Молекулярное баркодирование как новый метод изучения функции Т-лимфоцитов на уровне единичных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Козлов Иван Борисович

• Козлов Иван Борисович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Козлов Иван Борисович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ МОДИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1.1.1 Олигонуклеотидный синтез

1.1.2 Химические модификации

1.1.2.1 Модификации межнуклеотидной связи

1.1.2.2 Модификация азотистых оснований нуклеотидов

1.1.2.3 Модификация рибозы

1.2 СЕКВЕНИРОВАНИЕ ТРАНСКРИПТОМА ЕДИНИЧНОЙ КЛЕТКИ

1.2.1 Секвенирование нового поколения (N08)

1.2.1.1 Секвенирование короткими прочтениями

1.2.1.2 Секвенирование длинными прочтениями

1.2.2 Изучение транскриптома единичной клетки с помощью современных методов анализа

1.2.2.1 Изоляция клеток и амплификация клеточных РНК-транскриптов

1.2.2.2 Молекулярное мечение

1.2.2.3 Анализ данных секвенирования транскриптома единичной клетки

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Твердофазный синтез олигонуклеотидов

2.2 Модификация твердофазного носителя ПЭГ-спейсером и PC-линкером

2.3 Синтез баркодированной олигонуклеотидной последовательности

2.3.1 Формирование клеточного баркода методом «split-and-pool»

2.3.2 UMI баркод

2.4 Фотолиз баркодированных олигонуклеотидов

2.5 Подтверждение синтеза баркода методом «split-and-pool» с помощью биологических методов

2.5.1 Лигирование продуктов амплификации в вектор pGEM-T Easy (или pAL-2T)

2.5.2 Трансформация клеток E.coli и высев на селективную среду

2.5.3 Отбор клонов методом бело-голубой селекции с последующей проверкой методом ПЦР

2.5.4 Определение нуклеотидной последовательности баркода

2.6 Приготовление эмульсии вода-в-масле и инкапсуляция клеток и частиц с олигонуклеотидами

2.7 Проведение обратной транскрипции в эмульсии и подготовка библиотеки ДНК-фрагментов к секвенированию

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Разработка методики синтеза олигонуклеотидной последовательности

3.2 Применение Photo-Cleavable-линкера для фоторелиза олигонуклеотидной последовательности

3.3 Пространственный фактор в работе полимеразы при амплификации и синтезе кДНК методом обратной транскрипции

3.4 Создание баркодированной вставки в синтетическом олигонуклеотиде «split-and-pool» методом

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ . 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АОН - антисенс-олигонуклеотиды

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК

мРНК - матричная РНК

МФ - морфолинофосфорамидатные группы

ОН - олигонуклеотид

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФА - фосфорамидатная группа

BNA - bridged nucleic acid (мостиковые нуклеиновые кислоты) CRT - cyclic reversible termination (метод циклического обратимого завершения)

CuAAC - катализируемое медью азид-алкиновое циклоприсоединение

DMSO - диметилсульфоксид dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат DTT - дитиотрейтол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота ENA - ethylene-bridged nucleic acid (этилен-мостиковые нуклеиновые кислоты)

ET SSB - Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein (термостабильный белок, связывающий одноцепочечную ДНК)

FDA - Федеральная администрация США по пищевым продуктам и лекарственным препаратам

GEM - gel bead-in-emulsion (гелевая наночастица)

LNA - locked nucleic acid (замкнутые нуклеиновые кислоты)

MMLV - обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей

PC-Linker - photo-cleavable linker

PDMS - полиметилсилоксан

PS - фосфортиоатная группа

RNAsin - ингибитор рибонуклеаз

SBL - sequencing by ligation (секвенирование благодаря лигированию)

SBS - sequencing by synthesis (секвенирование благодаря синтезу) scRNA-seq - single-cell RNA sequencing (секвенирование РНК единичной клетки)

siRNA - малая интерферирующая РНК (миРНК) SMRT - single-molecule real-time (секвенирование единичной молекулы в реальном времени)

SNA - single-nucleotide addition (присоединения единичного нуклеотида)

Tm - температура плавления (дуплекса)

UMI - unique molecular identifier (уникальный молекулярный идентификатор)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярное баркодирование как новый метод изучения функции Т-лимфоцитов на уровне единичных клеток»

Актуальность работы

Использование полистирольного субстрата в качестве носителя при синтезе олигонуклеотидной (ОН) последовательности ускорило развитие данного направления органической химии [1]. До этого синтез последовательностей осложнялся высокими трудовыми и временными затратами, т.к. проводился при помощи жидкофазного метода, предполагающего длительные стадии выделения и отмывки. Развитие олигонуклеотидной химии привело к появлению четырех основных методов синтеза ОН, которые стали популярными и применялись для различных целей: Н-фосфонатный, фосфодиэфирный, фосфотриэфирный и фосфитный триэфирный. В большинстве своем их развитие происходило параллельно в разных лабораториях. Однако наиболее удобным с точки зрения автоматизации и стабильности процесса оказался фосфитный триэфирный метод, который занял позицию «золотого стандарта» олигонуклеотидного синтеза [2,3].

С ростом производительности приборов, которые позволяли за более короткий срок синтезировать более длинные олигонуклеотиды, развивались и направления, в которых синтетические ОН могли применяться. В частности, были разработаны дополнительные модификации нуклеиновой кислоты, которые позволили применять синтетические олигонуклеотиды в биологических, а позже и в медицинских целях. Изменения структуры нуклеотида, которые включают в себя модификации рибозного кольца, межнуклеотидной фосфатной связи и азотистого основания, нашли применение в различных научных направлениях и отраслях промышленности: антисенс-технологии на базе малых интерферирующих РНК, ПЦР и секвенирование с использованием меченных флюорофорными молекулами ОН, сингл-селл технологии, редактирование геномов, а также разработка фармацевтических субстанций.

Альтернативный способ преобразования олигонуклеотидной последовательности подразумевает внесение смысловых модификаций, таких как молекулярное мечение ОН благодаря баркодированию определенного участка последовательности. Это позволяет снизить количество ошибок и неравномерность амплификации при проведении РНК-секвенирования (СБЬ-Бед [4], МАЕ^-Бед [5], Бгор-вед [6]). Применение подобных методов позволяет обрабатывать информацию, получаемую от большого числа клеток. В таких случаях слабые сигналы, которые исходят от небольшого количества единичных клеток, обычно теряются. В свою очередь, данные, полученные на уровне отдельных клеток, в ряде случаев представляют значительную практическую ценность, в особенности это касается клеток иммунной системы. Информация о небольших популяциях клеток памяти, тканеспецифических лимфоцитах, эффекторных клетках, вовлеченных в противоопухолевый и аллогенный ответ, позволяет диагностировать заболевание, прогнозировать его развитие и находить эффективный способ лечения [7,8]. Так, например, исследования структуры репертуаров Т-клеточных рецепторов (ТКР) и функций Т-лимфоцитов при развитии патологического процесса требуют оценки эволюции Т-клеточного адаптивного иммунного ответа с учетом данных о клональном происхождении Т-клеток эффекторов [9]. В ряде работ предлагаются методы анализа единичных Т-лимфоцитов [10,11], однако их недостатком является невозможность одновременного анализа большого числа клеток и высокая стоимость. Существуют коммерческие решения для анализа репертуаров ТКР единичных Т-клеток или для анализа экспрессионного профиля единичных клеток [12], но цена такого анализа составляет порядка 20 тысяч евро за 1 эксперимент. При этом, несмотря на свою цену, предлагаемые технологии не могут быть использованы для комплексного исследования функции Т-лимфоцитов в контексте их антигенной специфичности.

Безусловно, технология, которая позволит снизить стоимость анализа и повысить эффективность обработки получаемой информации от единичных клеток, совершит прорыв в фундаментальной и клинической иммунологии.

Существующие в настоящее время технологии [6] подразумевают использование полистирольных частиц с ковалентно связанными баркодированными ОН в эмульсионной ПЦР. Однако данный подход показал недостаточную эффективность в экспериментах, а долгие сроки поставки реактивов из-за рубежа делают технологию scRNA-seq неприменимой для рутинной диагностики.

