Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомных аномалий при анэмбрионии и неразвивающейся беременности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Лебедев, Игорь Николаевич

• Лебедев, Игорь Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лебедев, Игорь Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хромосомные аномалии и патология раннего эмбрионального разбития человека.

1.2. Тканеспецифичный плацентарный мозаицизм у спонтанных абортусов: механизмы формирования и фенотипические эффекты.

1.3. Цитогенетические аномалии и нарушение пролиферативной активности клеток.

1.4. Возможности молекулярно-цитогенетических методов анализа кариотипа клеток с низкой пролиферативной активностью.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Структура и объем материала.

2.2. Культивирование фибробластов экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов и приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.3. Получение суспензий некультивированных клеток экстраэмбриональных тканей и приготовление препаратов интерфазных ядер.

2.3.1. Приготовление суспензий некультивированных клеток цитотрофобласта ворсин хориона.

2.3.2. Приготовление суспензий некультивированных клеток экстраэмбриональной мезодермы.

2.4. Получение центромероспецифических ДНК-зондов.

2.4.1. Выделение плазмидной ДНК.

2.4.2. Мечение плазмидной ДНК методом ник-трансляции.

2.5. Флюоресцентная гибридизация in situ на интерфазных ядрах.

2.6. Методы статистического анализа.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структура хромосомных нарушений при анэмбрионии и неразвивающейся беременности в условиях нормальной пролиферации клеток в долгосрочных культурах.

3.2. Молекулярно-цитогенетическое исследование кариотипа клеток спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью in vitro.

3.2.1. Создание алгоритма молекулярно-цитогенетического анализа кариотипа некультивированных клеток с низкой пролиферативной активностью in vitro.

3.2.2. Интерфазный FISH-анализ кариотипа клеток спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью in vitro.

3.3. Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомного мозаицизма как фактора ранней эмбриональной летальности.

3.3.1. Определение спонтанной частоты анеуплоидии и полиплоидии в клетках цитотрофобласта хориона и экстраэмбриональной мезодермы у медицинских абортусов методом флюоресцентной гибридизации in situ.

3.3.2. Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомного мозаицизма в экстраэмбриональных тканях спонтанных абортусов.

3.4. Ретроспективный молекулярно-цитогенетический анализ тетраплоидии в экстраэмбриональных тканях спонтанных абортусов.

3.5. Сравнительная характеристика структуры хромосомных нарушений при нормальной и низкой пролиферативной активности клеток спонтанных абортусов in vitro.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомных аномалий при анэмбрионии и неразвивающейся беременности»

Для ранних этапов онтогенеза человека характерна высокая частота репродуктивных потерь. По оценкам большинства исследователей, до 5075% зигот элиминируется в период от оплодотворения до имплантации [Roberts, Lowe, 1975; Miller et al., 1980], 15-20% клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в период до 28 недель [Кулешов, 1979; Warburton, Fraser, 1964; Jacobs, Hassold, 1987; Pauer et al., 1999]. Среди многообразия факторов, индуцирующих раннюю внутриутробную гибель зародыша, значительная роль принадлежит генетическим причинам - в среднем у 50% спонтанных абортусов выявляются аномалии хромосомного набора [Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990; Griffin et al., 1997]. Вопрос о вкладе хромосомных мутаций в этиологию спонтанного прерывания беременности дискутируется в литературе на протяжении уже четырех десятилетий, с тех пор как в 1961 г. в Гальтоновской лаборатории в Лондоне впервые были описаны нарушения кариотипа у спонтанных абортусов [Delhanty et al., 1961; Penrose, Delhanty, 1961]. За прошедшее время в мире был проведен значительный объем цитогенетических исследований спонтанных абортусов, позволивших сформировать определенные представления о структуре нарушений кариотипа, несовместимых с нормальным эмбриональным развитием. Показано, что доминирующим типом хромосомной изменчивости при эмбриональной летальности у человека являются нарушения числа хромосом -анеуплоидии (преимущественно трисомии по аутосомам и моносомия по X-хромосоме) и полиплоидия. На долю структурных аберраций хромосом приходится в среднем не более 5% нарушений хромосомного набора.

Вместе с тем, следует признать, что несмотря на значительный объем информации, накопленный в этой области знаний, вопрос о вкладе хромосомных мутаций в этиологию ранней внутриутробной смертности у человека не может считаться окончательно решенным. Одним из оснований для такого 6 утверждения может служить тот факт, что стандартные методы цитогенети-ческого анализа недостаточно эффективны при проведении исследований спонтанно абортированных зародышей. По данным ряда авторов, от 5 до 42% образцов тканей спонтанных абортусов оказываются недоступными для ци-тогенетического анализа вследствие дегенерации клеток при введении их в культуру, либо полного отсутствия клеточной пролиферации in vitro [Hassold et al., 1980; Byrne et al., 1985; Lin et al., 1985; Be et al., 1997]. Альтернативный «прямой» метод анализа кариотипа клеток, не связанный с этапом длительного культивирования тканей, также не обладает достаточной разрешающей способностью, поскольку не во всех образцах тканей внутриутробно погибших зародышей клетки проявляют хорошую митотическую активность in vitro, достаточную для получения качественных препаратов метафазных хромосом. Эффективность «прямого» метода при цитогенетическом анализе спонтанных абортов составляет от 76% [Eiben et al., 1990] до 94% [Guerneri et al., 1987].

Известен ряд исследований, направленных на анализ цитогенетиче-ских факторов, обусловливающих изменения характера клеточной пролиферации [Гринберг, 1978; Miller et al., 1996; Qumsiyeh et al., 2000], однако все они были выполнены с помощью стандартного цитогенетического метода, и следовательно, выводы, сделанные в этих работах, справедливы только по отношению к клеткам, обладающим относительно нормальной способностью к пролиферации в культуре. Вместе с тем, в последние годы стали накапливаться и такие данные, которые косвенным образом свидетельствуют о том, что дегенерация клеточных культур может быть обусловлена нарушениями кариотипа. В частности, в серии исследований, посвященных анализу причин дегенерации культур клеток амниотической жидкости при процедурах пре-натальной цитогенетической диагностики, были продемонстрированы существенные различия в частотах хромосомных нарушений, выявляемых при нормальном росте клеточной культуры и при дегенерации клеток: от 1 до 4% 7 аномалий хромосом в первой группе и от 10 до 19% - во второй [Persutte, Lenke, 1995; Reid et al., 1996; Lam et al., 1998]. Таким образом, вышеуказанные данные позволяют сделать предположение о том, что частота хромосомных аномалий, регистрируемых в клетках спонтанных абортусов при использовании стандартного метода цитогенетического анализа, может занижаться, ограничивая тем самым наши представления о вкладе хромосомных мутаций в этиологию ранней эмбриональной смертности у человека. Очевидно, что исследования в этом направлении представляют несомненную актуальность и практическую значимость.

В последние годы, с развитием методов молекулярной цитогенетики появилась возможность исследования хромосомного набора клеток с исключением этапа их культивирования. Несомненно, что использование таких методов как сравнительная геномная гибридизация (CGH) или флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) на интерфазных ядрах предоставляет уникальную возможность для изучения кариотипа клеток, неспособных к пролиферации in vitro. Оба этих метода обеспечивают точную идентификацию изменений числа копий хромосом - доминирующую группу нарушений кариотипа при ранней эмбриональной летальности. Результаты первых двух недавних попыток анализа кариотипа клеток спонтанных абортусов, в культурах которых была отмечена дегенерация, с помощью метода CGH показали высокую частоту хромосомных нарушений в этих выборках - в пределах 47-63% [Daniely et al., 1998; Lomax et al., 2000]. Однако, CGH имеет существенные ограничения для анализа мозаичных вариантов нарушений хромосомного набора [Daniely et al., 1999; Lestou et al., 1999], а также не позволяет выявлять такую частую хромосомную патологию у спонтанных абортусов как полиплоидию. Напротив, интерфазный FISH-анализ с использованием набора центромерос-пецифических ДНК-зондов выявляет все типы числовых аномалий хромосом, и кроме того, обладает высокой разрешающей способностью диагностики хромосомного мозаицизма [Lomax et al., 1994]. Эти особенности определяют 8 преимущество интерфазного цитогенетического анализа при исследовании кариотипа клеток спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью in vitro. Необходимо отметить, что подобные систематические исследования хромосомных нарушений у спонтанно погибших зародышей человека до настоящего времени не проводились. В связи с этим возникает необходимость в разработке эффективного алгоритма молекулярно-цитогенетического исследования кариотипа некультивированных клеток с помощью интерфазного FISH-анализа.

