):685-694.

35. Allen AM, Barker GL, Berry ST, Coghill JA, Gwilliam R, Kirby S, Robinson P, Brenchley RC, D'Amore R, McKenzie N et al: Transcript-specific, single-nucleotide polymorphism discovery and linkage analysis in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L.). Plant biotechnology journal 2011, 9(9):1086-1099.

36. Rachinskaia OA, Lemesh VA, Muravenko OV, Iurkevich O, Guzenko EV, Bol'sheva NL, Bogdanova MV, Samatadze TE, Popov KV, Malyshev SV et al: [Genetic polymorphism of flax Linum usitatissimum based on use of molecular cytogenetic markers]. Genetika 2011, 47(1):65-75.

37. Kumar S, You FM, Cloutier S: Genome wide SNP discovery in flax through next generation sequencing of reduced representation libraries. BMC genomics 2012, 13:684.

38. Dodds PN, Lawrence GJ, Catanzariti AM, Ayliffe MA, Ellis JG: The Melampsora lini AvrL567 avirulence genes are expressed in haustoria and their products are recognized inside plant cells. The Plant cell 2004, 16(3):755-768.

39. Dodds PN, Lawrence GJ, Catanzariti AM, Teh T, Wang CI, Ayliffe MA, Kobe B, Ellis JG: Direct protein interaction underlies gene-for-gene specificity and coevolution of the flax resistance genes and flax rust avirulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2006, 103(23):8888-8893.

40. Frost D, Way H, Howles P, Luck J, Manners J, Hardham A, Finnegan J, Ellis J: Tobacco transgenic for the flax rust resistance gene L expresses allele-specific activation of defense responses. Molecular plant-microbe interactions : MPMI 2004, 17(2):224-232.

41. Cloutier S, Ragupathy R, Niu Z, Duguid S: SSR-based linkage map of flax (Linum usitatissimum L.) and mapping of QTLs underlying fatty acid composition traits. Mol Breed 2010, 28:437-451.

42. Muir AD, Westcott ND: Flax: the genus Linum. London: Taylor & Francis; 2003.

43. Warude D, Joshi K, Harsulkar A: Polyunsaturated fatty acids: biotechnology. Crit Rev Biotechnol 2006, 26:83-93.

44. Mikkilineni V, Rocheford TR: Sequence variation and genomic organization of fatty acid desaturase-2 (fad2) and fatty acid desaturase-6 (fad6) cDNAs in maize. TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2003, 106(7):1326-1332.

45. Los DA, Murata N: Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochimica et biophysica acta 1998, 1394(1):3-15.

46. Shilman F, Brand Y, Brand A, Hedvat I, Hovav R: Identification and molecular characterization of homologous A9-stearoyl acyl carrier protein desaturase 3 genes from the allotetraploid pea-nut (Arachis hypogaea). Plant Mol Biol Rep 2011, 29(232-241).

47. Chi X, Yang Q, Zhao F, Qin S, Yang Y, Shen J, Lin H: Comparative analysis of fatty acid desaturases in cyanobacterial genomes. Comparative and functional genomics 2008:284508.

48. Ohlrogge JB, Jaworski JG: Regulation of fatty acids synthesis. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997, 48:109-136.

49. Khadake RM, Ranjekar PK, Harsulkar AM: Cloning of a novel omega-6 desaturase from flax (Linum usitatissimum L.) and its functional analysis in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biotechnology 2009, 42(2):168-174.

50. Vrinten P, Hu Z, Munchinsky MA, Rowland G, Qiu X: Two FAD3 desaturase genes control the level of linolenic acid in flax seed. Plant physiology 2005, 139(1):79-87.

51. Banik M, Duguid S, Cloutier S: Transcript profiling and gene characterization of three fatty acid desaturase genes in high, moderate, and low linolenic acid genotypes of flax (Linum usitatissimum L.) and their role in linolenic acid accumulation. Genome /National Research Council Canada = Genome / Conseil national de recherches Canada 2011, 54(6):471-483.

52. Thambugala D, Duguid S, Loewen E, Rowland G, Booker H, You FM, Cloutier S: Genetic variation of six desaturase genes in flax and their impact on fatty acid

87

composition. TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2013, 126(10):2627-2641.

53. Mohanty AK, Misra M, Hinrichsen G: Biofibers, biodegradable polymersand biocomposites: an overview. Macromol Mater Eng 2000, 276(1-24).

54. Roach MJ, Mokshina NY, Badhan A, Snegireva AV, Hobson N, Deyholos MK, Gorshkova TA: Development of cellulosic secondary walls in flax fibers requires beta-galactosidase. Plant physiology 2011, 156(3): 1351-1363.

55. Hotte NS, Deyholos MK: A flax fibre proteome: identification of proteins enriched in bast fibres. BMC plant biology 2008, 8:52.

56. Affenzeller MJ, Darehshouri A, Andosch A, Lutz C, Lutz-Meindl U: Salt stress-induced cell death in the unicellular green alga Micrasterias denticulata. Journal of experimental botany 2009, 60(3):939-954.

57. Dash PK, Cao Y, Jailani AK, Gupta P, Venglat P, Xiang D, Rai R, Sharma R, Thirunavukkarasu N, Abdin MZ et al: Genome-wide analysis of drought induced gene expression changes in flax (Linum usitatissimum). GM crops & food 2014, 5(2):106-119.

58. Quero A, Molinie R, Elboutachfaiti R, Petit E, Pau-Roblot C, Guillot X, Mesnard F, Courtois J: Osmotic stress alters the balance between organic and inorganic solutes in flax (Linum usitatissimum). Journal of plant physiology 2014, 171(1):55-64.

59. Chen Y, Schneeberger RG, Cullis CA: A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. The New phytologist 2005, 167(1):171-180.

60. Schneeberger RG, Creissen GP, Cullis CA: Chromosomal and molecular analysis of 5S RNA gene organization in the flax, Linum usitatissimum. Gene 1989, 83(1):75-84.

61. Schneeberger RG, Cullis CA: Specific DNA alterations associated with the environmental induction of heritable changes in flax. Genetics 1991, 128(3):619-630.

62. Sunkar R: MicroRNAs with macro-effects on plant stress responses. Seminars in

cell & developmental biology 2010, 21(8):805-811.