Таким образом, разработка отечественной технологии формирования синтетических ОН на твердофазном носителе с заданными характеристиками и специфическими последовательностями, которая позволит получать информацию от единичных клеток, приведет к развитию фундаментальных и прикладных направлений в области изучения клеточного разнообразия, фенотипических особенностей и эволюции клетки.

Цель исследования

Разработка отечественной технологии мечения мРНК единичных клеток на базе твердофазного олигонуклеотидного синтеза и эмульсионной ОТ-ПЦР.

Задачи исследования

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить синтез на поверхности полистирольной частицы, модифицированной функциональными группами, баркодированной олигонуклеотидной последовательности с помощью автоматического ДНК/РНК синтезатора.

2. Использовать «обратные» 5'-фосфорамидиты в синтезе для ориентации на частице олигонуклеотидной последовательности, которая прикреплена с 5'-конца, и формирования свободной 3'-гидроксильной группы.

3. Осуществить формирование уникальной метки частицы путем синтеза баркодированного участка последовательности ОН, используя рандомизацию подачи растворов фосфорамидитов с последующим объединением и перемешиванием частиц.

4. Оценить эффективность мечения мРНК клеток с помощью обратной транскрипции и синтезированных баркодированных ОН.

5. Охарактеризовать и исключить факторы, которые снижают эффективность процесса синтеза кДНК, благодаря дополнительного введения синтетических молекул в структуру олигонуклеотида.

Научная новизна работы

Разработанная технология эффективного мечения ОН с помощью молекулярных баркодов позволяет с высокой точностью определять и характеризовать структуру вариабельных фрагментов генов Т-клеточных рецепторов. Подобного комплексного подхода к изучению функциональной гетерогенности Т-лимфоцитов, объединяющего новейшие технологии в сфере твердофазного олигонуклеотидного синтеза, методы химической модификации синтетических ОН и разработки в области высокопроизводительного анализа единичных клеток, ранее описано не было.

Применены и описаны современные методы формирования баркодированных последовательностей в процессе синтеза ОН на твердофазном носителе с применением автоматических синтезаторов.

Впервые использован ПЭГ-спейсер (Spacer phosphoramidite 18) для инкорпорирования в структуру синтетического ОН. Показано, что его встраивание приводит к устранению пространственного фактора,

снижающего активность ферментов. Для этого перед синтезом олигонуклеотидной последовательности проводилась модификация полистирольных частиц ПЭГ-спейсером.

Впервые использован фотодеградируемый линкер (PC-linker Phosphoramidite) для инкорпорирования в структуру синтетического ОН. Показано, что его применение обеспечивает стабильное закрепление олигонуклеотидной последовательности на поверхности частицы. За счет чувствительности линкера к мягкому УФ-излучению, воздействие которого приводит к полной деструкции фрагмента его молекулы, происходит быстрое высвобождение синтетического ОН в раствор.

Показано, что свободный ОН эффективнее участвует в праймировании клеточной мРНК, а отсутствие влияния стерических факторов благоприятно сказывается на актвности ферментов, что в сумме приводит к повышению эффективности синтеза кДНК.

Впервые осуществлен процесс эмульгирования полученных частиц с синтетическими олигонуклеотидами и клеток в системе вода-в-масле. Подобраны условия и реагенты для формирования устойчивой эмульсии, а также ее деструкции. Коллегами из Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова разработан прибор, позволяющий эмульгировать клетки с частицами в масле в мягких условиях.

На основе международного опыта создания систем для высокопроизводительного анализа большого количества единичных клеток проанализированы направления модернизации разаработанных технологий.

Теоретическая значимость

Разработан и внедрен подход к уменьшению влияния стерического фактора на эффективность работы полимеразы при синтезе комплементарной ДНК на поверхности частицы. Применение системы

спейсеров и линкеров позволило повысить выход продукта синтеза кДНК при сохранении минимального количества частиц, вовлеченных в процесс праймирования мРНК. Разработанные технические решения существенно сократили издержки, обусловленные себестоимостью метода, а также привели к созданию технологии, которая будет значительно дешевле зарубежных аналогов, оставаясь конкурентоспособной.

Результаты исследования могут быть включены в научно-методические программы для студентов химических, биологических и медицинских ВУЗов, а также в образовательные программы учреждений высшего профессионального и последипломного образования.

Научно-практическая значимость

Разработаны и внедрены методы твердофазного синтеза длинной последовательности олигонуклеотида с использованием автоматического ДНК/РНК синтезатора и модификации программы синтеза. Это позволяет снизить расходы на дорогостоящие реактивы и повысить эффективность процесса синтеза, обеспечивая высокие выходы продукта.

Модернизирован процесс синтеза ОН последовательности на твердофазном носителе с использованием инвертированных фосфорамидитов, применение которых позволяет синтезировать последовательность в направлении 5'->3'. Синтез олигонуклеотидной последовательности с использованием «обратных» фосфорамидитов создает возможность закрепленному ОН праймировать нуклеиновые кислоты, а также осуществлять мечение вновь синтезированных молекул кДНК.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые в отечественной практике предпринята попытка дизайна и реализации комплексной технологии обработки нескольких десятков тысяч единичных клеток, которая позволяет оценивать и сравнивать

профили экспрессии различных генов между собой, изучать генетическую эволюцию в популяции и ткани.

2. Впервые предложен и реализован подход инкорпорирования спейсерных молекул для снижения влияния пространственного фактора на активность полимеразы при синтезе комплементарной ДНК на поверхности частицы. В результате встраивания дополнительных молекул в структуру олигонуклеотида привело к увеличению выхода продукта синтеза кДНК.

3. Впервые предложен и реализован подход к инкорпорированию фотодеградируемого линкера для высвобождения синтетической олигонуклеотидной последовательности, которая позволяет праймировать матричную РНК с высокой эффективностью, в раствор. Подобраны параметры проведения этого процесса в мягких условиях, воздействуя исключительно на фоточувствительный фрагмент и не оказывая влияния на нуклеиновую кислоту.

Личный вклад автора

Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.

Апробация результатов

Результаты работы представлены в устном докладе, с которым автор выступил на международном конгрессе Федерации Европейских биохимических обществ (FEBS Congress 2020, Краков), а также в рамках конференции II Научно-практическая школа «Секвенирование единичных клеток» (2020, Томск).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 6 статьях в научных журналах, которые включены в перечень рецензируемых периодических научных изданий, рекомендованных для опубликования основных научных результатов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Генетика» «Вестник РГМУ», Allergy). Также по результатам работы получен 1 патент.

Внедрение результатов работы

Результаты работы использованы в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, ООО «ДНК-Технология TC», ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ МОДИФИКАЦИИ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновая кислота - высокомолекулярное соединение, биополимер, образованный 2 видами нуклеотидов (рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды). Они представляют собой 2 класса нуклеиновых кислот: РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). РНК и ДНК присутствуют в каждой клетке всех живых организмов, играя огромную биологическую роль в жизненных процессах: хранение, передача генетической информации и формирование белка.

Несмотря на то, что РНК - одноцепочечная молекула, а ДНК -двуцепочечная, по своей химической структуре они очень похожи. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, рибозы (дезоксирибозы) и фосфордиэфирной связи. Различают пуриновые и пиримидиновые азотистые основания. К пуринам относятся аденин и гуанин, а к пиримидинам - урацил, тимин и цитозин. В состав ДНК входят тимин, цитозин, гуанин и аденин, а в РНК - урацил, цитозин, гуанин и аденин.

Биополимеры состоят из повторяющихся между собой нуклеотидов, которые соединены фосфордиэфирной связью. Наличие подвижного протона на одном из атомов кислорода фосфатной группы и смещение электронной плотности к атому фосфора характеризуют кислотные свойства молекул РНК и ДНК. Открытие нуклеиновых кислот вызвало огромный интерес во всем научном сообществе. Изучение их свойств и молекулярной структуры, а также попытки воссоздать биополимер искусственным способом привели к возникновению нового направления в органическом синтезе. Примерно через 2 года после того, как Watson и Crick [13] открыли двухцепочечную структуру ДНК, Mihelson и Todd опубликовали результаты получения динуклеотида химическим методом

[14]. Олигонуклеотидный синтез за более чем 65 лет в процессе своей эволюции сменил несколько направлений и подходов к формированию биополимера [15]. Мощным эволюционным рывком стала автоматизация процесса, преимуществами которой были удобство работы оператора, скорость процесса и стабильно высокое качество получаемого вещества.

