Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний в РФ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат медицинских наук Иванова, Евгения Андреевна

• Иванова, Евгения Андреевна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Иванова, Евгения Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 КЛАССИФИКАЦИЯ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХ МИОТОНИЙ

1.2 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ ХЛОРНОГО ИОННОГО КАНАЛА С1.С-1

1.3 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА 14эу1.4

1.4 ДИАГНОСТИКА НДМ

1.5 СТРОЕНИЕ ХЛОРНОГО КАНАЛА С1.С-1

1.6 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА 0.041

1.7 СТРОЕНИЕ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА 1ЧАУ1.4

1.8 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА БС144А

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

11.1 МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

11.2 ЭЛЕКТРОМИОГРАФИЯ

11.3 ЗАБОР ВЕНОЗНОЙ КРОВИ

11.4 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ

11.5 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

11.6 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ

11.6 ПРЯМОЕ АВТОМАТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

11.8 ПДРФ-АНАЛИЗ

11.9 МУЛЬТИПЛЕКСНОЕ ПРОБА-СПЕЦИФИЧНОЕ ЛИГИРОВАНИЕ

11.10 АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ

11.11 МЕТОДЫ СТАТИСТИКИ

11.12 АНАЛИЗ НЕРАВНОВЕСИЯ ПО СЦЕПЛЕНИЮ

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

N1.1 АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ

111.2 СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА 0.041

N1.3 ЧАСТЫЕ МУТАЦИИ ГЕНА С1.С1\11

N1.4 СООТНОШЕНИЕ МТ И МБ В ИССЛЕДОВАННОЙ ВЫБОРКЕ

N1.5 ПОПУЛЯЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИИЕ ЧАСТОТЫ МУТАЦИИ С.2680С>Т (Р.А1^894*) В ГЕНЕ С1-041

111.6 АНАЛИЗ НЕРАВНОВЕСИЯ ПО СЦЕПЛЕНИЮ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГАПЛОТИПА «ОСНОВАТЕЛЯ»

111.7 СЛУЧАИ ХЛОРНЫХ МИОТОНИЙ С ОДНОЙ ВЫЯВЛЕННОЙ МУТАЦИЕЙ

111.8 СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА SCN4A

111.9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛЕЙ «ХЛОРНЫХ» И «НАТРИЕВЫХ» МИОТОНИЙ В СТРУКТУРЕ НДМ

111.10 АЛГОРИТМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ НДМ

IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ

V ВЫВОДЫ

VI СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

У-

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриамид

АД - аутосомно-доминантный

АР - аутосомно-рецессивный

БАА - бисакриламид

ВМ - врожденная миотония

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЭМГ - игольчатая электромиография

КЗМ - калий - зависимая миотония

МБ - миотония Беккера

млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов

МТ - миотония Томсена

НатМ - натриевая миотония

НДМ - недистрофическая миотония

МЭКВ/Л - милли-грамм-эквивалент на литр

ПААГ - полиакриамидный гель

ПДАФ - полиморфизм длин амплификационных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ - парамиотония Эйленбурга

сМ - сантиморганида

СС - спорадический случай

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ФГБУ МГНЦ РАМН - Федеральное государственное бюджетное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

CLCN1 - chloride channel

HGMD - Human Genetic Mutation Database

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

SCN4A - sodium channel, voltage-gated, type IV, alpha subunit

SNP - Single Nucleotide Polymorphism

TBE - трис-боратный буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний в РФ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Недистрофические миотонии (НДМ) - группа заболеваний, ведущим симптомом которых является феномен миотонии, они относятся к группе мышечных каналопатий. Миотония составляет симптомокомплекс некоторых наследственных нервно-мышечных патологий (миотоническая дистрофия тип 1 и 2, пароксизмальная миоплегия, синдром Шварца - Джампела) или является ведущим симптомом при миотониях Томсена (МТ) и Беккера (МБ), парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), гиперкалиемическом параличе с миотонией (ГиперКП) и калий-зависимой миотонии (КЗМ). Последняя группа заболеваний отличается от вышеприведенных и этипатогенезом, и отсутствием дистрофического паттерна в клинической картине. Отсюда и возникла тенденция разделить все миотонические синдромы на дистрофические (ДМ) и недистрофические (НДМ).