88

63. Mathur S, Agrawal D, Jajoo A: Photosynthesis: response to high temperature stress. Journal of photochemistry and photobiology B, Biology 2014, 137:116126.

64. Suzuki N, Rivero RM, Shulaev V, Blumwald E, Mittler R: Abiotic and biotic stress combinations. The Newphytologist 2014, 203(1):32-43.

65. Sunkar R, Li YF, Jagadeeswaran G: Functions of microRNAs in plant stress responses. Trends in plant science 2012, 17(4):196-203.

66. Khraiwesh B, Zhu JK, Zhu J: Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants. Biochimica et biophysica acta 2012, 1819(2): 137-148.

67. Zhang B: MicroRNA: a new target for improving plant tolerance to abiotic stress. Journal of experimental botany 2015, 66(7):1749-1761.

68. Axtell MJ, Westholm JO, Lai EC: Vive la difference: biogenesis and evolution of microRNAs in plants and animals. Genome biology 2011, 12(4):221.

69. Cuperus JT, Fahlgren N, Carrington JC: Evolution and functional diversification of MIRNA genes. The Plant cell 2011, 23(2):431-442.

70. Voinnet O: Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell 2009, 136(4):669-687.

71. Reyes JL, Chua NH: ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination. The Plant journal : for cell and molecular biology 2007, 49(4):592-606.

72. !!! INVALID CITATION !!!

73. Bartel DP: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004, 116(2):281-297.

74. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, Kim VN: MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. The EMBO journal 2004, 23(20):4051-4060.

75. He L, Hannon GJ: MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.

Nature reviews Genetics 2004, 5(7):522-531.

76. Grigg SP, Canales C, Hay A, Tsiantis M: SERRATE coordinates shoot meristem function and leaf axial patterning in Arabidopsis. Nature 2005, 437(7061):1022-1026.

77. Kurihara Y, Takashi Y, Watanabe Y: The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. Rna 2006, 12(2):206-212.

78. Dong Z, Han MH, Fedoroff N: The RNA-binding proteins HYL1 and SE promote accurate in vitro processing of pri-miRNA by DCL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008, 105(29):9970-9975.

79. Llave C, Kasschau KD, Rector MA, Carrington JC: Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants. The Plant cell 2002, 14(7):1605-1619.

80. Mette MF, van der Winden J, Matzke M, Matzke AJ: Short RNAs can identify new candidate transposable element families in Arabidopsis. Plant physiology 2002, 130(1):6-9.

81. Park W, Li J, Song R, Messing J, Chen X: CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Current biology : CB 2002, 12(17):1484-1495.

82. Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP: MicroRNAs in plants. Genes & development 2002, 16(13):1616-1626.

83. Zhang Z, Yu J, Li D, Zhang Z, Liu F, Zhou X, Wang T, Ling Y, Su Z: PMRD: plant microRNA database. Nucleic acids research 2010, 38(Database issue):D806-813.

84. Zhang BH, Pan XP, Wang QL, Cobb GP, Anderson TA: Identification and characterization of new plant microRNAs using EST analysis. Cell research 2005, 15(5):336-360.

85. Sunkar R, Jagadeeswaran G: In silico identification of conserved microRNAs in large number of diverse plant species. BMC plant biology 2008, 8:37.

86. Sun X, Zhang Y, Zhu X, Korir NK, Tao R, Wang C, Fang J: Advances in identification and validation of plant microRNAs and their target genes. Physiologiaplantarum 2014, 152(2):203-218.

87. Ma X, Tang Z, Qin J, Meng Y: The use of high-throughput sequencing methods for plant microRNA research. RNA biology 2015, 12(7):709-719.

88. Liu CG, Calin GA, Volinia S, Croce CM: MicroRNA expression profiling using microarrays. Nature protocols 2008, 3(4):563-578.

89. Song C, Fang J, Wang C, Guo L, Nicholas KK, Ma Z: MiR-RACE, a new efficient approach to determine the precise sequences of computationally identified trifoliate orange (Poncirus trifoliata) microRNAs. PloS one 2010, 5(6):e10861.

90. Wang T, Chen L, Zhao M, Tian Q, Zhang WH: Identification of drought-responsive microRNAs in Medicago truncatula by genome-wide high-throughput sequencing. BMC genomics 2011, 12:367.

91. Eldem V, Celikkol Akcay U, Ozhuner E, Bakir Y, Uranbey S, Unver T: Genome-wide identification of miRNAs responsive to drought in peach (Prunus persica) by high-throughput deep sequencing. PloS one 2012, 7(12):e50298.

92. Melnikova NV, Belenikin MS, Bolsheva NL, Dmitriev AA, Speranskaya AS, Krinitsina AA, Samatadze TE, Amosova AV, Muravenko OV, Zelenin AV et al: Flax inorganic phosphate deficiency responsive miRNAs. J Agricultural Science 2014, 6(6):156-160.

93. Barrera-Figueroa BE, Gao L, Diop NN, Wu Z, Ehlers JD, Roberts PA, Close TJ, Zhu JK, Liu R: Identification and comparative analysis of drought-associated microRNAs in two cowpea genotypes. BMC plant biology 2011, 11:127.

94. Kumar R: Role of microRNAs in biotic and abiotic stress responses in crop plants. Applied biochemistry and biotechnology 2014, 174(1):93-115.

95. Shiroguchi K, Jia TZ, Sims PA, Xie XS: Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2012, 109(4):1347-1352.

96. Krasnov GS, Oparina NY, Dmitriev AA, Kudryavtseva AV, Anedchenko EA, Kondrat'eva TT, Zabarovsky ER, Senchenko VN: RPN1, a new reference gene for quantitative data normalization in lung and kidney cancer. Mol Biol+ 2011, 45(2):211-220.

97. Benes V, Castoldi M: Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods 2010, 50(4):244-249.

98. Shukla LI, Chinnusamy V, Sunkar R: The role of microRNAs and other endogenous small RNAs in plant stress responses. Biochimica et biophysica acta 2008, 1779(11):743-748.

99. Jones-Rhoades MW, Bartel DP: Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Molecular cell 2004, 14(6):787-799.

100. Panda SK, Sunkar R: Nutrient- and other stress-responsive microRNAs in plants: Role for thiol-based redox signaling. Plant signaling & behavior 2015, 10(4):e1010916.

