Молекулярно-цитогенетическое исследование уровня анеуплоидии в интерфазных ядрах клеток человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Тимошевский, Владимир Анатольевич

• Тимошевский, Владимир Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимошевский, Владимир Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МЕХАНИЗМЫ И КЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА ПРАВИЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМ В ПРОЦЕССЕ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ.

1.1.1. Сборка веретена деления.

1.1.2. Переход в анафазу, разделение сестринских хроматид и телофаза.

1.1.3. Регуляция клеточного деления.

1.2. АНЕУПЛОИДИЯ И РАК.

1.2.1. Вклад анеуплоидии в этиологию рака.

1.2.2. Анеуплоидия как возможная причина генетической нестабильности.

1.3. АНЕУПЛОИДИЯ КАК РЕЗУЛЬТАТ

МУТАГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ.

1.4. ВОЗМОЖНОСТИ ИНТЕРФАЗНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНЕУПЛОИДИИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ МАТЕРИАЛА.

2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

2.3. ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕНТРОМЕРОСПЕЦИФИЧНЫХ ДНК-ЗОНДОВ.

2.3.1. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.2. Меченые плазмидной ДНК методом ник-трансляции.

2.4. ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ Ш 5771/ НА ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДРАХ.

2.5. МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ЧАСТОТА СПОНТАННОЙ АНЕУПЛОИДИИ ПО Х-ХРОМОСОМЕ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА РАЗНОГО ТКАНЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

3.2. ПРИМЕНЕНИЕ ОДНОЦВЕТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU ДЛЯ АНАЛИЗА АНЕУПЛОИДИИ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ С ЧИСЛОВЫМИ НАРУШЕНИЯМИ ХРОМОСОМ.

3.3. ПРИМЕНЕНИЕ ДВУХЦВЕТНОЙ FISH ДЛЯ ОЦЕНКИ АНЕУПЛОИДИИ В КЛЕТКАХ ЛИЦ, НЕ ИМЕВШИХ КОНТАКТА С ВРЕДНЫМИ ВНЕШНЕСРЕДОВЫМИ АГЕНТАМИ.

3.4. ЧАСТОТА АНЕУПЛОИДИИ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЛИЦ, ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ ВРЕДНЫХ ВНЕШНЕСРЕДОВЫХ ФАКТОРОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-цитогенетическое исследование уровня анеуплоидии в интерфазных ядрах клеток человека»

Анеуплоидия играет существенную роль в патологии человека, включая врожденные пороки развития, спонтанное прерывание беременности и рак. В основе ее возникновения лежит нарушение процесса расхождения хромосом в процессе мейотического или митотического деления клеток. Существенная доля числовых нарушений хромосом возникает в результате воздействия мутагенных агентов внешней среды, преимущественно химической и физической природы, хотя и не исключено, что анеуплоидия может возникать и в результате эндогенных механизмов, связанных с повреждением аппарата, контролирующего расхождение хромосом во время клеточного деления. Однако до настоящего времени, в отличие от оценки структурных повреждений хромосом, не существует четкой общепринятой тест-системы детекции числовых хромосомных нарушений.

Разработка такой системы актуальна с различных точек зрения. Во-первых, она необходима для правильной оценки хромосомного мозаицизма в практике медико-генетического консультирования. При клинико-цитогенетическом исследовании больных диагностика мозаичных форм числовых хромосомных нарушений, в отличие от анеуплоидий гаметического происхождения, представляет определенные трудности. В некоторых случаях при стандартном цитогенетическом анализе не удается избежать ложнопозитивной диагностики анеуплоидии, связанной с потерей хромосом при приготовлении препаратов. С другой стороны, особенно при наличии малого клона клеток с иной хромосомной конституцией, можно пропустить наличие реально существующего мозаицизма, т.е. получить ложнонегативный диагноз анеуплоидии. По этой причине на стандартный анализ метафазных хромосом накладываются статистические ограничения, в силу которых диагностика мозаицизма, как правило, ограничена случаями, когда частота одного из клонов составляет не менее 10% [Кулешов, Симонян, 1987].

Во-вторых, ввиду отсутствия тест-системы детекции числовых хромосомных нарушений до настоящего времени остается неизученным анеугенный потенциал большого числа химических веществ и ионизирующей радиации. На сегодняшний день имеется довольно широкий ряд методов, предназначенных для оценки анеуплоидии, включающий субклеточные системы, тесты на грибах, растениях и дрозофиле, системах клеток млекопитающих in vitro и исследования in vivo соматических и половых клеток млекопитающих [Aardema et al., 1998]. Однако ни один из этих методов не является достаточно обоснованным или широко используемым в рутинном скрининге. Основным ограничением метафазного анализа является высокая вероятность артефактов, возникающих при приготовлении препаратов хромосом, следствием чего может быть завышение уровня гипоплоидии. С другой стороны, при стандартном анализе на выход числовых нарушений могут повлиять особенности селекции клеток при культивировании. Возможно, по этой причине в разных генотоксикологических тестах не проводится детекция анеугенного эффекта агентов внешней среды. Вместе с тем, разработка методов, специально предназначенных для учета геномных мутаций, крайне необходима по причине того, что многие факторы окружающей среды могут индуцировать этот класс хромосомных аномалий [Бочков, Чеботарев, 1989].

В связи с разработкой методов молекулярной цитогенетики представляется удобным использовать для оценки анеуплоидии методологию флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), заключающуюся в подсчете числа флуоресцентных сигналов в интерфазных ядрах клеток при гибридизации с хромосомоспецифическими ДНК-зондами. Такой подход соединяет в себе возможность оценки как гипердиплоидии, которая может быть оценена стандартным цитогенетическим анализом, так и гипоплоидии, детекция которой традиционно осуществляется микроядерным тестом.

Возможность анализа большой выборки клеток делает доступной детекцию малых клеточных клонов с дисбалансом числа хромосом, и это обстоятельство делает молекулярно-цитогенетический анализ интерфазных клеток также крайне полезным для детекции мозаицизма у больных и для целей пренатальной диагностики анеуплоидии у плода.

В настоящее время интерфазный Е18Н-анализ уже используется для определения числа хромосом при исследовании анеуплоидии как в половых (преимущественно в сперматозоидах), так и в соматических клетках разных тканей (преимущественно в злокачественных опухолях). Рядом авторов было показано дозо-зависимое увеличение частоты анеуплоидии при воздействии некоторых химических соединений [ЕазШюпс! е! а1., 1997; Яира й а1., 1997; 81ш1ег е1 а1., 1998; Беоапе, Ои1ои^ 2001]. Имеются также ограниченные сообщения об увеличении гипо- и гиперплоидии по некоторым хромосомам при рентгеновском и гамма-облучении культур клеток [Еаз1хпопс1 е! а1., 1995; Тош1 е1 а1., 2000]. Однако в целом, в литературе имеются довольно противоречивые данные по уровню спонтанной анеуплоидии по различным хромосомам набора, что, возможно, связано с разным типом исследуемых клеток, с разными критериями оценки результатов гибридизации ДНК-зондов с хромосомными мишенями и разными методическими подходами к проведению исследований. В связи с этим представляется важной стандартизация методов «интерфазной цитогенетики» и унификация используемых критериев оценки результатов гибридизации. Кроме того, остается не изученным вопрос о влиянии процесса культивирования клеток на выход числовых нарушений хромосом, а также практически нет данных по индукции анеуплоидии при воздействии вредных внешнесредовых факторов в системе т уШ. Поэтому разработка молекулярно-цитогенетических подходов к детекции анеуплоидии с учетом эндогенных и внешнесредовых факторов является актуальной проблемой и представляет большой практический и теоретический интерес.