Затронутый вопрос о хромосомном мозаицизме не является случайным. В последнее время в литературе активно дискутируется проблема о влиянии хромосомного набора плацентарных тканей на характер эмбрионального развития [Delozier-Blanchet, 1991; Kalousek, 1994, 2000; Simoni, Sirchia, 1994; Wolstenholme, 1996]. Известно, что именно внезародышевые ткани в большинстве случаев являются объектом исследования при цитоге-нетическом анализе репродуктивных потерь [Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990, Griffin et al., 1997], при этом априори предполагается наличие соответствия между кариотипом клеток экстраэмбриональных тканей и собственно тканей зародыша. Вместе с тем, в 1-2% случаев биопсий ворсин хориона при проведении пренатальной цитогенетической диагностики выявляется несоответствие между хромосомными наборами клеток плаценты и плода [Johnson, Wapner, 1997]. Что касается вопроса о плацентарном мозаицизме, как факторе ранней эмбриональной летальности, то до настоящего времени он остается открытым. Имеющиеся в литературе сведения о результатах сравнительного цитогенетического анализа различных экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов указывают на то, что частота межтканевых различий по хромосомной конституции клеток может достигать достаточно высокого значения - порядка 15% [Kalousek et al., 1992; Lombardi, Dev, 1992; Griffin et al., 1997]. Возможно, что детальный молекулярно-цитогенетический анализ плацентарных тканей, производных различных зародышевых и экстраэмбрио9 нальных детерминантов, позволит ближе подойти к оценке вклада межтканевых различий по хромосомному набору клеток в этиологию спонтанного прерывания беременности.

Наконец следует отметить, что спонтанные абортусы человека представляют собой достаточно гетерогенную в клиническом и морфологическом отношении группу [Сагг, 1975; Hansmann et al., 1985; Merz, 1991; Kalousek, 1998]. По нарастанию степени тяжести нарушения эмбрионального развития, всех пренатально погибших зародышей можно классифицировать на 3 группы: собственно спонтаннные аборты, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии. Последние две группы отличаются наличием выраженных признаков внутриутробной задержки развития зародыша, более того, при анэмбрионии формирование собственно эмбриональных структур прекращается, по всей видимости, еще на этапе дифференцировки внутренней клеточной массы. Представляется очевидным, что вклад генетических факторов в формирование этих форм патологии эмбриогенеза может оказаться более значительным, по сравнению с группой собственно спонтанных абортов. Наряду с этим необходимо подчеркнуть, что до настоящего времени анэмбрионии и неразвивающиеся беременности остаются недостаточно изученными в цитогенетическом отношении группами [Guerneri et al., 1987; Minelli et al., 1993; Brajenovic-Milic et al., 1998].

В нашей стране изучению цитогенетических причин спонтанного прерывания эмбриогенеза посвящено ограниченное число исследований [Кулиев, 1976; Кулешов, 1979; Головачев, 1983; Назаренко, 1993]. Молекулярно-цитогенетические исследования структуры хромосомных нарушений при ранней эмбриональной летальности у человека не проводились. Более того, предлагаемый в настоящей работе подход к изучению кариотипа клеток спонтанных абортусов с низкими пролиферативными свойствами не имеет аналогов и в мировой литературе.

10

Цель работы: Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомных аномалий при анэмбрионии и неразвивающейся беременности в клетках с нормальной и низкой пролиферативной активностью in vitro.

Задачи исследования:

1. Оценить вклад хромосомных нарушений в формирование анэм-брионий и неразвивающихся беременностей с использованием стандартного метафазного анализа при длительном культивировании клеток экстраэмбриональных тканей in vitro.

2. Разработать алгоритм исследования кариотипа некультивированных клеток зародышей с помощью интерфазного FISH-анализа с использованием центромероспецифических ДНК-зондов на все хромосомы набора и изучить структуру числовых нарушений хромосомного набора в клетках экстраэмбриональных тканей, неспособных к пролиферации in vitro.

3. Сравнить структуру числовых аномалий кариотипа в клетках экстраэмбриональных тканей пренатально погибших зародышей с нормальной и низкой пролиферативной активностью in vitro.

4. С помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток эмбрионов изучить распределение клеточных клонов с хромосомными аномалиями в цитотрофобласте хориона и экстраэмбриональной мезодерме, производных различных внезародышевых и эмбриональных детерминантов, и оценить вклад межтканевых различий по хромосомному набору плацентарных тканей в раннюю эмбриональную летальность у человека.

Научная новизна: Впервые с помощью интерфазного FISH-анализа исследована структура числовых хромосомных нарушений в клетках спонтанных абортусов человека, неспособных к пролиферации в условиях культивирования in vitro. У этих зародышей выявляется относительно высокая частота (около 20%) редких хромосомных нарушений - аутосомных моносо-мий в мозаичном состоянии с преобладающей эуплоидной клеточной линией. Высказано предположение, что данный тип хромосомных аномалий со

11 вместим с ранними этапами постимплантационной дифференцировки экстраэмбриональных тканей. Определена спонтанная частота анеуплоидии по некоторым хромосомам набора и уровень полиплоидии в цитотрофобласте хориона и экстраэмбриональной мезодерме. С помощью цитогенетического и молекулярно-цитогенетического анализа уточнен вклад хромосомных нарушений в формирование двух клинических форм патологии беременности -анэмбрионий и неразвивающихся беременностей. Определена частота ограниченного плацентарного хромосомного мозаицизма при ранней эмбриональной гибели.

Практическая значимость работы. Проведено цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое исследование 146 случаев спонтанного прерывания беременности - 35 анэмбрионий и 111 неразвивающихся беременностей. Предложен алгоритм интерфазного FISH-анализа числовых хромосомных нарушений в некультивированных клетках зародышей в случае дегенерации клеточных культур с использованием набора центромероспецифиче-ских ДНК-зондов. Определена спонтанная частота анеуплоидии по хромосомам 7, 8, 16 и X в экстраэмбриональных тканях, которая может быть использована в качестве контрольного уровня при проведении пренатальной диагностики хромосомных заболеваний у плода и оценке ограниченного плацентарного мозаицизма с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток зародышей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Впервые с использованием интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток спонтанных абортусов установлено, что частота числовых хромосомных аномалий в клетках с низкой пролиферативной активностью in vitro составляет 60% при анэмбрионии и 50% при неразвивающейся беременности и сопоставима с частотой числовых нарушений кариотипа, обнаруживаемых в этих двух клинических формах патологии беременности при

12 стандартном метафазном анализе в условиях нормальной клеточной пролиферации.

2. Структура числовых хромосомных нарушений в некультиви-руемых клетках спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью in vitro, определенная с помощью интерфазного FISH-анализа с набором центромероспецифических ДНК-зондов, отличается от структуры хромосомных нарушений, выявляемых при обычном цитогенетическом анализе длительно культивируемых клеток спонтанно погибших зародышей. В клетках эмбрионов, неспособных к пролиферации в условиях культивирования in vitro, около 20% аномалий кариотипа представлены аутосомными моносо-миями по ряду хромосом набора в мозаичном состоянии с преобладающей эуплоидной клеточной линией.