101. Paul S, Datta SK, Datta K: miRNA regulation of nutrient homeostasis in plants. Frontiers in plant science 2015, 6:232.

102. Kulcheski FR, Correa R, Gomes IA, de Lima JC, Margis R: NPK macronutrients and microRNA homeostasis. Frontiers in plant science 2015, 6:451.

103. Matthewman CA, Kawashima CG, Huska D, Csorba T, Dalmay T, Kopriva S: miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS letters 2012, 586(19):3242-3248.

104. Kawashima CG, Matthewman CA, Huang S, Lee BR, Yoshimoto N, Koprivova A, Rubio-Somoza I, Todesco M, Rathjen T, Saito K et al: Interplay of SLIM1 and miR395 in the regulation of sulfate assimilation in Arabidopsis. The Plant journal: for cell and molecular biology 2011, 66(5):863-876.

105. Jagadeeswaran G, Li YF, Sunkar R: Redox signaling mediates the expression of a sulfate-deprivation-inducible microRNA395 in Arabidopsis. The Plant journal : for cell and molecular biology 2014, 77(1):85-96.

92

106. Melnikova NV, Dmitriev AA, Belenikin MS, Speranskaya AS, Krinitsina AA, Rachinskaia OA, Lakunina VA, Krasnov GS, Snezhkina AV, Sadritdinova AF et al: Excess fertilizer responsive miRNAs revealed in Linum usitatissimum L. Biochimie 2015, 109:36-41.

107. Sunkar R, Zhu JK: Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. The Plant cell 2004, 16(8):2001-2019.

108. Pant BD, Buhtz A, Kehr J, Scheible WR: MicroRNA399 is a long-distance signal for the regulation of plant phosphate homeostasis. The Plant journal : for cell and molecular biology 2008, 53(5):731-738.

109. Branscheid A, Sieh D, Pant BD, May P, Devers EA, Elkrog A, Schauser L, Scheible WR, Krajinski F: Expression pattern suggests a role of MiR399 in the regulation of the cellular response to local Pi increase during arbuscular mycorrhizal symbiosis. Molecular plant-microbe interactions : MPMI 2010, 23(7):915-926.

110. Liang G, Ai Q, Yu D: Uncovering miRNAs involved in crosstalk between nutrient deficiencies in Arabidopsis. Scientific reports 2015, 5:11813.

111. Ariel F, Romero-Barrios N, Jegu T, Benhamed M, Crespi M: Battles and hijacks: noncoding transcription in plants. Trends in plant science 2015, 20(6):362-371.

112. Lauressergues D, Couzigou JM, Clemente HS, Martinez Y, Dunand C, Becard G, Combier JP: Primary transcripts of microRNAs encode regulatory peptides. Nature 2015, 520(7545):90-93.

113. Krannich CT, Maletzki L, Kurowsky C, Horn R: Network Candidate Genes in Breeding for Drought Tolerant Crops. International journal of molecular sciences 2015, 16(7):16378-16400.

114. Rajwanshi R, Chakraborty S, Jayanandi K, Deb B, Lightfoot DA: Orthologous plant microRNAs: microregulators with great potential for improving stress tolerance in plants. TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2014, 127(12):2525-2543.

115. Ding Y, Tao Y, Zhu C: Emerging roles of microRNAs in the mediation of drought stress response in plants. Journal of experimental botany 2013, 64(11):3077-3086.

116. Ferdous J, Hussain SS, Shi BJ: Role of microRNAs in plant drought tolerance. Plant biotechnology journal 2015, 13(3):293-305.

117. Giacomelli JI, Weigel D, Chan RL, Manavella PA: Role of recently evolved miRNA regulation of sunflower HaWRKY6 in response to temperature damage. The Newphytologist 2012, 195(4):766-773.

118. Zhang N, Yang J, Wang Z, Wen Y, Wang J, He W, Liu B, Si H, Wang D: Identification of novel and conserved microRNAs related to drought stress in potato by deep sequencing. PloS one 2014, 9(4):e95489.

119. Liu PP, Montgomery TA, Fahlgren N, Kasschau KD, Nonogaki H, Carrington JC: Repression of AUXIN RESPONSE FACTOR10 by microRNA160 is critical for seed germination and post-germination stages. The Plant journal : for cell and molecular biology 2007, 52(1):133-146.

120. Boualem A, Laporte P, Jovanovic M, Laffont C, Plet J, Combier JP, Niebel A, Crespi M, Frugier F: MicroRNA166 controls root and nodule development in Medicago truncatula. The Plant journal : for cell and molecular biology 2008, 54(5):876-887.

121. Trindade I, Capitao C, Dalmay T, Fevereiro MP, Santos DM: miR398 and miR408 are up-regulated in response to water deficit in Medicago truncatula. Planta 2010, 231(3):705-716.

122. Shamimuzzaman M, Vodkin L: Identification of soybean seed developmental stage-specific and tissue-specific miRNA targets by degradome sequencing. BMC genomics 2012, 13:310.

123. Kantar M, Lucas SJ, Budak H: miRNA expression patterns of Triticum dicoccoides in response to shock drought stress. Planta 2011, 233(3):471-484.

124. Liu Q, Zhang YC, Wang CY, Luo YC, Huang QJ, Chen SY, Zhou H, Qu LH, Chen YQ: Expression analysis of phytohorm one-regulated microRNAs in rice,

implying their regulation roles in plant hormone signaling. FEBS letters 2009, 583(4):723-728.

125. Szabados L, Savoure A: Proline: a multifunctional amino acid. Trends in plant science 2010, 15(2):89-97.

126. Li WX, Oono Y, Zhu J, He XJ, Wu JM, Iida K, Lu XY, Cui X, Jin H, Zhu JK: The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance. The Plant cell 2008, 20(8):2238-2251.

127. Zhao B, Liang R, Ge L, Li W, Xiao H, Lin H, Ruan K, Jin Y: Identification of drought-induced microRNAs in rice. Biochemical and biophysical research communications 2007, 354(2):585-590.

128. Zhang X, Zou Z, Gong P, Zhang J, Ziaf K, Li H, Xiao F, Ye Z: Over-expression of microRNA169 confers enhanced drought tolerance to tomato. Biotechnology letters 2011, 33(2):403-409.