Цель работы:

Выявить закономерности возникновения числовых нарушений хромосом в интерфазных ядрах клеток человека под влиянием эндогенных и экзогенных факторов и оценить разрешающие возможности интерфазного РКН-анализа в определении анеуплоидии.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень спонтанной анеуплоидии по половым хромосомам и ряду аутосом набора, а также пределы ее вариабельности в соматических клетках здоровых лиц, не имевших контактов с вредными внешнесредовыми агентами.

2. Оценить частоту анеуплоидии по половым хромосомам и ряду аутосом набора в соматических клетках индивидов, подвергающихся в процессе профессиональной деятельности комплексному воздействию вредных факторов ядерно-химического производства.

3. Изучить влияние процесса культивирования клеток на выход числовых хромосомных нарушений у лиц, имевших и не имевших контакта с вредными внешнесредовыми агентами.

4. Сравнить частоту анеуплоидии в соматических клетках лиц, подвергающихся воздействию комплекса факторов ядерно-химического производства и контрольных индивидов с целью оценки возможного анеугенного эффекта вредных внешнесредовых факторов.

5. Провести корреляционный анализ взаимосвязи между выходом структурных мутаций хромосом и частотой клеток с числовыми хромосомными нарушениями у лиц, подвергшихся профессиональному воздействию неблагоприятных внешнесредовых факторов.

6. На основании полученных результатов по особенностям индукции анеуплоидии в интерфазных ядрах дать обоснование новой тест-системы для оценки влияния мутагенных факторов среды на человека.

Научная новизна:

Впервые получены данные о разрешающих возможностях интерфазного РТБН-анализа для детекции анеуплоидии в клетках человека. Определена частота спонтанной анеуплоидии по половым хромосомам и ряду аутосом набора и пределы ее вариабельности в клетках крови здоровых лиц, не подвергавшихся воздействию внешнесредовых мутагенных агентов. Установлено, что частота спонтанной гипоплоидии близка к частоте гиперплоидии. Этот факт свидетельствует о том, что основным механизмом индукции анеуплоидии в лейкоцитах является нерасхождение хромосом, по сравнению с их отставанием в ходе клеточного деления. Показано, что у здоровых индивидов половые хромосомы X и У, в отличие от аутосом, более часто теряются в процессе культивирования клеток. Впервые с помощью молекулярно-цитогенетического анализа исследован уровень числовых хромосомных нарушений в интерфазных ядрах клеток работников крупного ядерно-химического комплекса. Установлено, что некультивированные клетки этих лиц более часто теряют У-хромосому, по сравнению с контролем, а культивированные клетки уже после первого цикла репликации ДНК обнаруживают увеличенную частоту анеуплоидии. Этот результат свидетельствует об экспрессии накопленных премутационных повреждений аппарата сегрегации хромосом, индуцированных вредными экзогенными факторами, в процессе в клеточного деления.

Практическая значимость

Предложены собственные критерии оценки сигналов гибридизации центромероспецифичных ДНК-зондов с хромосомными мишенями для анализа анеуплоидии в интерфазных клеточных ядрах. Определены частоты спонтанных числовых нарушений по хромосомам 7, 11, 12, 16, X и У, а также пределы их вариабельности в некультивированных и культивированных лейкоцитах периферической крови, которые могут быть использованы в клинической практике в качестве контрольного уровня для диагностики мозаицизма и для регистрации генетической нестабильности при гемобластозах. Впервые достоверно показано, что мутагенное воздействие вредных внешнесредовых агентов на человека может быть выявлено по повышению уровня анеуплоидных клеток в культуре через 1 цикл репликации ДНК, что принципиально важно для практического применения тестов на анеугенность. Поскольку интерфазный РГБИ-анализ оказывается достаточно чувствительным для детекции анеугенного эффекта, то полученные данные могут быть положены в основу тест-системы оценки числовых хромосомных нарушений в клетках человека при оценке экзогенных мутагенных воздействий и при эндогенных хромосомных нарушениях.

Положения, выносимые на защиту

1. В клетках периферической крови отдельные хромосомы набора, отличающиеся размером и положением центромеры, случайным образом вовлекаются в процесс спонтанного и индуцированного анеуплоидогенеза. Частота спонтанной гипоплоидии близка к частоте гиперплоидии и этот факт свидетельствует о том, что основным механизмом индукции анеуплоидии является нерасхождение хромосом, по сравнению с их отставанием в процессе клеточного деления.

2. Некультивированные лейкоциты здоровых лиц, не подвергавшихся вредным внешнесредовым воздействиям, статистически не отличаются от культивированных клеток этих же индивидов по общей частоте числовых нарушений хромосом, однако в культивируемых клетках средние значения и пределы вариабельности частоты анеуплоидии проявляют заметную тенденцию к повышению, по сравнению с некультивированными. Половые хромосомы X и У, в отличие от аутосом, более часто теряются в процессе культивирования клеток.

3. Некультивированные лейкоциты работников ядерно-химического производства более часто теряют У-хромосому, по сравнению с контролем, а культивированные клетки после первого цикла репликации ДНК

12 обнаруживают увеличенную частоту анеуплоидии, что свидетельствует об экспрессии потенциальных премутационных повреждений аппарата ахроматинового веретена, индуцированных вредными экзогенными факторами в процессе клеточного деления.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Тимошевский, Владимир Анатольевич

выводы

1. Анализ анеуплоидии в интерфазных ядрах клеток человека с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с одновременным использованием не менее двух центромероспецифичных ДНК-зондов является чувствительным методом выявления числовых хромосомных нарушений. Он позволяет выявлять более широкий спектр числовых нарушений хромосом, по сравнению с одноцветным вариантом FISH-анализа.

2. Установлена частота спонтанной анеуплоидии по половым хромосомам и ряду аутосом набора и пределы ее вариабельности у здоровых индивидов с учетом разрешающих возможностей интерфазного FISH-анализа. Величина общей анеуплоидии в пересчете на все хромосомы набора в некультивированных лейкоцитах крови индивидов в возрасте от 33 до 46 лет составляет 5,4%, а частота полиплоидии - 0,02%.

3. Отдельные хромосомы набора, отличающиеся размером и положением центромеры, не обнаруживают предпочтительного вовлечения в процессы спонтанного анеугенеза. Частота спонтанной гипоплоидии близка к частоте гиперплоидии и этот факт свидетельствует о том, что основным механизмом индукции анеуплоидии является нерасхождение хромосом, по сравнению с их отставанием в ходе клеточного деления.