3. Частота ограниченного плацентарного мозаицизма при ранней гибели зародышей человека, определенная с помощью сравнительного моле-кулярно-цитогенетического анализа распределения клеток с хромосомными аномалиями в пределах двух типов плацентарных тканей разного происхождения (цитотрофобласта хориона и экстраэмбриональной мезодермы), составляет 25%, что свидетельствует о существенном вкладе межтканевых отличий по хромосомному набору плацентарных тканей в нарушение нормального эмбрионального развития.

13

Заключение диссертации по теме «Генетика», Лебедев, Игорь Николаевич

165 ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток с низкой пролиферативной активностью in vitro показано, что частота числовых хромосомных аномалий составляет 60% при анэмбрионии и 50% при неразвивающейся беременности и сопоставима с частотой числовых нарушений кариотипа, обнаруживаемых в этих двух клинических формах патологии беременности при стандартном метафазном анализе в условиях нормальной клеточной пролиферации.

2. В клетках экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов, демонстрирующих дегенерацию при введении в культуру, регистрируется более широкий спектр числовых нарушений кариотипа, по сравнению с клетками, обладающими нормальной пролиферативной активностью. Установлено, что около 20% внутриутробно погибших зародышей с хромосомными аномалиями, клетки которых не способны к нормальной пролиферации в культуре, имеют моносомии по ряду аутосом набора в мозаичном состоянии с доминирующей эуплоидной клеточной линией.

3. Показано, что моносомии по хромосомам 7, 15, 21 и 22 в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией совместимы с ранними этапами постимплантационной дифференцировки трофобласта. Преимущественная компартментализация клеток с моносомией по хромосомам 21 и 22 в экстраэмбриональной мезодерме может являться критическим фактором, обусловливающим невозможность нормального морфогенеза эмбриональных структур.

4. В спектре хромосомных нарушений при анэмбриониях и неразвивающихся беременностях, полученных от беременных женщин г.Томска, отмечается более высокая частота тетраплоидного хромосомного набора, по сравнению с другими исследованными популяциями. Показано, что этот феномен не является артефактом, связанным с повышением уровня

166 плоидности клеток в ходе их длительного культивирования in vitro. Установлено, что возникновение тетраплоидии приходится на доимплантационный этап постзиготического дробления бластомеров.

5. В некультивированных клетках цитотрофобласта хориона и экстраэмбриональной мезодермы спонтанных абортусов частота ограниченного плацентарного мозаицизма составляет 25%. В сравнении со средней частотой ограниченного плацентарного мозаицизма 1-2%, регистрируемой при проведении пренатальной диагностики у живых плодов, высокая частота межтканевых различий по хромосомному набору плацентарных тканей у спонтанных абортусов может отражать значимость этого фактора в этиологии ранней эмбриональной летальности у человека.

6. Разработан алгоритм молекулярно-цитогенетического исследования кариотипа клеток с ограниченным пролиферативным потенциалом in vitro. Приоритетность анализа числа копий каждой отдельной хромосомы в интерфазных ядрах клеток исследуемой ткани с помощью флюоресцентной гибридизации in situ с центромероспецифичными ДНК-зондами на все хромосомы набора определяется средней частотой регистрации анеуплоидии по данной хромосоме в исследуемом материале.

167

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность заведующему лабораторией цитогенетики НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН доктору биологических наук, профессору С.А. Назаренко как инициатору и руководителю настоящей работы. Выражаю свою искреннюю признательность коллегам по работе Н.В. Островерховой, Н.Н. Сухановой, Т.В. Никитиной, В.А. Тимошевскому и всем сотрудникам лаборатории цитогенетики за поддержку и помощь в выполнении работы и обсуждении результатов исследования. Огромная благодарность врачам-гинекологам генетической клиники НИИ медицинской генетики М.О. Филипповой, М.П. Корф и среднему медперсоналу за помощь в сборе материала для настоящего исследования.

168

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранние этапы эмбрионального развития человека характеризуются высокой частотой репродуктивных потерь - до 50-75% зигот элиминируется в период от оплодотворения до имплантации [Roberts, Lowe, 1975; Miller et al., 1980], a 15-20% зародышей спонтанно погибает в течение I триместра беременности [Pauer et al., 1999]. Это обстоятельство определяет актуальность исследований, направленных на поиск и анализ факторов, обусловливающих столь значительную эмбриолетальность у человека. Первостепенное значение в этиологии нарушений эмбрионального развития отводится генетическим причинам. Серия масштабных цитогенетических исследований спонтанных абортусов, проведенных в разных странах мира за последние 4 десятилетия, позволила сформировать определенные представления о вкладе хромосомных мутаций в нарушение нормального эмбриогенеза. Установлено, что в среднем 50% случаев невынашивания беременности обусловлено хромосомными аномалиями, среди которых преобладают числовые нарушения хромосом: трисомия по аутосомам, моносомия по X-хромосоме и полиплоидия, а наименее распространенными являются структурные перестройки хромосом (табл. 1-3).

Вместе с тем, несмотря на значительный объем информации, накопленной в этой области знаний, вопрос о вкладе аномалий кариотипа в нарушение эмбрионального развития не может считаться окончательно решенным, вследствие ограниченных диагностических возможностей стандартного метода метафазного анализа. Известно, что от 5 до 42% культур клеток спонтанных абортусов выпадает из поля зрения исследователей по причине клеточной дегенерации in vitro (табл. 8), что ограничивает наши представления о частоте и структуре хромосомных нарушений в патологии раннего периода онтогенеза человека. Наша рабочая гипотеза заключалась в том, что дегенерация клеток спонтанных абортусов, при попытке введения их в длительные культуры, может служить индикатором наличия у зародышей

159 таких типов хромосомных аномалий, которые обусловливают невозможность дальнейшей пролиферации клеток зародыша, остановку его развития и спонтанное прерывание беременности.

С целью проверки данного предположения нами была сформирована выборка из 146 пренатально погибших зародышей, выявленных при ультразвуковом обследовании беременных женщин, и проведено культивирование клеток экстраэмбриональных тканей. Параллельно этому, был сформирован банк некультивированных клеток от всех спонтанных абортусов. Нормальная клеточная пролиферация, обусловившая возможность получения препаратов метафазных хромосом, была зафиксирована в 86 культурах (59%). Стандартный метафазный анализ показал, что при условии нормальной пролиферативной активности клеток, хромосомные аномалии выяляются в 60,0% случаев анэмбрионий и в 56,3% случаев неразвивающейся беременности.

С помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток было обследовано 60 образцов (20 - АЭ и 40 - НБ) тканей, при попытке длительного культивирования которых была зафиксирована клеточная дегенерация. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа показали, что частота числовых аномалий хромосом (выявляемых при использовании центро-мероспецифических ДНК-зондов) в этой группе абортусов составила 53,3%. Полученная величина соответствовала результатам, представленным в имеющихся на сегодняшний день в литературе двух сообщениях об аналогичных попытках исследования кариотипа клеток, неспособных к росту в культуре, с помощью метода сравнительной геномной гибридизации - 47,062,5% [Daniely et al., 1998; Lomax et al., 2000].

В сравнении с частотой числовых хромосомных нарушений, обнаруженных при нормальной клеточной пролиферации (56,0%), клетки с низкой пролиферативной активностью не характеризовались повышенной частотой всех числовых аномалий кариотипа (53,3%), однако, обнаруживали отличия как по спектру выявленных нарушений хромосомного набора, так и по часто

160 те отдельных типов хромосомных мутаций. Наиболее значимым оказался факт обнаружения в выборке из 60 абортусов 6 случаев моносомии по аутосомам, которая составила 18,8% процентов от всех хромосомных аномалий, выявленных при интерфазном FISH-анализе клеток с низкой пролифератив-ной активностью.