129. Liu HH, Tian X, Li YJ, Wu CA, Zheng CC: Microarray-based analysis of stressregulated microRNAs in Arabidopsis thaliana. Rna 2008, 14(5):836-843.

130. Budak H, Kantar M, Bulut R, Akpinar BA: Stress responsive miRNAs and isomiRs in cereals. Plant science : an international journal of experimental plant biology 2015, 235:1-13.

131. Golldack D, Li C, Mohan H, Probst N: Tolerance to drought and salt stress in plants: Unraveling the signaling networks. Frontiers in plant science 2014, 5:151.

132. Chaves MM, Oliveira MM: Mechanisms underlying plant resilience to water deficits: prospects for water-saving agriculture. Journal of experimental botany 2004, 55(407):2365-2384.

133. Si J, Zhou T, Bo W, Xu F, Wu R: Genome-wide analysis of salt-responsive and novel microRNAs in Populus euphratica by deep sequencing. BMC genetics 2014, 15 Suppl 1:S6.

134. Song JB, Gao S, Sun D, Li H, Shu XX, Yang ZM: miR394 and LCR are involved in Arabidopsis salt and drought stress responses in an abscisic acid-dependent manner. BMC plant biology 2013, 13:210.

95

135. Song JB, Huang SQ, Dalmay T, Yang ZM: Regulation of leaf morphology by microRNA394 and its target LEAF CURLING RESPONSIVENESS. Plant & cell physiology 2012, 53(7):1283-1294.

136. Lu X, Guan Q, Zhu J: Downregulation of CSD2 by a heat-inducible miR398 is required for thermotolerance in Arabidopsis. Plant signaling & behavior 2013, 8(8).

137. Hoagland DR, Arnon, D. I.: The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular 1950, 347:1-32.

138. Edwards K, Johnstone C, Thompson C: A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic acids research 1991, 19(6):1349.

139. Chen Y, Lowenfeld R, Cullis CA: An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax Int J Genet Mol Biol 2009, 1:38-47.

140. Waugh R, McLean K, Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A, Thomas BB, Powell W: Genetic distribution of Bare-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP). Molecular & general genetics : MGG 1997, 253(6):687-694.

141. Konovalov FA, Goncharov NP, Goryunova S, Shaturova A, Proshlyakova T, Kudryavtsev A: Molecular markers based on LTR retrotransposons BARE-1 and Jeli uncover different strata of evolutionary relationships in diploid wheats. Molecular genetics and genomics : MGG 2010, 283(6):551-563.

142. Melnikova NV, Kudryavtseva AV, Speranskaya AS, Krinitsina AA, Dmitriev AA, Belenikin MS, Upelniek VP, Batrak ER, Kovaleva IS, Kudryavtsev AM: The FaRE1 LTR-retrotransposon based SSAP markers reveal genetic polymorphism of strawberry (Fragaria x ananassa) cultivars. Journal of Agricultural Science 2012, 4(11):111-118.

143. Smykal P, Bacova-Kerteszova N, Kalendar R, Corander J, Schulman AH, Pavelek M: Genetic diversity of cultivated flax (Linum usitatissimum L.) germplasm assessed by retrotransposon-based markers. TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2011, 122(7):1385-1397.

96

144. Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL: Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology 2009, 10(3):R25.

145. Kozomara A, Griffiths-Jones S: miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic acids research 2011, 39(Database issue):D152-157.

146. Zuker M: Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research 2003, 31(13):3406-3415.

147. Moxon S, Schwach F, Dalmay T, Maclean D, Studholme DJ, Moulton V: A toolkit for analysing large-scale plant small RNA datasets. Bioinformatics 2008, 24(19):2252-2253.

148. Dai X, Zhao PX: psRNATarget: a plant small RNA target analysis server. Nucleic acids research 2011, 39(Web Server issue):W155-159.

149. Audic S, Claverie JM: The significance of digital gene expression profiles. Genome research 1997, 7(10):986-995.

150. Kramer MF: Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Current protocols in molecular biology / edited by FrederickMAusubel [et al] 2011, Chapter 15:Unit 15 10.

151. Huis R, Hawkins S, Neutelings G: Selection of reference genes for quantitative gene expression normalization in flax (Linum usitatissimum L.). BMC plant biology 2010, 10:71.

152. Krasnov GS, Oparina N, Dmitriev AA, Kudriavtsev AV, Anedchenko EA, Kondrat'eva TT, Zabarovskii ER, Senchenko VN: [Novel reference gene RPN1 for normalization of quantitative data in lung and kidney cancer]. Molekuliarnaia biologiia 2011, 45(2):238-248.

153. Senchenko VN, Krasnov GS, Dmitriev AA, Kudryavtseva AV, Anedchenko EA, Braga EA, Pronina IV, Kondratieva TT, Ivanov SV, Zabarovsky ER et al: Differential expression of CHL1 gene during development of major human cancers. PloS one 2011, 6(3):e15612.

154. Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001, 25(4):402-408.

155. Kalendar R, Tanskanen J, Chang W, Antonius K, Sela H, Peleg O, Schulman AH: Cassandra retrotransposons carry independently transcribed 5S RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008, 105(15):5833-5838.

156. Carthew RW, Sontheimer EJ: Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 2009, 136(4):642-655.

157. Hamilton A, Voinnet O, Chappell L, Baulcombe D: Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. The EMBO journal 2002, 21(17):4671-4679.

158. Wu L, Zhou H, Zhang Q, Zhang J, Ni F, Liu C, Qi Y: DNA methylation mediated by a microRNA pathway. Molecular cell 2010, 38(3):465-475.

159. Neutelings G, Fenart S, Lucau-Danila A, Hawkins S: Identification and characterization of miRNAs and their potential targets in flax. Journal of plant physiology 2012, 169(17):1754-1766.

160. Moss TY, Cullis CA: Computational prediction of candidate microRNAs and their targets from the completed Linum ussitatissimum genome and EST Database. Journal of Nucleic Acids Investigation 2012, 3(e2):9-17.

161. Barvkar VT, Pardeshi VC, Kale SM, Qiu S, Rollins M, Datla R, Gupta VS, Kadoo NY: Genome-wide identification and characterization of microRNA genes and their targets in flax (Linum usitatissimum): Characterization of flax miRNA genes. Planta 2013, 237(4):1149-1161.