4. Установлено, что в некультивированных лейкоцитах здоровых лиц, не подвергавшихся вредным внешнесредовым воздействиям, частоты спонтанной анеуплоидии по отдельным аутосомам статистически не отличаются от уровня анеуплоидии в культивированных клетках этих же индивидов. Однако в культивируемых клетках средние значения и пределы вариабельности частоты анеуплоидии аутосом проявляют заметную тенденцию к повышению, по сравнению с некультивированными клетками.

126

Половые хромосомы X и У, в отличие от аутосом, более часто теряются в процессе культивирования.

5. Некультивированные лимфоциты работников ядерно-химического производства более часто теряют У-хромосому, по сравнению с контролем. Культивированные лимфоциты этих индивидов уже после первого цикла репликации ДНК обнаруживают увеличенную частоту анеуплоидии, что свидетельствует об экспрессии потенциальных премутационных повреждений аппарата ахроматинового веретена, индуцированных вредными экзогенными факторами в процессе клеточного деления.

6. Корреляция между выходом числовых аномалий хромосом и структурными хромосомными нарушениями у одних и тех же индивидов в культивированных и некультивированных клетках не выявляется.

7. Совокупность полученных данных по особенностям индукции числовых нарушений хромосом в клетках человека и способу их оценки с помощью интерфазного Р18Н-анализа может быть использована в качестве тест-системы для выявления анеугенных факторов внешней среды на человека и диагностики мозаицизма в клинической практике.

127

БЛАГОДАРНОСТЬ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору, заведующему лабораторией цитогенетики НИИ МГ ТНЦ РАМН С.А.Назаренко как инициатору и руководителю настоящей работы. Выражаю искреннюю признательность коллегам по работе - Н.Н.Сухановой за помощь в наборе клинического материала от больных с подозрением на синдром Тернера, Н.А.Поповой за сотрудничество в наборе материала от работников СХК, Н.В.Островерховой за помощь в освоении методик молекулярно-цитогенетического анализа, а также всем сотрудникам лаборатории цитогенетики за поддержку, помощь в выполнении работы и обсуждении ее результатов. Огромная благодарность сотрудникам Генетической клиники и среднему медперсоналу за помощь в сборе материала для настоящей работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимость изучения закономерностей индукции числовых хромосомных нарушений у человека продиктована их значительным вкладом в этиологию различных патологических состояний - врожденных пороков развития, эмбриональную гибель и канцерогенез. Если вклад анеуплоидии по разным хромосомам набора в индукцию врожденных пороков развития и спонтанное прерывание беременности достаточно хорошо изучен, то вопросы по количественным закономерностям возникновения анеуплоидии в результате воздействия неблагоприятных внешнесредовых воздействий на человека и значимости анеуплоидии в опухолегенезе остаются предметом дискуссий. Кроме того, в практике медико-генетического консультирования определенные трудности представляет диагностика мозаичных форм числовых хромосомных нарушений. Это обстоятельство обусловлено методическими особенностями метафазного анализа и его статистическими ограничениями [Кулешов, Симонян, 1987]. По этим же причинам исследования генотоксикологических воздействий на человека ограничиваются анализом структурных хромосомных аберраций и не принимают во внимание их возможный эффект в отношении индукции числовых нарушений хромосом [Бочков, Чеботарев, 1989]. Однако значение анеуплоидии нельзя недооценивать, во-первых, ввиду того, что этот тип хромосомных нарушений обладает колоссальным мутагенным потенциалом и связан с развитием генетической нестабильности [Deusberg, Rasnick, 2000], а во-вторых, из-за того, что многие химические и физические внешнесредовые агенты способны индуцировать этот класс мутаций [Aardema et al., 1998]. По этой причине разработка подходов, предназначенных для детекции числовых хромосомных нарушений крайне необходима как для применения в медико-генетическом консультировании с целью выявления малых клонов клеток при мозаичных вариантах хромосомных заболеваний, так и для детекции возможного влияния вредных внешнесредовых воздействий на выход анеулоидных клеток.

В настоящей работе мы попытались оценить разрешающие возможности метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для определения анеуплоидии в интерфазных ядрах клеток человека. Сначала, с целью оценки чувствительности метода и определения контрольных значений для детекции мозаицизма по Х-хромосоме с помощью одноцветного интерфазного FISH-анализа мы оценили уровень спонтанной анеуплоидии по Х-хромосоме в соматических клетках разного тканевого происхождения у лиц, не имевших контактов с вредными внешнесредовыми воздействиями. Полученные данные показали, что анализ эпителиальных клеток ротовой полости и некультивированных лимфоцитов крови для установления мозаицизма оказывается более информативным, по сравнению с исследованием культивированных лимфоцитов, так как имеет более низкий предел вариабельности спонтанного уровня анеуплоидии. Следует отметить, что уже в первой серии экспериментов мы обратили внимание на то, что в процессе культивирования клеток в течение 72 часов (к этому моменту клетки проходят в среднем 2 цикла репликации ДНК) частота Х-анеуплоидных клеток заметно повышается. В частности, культивируемые лимфоциты женщин обнаруживают более высокую частоту гипоплоидии по Х-хромосоме, а лимфоциты мужчин - дисомию X, по сравнению с некультивированными. Высокая склонность к потере Х-хромосомы у женщин в процессе культивирования клеток, выявленная нами в системе in vitro, сильно напоминает процесс потери Х-хромосомы, выявляемый в ходе старения [Guttenbach et al., 1995]. Таким образом, наши данные свидетельствуют о параллелизме процессов естественного старения организма и репликативного старения in vitro, что косвенно подтверждает справедливость наблюдения Леонарда Хейфлика, сделанного около 40 лет тому назад [Hayflick, Moorhead, 1961]. Наши результаты согласуется с данными других авторов о преимущественном вовлечении половой хромосомы у женщин в процессы отставания и образования микроядер [ОиИепЬас11 е1 а1., 1995; БиггаНеэ е! а1., 1996].

Найденные нами пределы для детекции мозаицизма мы применили для уточняющей диагностики числовых хромосомных нарушений у 50 пациенток с подозрением на синдром Шерешевского-Тернера. Аномалии кариотипа выявлены в 38 случаях (76%). Чистая форма моносомии по Х-хромосоме была обнаружена у 17 пациенток, т.е. у 45% от числа больных с аномальным кариотипом, а аномалии мозаичного типа - у 21 больной (55%), Из 21 случая с диагностированной с помощью анализа метафазных хромосом чистой формой моносомии X интерфазный Р18Н-анализ подтвердил наличие этой формы патологии только у 15 больных, а в 6 случаях (29%) был обнаружен мозаицизм с наличием другой, преимущественно нормальной клеточной линии. В трех случаях из 19 (15%) интерфазный молекулярно-цитогенетический анализ не подтвердил наличия анеугоюидной 45,X клеточной линии, то есть позволил выявить случаи с ложнопозитивной диагностикой числовых нарушений. Результаты оценки сигналов гибридизации с Х-центромероспецифичным ДНК-зондом в интерфазных ядрах клеток разных тканей у 10 пациентов с подозрением на синдром Шерешевского-Тернера, у которых при стандартном цитогенетическом анализе был обнаружен нормальный кариотип, не имели существенных расхождений с данными метафазного анализа. У большинства пациентов (83%) с мозаичным вариантом моносомии по Х-хромосоме обнаруживаются существенные, статистически значимые межтканевые различия по содержанию разных клеточных клонов. Этот факт, а также найденные расхождения с данными метафазного цитогенетического анализа, диктуют необходимость использования интерфазного Р18Н-анализа для уточнения цитогенетического диагноза у пациентов с подозрением на синдром Шерешевского-Тернера, а также у женщин с невынашиванием беременности и/или нарушением полового развития. Наши данные подтверждают мнение о том, что отсутствие мозаицизма в лимфоцитах крови у больных с патологией развития вовсе не означает его отсутствия в других тканях [Robinson, 1994].