Недистрофические миотонии представляют собой гетерогенную клинически полиморфную группу заболеваний, причиной которых являются мутации в генах ионных каналов хлорного и натриевого - СЬСЫ1 и Б СN4А. Фенотипы больных различными формами НДМ перекрываются и варьируют как среди пациентов с определенным типом НДМ, так и внутри одной семьи. На этапе клинического осмотра трудно отличить МТ и МБ между собой. Реже, но, тем не менее, затруднена дифференциальная диагностика ПЭ, ГиперКП и КЗМ друг от друга. Тяжелее всего в спорадических случаях с фенотипом МТ предположить ген, мутации в котором вызывают проявления заболевания. Зачастую, верным шагом диагностики является поиск мутаций в гене СЬСЫ1, но в некоторых случаях этого недостаточно для подтверждения диагноза. Только после молекулярно-генетического анализа гена 8СИ4А можно выявить истинную причину заболевания.

Молекулярно-генетический анализ генов ионных каналов всегда представляет собой довольно трудоемкий и длительный процесс. Это обусловлено большим размером анализируемых генов и широким разнообразием мутаций, распределенных, как правило, по всей кодирующей последовательности данных

генов. Так и в случае НДМ, причинами заболеваний являются мутации генов, кодирующих хлорные и натриевые ионные каналы скелетных мышц. Спектры мутаций этих генов представлены подавляющим числом миссенс - замен, наряду с относительно небольшим числом других типов мутаций. Это затрудняет ещё и трактовку результатов исследования: не всегда очевиден эффект миссенс - замены для конкретного больного, особенно в изолированных случаях, когда сегрегационный анализ невозможен. По этим причинам молекулярно-генетический анализ генов CLCN1 и SCN4A для пациентов с различными НДМ следует проводить в больших группах пациентов, в которых хорошо представлены различные фенотипы и доступен материал родственников пробанда для проведения сегрегационного анализа. Не менее информативными остаются и описания больших семей с внутрисемейным клиническим полиморфизмом.

Актуальным является проведение подобных исследований для каждой страны, так как в различных регионах наблюдается накопление характерных частых мутаций гена CLCN1 и подтверждается выявление «горячих» экзонов гена SCN4A, что увеличивает эффективность поиска мутаций в каждом из генов.

В связи с тем, что долгое время врожденная миотония не признавалась как отдельная нозологическая форма и описана сравнительно недавно (1976 год), молекулярно-генетические методы недоступны для внедрения в диагностический процесс, оценка частоты распространенности недистрофических миотоний на данный момент очень приблизительна. Частота миотонии Томсена в Европе ранее оценивалась как 1:23 ООО человек, а миотонии Беккера - 1:50 ООО [Becker 1977]. С появлением и развитием молекулярно-генетических методов стало понятно, что частота миотонии Томсена гораздо более низкая, чем предполагалось ранее. В одних семьях, где ранее предполагался доминантный тип наследования, установлен псевдодоминантный, и их стали относить к случаям миотонии Беккера; в других - выявлены мутации в гене, кодирующем натриевые ионные каналы скелетных мышц - их стали причислять к другим формам НДМ. Следовательно, и частота миотонии Беккера должна быть значительно выше, чем её оценивали ранее, но точных данных по этому поводу нет. Самой частой врожденная миотония

(ВМ), как ранее назывались миотонии Томсена и Беккера, является в странах Скандинавии -1:10 ООО [Sun et al. 200J].