162. Gu X, Wages CJ, Davis KE, Guyett PJ, Bar-Peled M: Enzymatic characterization and comparison of various poaceae UDP-GlcA 4-epimerase isoforms. Journal of biochemistry 2009, 146(4):527-534.

163. Kim J, Jung JH, Reyes JL, Kim YS, Kim SY, Chung KS, Kim JA, Lee M, Lee Y, Narry Kim V et al: microRNA-directed cleavage of ATHB15 mRNA regulates vascular development in Arabidopsis inflorescence stems. The Plant journal: for cell and molecular biology 2005, 42(1):84-94.

98

164. Zhu H, Hu F, Wang R, Zhou X, Sze SH, Liou LW, Barefoot A, Dickman M, Zhang X: Arabidopsis Argonaute10 specifically sequesters miR166/165 to regulate shoot apical meristem development. Cell 2011, 145(2):242-256.

165. Miyashima S, Honda M, Hashimoto K, Tatematsu K, Hashimoto T, Sato-Nara K, Okada K, Nakajima K: A comprehensive expression analysis of the Arabidopsis MICRORNA165/6 gene family during embryogenesis reveals a conserved role in meristem specification and a non-cell-autonomous function. Plant & cell physiology 2013, 54(3):375-384.

166. Zhang H, Li L: SQUAMOSA promoter binding protein-like7 regulated microRNA408 is required for vegetative development in Arabidopsis. The Plant journal: for cell and molecular biology 2013, 74(1):98-109.

167. Zhu C, Ding Y, Liu H: MiR398 and plant stress responses. Physiologia plantarum 2011, 143(1):1-9.

168. Li W, Cui X, Meng Z, Huang X, Xie Q, Wu H, Jin H, Zhang D, Liang W: Transcriptional regulation of Arabidopsis MIR168a and argonaute1 homeostasis in abscisic acid and abiotic stress responses. Plant physiology 2012, 158(3):1279-1292.

169. Kawashima CG, Yoshimoto N, Maruyama-Nakashita A, Tsuchiya YN, Saito K, Takahashi H, Dalmay T: Sulphur starvation induces the expression of microRNA-395 and one of its target genes but in different cell types. The Plant journal: for cell and molecular biology 2009, 57(2):313-321.

170. Wang M, Wang Q, Zhang B: Response of miRNAs and their targets to salt and drought stresses in cotton (Gossypium hirsutum L.). Gene 2013, 530(1):26-32.

171. Hsieh LC, Lin SI, Shih AC, Chen JW, Lin WY, Tseng CY, Li WH, Chiou TJ: Uncovering small RNA-mediated responses to phosphate deficiency in Arabidopsis by deep sequencing. Plant physiology 2009, 151(4):2120-2132.

172. Hackenberg M, Huang PJ, Huang CY, Shi BJ, Gustafson P, Langridge P: A comprehensive expression profile of microRNAs and other classes of non-coding small RNAs in barley under phosphorous-deficient and -sufficient conditions.

DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 2013, 20(2):109-125.

173. Allen E, Xie Z, Gustafson AM, Carrington JC: microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 2005, 121(2):207-221.

174. Aung K, Lin SI, Wu CC, Huang YT, Su CL, Chiou TJ: pho2, a phosphate overaccumulator, is caused by a nonsense mutation in a microRNA399 target gene. Plant physiology 2006, 141(3):1000-1011.

175. Bari R, Datt Pant B, Stitt M, Scheible WR: PHO2, microRNA399, and PHR1 define a phosphate-signaling pathway in plants. Plant physiology 2006, 141(3):988-999.

176. Hershko A, Ciechanover A: The ubiquitin system. Annual review of biochemistry 1998, 67:425-479.

177. Brzovic PS, Lissounov A, Christensen DE, Hoyt DW, Klevit RE: A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular cell 2006, 21(6):873-880.

178. Shang F, Taylor A: Ubiquitin-proteasome pathway and cellular responses to oxidative stress. Free radical biology & medicine 2011, 51(1):5-16.

179. Smalle J, Vierstra RD: The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. Annual review of plant biology 2004, 55:555-590.

180. Santner A, Estelle M: The JAZ proteins link jasmonate perception with transcriptional changes. The Plant cell 2007, 19(12):3839-3842.

181. Thines B, Katsir L, Melotto M, Niu Y, Mandaokar A, Liu G, Nomura K, He SY, Howe GA, Browse J: JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature 2007, 448(7154):661-665.

182. Singh AP, Pandey BK, Deveshwar P, Narnoliya L, Parida SK, Giri J: JAZ Repressors: Potential Involvement in Nutrients Deficiency Response in Rice and Chickpea. Frontiers in plant science 2015, 6:975.

183. Zhang Y, Wang L: The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants. BMC evolutionary biology 2005, 5:1.

184. Bakshi M, Oelmuller R: WRKY transcription factors: Jack of many trades in plants. Plant signaling & behavior 2014, 9(2):e27700.

185. Chen L, Song Y, Li S, Zhang L, Zou C, Yu D: The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses. Biochimica et biophysica acta 2012, 1819(2):120-128.

186. Dai X, Wang Y, Zhang WH: OsWRKY74, a WRKY transcription factor, modulates tolerance to phosphate starvation in rice. Journal of experimental botany 2016, 67(3):947-960.

187. Su T, Xu Q, Zhang FC, Chen Y, Li LQ, Wu WH, Chen YF: WRKY42 modulates phosphate homeostasis through regulating phosphate translocation and acquisition in Arabidopsis. Plant physiology 2015, 167(4):1579-1591.

188. Yu Y, Wu G, Yuan H, Cheng L, Zhao D, Huang W, Zhang S, Zhang L, Chen H, Zhang J et al: Identification and characterization of miRNAs and targets in flax (Linum usitatissimum) under saline, alkaline, and saline-alkaline stresses. BMC plant biology 2016, 16(1):124.