С целью оценки разрешающих возможностей молекулярно-цитогенетического способа детекции числовых хромосомных нарушений, индуцированных неблагоприятными внешнесредовыми агентами, мы провели сравнительный анализ распределения числа гибридизационных сигналов в интерфазных клеточных ядрах с помощью двухцветной гибридизации т situ с использованием центромероспецифичных ДНК-зондов для хромосом 7, 11, 12, 16, X и Y. Исследование включало оценку анеуплоидии в культивированных в течение 52 часов (в среднем клетки проходили 1 цикл репликации ДНК) и некультивированных лейкоцитах периферической крови у контрольных здоровых лиц и группы работников крупного ядерно-химического комплекса, подвергающихся в процессе производственной деятельности воздействию ионизирубщего облучения и химических соединений. Анализ контрольной группы лиц подтвердил данные, полученные на предыдущем этапе исследований, о тенденции повышения анеуплоидии не только по половым хромосомам, но и аутосомам, а также общего уровня анеуплоидии при культивировании клеток in vitro. Этот результат согласуется с исследованием нерасхождения хромосом в зависимости от времени культивирования, в котором проявлялась тенденция к повышению частоты этих нарушений с увеличением продолжительности инкубации клеток крови в культуре [Sgura et al., 1997]. Сравнение частот спонтанной анеуплоидии по разным хромосомам набора показало, что она является результатом случайного вовлечения тех или иных хромосом в процессы нерасхождения или хромосомного отставания, что соответствует теоретическим ожиданиям, так как этот процесс не должен зависеть от длины хромосомы, и основан на взаимодействии МТ веретена с кинетохором [Wuttke et al., 1997].

Сравнительный анализ уровня анеуплоидии в некультивируемых и культивируемых клетках работников ядерно-химического производства показал, что у индивидов, подвергающихся воздействию комплекса вредных внешнесредовых факторов, частота анеуплоидии в культивированных клетках, прошедших 1 цикл репликации ДНК, статистически достоверно возрастает в среднем на 52%, по сравнению с некультивированными. В контрольной же группе лиц соответствующее возрастание частоты анеуплоидии составило только 23%, т.е. воздействие вредных внешнесредовых факторов вызвало более чем двукратное повышение спонтанной частоты анеуплоидных клеток, по сравнению с контрольным уровнем. Сравнение частоты числовых нарушений хромосом в некультивированных лейкоцитах работников СХК с контрольной группой лиц показало наличие статистически значимых различий только в отношении потерь Х- и У-хромосом. Различия с контролем при анализе культивированных лимфоцитов были выявлены по гипо- и гиперплоидии хромосомы 12, гипоплоидии хромосомы 11 и гиперплоидии X-хромосомы. Кроме того, тенденция к увеличению (0,05<р<0,1) наблюдалась для гипоплоидии 16 и суммы частот выявленных числовых хромосомных нарушений. Различия по совокупности аномалий (некультивированные и культивированные лейкоциты) имеют сходную картину с различиями в культивированных лейкоцитах и достоверны для гипоплоидии по хромосомам 11, 12, X и гиперплоидии X. Тенденция к увеличению (0,05<р<0,1) наблюдалась для гиперплоидии 7, 12 и гипоплоидии 16. Таким образом, по культивированным лимфоцитам обнаружено больше отличий по сравнению с некультивированными. Кроме того статистически значимые различия между разными типами клеток в группе работников СХК отмечены для гипоплоидии хромосом 7 (р=0,01), 11 (р=0,01) и гиперплоидии X (р^О,00002), а также сумме всех клеток с числовыми нарушениями (р=0,01), притом, что в контрольной группе такие различия были показаны только для гипоплоидии по хромосоме У. Полученные результаты свидетельствуют о наличии анеугенного влияния факторов радиационно-химического производства на лейкоциты периферической крови работников СХК, причем большая часть данных аномалий выявляется в процессе культивировании лимфоцитов уже через 1 цикл репликации ДНК, демонстрируя экспрессию потенциальных премутационных повреждений аппарата клеточного деления in vitro. Наши данные, впервые полученные в системе in vivo, находятся в соответствии с результатами двух исследований, показавших в системе in vitro, что для проявления числовых нарушений хромосом, клеткам, несущим потенциальные повреждения, необходимо пройти, по крайней мере, один митоз [Rupa et al., 1997а; Marcon et al., 1999].

Корреляция с дозой облучения была выявлена только для гипоплоидии хромосомы 12 в культивированных лейкоцитах. Ранговый коэффициент корреляции Спирмена составил 0,61 при уровне значимости 0,005. Других закономерностей, связанных с дозой облучения, не наблюдалось, однако, имела место тенденция к зависимости от дозы внешнего облучения общей суммы всех выявленных числовых аномалий (R=0,44; р=0,09). Это показывает, что ионизирующая радиация вносит вклад в индукцию числовых нарушений in vivo, что подтверждает данные других авторов о способности ионизирующей радиации индуцировать числовые хромосомные нарушения [Ramirez et al., 1997; Touil, 2000].

Нами была прослежена статистическая связь одного вида числового дисбаланса с другим по шести парам переменных (табл. 19). По четырем из этих связанных переменных наблюдались либо достоверные различия (р<0,05), либо тенденции к различиям (0,05<р<0,1) между контрольной группой и группой, связанной профессионально с мутагенными субстанциями. Предрасположенность к образованию анеуплоидных клеток может определяться статусом генов регуляции клеточного цикла, репарации и репликации ДНК. Кроме того, уровень числовых хромосомных нарушений в клетках отдельных индивидов может зависеть от иммунологических, гормональных и других особенностей, изменение которых может быть связано, помимо всего прочего, с возрастом [Guttenbach et al., 1995; Lithmanovitch et al., 1998; Carere et al., 1998, 1999; Shi et al., 2000]. Очевидно, что для решения вопроса индивидуальной предрасположенности к процессам

124 анеугенеза требуются масштабные дополнительные исследования. Полученные нами данные хотя и позволили обнаружить некоторые тенденции, однако малый процент связанных нарушений хромосом (5%) не дает оснований говорить о статусе индивидуальной предрасположенности отдельных индивидов к процессам анеугенеза, в то же время, исключить возможность этого явления также нельзя.

Анализ корреляций между выходом числовых нарушений и структурных аберраций показал, что по большей части переменных (всего 117 пар переменных, связь наблюдалась только по 8) никаких связей не выявляется. Надо полагать, что разница в механизмах, вызывающих числовые и структурные аномалии, обусловливает преимущественное отсутствие корреляций между этими типами нарушений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тимошевский, Владимир Анатольевич, 2002 год

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярния биология клетки: в 3-х т. Т.2 - М.: Мир, 1993. -539 с.

2. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. -М.Медицина -1989.272 с.

3. Кулешов Н. П., Симонян И. В. Диагностика мозаичных форм аномалий кариотипа в клинико-цитогенетических исследованиях // Цитология и генетика -1987. -Т. 21. № 1. с. 60-63.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир -1986. -268 с.

5. Суханова Н.Н. Молекулярно-генетический анализ и фенотипическое проявление чистых и мозаичных форм синдрома Шерешевского-Тернера. Автореф. канд. биол.наук. Томск 1998. 24 с.

6. Яковлева Ю.С. Частота и спектр хромосомных нарушений у работников ядерно-химического производства и населения сопредельных территорий. Автореф. дисс. канд. бол. паук. Томск. 2000. 25 с.

7. Aardema M.J., Albertini S., Ami P., Henderson L.M., Kirsch-Volders M., Mackay J.M., Sarrif A.M., Stringer D.A., Taalman R.D.F. Aneuploidy: a report of an ECETOC task force // Mutat. Res. -1998. -V410. -P. 3-79.

8. Abad M., Ciudad J., Rincon M.R., Silva I., Paz-Bupza J.L., Lopez A. DNA aneuplody by flow cytometry is an independent prognostic factor in gastric cancer // Anal. Cell Path. -1999. -V.16. -P. 223-231.

9. Ai H., Barera J.E., Pan Z., Meyers A.D., Varella-Garcia M. Identification of individuals at high risk for head and neck carcinogenesis using chromosome aneuploidy detected by fluorescence in situ hybridization //Mut. Res. -1999.-V. 439.-P. 223-232.

10. Amon A. The spindle checkpoint // Curr. Op. in Genetics & Develipment 1999. V. 9. -P.69-75.

11. Antonacci R., Rocchi M., Archidiácono N., Baldini A. Ordered mapping of three alpha satellite DNA subsets on the human chromosome 22 // Chrom. Res.-1995,- V.3.- P.127-134.

12. Archidiácono N., Antonacci R., Marzella R., Finelli., Lonoce A., Rocchi M. Comparative mapping of human alphoid sequences in great apes, using fluorescence in situ hybridization // Genomics.- 1995,- V.25.- P.477-484.

13. Armstrong M.J., Gara J.P., Gealy R., Greenwood S.K., Hilliard C.A., Laws G.M., Galloway S.M. Induction of chromosome aberrations in vitro by phenolphthalein: mechanistic studies II Mutat. Res. -2000. -V. 457, -P. 15-30.

14. Baldini A., Archidiácono N., Carbone R., Bolino A., Shridhar V., Miller O.J., Miller D.A., Ward D.C., Rocchi M. Isolation of a human chromosome 20-specific alpha satellite DNA clone // Cytog.Cell Genet.- 1992,- V.59.- P. 12-16.

15. Baldini A., Rocchi M., Archidiácono N., Miller O.J., Miller D A. A human alpha satellite DNA subset specific for chromosome 12 // Am.J.Hum.Genet.-1990. -V.46.- P.784-788.

16. Baldini A., Smith D.I., Rocchi M., Miller O.J., Miller D.A. Cloning and analysis of lOOkb of pericentromeric repetitive (alphoid) DNA from human chromosome 3 // Am. J. Hum. Genet.- 1989,- V.45.- A. 129.

17. Belmont L.D., Mitchison T.J. Identification of a protein that interact with tubulin dimmers and increases the catactrophe rate of microtubules // Cell -1996. -V. 84.-P. 623-631.

18. Bentley K.S., Kirkland D., Murphy M., Marshall R. Evaluation of thresholds for benomyl- and carbendazim-induced aneuploidy in cultured human lymphocytes using fluorescence in situ hybridization // Mutat Res -2000. -V.464. -P. 41-51.

19. Bialy H. Aneuploidy and cancer: vintage wine in a new bottle? Nature biotechnology 1998. -V. 16. -P. 137-138.

20. Bolenti H., Karsenti E., Vernos I. XKLP2, a novel Xenopus centrosomal kinesin-like protein required for centrosome separation during mitosis //Cell -1996. -V.84. -P. 49-50.

21. Brady D.M., Hardwick K.G. Complex formation between Madlp, Bublp and Bub3p is crucial for spindle checkpoint function // Curr. Biol. -2000. -V.10. -P.675-678.

22. Brinkley B.R., Zinkowski R.P., Mollon W.L., Davis F.M., Pisegna M.A., Pershouse M., Rao P.N. Movement and segregation of kinetochores experimentally detached from mammalian chromosomes // Nature 1988. -V. 336. -P.251-254.

23. Burke D.J., Complexity in the spindle checkpoint // Curr. Op. in Genetics & Develipment 2000. V. 10. -P.26-31.

24. Cahill D.P., Lengauer C., Yu J., Riggins G.J. Willson J.K., Markovitz S.D., Kinzler K.W., Vogelstein B. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers // Nature -1998. -V. 392. -P. 300-303.

25. Cahill D.P., Lengauer C., Yu J., Riggins G.J., Willson J.K., Markowitz S.D., Kinzler K.W. Vogelstein B. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers //Nature -1998. -V. 392. -P. 300-303.

26. Carmo-Avides M., Glover D. M. Abnormal spindle protein, Asp, and the integrity of mitotic centrosomal microtubule organizing centers // Science -1999. -V. 283. -P. 1733-1735.

27. Cassimenis L.U. Regulation of microtubule dynamics // Cell Motil Cytoskeleton -1993. -V.26. -P.275-281.

28. Cavenee W.K., Scrable H.J., James C.D. Molecular genetics of human cancer predisposition and progression // Mutat. Res. -1991. -V. 247. -P. 199-202.

29. Crebelli R. Treshold-mediated mechanism in mutagenesis: implication in the classification and regulation of chemical mutagens // Mutat. Res. -2000. -V. 464. -P. 129-135.

30. Dellarco Y.L., Mavournin K.H., Tice R.R. Aneuploidy and health risk assessment: current status and future directions // Environ. Mutagen. -1985. -V.7. -P. 405-424.

31. Deusberg P., Li R., Rasnick D., Rausch C., Wilier A., Kraemer A., Yerganian G., Hehlmann R. Aneuoloidy precedes and segregates with chemical carcinogenesis // Cancer Genet. Cytogenet. -2000. -V. 119. -P. 83-93.

32. Deusberg P., Rausch C., Rasnick D., Hehlmann R. Genetic instability of cancer cells is proportional to degree of aneuploidy // Proc, Natl. Acad. Sci USA -1998. -V.95. -P. 13692-13697.

33. Doxsey S.J. The centrosome a tiny organelle with big potential // Nature Genetics -1998. -V.20. -P.104-106.

34. Duesberg P., Rasnick D. Aneuploidy, the somatic mutation that makes cancer a species of ist own // Cell Motility and Cytoskeleton -2000. -V.47. -P. 81107.

35. Eastmond D.A., Shuler M., Rupa D.S. Advantages and limitation of using fluorescence in situ hybridization for the detection of aneuploidy in interphase human cells // Mutat. Res. -1995. -V. 348. -P. 153-162.