Моносомия по аутосомам - достаточно редкая хромосомная мутация даже у спонтанных абортусов. Предполагается, что такой тип хромосомного дисбаланса индуцирует остановку развития еще до этапа имплантации бла-стоцисты. В настоящем исследовании с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток мы оценили распределение in vivo клеточных клонов с аутосомной моносомией в двух типах экстраэмбриональных тканей, являющихся производными различных эмбриональных и внезародышевых детерминантов. Такой анализ позволил выдвинуть предположение о том, что, по крайней мере, в случаях с моносомиями по хромосомам 7 и 15 (которые до настоящего времени не были описаны у спонтанных абортусов), возникновение хромосомной аномалии приходилось уже на постимпланта-ционный этап дифференцировки цитотрофобласта, а кариотип импланти-рующеся бластоцисты был, по всей видимости, нормальным.

Что касается моносомий по хромосомам 21 и 22 (описания которых известны в цитогенетической литературе), то у 3 абортусов, для которых оказалось возможным изучить кариотип клеток двух типов внезародышевых тканей, клоны аномальных клеток были выявлены как в цитотрофобласте, так и в экстраэмбриональной мезодерме, что может указывать на то, что ау-тосомная моносомия уже присутствовала в бластоцисте до этапа имплантации.

Интересно отметить, что сравнительное исследование тканеспеци-фичного распределения клеток с аутосомными моносомиями кроме анализа механизмов и стадий формирования мутаций, позволило проследить и их некоторые фенотипические особенности. В частности, если частота аномаль

161 ных клеток в экстраэмбриональной мезодерме (производной эпибласта, из которого формируются и эмбриональные структуры) оказывалась выше или сопоставимой с частотой аутосомной моносомии в цитотрофобласте, то в таких случаях развитие зародыша блокировалось, по всей видимости, на этапе дифференцировки внутренней клеточной массы, поскольку данные абортусы были представлены пустыми плодными мешками. Если же аномальные клеточные клоны чаще обнаруживались в цитотрофобласте, или вообще отсутствовали в мезодерме, то развитие зародыша оказывалось совместимым с формированием эмбриональных структур. Возможно, что аутосомные моносомии являются критическим фактором, обусловливающим невозможность нормальной дифференцировки эпибласта. Таким образом, полученные нами данные позволяют выдвинуть предположение, что в ряде случаев моносомии по аутосомам в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией могут быть совместимы с ранними этапами постимплантационной дифференцировки экстраэмбриональных тканей, а низкая частота их регистрации при проведении стандартного метафазного анализа обусловлена, вероятно, гибелью клеток с таким хромосомным дисбалансом in vitro.

Что касается других типов хромосомных аномалий, то сравнительный анализ групп абортусов с нормальной и низкой пролиферативной активностью клеток, показал, что клетки с полиплоидным хромосомным набором, по-видимому, не обладают нарушенным пролиферативным потенциалом. Более того, тетраплоидные клетки обнаруживают выраженную пролиферативную активность, что подтверждает литературные данные [Rehder et al., 1989; Eiben et al., 1990]. Так, мы не обнаружили достоверных отличий в продолжительности культивирования клеток с нормальным и тетраплоидным кариотипом. При регистрации хромосомного мозаицизма в культурах клеток, 79% составили случаи с дополнительным тетраплоидным клоном, в то время как при клеточной дегенерации диплоидно-тетраплоидный вариант хромосомного набора был обнаружен только у 24%

162 абортусов с мозаичным кариотипом. Вместе с этим, необходимо особо отметить, что выраженная пролиферативная активность тетраплоидных клеток in vitro не является артефаком, обусловленным возможной полиплои-дизацией клеток в ходе длительного культивирования [Hunt, Jacobs, 1985]. Проведенный нами ретроспективный молекулярно-цитогенетический анализ в 100% случаев подтвердил наличие тетраплоидных клеточных клонов в плацентарных тканях in vivo.

Исследование межтканевого распределения тетраплоидных клеток позволило сделать заключение о постзиготическом возникновении данной геномной мутации на стадии дробления бластомеров. Очевидно, что данный период доимплантационного развития (в течение первой недели беременности) должен стать объектом пристального внимания специальных исследований, направленных на поиск и анализ факторов, индуцирующих возникновение тетраплоидии. Этот вопрос достаточно актуален, поскольку зарегистрированная в настоящем исследовании частота тетраплоидии у спонтанных абортов в популяции г.Томска необычно высока.

Еще одной отличительной особенностью результатов интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток, стало обнаружение высокой частоты хромосомного мозаицизма в плацентарных тканях спонтанных абортусов. У 30 из 32 (94%) абортусов с аномалиями кариотипа, хромосомные нарушения в том или ином типе тканей оказались в мозаичном состоянии. В 25% случаев выявлен ограниченный плацентарный мозаицизм, что подтвердило высказываемые в литературе гипотезы о влиянии хромосомного дисбаланса в плацентарных тканях на нарушение эмбрионального развития [Ка-lousek et al., 1992; Wolstenholme, 1996; Griffin et al., 1997]. Кроме этого, сравнительный анализ распределения клеток с хромосомными аномалиями между различными экстраэмбриональными тканями in vivo, позволил сформулировать предположение о стадиях эмбрионального развития, на которых произошло возникновение мутации. Также было обнаружено, что в некуль

163 тивируемых клетках экстраэмбриональной мезодермы, клетки которой про-лиферируют в длительных культурах, частота клеточных клонов с нарушениями кариотипа при хромосомном мозаицизме в среднем оказалсь меньше, по сравнению с цитотрофобластом. Учитывая то обстоятельство, что при интерфазном FISH-анализе исследовались клетки мезодермы с низким проли-феративным потенциалом, можно предположить, что как in vivo, так и in vitro имела место направленная селекция против клеточных клонов с хромосомными аномалиями.

Таким образом, молекулярно-цитогенетическое исследование спонтанных абортусов, клетки которых оказались неспособными к нормальной пролиферации in vitro, с одной стороны, не привело к существенной корректировке величины вклада числовых аномалий хромосомного набора в этиологию нарушений эмбрионального развития, а с другой стороны, позволило расширить наши представления о спектре хромосомной изменчивости на ранних этапах онтогенеза человека.

Проведенное исследование на настоящее время не имеет аналогов в мировой литературе. Вместе с тем, нельзя не отметить, что с развитием мо-лекулярно-цитогенетических методов, проблема получения информации о хромосомном наборе клеток, неспособных к росту in vitro, начинает активно дискутироваться в литературе [Lomax et al., 2000; Barrett et al., 2001]. В сравнении с уже полученными с помощью сравнительной геномной гибридизации данными, наши результаты, с одной стороны, демонстрируют соответствие частот выявляемых числовых нарушений хромосом, а с другой стороны, указывают на необходимость более пристального внимания к хромосомному мозаицизму, возможности диагностики которого с помощью метода CGH ограничены [Lestou et al., 1999].

Предложенный нами алгоритм интерфазного FISH-анализа кариотипа с использованием центромероспецифических ДНК-зондов, при котором приоритетность исследования числа копий той или иной хромосомы, определя

164 ется средней частотой анеуплоидии по данной хромосоме, может оказаться ценным и для исследования хромосомного дисбаланса в любых ситуациях, связанных с невозможностью получения информации о кариотипе с использованием методов стандартного метафазного анализа. Например, представляется возможным в течение всего двух реакций двухцветной гибридизации in situ (одной - с ДНК-зондами на центромерные районы хромосом 13/21 и 18, второй - с центромероспецифическими ДНК-зондами на половые хромосомы) на некультивированных клетках при процедурах пренатальной цитогене-тической диагностики определить клинически значимые варианты анеуплои-дий. Полученные в настоящем исследовании данные о спонтанной частоте анеуплоидии по хромосомам 7, 8, 16 и X в экстраэмбриональных тканях могут быть использованы в качестве контрольных значений при интерфазном FISH-анализе в случаях пренатальной диагностики хромосомных синдромов и при подозрении на ограниченный плацентарный мозаицизм.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лебедев, Игорь Николаевич, 2001 год

1. Баранов B.C. Спонтанная полиплоидия у лабораторных мышей. Эмбриологический и цитогенетический анализ // Онтогенез,- 1976,- Т.7.- N 3.-С.229-238.