189. Yu Y, Huang W, Chen H, Wu G, Yuan H, Song X, Kang Q, Zhao D, Jiang W, Liu Y et al: Identification of differentially expressed genes in flax (Linum usitatissimum L.) under saline-alkaline stress by digital gene expression. Gene 2014, 549(1):113-122.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность Наталии Владимировне Мельниковой за руководство, переданные знания и поддержку на всех этапах выполнения работы. Благодарю Анну Викторовну Кудрявцеву и весь коллектив Лаборатории постгеномных исследований за всестороннюю помощь, ценный опыт и дружескую атмосферу в коллективе. Выражаю признательность Алексею Александровичу Дмитриеву за конструктивную критику и мудрые советы. Благодарю Надежду Логиновну Большеву за внимание, проявленное к работе. Выражаю благодарность коллективу Лаборатории генетики Всероссийского научно-исследовательского института льна за плодотворное сотрудничество в процессе подготовки работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00114).

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Идентифицированные консервативные миРНК льна

миРНК Семейство миРНК Последовательность

lus-miR156j miR156/157 UGACAGAAGAGAGUGAGCACU

lus-miR156a miR156/157 UGACAGAAGAGAGUGAGCAC

lus-miR156k miR156/157 UUGACAGAAGAUAGAGAGC

lus-miR156l miR156/157 UGACAGAAGAGAGUGAGCACA

lus-miR156m miR156/157 UUGACAGAAGAGAGUGAGCAC

lus-miR156f miR156/157 GCUCUCUAUGCUUCUGUCAUC

lus-miR156n miR156/157 UGACAGAAGAUAGAGAGCAC

lus-miR156b miR156/157 UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC

lus-miR159d miR159 CUUGGAUUGAAGGGAGCUCU

lus-miR159c miR159 UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUU

lus-miR159e miR159 UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA

lus-miR160k miR160 UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC

lus-miR160a miR160 UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA

lus-miR160e miR160 GCGUAUGAGGAGCCAUGCAUA

lus-miR162c miR162 UCGAUAAACCUCUGCAUCCA

lus-miR162a miR162 UCGAUAAACCUCUGCAUCCAG

lus-miR162a miR162 GGAGGCAGCGGUUCAUCGAUC

lus-miR164a miR164 UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA

lus-miR164f miR164 UGGAGAAGCAGGGCACGUGC

lus-miR166j miR165/166 UCGGACCAGGCUUCAUCCCC

lus-miR166b miR165/166 UCGGACCAGGCUUCAUCCCCC

lus-miR166k miR165/166 UCUCGGACCAGGCUUCAUUC

lus-miR166l miR165/166 UCUCGGACCAGGCUUCAUUCC

lus-miR166m miR165/166 CGGACCAGGCUUCAUUCCCC

lus-miR166i miR165/166 UCGGACCAGGCUUCAUUCCCCC

lus-miR166n miR165/166 UCGGACCAGGCUUCAUUCCCUU

lus-miR166o miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCCU

1US^ÍR166P miR^/^ UCGGACCAGGCUUCAUUCCCU

lus-miR1ббg miR1б5/1бб GGAAUGUUGUCUGGCUCGAGG

lus-miR1ббq miR1б5/1бб UCGGACCAGGCUUCAUUCCCG

lus-miR1ббr miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCCC

lus-miR166s miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCC

lus-miR1ббa miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC

lus-miR1ббt miR1б5/1бб CUCGGACCAGGCUUCAUUCCC

lus-miRl66f miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCCUU

1US^ÍR166U miR1б5/1бб UCGAACCAGGCUUCAUUCCCC

lus-miRl66e miRl65/l66 UCGGACCAGGCUUCAUUCCUC

lus-miR1ббv miR1б5/1бб UC GGAC CAGGCUUCAUUCUC

1US^ÍR166W miR1б5/1бб UCCGGACCAGGCUUCAUUCCC

lus-miRl67c miRl67 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA

lus-miRl67f miRl67 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUG

lus-miR^7J miR1б7 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGG

lus-miRl67k miRl67 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCU

lus-miRl67a miRl67 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUC

lus-miRl67b miRl67 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUU

lus-miR1б7l miR1б7 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUAA

lus-miR^7m miR1б7 UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGA

lus-miR1б8b miR1б8 CCCGCCUUGCAUCAACUGAAU

lus-miRl6Sa miRl6S UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA

lus-miRl6Sc miRl6S UCGCUUGGUGCAGGUCGGGA

lus-miRl6Sd miRl6S UCGCUUGGUGCAGGUCGGG

lus-miRl69m miRl69 UAGCCAAGGAUGACUUGCCU

lus-miRl7lb miRl7l UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC

lus-miRl7lJ miRl7l UGAGCCGAACCAAUAUCACUC

lus-miRl7lk miRl7l UUGAGCCGUGCCAAUAUCACU

lus-miRl7li miRl7l UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG

lus-miRl7ll miRl7l UUGAGCCGCGCCAAUAUCACU