Очевидно, что с появлением возможности подтвердить клинический диагноз молекулярно-генетическими методами появилась возможность разработки эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики на основе частот встречаемости различных форм НДМ с целью оптимизировать использование дорогостоящих молекулярно-генетических методов, уточнить диагностические критерии, по которым можно поставить верный предварительный диагноз и тип наследования миотонии в данной семье.

На сегодняшний день исследований с участием больших групп пациентов с диагнозом недистрофической миотонии в России не проводилось, не разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики миотоний и в русскоязычной литературе упоминания о миотонии довольно скудные. Распространенность оценивается не более 3-5 случаев на 100 ООО [Гузеева 2009]. Соответственно, на данном этапе недистрофические миотонии в России являются малоизученными нозологическими формами.

Цель

Целью настоящего исследования является создание эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики для пациентов с различными формами недистрофических миотоний.

Задачи

1. Провести поиск мутаций генов СЬСЫ1 и БСША в выборке неродственных пациентов с недистрофическими миотониями, проживающих на территории РФ, описать спектр выявленных изменений;

2. Выявить особенности спектров мутаций генов СЬСЫ1 и БСЫ4А , исследовать возможные причины распространения повторяющихся мутаций генов СЬСЫ! и БСМА-,

3. Определить доли хлорных и натриевых миотоний среди пациентов с недистрофическими миотониями;

4. Определить расчетную частоту встречаемости миотонии Томсена и миотонии Беккера на территории РФ;

5. Разработать эффективный алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с недистрофическими миотониями.

Научная новизна

Впервые в России проведен молекулярно-генетический анализ генов СЬСИ1 и БСША, задействованных в патогенезе не дистрофических миотоний, описан спектр мутаций в них.

В гене СЬСИ1 выявлено 18 ранее неописанных мутаций. Впервые определены частые мутации гена СЬСЫ1 у пациентов РФ (замены р.С1у1908ег, с.1437_145(Ме1, р.А1а493С1и, р.ТЬг550Ме1, р.Туг686* и р.А^894*, составляющие 59% всех хромосом с мутациями) и разработана эффективная система их выявления.

В гене БСИ4А выявлено 10 различных миссенс мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов, из которых пять мутаций выявлены впервые. Определены «горячие» экзоны гена БСША.

Подсчитаны доли «хлорных» и «натриевых» недистрофических миотоний в структуре миотоний у российских больных, составляющие 82% и 18%, соответственно.

Определена популяционная частота носительства мутации р.А^894* (1,2%) гена СЬСЫ1 и рассчитаны ожидаемые частоты миотонии Томсена (1:710) и миотонии Беккера (1:8165) на территории РФ. На основе частот встречаемости хлорных и натриевых миотоний, а также особенностей описанного спектра мутаций генов СЬСЫ1 и БСЫ4А разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с НДМ.

Практическая значимость

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики различных форм НДМ, что сделало возможным проведение прямой и косвенной диагностики НДМ. Созданы эффективные диагностические системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в гене СЬСИ1, ответственном за развитие МТ и МБ, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервно - мышечной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту

1. Информативность поиска мутаций у пациентов с НДМ в генах CLCN1 и SCN4A составляет 95%. Доли «хлорных» и «натриевых» миотоний в выборке российских больных составляют 82% и 18% соответственно.

2. Частыми мутациями в гене CLCN1 являются: замены p.Glyl90Ser, p.Ala493Glu, p.Thr550Met, p.Tyr686*, p.Arg894* и делеция c,1437_1450dell4, которые составляют 59% всех хромосом с мутациями. Разработана эффективная система их детекции. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ.

3. Популяционная частота мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) в гене CLCN1 составляет 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%). Причиной высокой популяционной частоты мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) гена CLCN1 является эффект «основателя».

4. Расчетная частота миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равна 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26) соответственно. Доли миотоний Томсена и Беккера в выборке пациентов с НДМ равны 8% и 92% соответственно.