2. Головачёв Г.Д. Наследственность человека и внутриутробная гибель,- М.: Медицина, 1983,- 152 с.

3. Гринберг К.Н. Цитологические проявления хромосомного дисбаланса у человека // Прогресс в медицинской генетике (гетерогенность наследственной патологии человека) / под ред. Бочкова Н.П.- М.: Медицина, 1978,- С.151-186.

4. Гринберг К.Н., Терехов С.М. Хромосомный дисбаланс и клеточный пролиферативный потенциал in vitro // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.-1985,- Т.99,- N 2,- С.191-193.

5. Дыбан А.П., Баранов B.C. Цитогенетика развития млекопитающих,- Л.: Наука, 1978,- 216 с.

6. Кулаженко В.П., Кулиев A.M. Комплексная оценка фенотипа эмбриолеталей человека // Прогресс в медицинской генетике (гетерогенность наследственной патологии человека) / под ред. Бочкова Н.П.- М.: Медицина, 1978 С. 187-229.

7. Кулешов Н. П. Частота возникновения и судьба хромосомных аномалий у человека: Автореф. дисс. докт. мед. наук.- М., 1979,- 45 с.

8. Кулиев A.M. Фенотипические эффекты хромосомных эмбриолеталей человека: Автореф. дисс. докт. мед. наук.- М., 1976,- 39 с.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия. Учебное пособие для университетов и педагогических институтов.- М.: Высшая школа, 1973,- 343 с.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование,- М.: Мир, 1984.- 286 с.

11. И. Назаренко С.А. Изменчивость хромосом и развитие человека. -Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1993,- 200 с.169

12. Назаренко С.А., Тимошевский В.А., Островерхова Н.В. Интерфазный анализ Х-анеуплоидии методом флюоресцентной гибридизации in situ в разных тканях здоровых лиц // Генетика.- 1997,- Т.33 N 10,- С.1426-1430.

13. Цирельников Н.И. Гистофизиология плаценты человека / Отв. ред. Л.И. Корочкин-Новосибирск: Наука. Сиб. Отделение, 1980- 184 с.

14. Andrews Т., Dunlop W., Roberts D.F. Cytogenetic studies in spontaneous abortuses //Hum. Genet.- 1984,- V.66.- N 1,- P.77-84.

15. Angell R.R., Summer A.T., West J.D., Thatcher S.S., Glasier A.F., Baird D.T. Post-fertilization polyploidy in human preimplantation embryos fertilized in vitro // Hum Reprod.- 1987,- V.2.- P.721-727.

16. Antonacci R., Rocchi M., Archidiacono N., Baldini A. Ordered mapping of three alpha satellite DNA subsets on the human chromosome 22 // Chrom. Res.- 1995,- V.3.- P.127-134.

17. Archidiacono N., Antonacci R., Marzella R., Finelli., Lonoce A., Rocchi M. Comparative mapping of human alphoid sequences in great apes, using fluorescence in situ hybridization // Genomics.- 1995,- V.25.- P.477-484.

18. Baldini A., Archidiacono N., Carbone R., Bolino A., Shridhar V., Miller O.J., Miller D.A., Ward D.C., Rocchi M. Isolation of a human chromosome 20-specific alpha satellite DNA clone // Cytog.Cell Genet.- 1992,- V.59.- P. 12-16.

19. Baldini A., Rocchi M., Archidiacono N., Miller O.J., Miller D.A. A human alpha satellite DNA subset specific for chromosome 12 // Am.J.Hum.Genet.- V.46.- P.784-788.

20. Baldini A., Smith D.I., Rocchi M., Miller O.J., Miller D.A. Cloning and analysis of lOOkb of pericentromeric repetitive (alphoid) DNA from human chromosome 3 // Am. J. Hum. Genet.-1989.- V.45.- A. 129.

21. Bacino C.A., Schreck R., Fischel-Ghosdian N., Pepkowitz S., Prezant T.R., Graham J.M. Clinical and molecular studies in full trisomy 22: Fur170ther delineation of the phenotype and review literature // Am. J. Med. Genet.-1995,- V.56.- P.359-365 .

22. Baretton G.B., Muller M., Wirtz A., Murken J., Arnholdt H. Numerical chromosomal aberrations in abortion tissues: comparison of conventional and interphase cytogenetics in paraffin section and nuclear suspensions // Pathologe.- 1998.- V.19.- P.120-128.

23. Barrett I.J., Lomax B.L., Loukianova Т., Tang S.S., Lestou V.S., Kalousek D.K. Comparative genomic hybridization: a new tool for reproductive pathology//Arch. Pathol. Lab. Med.- 2001,- V.125.- P.81-84.

24. Be C.R., Velasquez P.M., Youlton R.R. A cytogenetic study in 609 abortions // Rev. Med. Chile.- 1997,- V.125.- P.317-322.

25. Bell K.A., Van Deerlin P.G., Feinberg R.F., du Manoir S,, Haddad B.R. Diagnosis of aneuploidy in archival, paraffin-embedded pregnancy-loss tissues by comparative genomic hybridization // Fetil. Steril.- 2001,- V.75.- P.374-379.

26. Benadiva C.A., Kligman I., Munne S. Aneuploidy 16 in human embryos increases significantly with maternal age // Fertil. Steril.- 1996.- V.66.- N 2.-P.248-255.

27. Bischoff F.Z., Zenger-Hain J., Moses D., Van Dyke D.L., Shaffer L.G. Mosaicism for trisomy 12: four cases with varying outcomes // Prenat. Di-agn.- 1995,- V.15.- N 11,- P.1017-1026.

28. Boue J., Boue A., Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions // Teratology.- 1975.-V.12.-N 1.-P.11-26.

29. Brajenovic-Milic В., Petrovic O., Krasevic M., Ristic S., Kapovic M. Chromosomal anomalies in abnormal human pregnancies // Fetal Diagn. Therapy.-1998.- V.13.-N 3,- P.187-191.171

30. Bruderlein S., Gebhart E., Siebert E., Augustus M. Premature chromosome condensation studies on human metastsic carcinoma cells // Hum. Genet.- 1986,- V.73.- P.44-52.

31. Bryndorf Т., Christensen В., Xiang Y., Lind A.M., Philip J. Rapid detection of numericl aberration of chromosomes 13, 18 and 21 in chorionic mesenchymal cells //Prenat. Diagn.- 1993,- V.13.- P.815-823.

32. Bugge M., Collins A., Petersen M.B., Fisher J., Brandt C., Hertz J.M., Tranebjaerg L. Non-disjunction of chromosome 18 // Hum. Mol. Genet.-1998,- V.7.- P.661-668.

33. Byrne J., Warburton D., Kline J., Blanc W., Stein Z. Morphology of early fetal death and their chromosomal characteristics // Teratology.- 1985.-V.32.- P.297-315.

34. Carr D.H. Cytogenetics and the pathologist // Pathol. An.- 1975 -V.10.- P.93-144.

35. Carr D.H. Cytogenetics of human reproductive wastage // Issues and Reviews in Teratology.- 1983.- V. 1.- P.33-72.

36. Carr D.H., Gedeon M.M. Q-banding of chromosomes in human spontaneous abortions // Canad. J. Genet. Cytol.- 1978,- V.20.- N 3,- P.415-425.

37. Crane J.P., Cheung S.W. An embryonic model to explain cytogenetic inconsistencies observed in chorionic villus versus fetal tissue // Prenat. Diagn.-1988,-V.8.-N 2,-P. 119-129.