lus-miRl7lm miRl7l UUGAGCCGUGCCAAUAUCAC

lus-miRl72e miRl72 GGAAUCUUGAUGAUGCUGCAG

lus-miRl72a miRl72 AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU

lus-miRl72e miRl72 GGAGCAUCAUCAAGAUUCACA

lus-miRl72k miRl72 GUAGCAUCAUCAAGAUUCAC

lus-miRl72l miRl72 GUAGCAUCAUCAAGAUUCACA

lus-miRl72m miRl72 GGAAUCUUGAUGAUGCUGCA

lus-miR3l9c miR3l9 UUGGACUGAAGGGAGCUCCCA

lus-miR3l9d miR3l9 UUGGACUGAAGGGAGCUCC

lus-miR3l9b miR3l9 UUGGACUGAAGGGAGCUCCC

lus-miR3l9e miR3l9 CUUGGACUGAAGGGAGCUCC

lus-miR3l9a miR3l9 UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU

lus-miR3l9f miR3l9 UUGGACUGAAGGGAGCUCCUU

lus-miR3l9g miR3l9 CUUGGACUGAAGGGAGCUCCC

lus-miR3l9h miR3l9 CUUGGACUGAAGGGAGCUCCU

lus-miR390a miR390 AAGCUCAGGAGGGAUAGCGCC

lus-miR390e miR390 AGCUCAGGAGGGAUAGCGCC

lus-miR393e miR393 UC CAAAGGGAUC GCAUUGAUCC

lus-miR393f miR393 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCU

lus-miR393g miR393 UUCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC

lus-miR393a miR393 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC

lus-miR394a miR394 UUGGCAUUCUGUCCACCUCC

lus-miR395a miR395 CUGAAGUGUUUGGGGGAACUC

lus-miR395e miR395 CUGAAGUGUUUGGAGGAACUC

lus-miR396f miR396 UUCAAUAAAGCUGUGGGAAG

lus-miR396a miR396 GUUCAAUAAAGCUGUGGGAAG

lus-miR396a miR396 UUCCACAGCUUUCUUGAACUG

lus-miR396g miR396 ССиСААСААЛССиСиСССЛСЛ

1иБ-т1К396Ь т1Я396 иССАСАвСиииСииаААСиа

1иБ-т1К3961 т1Я396 ииССАСАвСиииСииаААСи

lus-miR396j miR396 СиСААСАААССиСиСССАСА

1ив-т1Я396Ь т1Я396 ШССАСАССШиСиШАЛСии

lus-miR396k miR396 ииССАСАССиШСШСААСиА

1ив-т1К397е т1Я397 АишАсиоСАОСаишАША

1иБ-т1К398ё т1Я398 иаиаииСиСАааиСвССССиа

1ив-т1Я398е т1Я398 иашиишСАсшСАССССиС

1ив-т1Я398Г т1Я398 иашиишСАсшСАССССи

lus-miR399h miR399 иСССАААССАСАСииССССиС

1иБ-т1К408а т1Я408 АивСАСивССиСииСССиООС

Примечание: миРНК, идентифицированные у льна впервые, выделены жирным

шрифтом.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Идентифицированные потенциальные уникальные миРНК

Потенциальная миРНК Последовательность P (RPM) N (RPM) NPK (RPM) fold change (P/N) fold change (NPK/N) fold change (NPK/P)

lus-miR-N1 AGUAGGCAACGUUCUGGCUCC 63,8 210,9 135,5 -1,7 -0,6 -0,6

lus-miR-N1 AGUAGGCAACGUUCUGGCUCC 63,8 210,9 135,5 -1,7 -0,6 -0,6

lus-miR-N2 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCU 64,0 50,1 71,1 0,4 0,5 0,5

lus-miR-N2 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCU 64,0 50,1 71,1 0,4 0,5 0,5

lus-miR-N3 UUGAAUCAGCAGCUCCAUCGC 34,0 46,5 103,3 -0,4 1,2 1,2

lus-miR-N4 CACGGAAAUUGACAAUUUUGACAU 1,3 1,8 1,7 -0,5 -0,1 -0,1

lus-miR-N4 CACGGAAAUUGACAAUUUUGACAU 1,3 1,8 1,7 -0,5 -0,1 -0,1

lus-miR-N4 CACGGAAAUUGACAAUUUUGACAU 1,3 1,8 1,7 -0,5 -0,1 -0,1

lus-miR-N4 CACGGAAAUUGACAAUUUUGACAU 1,3 1,8 1,7 -0,5 -0,1 -0,1

lus-miR-N5 AUUCCGUCUGGGUGGUCUGACCGG 0,9 1,9 1,7 -1,2 -0,2 -0,2

lus-miR-N5 AUUCCGUCUGGGUGGUCUGACCGG 0,9 1,9 1,7 -1,2 -0,2 -0,2

lus-miR-N5 AUUCCGUCUGGGUGGUCUGACCGG 0,9 1,9 1,7 -1,2 -0,2 -0,2

lus-miR-N6 AUCGGGCCGUCUGAUUUGGGCAGC 0,4 0,8 0,9 -0,9 0,1 0,1

lus-miR-N6 AUCGGGCCGUCUGAUUUGGGCAGC 0,4 0,S 0,9 -0,9 0,1 0,1

lus-miR-N6 AUCGGGCCGUCUGAUUUGGGCAGC 0,4 0,S 0,9 -0,9 0,1 0,1

lus-miR-N6 AUCGGGCCGUCUGAUUUGGGCAGC 0,4 0,S 0,9 -0,9 0,1 0,1

lus-miR-N6 AUCGGGCCGUCUGAUUUGGGCAGC 0,4 0,S 0,9 -0,9 0,1 0,1

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-N7 AUACAUGUCAAAUAUUAGUCGAUU 1,9 1,0 1,3 1,0 0,4 0,4

lus-miR-NS ACCACCCGGACGGAAAUCUGGUCC 1,0 3,5 2,7 -1,7 -0,3 -0,3

lus-miR-NS ACCACCCGGACGGAAAUCUGGUCC 1,0 3,5 2,7 -1,7 -0,3 -0,3

lus-miR-NS ACCACCCGGACGGAAAUCUGGUCC 1,0 3,5 2,7 -1,7 -0,3 -0,3

lus-miR-N9 AACCGGUCGUCCCAAUUGGACUGC 2,9 1,9 2,5 0,6 0,4 0,4

lus-miR-N9 AACCGGUCGUCCCAAUUGGACUGC 2,9 1,9 2,5 0,6 0,4 0,4

lus-miR-N10 CUUGGGCCCAAUUAAUUCUGAAAG 2,4 1,1 2,0 1,1 0,8 0,8

lus-miR-N10 CUUGGGCCCAAUUAAUUCUGAAAG 2,4 1,1 2,0 1,1 0,8 0,8

lus-miR-N10 CUUGGGCCCAAUUAAUUCUGAAAG 2,4 1,1 2,0 1,1 0,8 0,8

lus-miR-N11 CCGUGGACUCUACCCGAAAUGUGG 0,4 1,1 1,0 -1,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N11 CCGUGGACUCUACCCGAAAUGUGG 0,4 1,1 1,0 -1,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N11 CCGUGGACUCUACCCGAAAUGUGG 0,4 1,1 1,0 -1,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N11 CCGUGGACUCUACCCGAAAUGUGG 0,4 1,1 1,0 -1,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N12 AAUGGAGAGUUCGGAAAGAAG 9,9 11,1 7,9 -0,2 -0,5 -0,5