Современная фармацевтическая промышленность и сфера разработки лекарственных препаратов на основе терапевтических ОН требуют роста производительности олигонуклеотидных синтезаторов, которые способствуют ускорению синтеза и повышению качества продукта, что дает импульс развитию научно-практическим направлениям в области медицины и органической химии. Использование автоматических синтезаторов позволило расширить спектр применения синтетических олигонуклеотидов (ОН) в науке. Среди таких направлений сборка генов или целого генома [16,17], ПЦР [18], секвенирование [19-21], редактирование генома с помощью технологии СМБРЯ Сав9 [22,23], а также разработка фармацевтических субстанций [24-26]. Во многих случаях, описанных выше, для решения конкретных задач требуются определенного рода преобразования в структуре олигонуклеотидной последовательности. Различают два типа модификаций: внутренние и концевые. Внутренние модификации синтетических олигонуклеотидов подразумевают изменение структуры нуклеотида и будут рассмотрены в этой работе подробно. Во вторую группу входят способы изменения 3'- и 5'-синтетической последовательности различными молекулами, в том числе белками [27-30].

1.1.1 Олигонуклеотидный синтез

В природе существует универсальный инструмент копирования и трансляции нуклеиновых кислот с помощью специальных ферментов, которые с большой скоростью считывают и достраивают копию последовательности, присоединяя один нуклеотид за другим. Ученые-химики более 70 лет работают над созданием столь же эффективного и быстрого способа формирования нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотидный синтез - химический метод, в процессе которого происходит образование цепи нуклеиновой кислоты. Строительные блоки подаются один за другим в соответствии с заданной последовательностью. Синтез олигонуклеотидов принято проводить либо в жидкой фазе (жидкофазный олигонуклеотидный синтез (ЖФОС)), либо на твердой подложке (твердофазный олигонуклеотидный синтез (ТФОС)). ЖФОС использует растворимые полимерные носители и обладает потенциалом масштабируемости. Однако в настоящее время для проведения ЖФОС требуется 3 отдельных этапа реакции и 4-5 этапов осаждения при добавлении нуклеотида. Кроме того, длительное время воздействия кислот на этапе депротекции приводит к деградации последовательностей с высоким содержанием А (аденина) вследствие депуринизации и расщепления цепей. Таким образом, несмотря на существенные недостатки ТФОС, он является на данный момент времени наиболее оптимальным способом синтеза ОН разной длины (вплоть до 300 нуклеотидов).

Развитие химии ОН привело к появлению пяти основных методов синтеза ОН, которые стали популярными и применялись для различных целей: Н-фосфонатный, фосфодиэфрный, фосфотриэфирный, фосфитный триэфирный и фосфорамидитный метод.

Рассмотрим каждый из них в отдельности:

1) Н-фосфонатный метод

Данный метод основан на введении 1-Н фосфонатов, содержащих уже окисленную форму фосфора Р(У), однако вместо атома кислорода/серы, являющихся анионными фрагментами, молекула содержит атом водорода, ковалентно соединенный с атомом фосфора, который в дальнейшем окисляется с образованием целевых соединений (рисунок 1).

Рисунок 1 - Н-фосфонатный метод синтеза.

Одним из ключевых недостатков данного синтеза является нестабильность 1-Н фосфонатов, их высокая токсичность, и низкие выходы реакций окисления фосфора до целевых молекул.

Именно по эти причинам, данный метод не получил должного развития и применения в фармацевтической химии и остался лишь сугубо научным приложением к олигонуклеотидному синтезу.

2) Фосфодиэфирный метод

В 1950-ом году был разработан фосфодиэфирный метод, суть которого заключалась в реакции активированного дициклогексилкарбодиимидом фСС) 3'-0-ацетилнуклеозид-5'-0-фосфата

с «-толуолсульфонилхлоридом. Активированные молекулы далее вступали в реакцию с 5'-защищенным нуклеозидом с получением динуклеозидмонофосфата. Затем, после удаления ацетильной защитной группы с 3'- атома кислорода осуществляли дальнейшее удлинение цепи (рисунок 2).

Рисунок 2 - Фосфодиэфирный метод.

Главным недостатком данного метода синтеза является образование олигомеров пирофосфата и олигонуклеотидов, разветвленных на межнуклеозидный фосфат. Также, очевидным недостатком данного метода синтеза, является невозможность введение гетероатомов в фосфатную группу вместо атома кислорода, что всячески сужает сферу дальнейшего использования ОН, синтезированных данным способом, т.к. большинство терапевтических ОН представляют собой модифицированные по фосфатной группе молекулы.

3) Фосфотриэфирный метод.

В 1960-х годах был разработан фосфотриэфирный подход к синтезу олигонуклеотидов. Существенным отличием от фосфодиэфирного метода являлась защита атома кислорода фосфатной группы 2-цианоэтильной

группой (рисунок 3). Данный факт, исключал образование вырожденных олигонуклеотидов. Высокая селективность данного метода привела к увеличению выхода и сокращению времени синтеза. Данный метод изначально был разработан для жидкофазного олигонуклеотидного синтеза, однако нашел применения и в твердофазном методе, при использовании полистирольных носителей, а затем и на носителе с контролируемым размером пор, что стимулировало масштабные исследования в области твердофазного синтеза ОН, которые в конечном итоге привели к полной автоматизации олигонуклеотидного синтеза.

ОР?

Рисунок 3 - Фосфотриэфирный метод.

Явным недостатком данного метода синтеза является отсутствие возможности введения гетероатома в фосфонатную группу, а также сложность выполнения синтеза.

4) Фосфитный триэфирный метод/Фосфорамидитный метод

Говоря об этих способах синтеза ОН, важно учитывать, что по своей сути они идентичны, т.к. фосфорамидитный синтез, это успешная модификация фосфиттриэфирного метода.

Как упоминалось ранее, природные нуклеотиды (нуклеозид-3'- или 5'-фосфаты) и их фосфодиэфирные аналоги имеют весьма низкую реакционную способность, для того чтобы обеспечить высокое качество

протекания синтеза, однако, селективность и скорость образования межнуклеозидных связей резко увеличивается при использовании З'-О-(К,К-диизопропилфосфорамидитов) производных нуклеозидов (фосфорамидитов), которые являются строительными блоками в фосфиттриэфирном методе синтеза (рисунок 4).

Однако, существует техническая проблема, обусловленная с наличием множества лабильных функциональных групп в фосфорамидитах, следовательно, для того чтобы минимизировать вырожденные или разветвленные последовательности все функциональные группы должны быть защищены кислотоустойчивыми защитными группами.

По завершении синтеза олигонуклеотидной цепи все защитные группы удаляют, чтобы получить целевые последовательности. Ниже кратко рассмотрены защитные группы, используемые в настоящее время в коммерчески доступных и наиболее распространенных нуклеозидных фосфорамидитных строительных блоках:

1) 5'-гидроксильная группа защищена кислотолабильной группой ДМТ (4,4'-диметокситритил).

2) Тимин и урацил, азотистые основания тимидина и уридина соответственно, не имеют экзоциклических аминогрупп и, следовательно, не требуют постановки какой-либо защиты.

Хотя азотистое основание гуанозина и 2'-дезоксигуанозина имеет экзоциклическую аминогруппу, её основность настолько низка, она не реагирует с фосфорамидитами в условиях реакции присоединения следующего нуклеотида. Также, постановка защитных групп на амино-или гидрокси- группы, необходима для увеличения растворимости фосфорамидитов в ацетонитриле, растворителе, который является основным в олигонуклеотидном синтезе. При рутинном синтезе олигонуклеотидов экзоциклические аминогруппы в нуклеозидах остаются постоянно защищенными по всей длине сборки олигонуклеотидной цепи,

что позволяет говорить о высоком уровне селективности данного метода синтеза.