36. Elhajouji A., Tibaldi F., Kirsch-Volders M. Indication for thresholds of chromosome non-disjunction versus chromosome lagging induced by spindle inhibitors in vitro in human lymphocytes // Mutagenesis -1997. -V.12. -P.133-140.

37. Fearon E.R., Yogelstein B., A genetic model for colorectal tumorigenesis // Cell 1990. -V. 61. -P. 759-767.

38. Finlay G.J. Genetics, molecular biology and colorectal cancer // Mutat. Res. -1993. -V. 290. -P. 3-12.

39. Gahn B., Schafer C., Neef J., Troff C., Feuring-Buske M., Hiddeman W., Wormann B. Detection of trisomy 12 and Rb-deletion in CD34+ cells of patient with B-cell chronic lymphocytic leukemia // Blood -1997. -V.89. -P.4275-4281.

40. Geisler C.H., Philip P., Hansen M.M. B-cell chronic lymphocytic leukemia: Clonal chromosome abnormalities and prognosis in 89 cases. Eur. J. Hematol -1989. -V. 43. -P.397.

41. Goldman A. S., Fomina Z., Knigts P. Analysis of the primary sex ratio, sex chromosome aneuploidy and diploidy in human sperm using dual-color fluorescence in situ hybridization//Eur. J. Hum. Genet. -1993. -V.l. -P. 325-334.

42. Goldman A. S., Fomina Z., Knigts P. et al. Analysis of the primary sex ratio, sex chromosome aneuploidy and diploidy in human sperm using dual-colour fluorescence in situ hybridisation // Eur. J. Hum. Genet. -1993. -V. 1. -P. 325-334.

43. Gorbsky G.J., Ricketts W.A. Differential expression of a phosphoepitope at the kinetochores of moving chromosomes // J. Cell. Biol. -1993. -V. 122. -P. 1311-1321.

44. Guttenbach M., Koschorz B., Bernthaler U. Grimm T., Schmid M. Sex chromosome loss and aging: in situ hybridization studies on human interphase nuclei//Am. J. Hum. Genet. -1995. -V. 57. -P.1143-1150.

45. Hayflick L., Moorhead P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell Res. -1961. -V. 25. -P. 585-621.

46. Hassold T.J., Pettay D., Robinson A., Uchida I. Molecular studies of parental origin and mosaicism in 45,X conceptuses // Hum. Genet. -1992. -V. 89. -P. 647-652.

47. Heald R., Tournebize R., Blank T., Sandaltzopoulos R., Becker P., Hyman A., Karsenti E. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts // Nature -1996. -V.382. -P.420-425.

48. Henderson L., Albertini S., Aardema M. Thresholds in genotoxicity responses //Mutat. Res. -2000. -V. 464. -P. 123-128.

49. Hinchciffe E. H., Li C., Thompson E. A., Mailer J. L., Sluder G. Requirement of Cdk2-cyclin E activity for repeated centrosome reproduction in Xenopus egg extracts. //Science -1999. -V. 283. -P. 851-854.

50. Holloway S.L., Glotzer M., King R.W., Murray A.W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of Maturation-Promoting Factor //Cell -1993. -V.73. -P. 1393-1402.

51. Hoyt M. A. Exit from mitosis: spindle pole power // Cell -2000. -V. 102. -P. 267-270.

52. Jin D.Y., Spencer F., Jeang K.T. Human T cell leukemia virus type 1 oncoprotein Tax targets the human mitotic checkpoint protein MAD1 // Cell -1998. -V. 33. -P.81-91.

53. Kalitsis P., Earle E., Fowler K.J. Bub3 gene disruption in mice reveals essential mitotic spindle checkpoint function during early embryogenesis // Genes Dev. -2000. -Y. 14. -P. 2277-2282.

54. Kaplan K.B., Burds A.A., Swedlow J.R. A role for the Adenomatous Polyposis Coli protein in chromosome segregation // Nat. Cell Biol. 2001. -V. 3. -P. 429-432.

55. Kibbelaar R., van Kampf H., Dreef E.J., Wessels J.W., Beverstock G.C., Raap A.K., Fibbe W.E. Detection trisomy 8 in hematological disorders by in situ hybridization 11 Cytogenet Cell Genet -1991. -V. 56. -P. 132-136.

56. Kibbelaar R.E., Kok F., Dreef E.J., Kleiverda J.K., Cornelisse C.J., Raap A.K. Kluin P.M. Statistical methods in interphase cytogenetics: an experimental approach. // Cytometry -1993. -V.14. -P. 716-724.

57. Knecht R. Prognostic significance of polo-like kinase (PLK) expression in squamous cell carcinomas of the head and neck // Cancer Res. -1999. -V.59. -P. 2794-2797.

58. Koufus A., Hansen M.F., Copeland N.G., Jenkins N.A., Lampkin B.C., Cavanee W.K. Loss of heterozygosity in the three embryonal tumours suggests a common pathogenetic mechanism // Nature -1985. -V. 316. -P. 330-334.

59. Kraemer S.M., Waldren C.A. Chromosomal mutations and chromosome loss measured in a new human-hamster hybrid cell line, AlC: studies with colcemid, ultraviolet irradiation, and 137Cs y-rays // Mutat. Res. -1997. -V.379. -P. 151-166.

60. Kramer E. R., Scheuringer N., Podtelejnikov A.V, Mann M., Peters J.M. Mitotic regulation of the APC activator proteins CDC20 and CDH1 // Mol. Biol. Cell -2000. -V.l 1. -P. 1555-1569.

61. Kubbies M., Shindler D., Hoehn H., Rabinovich P.S. Cell cycle kinetics by BrdU-Hoest flow cytometry: an altrenative to the differential metaphase labelling technique // Cell. Tiss. Kinet. 1985. -V. 18. -P. 551-562.

62. Lafi A., Parry E.M., Parry J.M. The effects of benzodiazapines upon the fidelity of mitotic cell deivision in cultered Chinese Hamster cells // Mutation Res. -1987.-V. 189. -P.319-332.

63. Larsson N., Marklund U., Gradin H.M., Brattsand G., Gullbcrg M. Control of microtubule dynamics by oncoprotoin 18: dissection of the regulatory role of multisite phosphorylation during mitosis // Mol. Cell Biol. -1997. -V.17. -P.5530-5539.

64. Lee W., Han K., Drut R.M., Harris C.P., Meisner L.F. Use of fluorescence in situ hybridization for retrospective detection of aneuploidy in multiple myeloma // Genes Chromosome Cancer 1993. -V. 7. -P. 137-143.

65. Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelsetein B. Genetic instability in colorectal cancers // Nature -1997. -V. 386. -P. 623-627.

66. Lindberg J.O., Stenling R.B., Rutegard J.N. DNA aneuploidy as a marker of premalignancy in surveillance of patients with ulcerative colits // Br. J. Surg.-1999. V. 86.-P. 947-950.

67. Litmanovitch T., Altaras M.M., Dotan A., Avivi L. Asynchronous replication of homologous alpha-satellite DNA loci in man is associated with nondisjunction// Cytogenet. Cell Genet. -1998. -V. 81. -P. 26-35.