lus-miR-N13 UGUUAGAGAAAUAGCCGUUGGAGG 0,5 0,0 1,0 8,5 9,6 9,6

lus-miR-N14 UUUUAGGAAGAGAAUGAACAC 26,9 18,7 21,3 0,5 0,2 0,2

lus-miR-N14 UUUUAGGAAGAGAAUGAACAC 26,9 18,7 21,3 0,5 0,2 0,2

lus-miR-N15 AACGGGGGAUGCAAAUGGAGC 21,1 20,2 13,5 0,1 -0,6 -0,6

lus-miR-N15 AACGGGGGAUGCAAAUGGAGC 21,1 20,2 13,5 0,1 -0,6 -0,6

lus-miR-N16 UUGGAUGAGAAUGAGAAAGUUAGC 2,0 1,8 2,1 0,1 0,2 0,2

lus-miR-N16 UUGGAUGAGAAUGAGAAAGUUAGC 2,0 1,8 2,1 0,1 0,2 0,2

lus-miR-N17 AAAUUGAAAAUUUUCAAAUCGGCU 0,9 0,0 0,0 9,3 -0,1 -0,1

lus-miR-N18 AUUAGCAUUGUCACUGUCAGCACC 1,3 2,2 2,2 -0,8 0,0 0,0

lus-miR-N18 AUUAGCAUUGUCACUGUCAGCACC 1,3 2,2 2,2 -0,8 0,0 0,0

lus-miR-N1S AUUAGCAUUGUCACUGUCAGCACC 1,3 2,2 2,2 -0,S 0,0 0,0

lus-miR-N19 AAAUAUAGUGAACUAGAUCAGGCU 0,0 1,2 0,S -10,5 -0,7 -0,7

lus-miR-N19 AAAUAUAGUGAACUAGAUCAGGCU 0,0 1,2 0,S -10,5 -0,7 -0,7

lus-miR-N19 AAAUAUAGUGAACUAGAUCAGGCU 0,0 1,2 0,S -10,5 -0,7 -0,7

lus-miR-N20 UAUACGGAUCAUACAAAUGUGUA 1,5 1,0 1,2 0,6 0,3 0,3

lus-miR-N20 UAUACGGAUCAUACAAAUGUGUA 1,5 1,0 1,2 0,6 0,3 0,3

lus-miR-N20 UAUACGGAUCAUACAAAUGUGUA 1,5 1,0 1,2 0,6 0,3 0,3

lus-miR-N21 AAGCUAAGUUUCAUCAUAAUGACC 3,6 1,S 2,6 1,0 0,5 0,5

lus-miR-N21 AAGCUAAGUUUCAUCAUAAUGACC 3,6 1,S 2,6 1,0 0,5 0,5

lus-miR-N22 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCC 3,4 2,S 6,7 0,3 1,3 1,3

lus-miR-N22 UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCC 3,4 2,S 6,7 0,3 1,3 1,3

lus-miR-N23 UUCCAACUGGUAGUCGUACGGUGU 1,6 1,2 1,S 0,3 0,6 0,6

lus-miR-N23 UUCCAACUGGUAGUCGUACGGUGU 1,6 1,2 1,S 0,3 0,6 0,6

lus-miR-N24 AUAUGGGCUGAACUCGGGUUAACC 1,6 3,2 1,S -1,0 -0,S -0,S

lus-miR-N24 AUAUGGGCUGAACUCGGGUUAACC 1,6 3,2 1,S -1,0 -0,S -0,S

lus-miR-N25 CGUUAGAAAGUAGCUGUUGGAGGC 1,3 2,1 3,S -0,7 0,9 0,9

lus-miR-N25 CGUUAGAAAGUAGCUGUUGGAGGC 1,3 2,1 3,S -0,7 0,9 0,9

lus-miR-N26 CCAACUUUGACUGUCUAUAGCGCC 0,9 0,0 0,0 9,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N26 CCAACUUUGACUGUCUAUAGCGCC 0,9 0,0 0,0 9,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N26 CCAACUUUGACUGUCUAUAGCGCC 0,9 0,0 0,0 9,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N26 CCAACUUUGACUGUCUAUAGCGCC 0,9 0,0 0,0 9,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N26 CCAACUUUGACUGUCUAUAGCGCC 0,9 0,0 0,0 9,4 -0,1 -0,1

lus-miR-N27 AACUACAGUUGGUCGAUACGUAAC 0,6 1,0 1,7 -0,7 0,8 0,8

lus-miR-N27 AACUACAGUUGGUCGAUACGUAAC 0,6 1,0 1,7 -0,7 0,8 0,8

lus-miR-N28 AGGGUAUGUUCGACUCGAUAGGCU 0,0 6,1 4,5 -12,8 -0,5 -0,5

lus-miR-N28 AGGGUAUGUUCGACUCGAUAGGCU 0,0 6,1 4,5 -12,8 -0,5 -0,5

lus-miR-N28 AGGGUAUGUUCGACUCGAUAGGCU 0,0 6,1 4,5 -12,8 -0,5 -0,5

lus-miR-N28 AGGGUAUGUUCGACUCGAUAGGCU 0,0 6,1 4,5 -12,8 -0,5 -0,5

lus-miR-N29 GGUGUGCACCGACCGUCUCGUCCC 23,4 63,9 23,0 -1,4 -1,5 -1,5

lus-miR-N29 GGUGUGCACCGACCGUCUCGUCCC 23,4 63,9 23,0 -1,4 -1,5 -1,5

lus-miR-N30 AAAUCGGCUAAUAUUUCACAUGCA 2,2 2,8 1,2 -0,4 -1,2 -1,2

lus-miR-N30 AAAUCGGCUAAUAUUUCACAUGCA 2,2 2,8 1,2 -0,4 -1,2 -1,2

lus-miR-N31 GAGUCUUUGGAUACGGAAUAGAGC 1,8 3,6 3,7 -1,0 0,0 0,0

lus-miR-N31 GAGUCUUUGGAUACGGAAUAGAGC 1,8 3,6 3,7 -1,0 0,0 0,0

lus-miR-N31 GAGUCUUUGGAUACGGAAUAGAGC 1,8 3,6 3,7 -1,0 0,0 0,0

lus-miR-N32 GUGUCUAGACCCAUUCAUUUGGAC 1,4 0,0 0,9 10,0 9,4 9,4

lus-miR-N32 GUGUCUAGACCCAUUCAUUUGGAC 1,4 0,0 0,9 10,0 9,4 9,4

lus-miR-N33 UGAGAACCGGCUGUCAGAUGGACC 1,2 1,0 1,4 0,3 0,6 0,6

lus-miR-N33 UGAGAACCGGCUGUCAGAUGGACC 1,2 1,0 1,4 0,3 0,6 0,6