Рисунок 4 - Фосфорамидитный метод

3) Наиболее часто встречающиеся защитные группы для фосфорамидитов это: Вг (бензоил), Ас (ацетил), dmf (диметилфорамид), 1Ви (изобутерил), СуБ1 (цианоэтил).

Отдельно следует остановится на этапах фосфорамидитного метода и механизме реакций. В начале синтеза олигонуклеотида первый

защищенный фосфорамидит предварительно присоединяют к твердофазному носителю за его 3'- гидрокисильную группу рибозы. Связанный с носителем нуклеозид имеет защитную группу 5'-ДМТ (ДМТ = 4,4'-диметокситритил), роль которой состоит в предотвращении неконтролируемой полимеризации во время функционализации носителя. В последствие эта защитная группа должна быть удалена с 5'-конца нуклеотида в процессе детритилирования.

После детритилирования, связанный с носителем нуклеозид готов к реакции со следующим основанием, которое добавляется в виде фосфорамидитного мономера. Большой избыток соответствующего фосфорамидита смешивают с активатором (тетразолом или его производным), оба из которых растворяются в ацетонитриле (хороший растворитель для реакций нуклеофильного замещения). Диизопропиламиногруппа нуклеозидфосфорамидита протонируется активатором и таким образом превращается в хорошо уходящую группу. Он быстро подвергается атаке 5'-гидроксильной группы нуклеозида, связанного с подложкой, на соседний атом фосфора, и образуется новая связь фосфор-кислород, создавая триэфир фосфита.

Фосфорамидиты достаточно стабильны в инертной атмосфере, их можно получать в больших количествах, транспортировать по всему миру и хранить в сухом виде в течение долгого времени. Данные вещества становятся реакционноспособными только при протонировании.

При описанной технологии можно ожидать выходы реакций более 98-99% на каждой стадии цикла, однако даже при использовании наиболее эффективных синтетических подходов и самых чистых реагентов невозможно достичь 100% выхода реакции. Это означает, что на связанном с носителем нуклеотиде будут содержаться непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы и, если каким-либо образом не понизить их реакционную способность, то в ходе синтеза будет накапливаться большое количество вырожденных примесей. Наличие данного рода примесей,

способно привести к негативному результату любого биохимического эксперимента или к получению недостоверных результатов.

Удаления вырожденных последовательностей можно добиться, введя стадию «кэпирования» после реакции присоединения фосфорамидита, для того чтобы дезактивировать непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы. В условиях автоматизированного олигонуклеотидного синтеза используются два кэпирующих раствора: уксусный ангидрид/пропионовый ангидрид и ^метилимидазол (ЫМ1). Эти два реагента (растворенные в тетрагидрофуране с добавлением небольшого количества пиридина) смешивают на ДНК-синтезаторе перед подачей в колонку для синтеза. Данная смесь быстро ацилирует спирты, а пиридин обеспечивает поддержание щелочного pH реакционной смеси. Ацилирование 5'-гидроксильных групп делает их инертными для последующих реакций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Козлов Иван Борисович, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Letsinger R.L. et al. Reactions on Polymer Supports // J Am Chem Soc. 1964. Vol. 86, № 23. P. 5163-5165.

2. Letsinger R. et al. Nucleotide chemistry. XX. Phosphite coupling procedure for generating internucleotide links // J Am Chem Soc. 1975. Vol. 97, № 11. P. 3278-3279.

3. Letsinger R.L., Lunsford W.B. Synthesis of thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates. // J. Am. Chem. Soc. 1976. Vol. 98, № 12. P. 3655-3661.

4. Yanai I., Hashimshony T. Single Cell Methods, Sequencing and Proteomics // Methods Mol Biology Clifton N J. 2019. Vol. 1979. P. 45-56.

5. Klein A.M. et al. Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells // Cell. 2015. Vol. 161, № 5. P. 1187-1201.

6. Macosko E.Z. et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. // Cell. 2015. Vol. 161, № 5. P. 1202-1214.

7. Bindea G. et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer // Immunity. 2013. Vol. 39, № 4. P. 782-795.

8. DeNardo D.G., Coussens L.M. Inflammation and breast cancer. Balancing immune response: crosstalk between adaptive and innate immune cells during breast cancer progression // Breast Cancer Res. 2007. Vol. 9, № 4. P. 212.

9. Efremova M. et al. Immunology in the Era of Single-Cell Technologies // Annu Rev Immunol. 2020. Vol. 38, № 1. P. 1-31.

10. Jiang N., Zhang S., Ma K. An ID card for T cells. // Nat Biotechnol. 2014. Vol. 32, № 7. P. 639-640.

11. Newell E.W., Davis M.M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells // Nat Biotechnol. 2014. Vol. 32, № 2. P. 149-157.

12. Genomics 10X. Reveal the Full Complexity of Cellular Diversity, Cell by Cell [Electronic resource]. URL: https://www.10xgenomics.com/single-cell/.

13. WATSON J.D., CRICK F.H.C. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. Vol. 171, №2 4356. P. 737-738.

14. Michelson A., Todd A. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3': 5'-internucleotidic linkage // J Chem Soc Resumed. 1955. Vol. 0, № 0. P. 2632-2638.

15. Reese C.B. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis // Org Biomol Chem. 2005. Vol. 3, № 21. P. 3851.

16. Hoover D.M., Lubkowski J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, № 10. P. e43-e43.

17. Smith H.O. et al. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: ^X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides // Proc National Acad Sci. 2003. Vol. 100, № 26. P. 15440-15445.

18. Erlich H.A., Bugawan T.L. PCR Technology. 1989. P. 193-208.

19. Schütze T. et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing // Plos One. 2011. Vol. 6, № 12. P. e29604.

20. Grada A., Weinbrecht K. Next-Generation Sequencing: Methodology and Application // J Invest Dermatol. 2013. Vol. 133, № 8. P. 1-4.

21. Gnirke A. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing // Nat Biotechnol. 2009. Vol. 27, № 2. P. 182-189.

22. Kelley M.L. et al. Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing // J Biotechnol. 2016. Vol. 233. P. 74-83.

23. Palumbo C.M. et al. Versatile 3' Functionalization of CRISPR Single Guide RNA // Chembiochem. 2020. Vol. 21, № 11. P. 1633-1640.

24. Lundin K.E., Gissberg O., Smith C.I.E. Oligonucleotide Therapies: The Past and the Present // Hum Gene Ther. 2015. Vol. 26, № 8. P. 475-485.

25. Shen X., Corey D.R. Chemistry, mechanism and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 46, № 4. P. gkx1239.

26. Corey D.R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy // Nat Neurosci. 2017. Vol. 20, № 4. P. 497-499.

27. Kijas J.M. et al. Enrichment of microsatellites from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin-coated magnetic particles. // Biotechniques. 1994. Vol. 16, № 4. P. 656-660, 662.

28. Niemeyer C.M. et al. Oligonucleotide-directed self-assembly of proteins: semisynthetic DNA—streptavidin hybrid molecules as connectors for the generation of macroscopic arrays and the construction of supramolecular bioconjugates // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22, № 25. P. 5530-5539.

29. Didenko V.V. DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET): Designs and Applications // Biotechniques. 2001. Vol. 31, № 5. P. 1106-1121.

30. Benizri S. et al. Bioconjugated Oligonucleotides: Recent Developments and Therapeutic Applications // Bioconjugate Chem. 2019. Vol. 30, № 2. P. 366-383.

31. El-Sagheer A.H., Brown T. Synthesis and Polymerase Chain Reaction Amplification of DNA Strands Containing an Unnatural Triazole Linkage // J Am Chem Soc. 2009. Vol. 131, № 11. P. 3958-3964.

32. Beier M., Pfleiderer W. Nucleotides, Part LXII , Pyridinium Salts -An Effective Class of Catalysts for Oligonucleotide Synthesis // Helv Chim Acta. 1999. Vol. 82, № 6. P. 879-887.

33. Hayakawa Y. et al. Acid/azole complexes as highly effective promoters in the synthesis of DNA and RNA oligomers via the phosphoramidite method. // J Am Chem Soc. 2001. Vol. 123, № 34. P. 8165-8176.