68. Liu P., Zhang H., McLellan A., Vogel H., Bradley A. Embryonic lethality and tumorigenesis caused by segmental aneuploidy on mouse chromosome 11 // Genetics -1998. -V. 150. -P. 1155-1168.

69. Lomax B.L., Kalousek D.K., Kuchinka B.D., Barrett I.J., Harrison K.J., Safavi H. The utilization of interphase cytogenetic analysis for the detection of mosaicism // Hum. Genet. -1994. -V.93. -P. 243-247.

70. Lovell D.P. Dose-response and threshold-mediated mechanisms in mutagenesis: statistical models and study design // Mutat. Res. -2000. -V. 464. -P. 87-95.

71. Mark H.F. Interphase cytogenetics for studying solid tumors I I Cancer1998. -V. 83. -P.839-843.

72. Marshall R.R., Murphy M., Kirkland D.J., Bentley K.S. Fluorescence in situ hybridisation with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy//Mutat. Res. -1996. -V.372. -P. 233-245.

73. Matsumoto Y., Hayashi K., Nishida E. Cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2) is required for centrosome duplication in mammalian cells // Curr. Biol.1999. -V.9. -P.429-432.

74. Michel L.S., Liberal V., Chatterjee A. MAD2 haplo-insufficiency causes premature anaphase and chromosome instability in mammalian cells // Nature 2001. -P. 409. -P. 355-359.

75. Migliore L., Cocchi L., Scarpato R., Sbrana I. Induction of aneuploidy by the antineoplastic drug estramustine in human lymphocytes // Mutat. Res. -1998. -V. 412.-P. 33-40.

76. Moritz M., Braunfeld M.B., Sedat J.W., Alberts B., Agars D.A. Microtubule nucleation by y-tubulin-containing rings in the centrosomes //Nature -1995.-V.378.-P. 637-640.

77. Mormiter P.K., Contopoulou R., Schild D. Mitotic chromosome loss in radiation-sensitive strain of the yeast Sacchoromyces cerevisiae // Proc. Natl Acad. Sci. USA-1981. -V.78. -P. 5778-5782.

78. Muro Y., MasumotoH., Yoda K., NozakiN., Ohashi M., Okazaki T. Centromere protein B assembles human centromeric alpha-satellite DNA at the 17-bp sequence, CENP-B box//J. Cell Biol. 1992. -V.116. -P. 585-596.

79. Nicklas R.B., Ward S.C., Gorbsky G.J. Kinetochore chemistry is sensitive to tension and may link mitotic forces to a cell cycle checkpoint // J. Cell. Biol. -1995. -V.130. -P. 929-939.

80. Nigg E.A. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle HBioEssays -1995. -V.17. -P. 471-480.

81. Nigg E.A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints //Nature Reviews: Mol. Cell Biol. -2001. -V.2. -P. 21-32.

82. Oshimura M,, Barrett J.C. Chemically-induced aneuploidy in mammalian cells: mechanisms of biological significance in cancer // Environ. Mol. Mutagen. -1986. -V.8. -P. 129-159.

83. Parry J.M., Jenkins G.J, Haddad F., Bourner R., Parry E.M. In vitro and in vivo extrapolations of genotoxin exposures: consideration of factors which influence dose-response thresholds // Mutat. Res. -2000. -V.464. -P. 53-63.

84. Pichan G.A., Purohit A., Wallance J., Knecht H., Ubda B., Queensberry P., Doxsey S.J. Centrosome defect and genetic instability in malignant tumors // Cancer Res. -1998. -V.58. -P. 3974-3985.

85. Pihan G.A., Doxsey S.J. The mitotic machinery as a sours of genetic instability in cancer // Semin. Cancer Biol. -1999. -V.9. -P. 289-302.

86. Ramirez M., Surales J., Galofre P., Creus A., Marcos R. Radioactive iodine induces clastogenic and age-dependent aneugenic effects in lymphocytes of thyroid cancer patients as revealed by interphase FISH // Mutagenesis -1997. -V. 12. -P. 449-455.

87. Rieder C.L., Khodjakov A., Paliulis L.V. Mitosis in vertebrate somatic cells with two spindles: implications for the metaphase/anaphase transition checkpoint and cleavage // Proc. Natl Acad. Sci. USA -1997. -V.94. -P. 51075112.

88. Robinson W.P., Bernasconi F., Basaran S. et al. A somatic origin of homologous Robertsonian Translocations and isochromosomes // Am. J. Hum. Genet. -1994. -V. 54. -P. 290-302.

89. Rocchi M., Archidiácono N., Carbone R., Bolino A., Shridhar V., Ward D.C., Baldini A. Isolation of a human chromosome 22-specific alpha satellite clone // Cytog. Cell Genet-1991,- V.58.- P.2050-2051

90. Rocchi M., Archidiácono N., Ward D.C., Baldini A. A human chromosome 9-specific alphoid DNA repeat spatially resolvable from satellite 3 DNA by fluorescent in situ hybridization // Genomics.-1991,- V.9.- P.517-523.

91. Rocchi M., Baldini A., Archidiácono N., Lainwala S., Miller O.J., Miller D.A. Chromosome-specific subset of human alphoid DNA identified by a chromosome 2-derived clone // Genomics.- 1990,- V.8.- P.705-709.

92. Rooney D.E., Czepulkowski B.H. (eds) Human cytogenetics. A practical approach.- New York.: Oxford University Press, 1992.- V.I.- P.157-192.

93. Rupa D.S., Hasegawa L.S., Eastmond D.A. Detection of chromosomal alterations affecting the lcen-lql2 region in irradiated granulocytes and lymphocytes by multicolour FISH with tandem DNA probes // Mutagenesis -1997a. -V. 12. -P. 195-200.

94. Rupa D.S., Shuler M., Eastmond. Detection of hyperploidy and breakage affecting the lcen-lql2 region of cultured interphase human lymphocytes treated with various genotoxic agents // Envir. Mol. Mutagenesis -1997. -V. 29. -P. 161167.

95. Russel D.P., Bourner R.D., Parry E.M., Parry J.M. Chemically induced aneuploidy: investigations into chromosome specific effects in mitosis // Mutat. Res. -1998.-V.404.-P.191-197.

96. Russell P. Checkpoints on the road to mitosis // Trends Biochem. Sci -1998.-V. 23. -P.399-402.

97. Sawin K. E., Milchlson T. J. Mutations In the kinesin-like protein Eg5 disrupting localization to the mitotic spindle // Proc. Natl Acad. Sci. -1995. -V. 92-P. 4289-4293.

98. Schad C.R., Dewald G.W. Building a new clinical test for fluorescence in situ hybridization //App. Cytogen. -1995. -V.2. -P. 1-4.

99. Schiff P.B., Fant J., Horwitz S.B. Promotion of micro-tubule assembly in vitro by taxol // Nature -1979. -V. 22. -P. 665-667.

100. Schuessler H., Schilling K. Oxygen effect in the radiolysis of proteins. II. BSA. //Int. J. Radiat. Biol. -1984. -V.45. -P.267-281.

101. Sen S. Aneuploidy and cancer // Current Opinion in Oncology 2000. -V. 12. -P. 82-88.

102. Seoane A.I., Dulout F.N. Genotoxic ability of cadmium, chromium and nickel salts studied by kinetochore staining in the cytokinesis-blocked micronucleus assay // Mutat. Res. -2001. -Y. 490. -P. 99-106.