38. Creasy M.R., Crolla J.A., Alberman E.D. A cytogenetic study of human spontaneous abortions using banding techniques // Hum. Genet.- 1976,- V. 31,- N 2,- P.177-196.

39. Christiaens G.C., Vissers J., Poddighe P.J., de Pater J.M. Comparative genomic hybridization for cytogenetic evaluation of stillbirth // Obstet. Gyne-col.- 2000.- V.96.- P.281-286.1.l

40. Cristian S.L., Smith A.C.M., Black C., Elder F.F.B., Johnson J.M-P., Resta R.G., Rocklin M.L. Prenatal diagnosis of uniparental disomy 15 following trisomy 15 mosaicism // Prenat. Diagn.- 1996.- V.16.- P.323-332.

41. Cure S., Boue J., Boue A. Growth characteristics of human embryonic cell lines with chromosomal anomalies // Biomedicine.- 1974.- V.21.- P.233-236.

42. D'Aiuto L., Antonacci R., Marzella R., Archidiacono N., Rocchi M. Cloning and comparative mapping of a human chromosome 4-specific alpha satellite DNA sequence // Genomics.- 1993,- V.18.- P.230-235.

43. Daniely M., Aviram-Goldring A., Barkai G., Goldman B. Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from reccurent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization // Hum. Reprod.- 1998,- V.13.- N 4.- P.805-809.

44. Daniely M., Barkai G., Goldman В., Aviram-Goldring A. Detection of numerical chromosomal aberration by comparative genomic hybridization // Prenat. Diagn.- 1999.-V. 19.-P. 100-104.

45. De Brasi D., Genuardi M., D'Agostino A., Calvieri F., Tozzi C., Varrone S., Neri G. Double autosomal/gonosomal mosaic aneuploidy: Study of non-disjunction in two cases with trisomy of chromosome 8 // Hum. Genet.- 1995.-V.95.- P.519-525.

46. Dejmek J., Vojtassak J., Malova J. Cytogenetic analysis of 1508 spontaneous abortions originating from south Slovakia // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.- 1992,- V.46.- P.129-136.

47. Delhanty J.D.A., Ellis J.R., Rowley P.T. Triploid cell in a human embryo // Lancet.-1961,- V.I.- P. 1286.

48. Delozier-Blanchet C.D. Cytogenetic anomalies and placental function // Rev. Franc, de Gynecol, et d'Obstetriq.-1991.- V.86.- N 12,- P.723-729.

49. Eiben В., Bartels I., Bahr-Porsch S., Borgmann S., Gatz G., Gellert G., Goebel R., Hammans W., Hentemann M., Osmers R., Rauskolb R., Hansmann173

50. Cytogenetic analysis of 750 spontaneous abortions with the direct-preparation method of chorionic villi and its implications for studying genetic causes of pregnancy wastage // Am. J. Hum. Genet.- 1990.- V.47.- P.656-663.

51. Everett C.A., West J.D. Evidence for selection against tetraploid cells in teteraploid<-»diploid mouse chimaeras before the late blastocyst stage // Genet. Res.- 1998.- V.72.- N 3,- P.225-228.

52. Fisher J.M., Harvey J.F., Morton N.E., Jacobs P.A. Trisomy 18: studies of the parent and cell division of origin and the effect of aberrant recombination on nondisjunction // Am. J. Hum. Genet.- 1995.- V.56.- N 3.- P.669-675.

53. Fonatsch C., Duchrow M., Rieder H., Schluter C., Gerdes J. Assignment of the human Ki-67 gene (MKI67) to 10q25-qter // Genomics.- 1991.-V.ll.- P.476-477.

54. Ford C.E. Mosaicism and chimaeras // Br. Med. Bull.- 1969,- V.25.-P. 104-109

55. Fung J., Weier H-U.G., Goldberg J.D., Pedersen R.A. Multilocus genetic analysis of single interphase cells by spectral imaging // Hum. Genet.-2000.- V.107.- N 6,- P.615-622.

56. Goldman A.S., Fomina Z., Knight P. Analysis of the primary sex ratio, sex chromosome aneuploidy and diploidy in human sperm using dual-colour fluorescence in situ hybridization // Eur. J. Hum. Genet.- 1993.- V.I.- P.325-334.

57. Gray J.W., Pinkel D., Brown J.M. Fluorescence in situ hybridization in cancer and radiation biology // Radiat. Res.- 1994.- V.137.- P.275-289.

58. Griffin D.K. The incidence, origin and etiology of aneuploidy // Int. Rev. Cytol.- 1996,- V.167.- P.263-296.174

59. Griffin D.K., Millie E.A., Redline R.W., Hassold T.J., Zaragoza M.V. Cytogenetic analysis of spontaneous abortions: Comparison of techniques and assessment of the incidence of confined placental mosaicism // Am. J. Med. Genet.- 1997.- V.72.- P.297-301.

60. Guerneri S., Bettio D., Simoni G., Brambati В., Lanzani A., Fraccaro M. Prevalence and distribution of chromosome abnormalities in a sample of first trimester internal abortions // Hum. Reprod.- 1987,- Y.2.- N 8,- P.735-739.

61. Hahnemann J.M., Vejerslev L.O. European collaborative research on mosaicism in CVS (EUROCROMIC) fetal and extrafetal cell lineages in 192 gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy // Am. J. Med. Genet.- 1997,-V.70.-P.179-187.

62. Hanna J.S., Shires P., Matile G. Trisomy 1 in a clinically recognized pregnancy // Am. J. Med. Genet.- 1997.- V.68.- P.98.

63. Hansmann M., Hackeloer B-J., Staudach A. Ultrasound diagnosis in obstetrics and gynecology.- Berlin.: Springer-Verlag, 1985,- 495 p.

64. Hassold Т., Chen N., Funkhouser J., Jooss Т., Manuel В., Matsuura J., Matsuyama A., Wilson C., Yamane J.A., Jacobs P.A. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions // Ann. Hum. Genet.- 1980,- V.44.- N 2,- P. 151-178.

65. Hassold Т., Hunt P.A., Sherman S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology // Curr. Opin. Genet. Dev.- 1993.- V.3.- N 3P.398-403.

66. Hassold Т., Jacobs P.A., Leppert M., Sheldon M. Cytogenetic and molecular studies of trisomy 13 // J. Med. Genet.- 1987,- V.24.- P.725-732.

67. Hassold Т., Merrill M., Adkins K., Freeman S., Sherman S. Recombination and maternal-age dependent nondisjunction: molecular studies of trisomy 16 //Am. J. Hum. Genet.- 1995,-V.57.-P.867-874.175

68. Hassold Т., Pettay D., Freeman S.D., Grantham M., Takaesu N. Molecular studies of non-disjunction in trisomy 16 // J. Med. Genet.-1991.- V.28.-P. 159-162

69. Hassold Т., Sandison A. The effect of chromosome constitution on growth in culture of human spontaneous abortions // Hum. Genet.- 1983,- V.63.- N 2,- P.166-170.

70. Hassold Т., Takaesu N. Analysis of non-disjunction in human tri-somic spontaneous abortions //Prog. Clin. Biol. Res.- 1989.- V.311.- P.l 15-134.

71. Henderson K.G., Shaw Т.Е., Barrett I.J., Telenius A.H.P., Wilson R.D., Kalousek D.K. Distribution mosaicism in human placentae // Hum. Genet.-1996,- V.97.- P.650-654.

72. Hittelman W.N., Rao P.N. Predicting response or progression of human leukemia by premature chromosome condensation of bone marrow cells // Cancer Res.- 1978,- V.38.- P.416-423.

73. Horiuchi I., Hashimoto Т., Tsuji Y., Shimada H., Furuyama J., Ko-yama K. Direct assessment of triploid cells in mosaic human fetuses by fluorescence in-situ hybridization //Mol. Hum. Reprod.- 1997,- V.3.- N 5.- P.445-450.