34. Hayakawa Y. Toward an Ideal Synthesis of Oligonucleotides: Development of a Novel Phosphoramidite Method with High Capability // B Chem Soc Jpn. 2001. Vol. 74, № 9. P. 1547-1565.

35. Beaucage S., Jain H. Encyclopedia of Cell Biology // Mol Princ Components Technology Concepts. 2016. P. 36-53.

36. Sekine M. Synthesis of Therapeutic Oligonucleotides. 2018. P. 41-65.

37. Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites— A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis // Tetrahedron Lett. 1981. Vol. 22, № 20. P. 1859-1862.

38. Vargeese C. et al. Efficient activation of nucleoside phosphoramidites with 4,5-dicyanoimidazole during oligonucleotide synthesis // Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26, № 4. P. 1046-1050.

39. Beaucage S.L., Caruthers M.H. Synthetic Strategies and Parameters Involved in the Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides According to the Phosphoramidite Method // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2000. Vol. 00, № 1. P. 3.3.1-3.3.20.

40. Tsukamoto M., Hayakawa Y. Synthesis of Therapeutic Oligonucleotides. 2018. P. 17-39.

41. Beaucage S., Iyer R. Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach // Tetrahedron. 1992. Vol. 48, № 12. P. 22232311.

42. Letsinger R., Caruthers M., Jerina D. Reactions of Nucleosides on Polymer Supports. Synthesis of Thymidylylthymidylylthymidine* // Biochemistry-us. 1967. Vol. 6, № 5. P. 1379-1388.

43. Matteucci M., Caruthers M. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support // J Am Chem Soc. 1981. Vol. 103, № 11. P. 3185-3191.

44. Caruthers M. et al. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. // Methods Enzymol. 1987. Vol. 154. P. 287-313.

45. Bell N.M., Micklefield J. Chemical Modification of Oligonucleotides for Therapeutic, Bioanalytical and other Applications // Chembiochem. 2009. Vol. 10, № 17. P. 2691-2703.

46. Fire A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. Vol. 391, № 6669. P. 806-811.

47. Antipova O.M. et al. Advances in the Application of Modified Nucleotides in SELEX Technology // Biochem Mosc. 2018. Vol. 83, № 10. P. 1161-1172.

48. Catani M. et al. Oligonucleotides: Current trends and innovative applications in the synthesis, characterization and purification. // Biotechnol J. 2020. P. e1900226.

49. Smet M.D. de, Meenken C., Horn G.J. van den. Fomivirsen - a phosphorothioate oligonucleotide for the treatment of CMV retinitis // Ocul Immunol Inflamm. 2009. Vol. 7, № 3-4. P. 189-198.

50. Kim J. et al. Patient-Customized Oligonucleotide Therapy for a Rare Genetic Disease. // New Engl J Medicine. 2019. Vol. 381, № 17. P. 1644-1652.

51. Keam S.J. Inotersen: First Global Approval // Drugs. 2018. Vol. 78, № 13. P. 1371-1376.

52. Heo Y.-A. Golodirsen: First Approval // Drugs. 2020. Vol. 80, № 3. P. 329-333.

53. Glazier D.A. et al. Chemical Synthesis and Biological Application of Modified Oligonucleotides // Bioconjugate Chem. 2020. Vol. 31, № 5. P. 12131233.

54. Clercq E.D., Eckstein F., Merigan T.C. Interferon Induction Increased through Chemical Modification of a Synthetic Polyribonucleotide // Science. 1969. Vol. 165, № 3898. P. 1137-1139.

55. Eckstein F. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides // Nucleic Acid Ther. 2014. Vol. 24, № 6. P. 374-387.

56. Stein C.A. et al. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acids Res. 1988. Vol. 16, № 8. P. 3209-3221.

57. Geary R.S. et al. Pharmacokinetics, biodistribution and cell uptake of antisense oligonucleotides // Adv Drug Deliver Rev. 2015. Vol. 87. P. 46-51.

58. Koller E. et al. Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39, № 11. P. 4795-4807.

59. Prakash T.P. et al. Synergistic effect of phosphorothioate, 5'-vinylphosphonate and GalNAc modifications for enhancing activity of synthetic siRNA // Bioorg Med Chem Lett. 2016. Vol. 26, № 12. P. 2817-2820.

60. Hassler M.R. et al. Comparison of partially and fully chemically-modified siRNA in conjugate-mediated delivery in vivo // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46, № 5. P. gky037-.

61. Eckstein F. Nucleoside Phosphorothioates // Annu Rev Biochem. 1985. Vol. 54, № 1. P. 367-402.

62. Guga P., Stec W.J. Synthesis of Phosphorothioate Oligonucleotides with Stereodefined Phosphorothioate Linkages // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2003. Vol. 14, № 1. P. 4.17.1-4.17.28.

63. Knouse K.W. et al. Unlocking P(V): Reagents for chiral phosphorothioate synthesis // Science. 2018. Vol. 361, № 6408. P. 1234-1238.

64. Letsinger R.L., Mungall W.S. Phosphoramidate analogs of oligonucleotides. // J Org Chem. 1970. Vol. 35, № 11. P. 3800-3803.

65. Peyrottes S. Oligodeoxynucleoside phosphoramidates (P-NH2): synthesis and thermal stability of duplexes with DNA and RNA targets // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24, № 10. P. 1841-1848.

66. Endo M., Komiyama M. Novel Phosphoramidite Monomer for the Site-Selective Incorporation of a Diastereochemically Pure Phosphoramidate to Oligonucleotide // J Org Chem. 1996. Vol. 61, № 6. P. 1994-2000.

67. Gryaznov S., Chen J.-K. Oligodeoxyribonucleotide N3'.fwdarw.P5' Phosphoramidates: synthesis and Hybridization Properties // J Am Chem Soc. 1994. Vol. 116, № 7. P. 3143-3144.

68. Gryaznov S.M. et al. Oligonucleotide N3'-->P5' phosphoramidates. // P Natl Acad Sci Usa. 1995. Vol. 92, № 13. P. 5798-5802.

69. Chen J.K. et al. Synthesis of oligodeoxyribonucleotide N3'-->P5' phosphoramidates. // Nucleic Acids Res. 1995. Vol. 23, № 14. P. 2661-2668.

70. Zhou-Sun B. et al. A physico-chemical study of triple helix formation by an oligodeoxythymidylate with N3'^P5' phosphoramidate linkages // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25, № 9. P. 1782-1787.

71. Heidenreich O., Gryaznov S., Nerenberg M. RNase H-independent antisense activity of oligonucleotide N3WP5' phosphoramidates // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25, № 4. P. 776-780.

72. Gryaznov S. et al. Oligonucleotide N3'-->P5' phosphoramidates as antisense agents. // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24, № 8. P. 1508-1514.

73. Skorski T. et al. Antileukemia effect of c-myc N3'^P5' phosphoramidate antisense oligonucleotides in vivo // Proc National Acad Sci. 1997. Vol. 94, № 8. P. 3966-3971.

74. Rigl C.T. et al. Structural RNA mimetics: N3'-->P5' phosphoramidate DNA analogs of HIV-1 RRE and TAR RNA form A-type helices that bind specifically to Rev and Tat-related peptides. // Biochemistry-us. 1997. Vol. 36, № 3. P. 650-659.

75. Testa S.M., Gryaznov S.M., Turner D.H. In vitro suicide inhibition of self-splicing of a group I intron from Pneumocystis carinii by an N3' ^ P5' phosphoramidate hexanucleotide // Proc National Acad Sci. 1999. Vol. 96, № 6. P. 2734-2739.

76. Gat Y., Lynn D.G. Reading DNA differently // Biopolymers. 1998. Vol. 48, № 1. P. 19-28.

77. Syed Y.Y. Eteplirsen: First Global Approval. // Drugs. 2016. Vol. 76, № 17. P. 1699-1704.

78. Karkare S., Bhatnagar D. Promising nucleic acid analogs and mimics: characteristic features and applications of PNA, LNA, and morpholino // Appl Microbiol Biot. 2006. Vol. 71, № 5. P. 575-586.