5. Экзоны 12, 13 и 22 гена SCN4A являются «горячими», мутации в них обуславливают 79% случаев натриевых миотоний.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы отражены в 10 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010; международном семинаре по исследованию наследственных каналопатий в Беатенберге, Швейцария 2010; на II и III Всероссийских конференциях по редким заболеваниям и редко применяемым медицинским технологиям "ДОРОГА ЖИЗНИ" 2011, 2012; на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009 и 2012, на конференциях European Human Genetics Conference 2009, 2010, 2011, 2012.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ LI КЛАССИФИКАЦИЯ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХМИОТОНИЙ

Миотония (myotonia; греч. mys, my[os] - мышца + tonos - напряжение) -состояние повышенного возбуждения поперечнополосатых мышц, которое приводит к их замедленной релаксации после произвольного сокращения или механической стимуляции. Миотония составляет симптомокомплекс некоторых наследственных нервно-мышечных патологий (миотоническая дистрофия тип 1 и 2, пароксизмальная миоплегия, синдром Шварца - Джампела) или является ведущим симптомом при миотониях Томсена (МТ) и Беккера (МБ), парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), калий-зависимой миотонии (КЗМ). Последняя группа заболеваний отличается от вышеприведенных и этиопатогенезом, и отсутствием дистрофического паттерна в клинической картине. Отсюда и возникла тенденция разделить все миотонические синдромы на дистрофические (ДМ) и недистрофические (НДМ).

Недистрофические миотонии (НДМ) - группа заболеваний, ведущим симптомом которых является феномен миотонии, они относятся к группе мышечных каналопатий. Каналопатии - обширная группа заболеваний, характеризующаяся патологией ионных каналов различных тканей организма. Ионные каналы скелетных мышц принадлежат к семейству потенциал-зависимых ионных каналов, которые регулируют возбудимость сарколеммы. Мышечные каналопатии характеризуются гипервозбудимостью сарколеммы (миотония), гиповозбудимостью (парезы и параличи) или их сочетанием. Состояние сарколеммы - критерий, с помощью которого можно охарактеризовать и разделить недистрофические миотонии на клинико-генетические формы (рис.1). Приведенная ниже классификация основана на различии в причинах возникновения миотоний, а именно, на том, какие генетические изменения приводят к фенотипу миотонии.

НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ

МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ

ПАТОЛОГИЕЙ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ ПАТОЛОГИЕЙ ХЛОРНЫХ КАНАЛОВ

(НАТРИЕВЫЕ МИОТОНИИ) (ХЛОРНЫЕ МИОТОНИИ)

ГИПЕРКАЛИЕ МИЧЕСКИЙ ПАРАЛИЧ С МИОТОНИЕЙ

ПАРАМИОТОНИЯ ЭЙЛЕНБУРГА

КАЛИИ-

ЗАВИСИМАЯ

МИОТОНИЯ

миотония

TOMCEHA

миотония

БЕККЕРА

ВАРИАБЕЛЬНАЯ МИОТОНИЯ

ПЕРМАНЕНТНАЯ МИОТОНИЯ

АЦЕТАЗОЛЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ МИОТОНИЯ

Рис. 1. Классификация недистрофических миотоний (адаптировано из [Mankodi А.

2008]).

Исходно миотонии Томсена и Беккера назывались врожденными миотониями (ВМ), а миотония Беккера также генерализованной миотонией (ГМ). Позднее описан фенотип парамиотонии Эйленбурга. С появлением возможности подтверждения диагноза молекулярно-генетическими методами выделены калий-зависимые миотонии. С внедрением в диагностическую практику молекулярно-генетического анализа причинных генов стало понятно, что установление формы миотонии на основании только клинических критериев не всегда подтверждается выявлением мутации в предполагаемом гене [Trip J. 2008].