74. Hunt P.A., Jacobs P.A. In vitro growth and chromosome constitution of placental cells. I. Spontaneous and elective abortions // Cytogenet. Cell Genet.-1985,-V.39.- P.l-6.

75. Iwarsson E., Lundqvist M., Inzunza J., Ahrlund-Richter L., Sjoblom P., Lundkvist O., Simberg N., Nordenskjold M., Blennow E. A high degree of aneuploidy in frozen-thawed human preimplantation embryos // Hum. Genet.-1999.-V.104.-P.376-382.176

76. Jacobs P. A. The chromosomal complement of human gametes // Oxford. Rev. Repr. Biol.- 1992,- V.14.- P.48-72.

77. Jacobs P.A., Hunt P.A., Matsuura J.S., Wilson S.S. Complete and partial hydatidiforme mole in Hawaii: cytogenetics, morphology and epidemiology // Br. J. Obstet. Gynaecol.- 1982,- V.89.- P.258-266.

78. James R.M., West J.D. A chimaeric animal model for confined placental mosaicism // Hum. Genet.- 1994.- V.93.- P.603-604.

79. James R.S., Jacobs P.A. Molecular studies of the aetiology of trisomy 8 in spontaneous abortions and the liveborn population // Hum. Genet-1996,- V.97.- N 3,- P.283-286.

80. Johnson R.T., Rao P.N. Mammalian cell fusion: induction of premature chromosome condensation in interphase nuclei // Nature.- 1970,- V.26.-P.717-722.

81. Johnson A., Wapner R.J. Mosaicism: implication for postnatal outcome // Curr. Opin. Obstet. Gynecol.- 1997,- V.9.- N 2,- P.126-135.

82. Joos S., Fink T.M., Ratsch A., Lichter P. Mapping and chromosome analysis: the potential of fluorescence in situ hybridization // J. Biotechnol.- 1994,-V.35.- P.135-153.

83. Kajii Т., Ferrier A., Niikawa N., Takahara H., Ohama K., Avirachan S. Anatomic and chromosomal anomalies in 639 spontaneous abortuses // Hum. Genet.- 1980,- V.55.- P.87-98.

84. Kallioniemi A., Kallioniemi O.P., Sudar D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors // Science.- 1992.-V.258.- P.818-821.177

85. Kallioniemi O.P., Kallioniemi A., Piper J. Optimizing comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumors // Genes Chromosom. Cancer.- 1994,- V.10.- P.231-243.

86. Kalousek D.K. Early spontaneous abortion: morphologic and karyotypic findings in 3912 cases // Birth Defects: Original Article Series.- 1993.-V.29.- N 1,- P.53-61.

87. Kalousek D.K. Confined placental mosaicism and uniparental disomy // Funct. Dev. Morph.-1994.- V.4.- N 2.- P.93-98.

88. Kalousek D.K. Current topic: confined placental mosaicism and intrauterine fetal development // Placenta.- 1994,- V.15.- P.219-230.

89. Kalousek D.K. Clinical significance of morphologic and genetic examination of spontaneously aborted embryos // Am. J. Rep. Imm.- 1998.- V39.-P.108-119.

90. Kalousek D.K. Pathogenesis of chromosomal mosaicism and its effects on early human development // Am. J. Med. Genet.- 2000,- V.91- P.39-45.

91. Kalousek D.K., Barrett I.J., Gartner A.B. Spontaneous abortions and confined placental mosaicism // Hum. Genet.- 1992.- V.88.- P.642-646.

92. Kalousek D.K., Dill F.J. Chromosomal mosaicism confined to the placenta in human conceptions // Science.- 1983,- V.221.- P.665-667.

93. Kalousek D.K., Langlois S., Robison W.P., Telenius A., Bernard L., Barrett I.J., Howard-Peebles P.N., Wilson R.D. Trisomy 7 CVS mosaicism: pregnancy outcome, placental and DNA analysis in 1.4 cases // Am. J. Med. Genet.-1996,- V.65.- P.348-352.

94. Nielsen К., Petersen M.B. Origin of non-disjunction in trisomy 8 and trisomy 8 mosaicism // Eur. J. Hum. Genet.- 1998.- V.6.- P.432-438.

95. Lam Y.H., Tang M.H.Y., Sin S.Y., Ghosh A. Clinical significance of amniotic fluid cell culture failure // Prenat. Diagn.- 1998.- V.18.- P.343-347.

96. Lamb N.E., Freeman S.B., Savage-Austin A., Pettay D., Taft L., Hersey J. Susceptible chiasmate configurations of chromosome 21 predispose to non-disjunction in both maternal meiosis I and meiosis II // Nat. Genet.- 1996.-V.14.- P.400-405.

97. Lauritsen J.G. Aetiology of spontaneous abortion // Acta Obstet. Gynecol. Scand. Suppl.- 1976.-V.52.-P.l-29.

98. Lestou V.S., Kalousek D.K. Confined placental mosaicism and intrauterine fetal growth // Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed.- 1998,- V.79.-P.223-226.

99. Lin С., De Braekeleer M., Jamro H. Gytogenetic studies in spontaneous abortions: the Calgary experience // Can. J. Genet. Cytol.- 1985.- V.27.-P.565-570.

100. Lomax B.L., Kalousek D.K., Kuchinka B.D., Barrett I.J., Harrison K.J., Safavi H. The utilization of interphase cytogenetic analysis for the detection of mosaicism // Hum. Genet.- 1994,- V.93.- P.243-247.

101. Lombardi S.J., Dev V.G. Cytogenetic discrepancies in spontaneous abortions with direct and culture analysis of chorionic villi // Am. J. Obstet. Gynecol. 1992,- V.170.- P.264.

102. Markert C.L., Petters R.M. Manufactured hexaparental mice show that adults are derived from three embryonic cells // Science.- 1978,- V.202.- P.56-58.

103. McFadden D.E., Pantzar J.T. Placental pathology of triploidy // Hum. Pathol.- 1996,- V.27.-N 10,-P.1018-1020.

104. Merz E. Ultrasound in gynecology and obstetrics.- Stuttgart.: Georg Thieme Verlag, 1991,- 343 p.

105. Meulenbroeck G.H.M., Geraedts J.P.M. Parental origin of chromosome abnormalities in spontaneous abortions //Hum. Genet.- 1982.- V.62.- P. 129133.

106. Miller J.F., Williamson E., Glue J. Foetal loss after implantation: a prospective study // Lancet.- 1980,- V.l 1.- P.554-556.

107. Minelli E., Buchi С., Granata P., Meroni E., Righi R., Portentoso P., Giudici A., Ercoli A., Sartor M.G., Rossi A. Cytogenetic findings in echographi-cally defined blighted ovum abortions // Ann. Genet.- 1993,- V.36.- N 2,- P.107-110.

108. Moore G.E., Ruangvutilert P., Chatzimeletiou K., Bell G., Chen C-K., Johnson P., Harper J.C. Examination of trisomy 13, 18 and 21 foetal tissues at different gestagional ages using FISH // Eur. J. Hum. Genet.- 2000.- V.8.- P.223-228.

109. Nicolaidis P., Petersen M.B. Origin and mechanisms of nondisjunction in human autosomal trisomies // Hum. Reprod.- 1998,- V.13.- N 2.-P.313-319.

110. Ohno M., Maeda Т., Matsunobi A. A cytogenetic study of spontaneous abortions with direct analysis of chorionic villi // Obstet. Gynecol.-1991.-V.77.- P.394-398.

111. Pangalos C., Avramopoulos D., Blouin J., Raoul O., de Blois M., Priur M., Schinzel A. Understanding mechanism(s) of mosaic trisomy 21 by using DNA polymorphism analysis // Am. J. Hum. Genet.- 1994.- V.60.- P.917-927.