79. Verma S., Eckstein F. MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES: Synthesis and Strategy for Users // Annu Rev Biochem. 1998. Vol. 67, № 1. P. 99-134.

80. Liu H. et al. A Four-Base Paired Genetic Helix with Expanded Size // Science. 2003. Vol. 302, № 5646. P. 868-871.

81. Gaither A., Iourgenko V. RNA interference technologies and their use in cancer research // Curr Opin Oncol. 2007. Vol. 19, № 1. P. 50-54.

82. Cobb A.J.A. Recent highlights in modified oligonucleotide chemistry // Org Biomol Chem. 2007. Vol. 5, № 20. P. 3260-3275.

83. Rychahou P.G. et al. RNA interference: Mechanisms of action and therapeutic consideration // Surgery. 2006. Vol. 140, № 5. P. 719-725.

84. Dias N., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol Cancer Ther. 2002. Vol. 1, № 5. P. 347-355.

85. Dove A. Cell-based therapies go live // Nat Biotechnol. 2002. Vol. 20, № 4. P. 339-343.

86. Heuberger B.D., Switzer C. An Alternative Nucleobase Code: Characterization of Purine-Purine DNA Double Helices Bearing Guanine-Isoguanine and Diaminopurine 7-Deaza-Xanthine Base Pairs // Chembiochem. 2008. Vol. 9, № 17. P. 2779-2783.

87. Newman P.C. et al. Incorporation of a complete set of deoxyadenosine and thymidine analogs suitable for the study of protein nucleic acid interactions into oligodeoxynucleotides. Application to the EcoRV restriction endonuclease and modification methylase // Biochemistry-us. 1990. Vol. 29, № 42. P. 98919901.

88. Cal S., Connolly B.A. DNA Distortion and Base Flipping by the EcoRV DNA Methyltransferase A STUDY USING INTERFERENCE AT dA

AND T BASES AND MODIFIED DEOXYNUCLEOSIDES // J Biol Chem. 1997. Vol. 272, № 1. P. 490-496.

89. Liu Q. et al. Branch-site selection in a group II intron mediated by active recognition of the adenine amino group and steric exclusion of non-adenine functionalities. // J Mol Biol. 1997. Vol. 267, № 1. P. 163-171.

90. Schweitzer B.A., Kool E.T. Aromatic Nonpolar Nucleosides as Hydrophobic Isosteres of Pyrimidine and Purine Nucleosides. // J Org Chem. 1994. Vol. 59, № 24. P. 7238-7242.

91. Guckian K.M. et al. Factors Contributing to Aromatic Stacking in Water: Evaluation in the Context of DNA. // J Am Chem Soc. 2000. Vol. 122, № 10. P. 2213-2222.

92. Doi Y. et al. Artificial DNA made exclusively of nonnatural C-nucleosides with four types of nonnatural bases. // J Am Chem Soc. 2008. Vol. 130, № 27. P. 8762-8768.

93. Wagner R. et al. Antisense gene inhibition by oligonucleotides containing C-5 propyne pyrimidines // Science. 1993. Vol. 260, № 5113. P. 1510-1513.

94. Flanagan W.M., Kothavale A., Wagner R.W. Effects of Oligonucleotide Length, Mismatches and mRNA Levels on C-5 Propyne-Modified Antisense Potency // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24, № 15. P. 29362941.

95. Wagner R.W. et al. Potent and selective inhibition of gene expression by an antisense heptanucleotide // Nat Biotechnol. 1996. Vol. 14, № 7. P. 840844.

96. Liu H. et al. Toward a new genetic system with expanded dimensions: size-expanded analogues of deoxyadenosine and thymidine. // J Am Chem Soc. 2004. Vol. 126, № 4. P. 1102-1109.

97. Lee A.H.F., Kool E.T. A new four-base genetic helix, yDNA, composed of widened benzopyrimidine-purine pairs. // J Am Chem Soc. 2005. Vol. 127, № 10. P. 3332-3338.

98. Lee A.H.F., Kool E.T. Exploring the limits of DNA size: naphtho-homologated DNA bases and pairs. // J Am Chem Soc. 2006. Vol. 128, № 28. P. 9219-9230.

99. Xu W., Chan K.M., Kool E.T. Fluorescent nucleobases as tools for studying DNA and RNA // Nat Chem. 2017. Vol. 9, № 11. P. 1043-1055.

100. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. // European J Biochem Febs. 2003. Vol. 270, № 8. P. 1628-1644.

101. Manoharan M. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs // Curr Opin Chem Biol. 2004. Vol. 8, № 6. P. 570-579.

102. Gaglione M., Messere A. Recent progress in chemically modified siRNAs. // Mini Rev Medicinal Chem. 2010. Vol. 10, № 7. P. 578-595.

103. Caillaud M., Madani M.E., Massaad-Massade L. Small interfering RNA from the lab discovery to patients' recovery // J Control Release. 2020. Vol. 321. P. 616-628.

104. Hertoghs K.M.L., Ellis J.H., Catchpole I.R. Use of locked nucleic acid oligonucleotides to add functionality to plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31, № 20. P. 5817-5830.

105. H0jland T. et al. LNA ( locked nucleic acid ) and analogs as triplex -forming oligonucleotides // Org Biomol Chem. 2007. Vol. 5, № 15. P. 23752379.

106. Lee J.A. et al. Synthesis of novel apio carbocyclic nucleoside analogues as selective a(3) adenosine receptor agonists. // J Org Chem. 2005. Vol. 70, № 13. P. 5006-5013.

107. Venkatesan N., Kim S., Kim B. Novel Phosphoramidite Building Blocks in Synthesis and Applications Toward Modified Oligonucleotides // Curr Med Chem. 2003. Vol. 10, № 19. P. 1973-1991.

108. Inoue H. et al. Synthesis and hybridization studies on two complementary nona(2'-O-methyl)ribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15, № 15. P. 6131-6148.

109. Haner R., Keller T.H. Synthesis and hybridization properties of oligonucleotides containing 2' -O-modified ribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21, № 19. P. 4499-4505.

110. Keller T.H., Häner R. A General Method for the Synthesis of 2'-O-Modified Ribonucleosides // Helv Chim Acta. 2013. Vol. 76, № 2. P. 884-892.

111. White A.W. et al. Resistance-modifying agents. 9. Synthesis and biological properties of benzimidazole inhibitors of the DNA repair enzyme poly(ADP-ribose) polymerase. // J Med Chem. 2000. Vol. 43, № 22. P. 40844097.

112. Griffey R.H. et al. 2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides. // J Med Chem. 1996. Vol. 39, № 26. P. 5100-5109.

113. Li M. et al. Synthesis and cellular activity of stereochemically-pure 2'-O-(2-methoxyethyl)-phosphorothioate oligonucleotides // Chem Commun. 2017. Vol. 53, № 3. P. 541-544.

114. Gr0tli M. et al. 2'-O-Propargyl oligoribonucleotides: Synthesis and hybridisation // Tetrahedron. 1998. Vol. 54, № 22. P. 5899-5914.

115. Prakash T.P. et al. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. // J Med Chem. 2005. Vol. 48, № 13. P. 4247-4253.

116. Deleavey G.F., Watts J.K., Damha M.J. Chemical Modification of siRNA // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2009. Vol. 39, №№ 1. P. 16.3.1-16.3.22.

117. Davis S. et al. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34, № 8. P. 2294-2304.

118. Thomas G.S. et al. Mipomersen, an Apolipoprotein B Synthesis Inhibitor, Reduces Atherogenic Lipoproteins in Patients With Severe Hypercholesterolemia at High Cardiovascular Risk A Randomized, DoubleBlind, Placebo-Controlled Trial // J Am Coll Cardiol. 2013. Vol. 62, № 23. P. 2178-2184.

119. Li N. et al. Mipomersen is a Promising Therapy in the Management of Hypercholesterolemia: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials // Am J Cardiovasc Drug. 2014. Vol. 14, № 5. P. 367-376.