Миотония возникает в результате снижения функциональной активности хлорных и натриевых каналов скелетных мышц (CLC-1, Nävi.4) [Matthews Е. 2010], приводящего к повышению возбудимости сарколеммы скелетных волокон соответственно, которое клинически проявляется замедленным расслаблением мышцы после сокращения. К снижению функциональной активности ионных каналов при недистрофических миотониях приводят мутации генов CLCN1 и SCN4A. С внедрением методов молекулярно-генетического анализа в алгоритм диагностики миотоний, возникла тенденция разделить НДМ на хлорные и натриевые согласно этиопатогенезу (рис.1).

1.2 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ

ХЛОРНОГО ИОННОГО КАНАЛА CLC-1

В группе НДМ наиболее распространенными являются миотонии Томсена [#160800] и Беккера [#255700]. Обе формы миотонии характеризуются наличием миотонического феномена и мышечной гипертрофией, но миотония Беккера считается более тяжелой формой с прогрессирующим течением [Гехш Б.М. 1982]. Клинически разграничение миотоний Томсена и Беккера в основном опирается на различие в типе наследования. Обе формы заболевания изначально назывались «врожденная миотония» (ВМ) [Colding-Jergensen Е. 2005, Ptâcek L.J. 2002]. Доминантно наследуемая ВМ впервые описана в 1976 году датским врачом Юлиусом Томсеном (Thomsen Asmus Julius Thomas) в собственной семье. Миотония проявляется ригидностью мышцы в начале движения, тяжесть проявления симптома выражается во времени задержки расслабления. Напряжение спадает после повторения движения несколько раз, это явление носит название «феномен врабатывания» («warm-up» phenomenon). Как правило, наиболее выражена миотония икроножных и бедренных мышц. Обычно эта форма миотонии манифестирует в раннем младенчестве [.Lerche H. 1993, Pusch M. 2002].

В 1977 году профессор Беккер (Peter Emil Becker) первым описал рецессивно наследуемую генерализованную ВМ и сочетание миотонии с кратковременными парезами. Клинически МБ проявляется в раннем детстве или подростковом периоде. Изначально может присутствовать гипертрофия только икроножных мышц, к которой постепенно присоединяется гипертрофия бедренных, плечевых, шейных мышц, из-за чего МБ называют «восходящей» [Kubisch С. 1998]. Редко пациенты с тяжелой формой МБ могут жаловаться на миалгии, развивающиеся мышечные крампи, как правило, в период отдыха после тяжелых физических нагрузок.

Во всех описаниях пациентов с ВМ возраст манифестации МТ указывают «с рождения», а МБ - «в раннем детстве», «в первой декаде жизни» и т.п. Хотя более

тяжелая рецессивная форма, казалось бы, предполагает проявление признаков заболевания раньше, чем доминантная. Возможно, это связано с вариабельностью клинической картины среди пациентов с миотониями в общем [Lehmann-Horn F 1999, Lehmann-Horn F 1995]. Также в семьях с МТ младенец окружен большим вниманием со стороны родителей, так как один из них уже страдает от заболевания. Поэтому первые симптомы замечают раньше. Колебания во времени проявлений признаков МТ и МБ и их тяжести могут быть обусловлены погрешностями в диете, недосыпанием, длительной физической нагрузкой, особенно на холоде и эмоциональным стрессом. Также миотония может стать клинически более выраженной у женщин во время менструаций и беременности, что может быть результатом функциональной перестройки белка хлорного канала CLC-1, обусловленной влиянием половых гормонов [Fialho D 2008]. В целом наличие отличительных признаков между МТ и МБ весьма условно и не позволяет дифференцировать их клинически в большинстве случаев (табл.1).