103. Shao J., Zhang L., Semenza J.C., Beach B., Smith M. Tetrasomy 8 detected by interphase cytogenetics in a child with acute lymphocytic leukemia // Cancer Genet. Cytogenet. -1996. -V. 92. -P. 135-140.

104. Shi Q., Chen J., Adler I.-D., Zhang J., Martin R., Pan S., Zhang X., Shan X. Increased nondisjunction of chromosome 21 with age in human peripheral lymphocytes // Mutat. Res. -2000. -V.452. -P. 27-37.

105. Smith P.L., Gimenez-Abian J.F., Clarke J. D. DNA-Damage-Independent Checkpoints: Yeast and Higher Eukaryotes // Cell Cycle -2002. -V. 1. -P. 17-33.

106. Sujatha T.V., Hegde M.J. C-mitotic effects of trichloroethylene (TCE) on bone marrow cells mice //Mut. Res. -1998. -V. 413. -P.151-158.

107. Surralles J., Falck G., Norppa H. In vivo cytogenetic damage revealed by FISH analysis of micronuclei in uncultured human T lymphocytes I I Cytogen. Cell. Genet. -1996. -V. 75. -P. 151-154.

108. Tabernero D., San Miguel J.F., Garcia-Sanz R., Najera L., Garcia-Isidoro M., Perez-Simon J.A., Gonzalez M., Wiegant J., Raap A.K., Orfao A. Incidence of chromosome numerical changes in multiple myeloma // Am. J. Pathol. -1996. -V. 149. -P.153-161.

109. Uhlmann F., Wernic D., Poupart M.A., Koonin E.V., Nasmyth K. Cleavage of cohcsin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast //Cell -2000. -V.103. -P.375-386.

110. Vagnarelli P., De Sario A., De Carli L. Aneuploidy induced by chloral hydrate detected in human lymphocytes with the Y97 probe // Mutagenesis -1990. -Y.5. -P. 591-592.

111. Van Bao T., Imreh E., Czeizel A.E. Cytogenetic effectsof diazepam in peripheral lymphocytes of self-poisoned per-sons // Mutation Res. -1992. -V. 298. -P. 131-137.

112. Verschaeve L., Drieson M., Kirsh-Volders M., Hens L., Susanne C. Chromosome distribution after inorganic lead exposure // Hum. Genet. -1979. -V. 49.-P. 147-158.

113. Verschaeve L., Kirsh-Volders M., Susanne C., Groetenbriel C., Haustermans R., Lecomte A., Rossels D. Genetic damage induced by occupationally low mercury exposure // Environ. Res. -1976. -V. 12. -P. 306-316.

114. Verschaeve L., Tassignon J.-P., Meferve M., De Stoop P., Susanne C. Cytogenetic investigation on leukocytesof workers exposed to metallic mercury // Environ. Mutagen. -1979a. -V. 1. -P. 259-268.

115. Visscher D., Wallis T., Awussah S., Mohamed A., Crissman J. Evaluation of MYC and chromosome 8 copy number in breast carcinoma by interphase cytogenetics. Genes Chromosome Cancer-1997. -V. 18. -P. 1-7.

116. Visscher D., Wallis T., Crissman J. Evaluation of chromosome aneuploidy in tissue sections of preinvasive breast carcinomas using interphase cytogenetics // Cancer-1996. ~W.11. -P. 316-320.

117. Waizenegger I.C., Hauf S., Meinke A., Peters J.M. Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophase and from centromeres in anaphase//Cell -2000. -V. 103. -P.399-410.

118. Walczak C.E., Mitchison T.J., Desai A. XKCM1: Xenopus kinesin-related protein that regulated microtubule dynamics during mitotic spindle assembly // Cell -1996. -V. 84. -P. 37-47.

119. Wang MR., Perrisel B., Tailandier J., Malet P. Interfase cytogenetic studies of bladder cancer // Bull Cancer. -1994. -V. 81. -P. 1060-1066.

120. Waters J.C., Chen R.H., Murray A.W. Mad2 binding by phosphorylated kinetochores links error detection and checkpoint action in mitosis // Curr. Biol. -1999.-V.9.-P. 649-652.

121. Waters J.C., Salmon E.D. Pathways of spindle assembly // Current Opinion in Cell Biology -1997. -V.9. -P. 37-43.

122. Whysner J., Verna L., English J.C., Williams G.M. Analysis of studies related to tumorigenicity induced by hydroquinone // Reg. Tox. Pharm. -1995. -V. 21.-P. 158-176.

123. Wilson L., Morse A.N. Characterization of acetyl-3H-labeled vinblastine binding to vinblastine-tubulin crystals // J. Mol. Biol. 1978. -V. 121. -P. 255268.

124. Wuttke K., Streffer C., Muller W.U. Detection of chromosome 2 and chromosome 7 within X-ray- or colchicine-induced micronuclei by fluorescence in situ hybridization // Mutagenesis -1997. -V. 12. -P.55-59.

125. Xi L., Zhang L., Wang Y. Smith MT Induction of chromosome-specific aneuploidy and micronuclei in human lymphocytes by metabolites of 1,3-butadiene // Carcinogenesis -1997. -V.18. -P. 1687-1693.

126. Xu X., Weaver Z., Linke S.P., Li C., Gotay J., Wang X.W. Centrosome amplification and a defective G2-M cell cycle chechpoint induce genetic instability in BRCA1 exon 11 isoform deficient cells // Mol. Cell -1999. -V.3. -P. 389-395.

127. Zhang D., Nicklas R.B., Chromosome initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes // J. Cell Biol. -1995. -V.131. -P. 1125-1131.

128. Zhang L., Rothman N. Wang Y., Hayes R.B., Bechtold W., Venkatesh P., Yin S., Wang Y., Dosemeci M., Li G., Lu W., Smith M.T. Interphase cytogenetics of workers exposed to benzene // Environ. Health. Perspect. -1996. -V. 104. Suppl 6. -P. 1325-1329.

129. Zhang L., Wang Y., Shang N., Smith M.T. Benzene metabolites induce the loss and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in human lymphocytes // Leuk. Res. -1998. -V.22. -P.105-113.

130. Zhang Z., Park W.S., Pack S., Schmidt L., Vortemeyer A.O. Trisomy 7-harbouring non-random duplication of the mutant MET allele in hereditary papillary renal carcinomas // Nat. Genet. -1998. -V.20. -P.66-69.

131. Zhang L., Aviv H., Gardner JP., Okuda K., Patel S., Kimura M., Bardeguez A., Aviv A. Loss of chromosome 13 in cultured human vascular endothelial cells // Exp. Cell. Res. -2000. -V. 260. -P. 357-364.145

132. Zheng Y., Wong M.L., Alberts B., Mitchison T.J., Nucleation of microtubule assembly by y-tubulin-containing ring complex // Nature -1995. -V.378. -P. 578-583.

133. Zou H., McGarry T.J., Bernal T., Kirschner M.W. Identification of a vertebrate sister chromatid separation inhibitor involved in transformation and tumorigenesis // Science -1999. -V.285. -P. 418-421.