120. Bennett C.F., Krainer A.R., Cleveland D.W. Antisense Oligonucleotide Therapies for Neurodegenerative Diseases // Annu Rev Neurosci. 2019. Vol. 42, № 1. P. 385-406.

121. Manoharan M. et al. Unique Gene-Silencing and Structural Properties of 2'-Fluoro-Modified siRNAs // Angewandte Chemie Int Ed. 2011. Vol. 50, № 10. P. 2284-2288.

122. Cuellar T.L. et al. Systematic evaluation of antibody-mediated siRNA delivery using an industrial platform of THIOMAB-siRNA conjugates // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 2. P. 1189-1203.

123. Deleavey G.F. et al. Synergistic effects between analogs of DNA and RNA improve the potency of siRNA-mediated gene silencing // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 13. P. 4547-4557.

124. Singh S.K. et al. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition // Chem Commun. 1998. Vol. 0, № 4. P. 455456.

125. Obika S. et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering // Tetrahedron Lett. 1997. Vol. 38, № 50. P. 8735-8738.

126. Kauppinen S., Vester B., Wengel J. Locked nucleic acid: high-affinity targeting of complementary RNA for RNomics. // Handb Exp Pharmacol. 2006. № 173. P. 405-422.

127. Lennox K.A., Behlke M.A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides // Gene Ther. 2011. Vol. 18, № 12. P. 1111-1120.

128. Braasch D.A., Corey D.R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA // Chem Biol. 2001. Vol. 8, № 1. P. 1-7.

129. Straarup E.M. et al. Short locked nucleic acid antisense oligonucleotides potently reduce apolipoprotein B mRNA and serum cholesterol

in mice and non-human primates // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 20. P. 7100-7111.

130. Jepsen J.S., Srensen M.D., Wengel J. Locked Nucleic Acid: A Potent Nucleic Acid Analog in Therapeutics and Biotechnology // Oligonucleotides. 2004. Vol. 14, № 2. P. 130-146.

131. Lindow M., Kauppinen S. Discovering the first microRNA-targeted drug // J Cell Biology. 2012. Vol. 199, № 3. P. 407-412.

132. Obad S. et al. Silencing of microRNA families by seed-targeting tiny LNAs. // Nat Genet. 2011. Vol. 43, № 4. P. 371-378.

133. Murphy B.L. et al. Silencing of the miR-17~92 Cluster Family Inhibits Medulloblastoma Progression // Cancer Res. 2013. Vol. 73, № 23. P. 7068-7078.

134. Kumar R. et al. The first analogues of LNA (locked nucleic acids): phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA. // Bioorg Med Chem Lett. 1998. Vol. 8, № 16. P. 2219-2222.

135. Rahman S.M.A. et al. Design, Synthesis, and Properties of 2',4'-BNANC: A Bridged Nucleic Acid Analogue // J Am Chem Soc. 2008. Vol. 130, № 14. P. 4886-4896.

136. Babu B.R. et al. Optimized DNA targeting using N,N-bis(2-pyridylmethyl)-beta-alanyl 2'-amino-LNA. // Chem Commun Camb Engl. 2005. № 13. P. 1705-1707.

137. Morita K. et al. 2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA): highly nuclease-resistant and thermodynamically stable oligonucleotides for antisense drug // Bioorg Med Chem Lett. 2002. Vol. 12, № 1. P. 73-76.

138. Morita K. et al. Synthesis and properties of 2'-O,4'-C-Ethylene-Bridged nucleic acids (ENA) as effective antisense oligonucleotides // Bioorgan Med Chem. 2003. Vol. 11, № 10. P. 2211-2226.

139. Morita K., Koizumi M. Synthesis of ENA Nucleotides and ENA Oligonucleotides // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2018. Vol. 72, № 1. P. 4.79.1-4.79.21.

140. Surono A. et al. Chimeric RNA/Ethylene-Bridged Nucleic Acids Promote Dystrophin Expression in Myocytes of Duchenne Muscular Dystrophy by Inducing Skipping of the Nonsense Mutation-Encoding Exon // Hum Gene Ther. 2004. Vol. 15, № 8. P. 749-757.

141. Yagi M. et al. Chimeric RNA and 2-O, 4-C-Ethylene-Bridged Nucleic Acids Have Stronger Activity Than Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides in Induction of Exon 19 Skipping in Dystrophin mRNA // Oligonucleotides. 2004. Vol. 14, № 1. P. 33-40.

142. Macaulay I.C., Voet T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives // Plos Genet. 2014. Vol. 10, № 1. P. e1004126.

143. Sandberg R. Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine // Nat Methods. 2014. Vol. 11, № 1. P. 22-24.

144. Swain P.S., Elowitz M.B., Siggia E.D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression // Proc National Acad Sci. 2002. Vol. 99, № 20. P. 12795-12800.

145. Lenive O., Kirk P.D.W., Stumpf M.P.H. Inferring extrinsic noise from single-cell gene expression data using approximate Bayesian computation // Bmc Syst Biol. 2016. Vol. 10, № 1. P. 81.

146. Raj A. et al. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells // Plos Biol. 2006. Vol. 4, № 10. P. e309.

147. Saiki R.K. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Sci New York N Y. 1985. Vol. 230, № 4732. P. 1350-1354.

148. Schena M. et al. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray // Science. 1995. Vol. 270, № 5235. P. 467-470.

149. Brenner S. et al. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays // Nat Biotechnol. 2000. Vol. 18, № 6. P. 630-634.

150. Kanter I., Kalisky T. Single Cell Transcriptomics: Methods and Applications // Frontiers Oncol. 2015. Vol. 5. P. 53.

151. Fuchs O. Single-Cell Omics. 2019. P. 231-251.

152. Kalisky T., Blainey P., Quake S.R. Genomic Analysis at the Single-Cell Level // Annu Rev Genet. 2011. Vol. 45, № 1. P. 431-445.

153. Ramsköld D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nat Biotechnol. 2012. Vol. 30, № 8. P. 777-782.

154. Dalerba P. et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells // Proc National Acad Sci. 2007. Vol. 104, № 24. P. 1015810163.

155. Shapiro E., Biezuner T., Linnarsson S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science // Nat Rev Genet. 2013. Vol. 14, № 9. P. 618-630.

156. Mardis E.R. Next-Generation Sequencing Platforms // Annu Rev Anal Chem. 2013. Vol. 6, № 1. P. 287-303.

157. Mardis E.R. DNA sequencing technologies: 2006-2016. // Nat Protoc. 2017. Vol. 12, № 2. P. 213-218.

158. Liu L. et al. Comparison of Next-Generation Sequencing Systems // J Biomed Biotechnol. 2012. Vol. 2012. P. 251364.

159. Shen Y. et al. Comparing Platforms for C. elegans Mutant Identification Using High-Throughput Whole-Genome Sequencing // Plos One. 2008. Vol. 3, № 12. P. e4012.

160. Harismendy O. et al. Evaluation of next generation sequencing platforms for population targeted sequencing studies // Genome Biol. 2009. Vol. 10, № 3. P. R32.

161. Metzker M.L. Sequencing technologies — the next generation // Nat Rev Genet. 2010. Vol. 11, № 1. P. 31-46.

162. Ju J. et al. Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators // Proc National Acad Sci. 2006. Vol. 103, № 52. P. 19635-19640.

163. Bentley D.R. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry // Nature. 2008. Vol. 456, № 7218. P. 53-59.

164. Goodwin S., McPherson J.D., McCombie W.R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies // Nat Rev Genet. 2016. Vol. 17, № 6. P. 333-351.

165. Margulies M. et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors // Nature. 2005. Vol. 437, № 7057. P. 376-380.

166. Rothberg J.M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing // Nature. 2011. Vol. 475, № 7356. P. 348-352.

167. Forgetta V. et al. Sequencing of the Dutch elm disease fungus genome using the Roche/454 GS-FLX Titanium System in a comparison of multiple genomics core facilities. // J Biomol Techniques Jbt. 2013. Vol. 24, № 1. P. 39-49.

168. Loman N.J. et al. Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms // Nat Biotechnol. 2012. Vol. 30, № 5. P. 434439.