Распространенность миотонии Томсена в Европе ранее оценивалась как 1:23 ООО человек, миотонии Беккера - 1:50 ООО [Rojas C.V. 1991], а распространенность недистрофических миотоний в общем составляла 1:100 ООО [Meyer-Kleine К. 1995]. Но последняя цифра сильно занижена, так как если суммировать частоту подсчитанных Беккером частот, получим 6:100 000. С появлением и развитием молекулярно-генетических методов стало понятно, что частота миотонии Томсена гораздо более низкая, чем предполагалось ранее. Следовательно, и частота миотонии Беккера должна быть значительно выше, чем прежде считалось. На данный момент, частота МТ и МБ по различным источникам колеблется от 2 до 7,3 на 100 000 человек [Рарропеп Н. 1999]. Самой распространеной ВМ на данный момент является в странах Скандинавии - 9,7:100 000 [Sun С. 2001].

Табл.1. Основные признаки недистрофических миотоний (Адаптировано из [Trip J.

2008])

МИОТОНИЯ ТОМСЕНА МИОТОНИЯ БЕККЕРА ПАРАМИОТОНИЯ ЭЙЛЕНБУРГА КАЛИИ-ЗАВИСИМАЯ МИОТОНИЯ

Вариабельная МИОТОНИЯ Перманентная МИОТОНИЯ Ацетозол-чувствительная МИОТОНИЯ

Ген СЬСИ1 СЬСЫ1 БС№А БСША БСМА БСША

Тип насл-я АД АР АД АД АД АД

Возраст манифеста ции С рождения, ранее детство Первая декада жизни С рождения <10 лет <10 лет <10 лет

Особенности проявления миотонии Усиливаете я после отдыха Усиливаете я после отдыха Пародоксальная миотония часто проявляется на холоде Отложенное проявление симптомов Генерализова на преимущест венно в мышцах шеи и плеча Вариабельна в течение жизни

Феномен «врабатыван ия» Да Да Нет Нет Нет Нет

Пародоксаль ная миотония Нет Нет Да Нет Нет Нет

Прогрессиро вание симптомов Нет, варьирует в течение жизни Несколько лет прогрессии рования, после чего состояние стабилизи руется Нет Нет Нет Нет

Другие особенности Нет Часто мышечная слабость после отдыха, проходящая в процессе работы мышц Мышечная слабость усиливается на холоде Миотония усугубляется с увеличением концентрации ионов К+ в крови Миотония усугубляется с увеличением концентраци и ионов К+в крови Миотония усугубляется с увеличением концентрации ионов К+ в крови, физическая нагрузка вызывает боль в мышцах

1.3 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА Navl.4

К группе заболеваний, обусловленных инактивацией натриевых каналов, относятся следующие наследственные мышечные заболевания: гипер-, нормо- и гипокалиемические периодические параличи, врожденная парамиотония Эйленбурга, калий-зависимая миотония, которая включает в себя миотонию с волнообразным течением (myotonia fluctuans), миотония с равномерным течением (myotonia permanents), миотонию, чувствительную к ацетазоламиду [Саппоп S.C. 2000, Jurkat-Rott К. 2000] (рис.1). Первые четыре из вышеперечисленных заболеваний хорошо известны, последние три идентифицированы не так давно и включены в данную группу заболеваний на основании единого молекулярного дефекта. Все перечисленные заболевания наследуются по аутосомно-доминантно.

Парамиотония Эйленбурга [#168300], описанная Эйленбургом (Von Eulenburg) в 1886 году, отличается от ВМ по нескольким аспектам (табл.1). Во-первых, для ПЭ характерна парадоксальная миотония (симптомы ухудшаются с повторением движений) - явление, обратное эффекту «врабатывания» ("warm-up phenomenon") при МТ и МБ. Во-вторых, миотония при ПЭ провоцируется и усугубляется с понижением температуры [Michel Р. 2007, Nurputra D.K. 2012, Parasivam S. 2009]. В-третьих, продолжительные физические нагрузки на холоде могут вызывать мышечную слабость в течение нескольких часов. Распространенность ПЭ составляет 1 на 356 ООО [PtâêekL.J. 1994, Саппоп S.C. 2000].