112. Pauer H.U., Beust G., Bartels I. Zytogenetische ursachen von aborten // Reproduktionsmedizin- 1999 V.15 - P.124-132.

113. Penrose L.S., Delhanty J.D.A. Triploid cell cultures from a macerated fetus // Lancet.-1961,- V.I.- P.1261-1263.

114. Persutte W.H., Lenke R.P. Failure of amniotic-fluid cell growth: is it related to fetal aneuploidy? // Lancet 1995 - V.345.- P.96-97.

115. Qumsiyeh M.B. Chromosome abnormalities in the placenta and spontaneous abortions // J. Maternal-Fetal Med.- 1998,- V.7.- P.210-212.181

116. Qumsiyeh M.B., Kim K.R., Ahmed M.N., Bradford W. Cytogenetics and mechanisms of spontaneous abortions: increased apoptosis and decreased cell proliferation in chromosomally abnormal villi // Cytogenet. Cell Genet.- 2000,-V.88.- N 3-4.- P.230-235.

117. Rao Y.V.N.G., Schnittger S., Hansmann I. Chromosomal localisation of the human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene to or close to 20pl2 by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet.- 1991,- V.56.- P. 169-170.

118. Reddy K.S. Double trisomy in spontaneous abortions // Hum. Genet.- 1997,- V.101.- P.339-345

119. Reddy K.S. Triple aneuploidy in spontaneous abortions // Clin. Genet.- 1999,-V.56.-P.103-104.

120. Rehder H., Coerdt W., Eggert R., Klink F., Schwinger E. Is there a correlation between morphological and cytogenetic findings in placental tissue from early missed abortions? // Hum. Genet.- 1989,- V.82.- N 4 P.377-385.

121. Reid R., Sepulveda W., Kyle P.M., Davies G. Amniotic fluid culture failure: clinical significance and association with aneuploidy // Obstet. Gynecol.-1996,- V.87.- P.588-592.

122. Roberts C.J., Lowe D.B. Where have all the conceptions gone? // Lancet.-1975.- V.I.- P.498-499.

123. Robinson W.P., Bernasconi F., Lau A., McFadden D.E. Frequency of meiotic trisomy depends on involved chromosome and mode of ascertainment // Am. J. Med. Genet.- 1999,- V.88.- P.34-42.182

124. Rocchi M., Archidiacono N., Carbone R., Bolino A., Shridhar V., Ward D.C., Baldini A. Isolation of a human chromosome 22-specific alpha satellite clone // Cytog. Cell Genet.-1991,- V.58.- P.2050-2051.

125. Rocchi M., Archidiacono N., Ward D.C., Baldini A. A human chromosome 9-specific alphoid DNA repeat spatially resolvable from satellite 3 DNA by fluorescent in situ hybridization // Genomics.-1991.- V.9.- P.517-523.

126. Rocchi M., Baldini A., Archidiacono N., Lainwala S., Miller O.J., Miller D.A. Chromosome-specific subset of human alphoid DNA identified by a chromosome 2-derived clone // Genomics.- 1990.- V.8.- P.705-709.

127. Rooney D.E., Czepulkowski B.H. (eds) Human cytogenetics. A practical approach.- New York.: Oxford University Press, 1992.- V.I.- P.157-192.

128. Sanchez J.M., Franzi L., Collia F., De Diaz S.L., Panal M., Dubner M. Cytogenetic study of spontaneous abortions by transabdominal villus sampling and direct analysis of villi //Prenat. Diagn.- 1999,- V.19.- P.601-603.

129. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosome // Lancet.-1971.- V.2.- P.971-972.

130. Sebire N.J., Fowler D., Roberts L., Mahmood S., Nicolaides K.H. Short communication: Trophoblast proliferation is increased in chorionc villi from pregnancy with fetal trisomy 18 // Placenta.- 2000,- V.21.- N 5-6.- P.584-586.

131. Simoni G., Sirchia S.M. Confined placental mosaicism // Prenat. Diagn.-1994,-V.14.-P.l 185-1189.

132. Snow M.H. Tetraploid mouse embryos produced by cytochalasin В during cleavage // Nature.- 1973,- V.244.- P.513-515.

133. Sundberg K., Jorgessen F.S., Tabor A., Bang J. Experience with early amniocentesis // J. Perinat. Med.- 1995.- V.23.- P.149-158.183

134. Takahara H., Ohama К., Fujiwara A. Cytogenetic study in early spontaneous abortions // Hiroshima J. Med. Sciences.- 1977,- V.26.- N 4,- P.291-296.

135. Trent J.M., Stanisic Т., Olson S. Cytogenetic analysis of urological malignancies: study of tumor colony forming cells and premature chromosome condensation//J. Urol.- 1984.-V.131.-P.146-151.

136. Trisomy 15 CPM: probable origins, pregnancy outcome and risk of fetal UPD: European Collaborative Research on Mosaicism in CVS // Prenat. Diagn.- 1999,-V.19.-N 1,- P.29-35.

137. Wakuda K., Yoshida Y. DNA ploidy and proliferative characteristics of human trophoblasts // Acta Obstet. Gynecol. Scand- 1992 V.71.- N 1- P.12-16.

138. Wapner R., Jackson L., Davies G., Barr M., Них С. Cytogenetic discrepancies found at chorionic villus sampling // Am. J. Hum. Genet.- 1985,- V.37 (suppl.).- A. 122.

139. Warburton D., Fraser F.C. Spontaneous abortion risk in man: data from reproductive histories collected in a medical genetics unit // Am. J. Hum. Genet.- 1964,- V.16.- P.l-24.

140. Warburton D., Kinney A. Chromosomal differences in susceptibility to meiotic aneuploidy // Environmental Mol. Mutagenesis.- 1996,- V.28.- N 3,-P.237-247,

141. Warburton D., Stein Z., Kline J. et al. Chromosome abnormalities in spontaneous abortion. Data from New York city studies // Human embryonic and fetal death. Porter I.H., Hook E.B. eds.- New York.: Academic Press, 1980,-P.261-314.

142. Warburton D., Yu C.Y., Kline J., Stein Z. Mosaic autosomal trisomy in cultures from spontaneous abortions // Am. J. Hum. Genet.- 1978.- V.30.- N 6,-P.609-617.

143. Watt J.L., Templeton A.A., Messinis I., Bell L., Cunningham P., Duncan R.O. Trisomy 1 in an eight cell human pre-embryo // J. Med. Genet.-1987.- V.24.-P.60-64.

144. Wilkinson T.A., James R.S., Crolla J.A., Cockwell A.E., Cambell P.L., Temple I.K. A case of maternal uniparenatal disomy of chromosome 9 in association with confined placental mosaicism for trisomy 9 // Prenat. Diagn.- 1996,-V.16.-N4.- P.371-374.

145. Wolstenholme J. Confined placental mosaicism for trisomies 2, 3, 7, 8, 9, 16 and 22: their incidence, likely origins and mechanisms for cell lineage compartmentalization//Prenat. Diagn.- 1996,- V.16.- P.511-524.

146. Wolstenholme J., Rooney D.E., Davison E.V. Confined placental mosaicism, IUGR and adverse pregnancy outcome: a controlled retrospective U.K. collaborative study//Prenat. Diagn.- 1994,- V.14.- P.345-361.

147. Zaragoza M.V., Jacobs P.A., James R.S., Rogan P., Sherman S., Hassold T.J. Nondisjunction of human acrocentric chromosomes: studies of 432 fetuses and liveborns // Hum. Genet.- 1994,- V.94.- P.411-417.

148. Zaragoza M.V., Millie E., Redline R.W., Hassold T.J. Studies of non-disjunction in trisomies 2,1, 15 and 22: does the parental origin of trisomy influence placental morphology? // J. Med. Genet.- 1998,- V.35.- P.924-931.