169. Eid J. et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules // Science. 2009. Vol. 323, № 5910. P. 133-138.

170. English A.C. et al. Assessing structural variation in a personal genome—towards a human reference diploid genome // Bmc Genomics. 2015. Vol. 16, № 1. P. 286.

171. Carneiro M.O. et al. Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data // Bmc Genomics. 2012. Vol. 13, № 1. P. 375.

172. Goodwin S., McCombie W.R. Sequencing Complex Genomes with PromethlON Technology in a Core Setting. // J Biomol Techniques Jbt. 2019. Vol. 30, № Suppl. P. S36-S37.

173. Johnson L.K. et al. Draft genome assemblies using sequencing reads from Oxford Nanopore Technology and Illumina platforms for four species of North American Fundulus killifish. // Gigascience. 2020. Vol. 9, № 6.

174. Jeon S.A. et al. Comparison of the MGISEQ-2000 and Illumina HiSeq 4000 sequencing platforms for RNA sequencing. // Genom Informatics. 2019. Vol. 17, № 3. P. e32.

175. Sun Y. et al. Panel-based NGS reveals disease-causing mutations in hearing loss patients using BGISEQ-500 platform. // Medicine. 2019. Vol. 98, № 12. P. e14860.

176. Xu Y. et al. A new massively parallel nanoball sequencing platform for whole exome research // Bmc Bioinformatics. 2019. Vol. 20, № 1. P. 153.

177. Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics // Nat Rev Genet. 2009. Vol. 10, № 1. P. 57-63.

178. Tang F. et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell // Nat Protoc. 2010. Vol. 5, № 3. P. 516-535.

179. Soon W.W., Hariharan M., Snyder M.P. High-throughput sequencing for biology and medicine // Mol Syst Biol. 2013. Vol. 9, № 1. P. 640.

180. Eldar A., Elowitz M.B. Functional roles for noise in genetic circuits // Nature. 2010. Vol. 467, № 7312. P. 167-173.

181. Frank N.Y., Schatton T., Frank M.H. The therapeutic promise of the cancer stem cell concept // J Clin Invest. 2010. Vol. 120, № 1. P. 41-50.

182. Frumkin D. et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. // Bmc Biotechnol. 2008. Vol. 8, № 1. P. 17.

183. Tang F. et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell // Nat Methods. 2009. Vol. 6, № 5. P. 377-382.

184. Kolodziejczyk A.A. et al. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing // Mol Cell. 2015. Vol. 58, № 4. P. 610-620.

185. Picelli S. et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2 // Nat Protoc. 2014. Vol. 9, № 1. P. 171-181.

186. Islam S. et al. Highly multiplexed and strand-specific single-cell RNA 5' end sequencing // Nat Protoc. 2012. Vol. 7, № 5. P. 813-828.

187. Zilionis R. et al. Single-cell barcoding and sequencing using droplet microfluidics // Nat Protoc. 2017. Vol. 12, № 1. P. 44-73.

188. Hashimshony T. et al. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification // Cell Reports. 2012. Vol. 2, № 3. P. 666673.

189. Eberwine J. et al. Analysis of gene expression in single live neurons // Proc National Acad Sci. 1992. Vol. 89, № 7. P. 3010-3014.

190. Shumyatsky G.P. et al. Identification of a Signaling Network in Lateral Nucleus of Amygdala Important for Inhibiting Memory Specifically Related to Learned Fear // Cell. 2002. Vol. 111, № 6. P. 905-918.

191. Tang F., Lao K., Surani M.A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis // Nat Methods. 2011. Vol. 8, № Suppl 4. P. S6-S11.

192. Smith Z.D. et al. Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event // Nat Biotechnol. 2010. Vol. 28, № 5. P. 521-526.

193. Shalek A.K. et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation // Nature. 2014. Vol. 510, № 7505. P. 363-369.

194. Stubbington M.J.T. et al. Single-cell transcriptomics to explore the immune system in health and disease // Science. 2017. Vol. 358, № 6359. P. 5863.

195. Poulin J.-F. et al. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics // Nat Neurosci. 2016. Vol. 19, № 9. P. 1131-1141.

196. S0rlie T. et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications // Proc National Acad Sci. 2001. Vol. 98, № 19. P. 10869-10874.

197. Tirosh I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq // Science. 2016. Vol. 352, № 6282. P. 189196.

198. Zheng C. et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing // Cell. 2017. Vol. 169, № 7. P. 1342-1356.e16.

199. Han Q. et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines // Proc National Acad Sci. 2012. Vol. 109, № 5. P. 1607-1612.

200. Kavaler J., Davis M.M., Chien Y. Localization of a T-cell receptor diversity-region element // Nature. 1984. Vol. 310, № 5976. P. 421-423.

201. WEIGERT M.G. et al. Variability in the Lambda Light Chain Sequences of Mouse Antibody // Nature. 1970. Vol. 228, №№ 5276. P. 1045-1047.

202. Williams R. et al. Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR // Nat Methods. 2006. Vol. 3, № 7. P. 545-550.

203. Mikkelsen R.J.T. et al. Photolabile Linkers for Solid-Phase Synthesis. // Acs Comb Sci. 2018. Vol. 20, № 7. P. 377-399.

204. Scott P.J.H. Linker Strategies in Solid-Phase Organic Synthesis. 2009. P. 343-389.

205. Guillier F., Orain D., Bradley M. Linkers and Cleavage Strategies in Solid-Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry. (Chem. Rev. 2000, 100, 2091. Published on the Web May 6, 2000). // Chem Rev. 2000. Vol. 100, № 10. P. 3859-3859.

206. Amit B., Zehavi U., Patchornik A. Photosensitive Protecting Groups — A Review // Israel J Chem. 1974. Vol. 12, № 1-2. P. 103-113.

207. Bamford C.H., Norrish R.G.W. 359. Primary photochemical reactions. Part VII. Photochemical decomposition of iso valeraldehyde and di- n -propyl ketone // J Chem Soc Resumed. 1935. Vol. 0, № 0. P. 1504-1511.

208. Rich D.H., Gurwara S.K. Removal of protected peptides from an ortho -nitrobenzyl resin by photolysis // J Chem Soc Chem Commun. 1973. Vol. 0, № 17. P. 610-611.

209. Greenberg M.M. Photochemical cleavage of oligonucleotides from solid phase supports // Tetrahedron Lett. 1993. Vol. 34, № 2. P. 251-254.

210. Matray T.J., Greenberg M.M. Site-Specific Incorporation of the Alkaline Labile, Oxidative Stress Product (5R)-5,6-Dihydro-5-hydroxythymidine in an Oligonucleotide // J Am Chem Soc. 1994. Vol. 116, № 15. P. 6931-6932.

211. Greenberg M.M., Gilmore J.L. Cleavage of Oligonucleotides from Solid-Phase Supports Using o-Nitrobenzyl Photochemistry // J Org Chem. 1994. Vol. 59, № 4. P. 746-753.

212. Huang F., Shi Y. Synthesis of photolabile transcription initiators and preparation of photocleavable functional RNA by transcription // Bioorg Med Chem Lett. 2012. Vol. 22, № 13. P. 4254-4258.

213. Yu H. et al. Chemistry and biological applications of photo-labile organic molecules // Chem Soc Rev. 2009. Vol. 39, № 2. P. 464-473.

214. Leriche G., Chisholm L., Wagner A. Cleavable linkers in chemical biology // Bioorgan Med Chem. 2012. Vol. 20, № 2. P. 571-582.

215. Wegner S.V., Sentürk O.I., Spatz J.P. Photocleavable linker for the patterning of bioactive molecules // Sci Rep-uk. 2015. Vol. 5, № 1. P. 18309.

216. Ozsolak F. et al. Direct RNA sequencing // Nature. 2009. Vol. 461, № 7265. P. 814-818.

Благодарности

Автор выражает благодарность руководству ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России в лице директора, д.м.н., профессора, чл.-корр. РАН Хаитова Мусы Рахимовича, а также сотрудникам лаборатории молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, лаборатории адаптивного иммунитета ИБХ РАН и сотрудникам компании «ДНК-Технология» за поддержку и помощь в написании работы.