Из всех периодических параличей наличие симптома миотонии описано при гипер кал иемическом варианте (ГиперКП) [#170500], это своеобразная «переходная» форма между миотониями и периодическим параличом [Илларыошкин С.Н. 2002]. У пациентов с ГиперКП обнаруживают симптомы ПЭ, и, наоборот, у пациентов с ПЭ случаются приступы периодического паралича [Yoshinaga H. 2012, Park J.H. 2010]. Тип наследования заболевания — аутосомно-доминантный. Оно дебютирует в младенческом или детском возрасте. Приступы

выраженной генерализованной мышечной слабости развиваются в период отдыха, через 20—30 мин после интенсивной физической нагрузки («отложенная» миотония). В начале слабость возникает в нижних конечностях, затем — в верхних; продолжительность приступов — от 15 до 60 мин. Дыхательная мускулатура, как правило, не страдает. При этом типе паралича миотония обычно обнаруживается только на ЭМГ. Во время приступа часто, но не всегда уровень калия в крови превышает верхнюю границу нормы (5,0-6,0 мэкв/л).

С развитием молекулярно-генетической диагностики в группе НДМ выделилось ещё три формы доминантно наследуемых миотонии, причиной которых было нарушение быстрой инактивации натриевых каналов скелетных мышц - калий-зависимые миотонии (КЗМ) [#608390] [Groome J.R. 2005, Cannon S.C. 2000, McClatchey A.I. 1992].

Волнообразная (флуктуирующая) миотония [#170500]. Заболевание характеризуется симптомами парамиотонии, которые проявляются в течение получаса после физических упражнений («отложенная» миотония) и длятся в течение часа. Интенсивность миотонического феномена варьирует день ото дня и увеличивается при воздействии холода, приеме препаратов натрия и агентов, вызывающих деполяризацию мембраны мышечного волокна (например, суксаметония).

Перманентная миотония [#603967]. Выраженная продолжительная миотония, с вовлечением дыхательной мускулатуры. У больных наблюдается значительная гипертрофия мышц. Эту форму наиболее сложно отличить клинически от ВМ.

Ацетазол-зависимая миотония [#608390]. Миотонические симптомы сопровождаются возникновением мышечных гипертрофий, мышечными болями и скованностью. Мышечная слабость не характерна. Отмечен терапевтический эффект при приеме ацетазоламида [Ptacek L.J. 1994, Pusch М. 2002, Cannon S.C. 2000, VicartS. 2005] (табл. 1).

1.4 ДИАГНОСТИКА НДМ

Характерный для пациентов с недистрофическими миотониями феномен задержки расслабления мышц (миотония) выявляется, во-первых, с помощью стандартного неврологического осмотра перкуторно, во-вторых, подтверждается электромиографически и молекулярно-генетически. Наличие миотонии может быть установлено с помощью игольчатой электромиографии (ИЭМГ). Миотония характеризуется характерным высокочастотным разрядом, сопровождающимся характерным звуком «пикирующего бомбардировщика», если запись сделана и с помощью акустической ЭМГ [Fialho D. 2007].

Семейный анамнез способствует разграничению миотоний Томсена и Беккера в некоторых случаях, но не во всех, так как экспрессия заболевания довольно вариабельна. Истинный аутосомно-доминантный тип наследования исключает миотонию Беккера, но отсутствие клинических проявлений у родителей пациента менее информативно, так как заболевание может быть вызвано мутациями de novo (на данный момент экспериментальных подтверждений этой теории нет), или проявляться у родителя, передавшего пробанду мутацию, только на ЭМГ (латентная миотония).

Мышечная биопсия не является обязательной частью диагностического процесса, так как при микроскопии не обнаруживается никаких специфичесиких маркеров наследственной миотонии [Гехт Б.М. 1982].

Самым сложным этапом является дифференциальная диагностика между недистрофическими миотониями Томсена и Беккера, парамиотонией Эйленбурга и калий-зависимыми миотониями. В основном, даже на стадии клинического осмотра и составления родословной можно предположить причину миотонии по ее характеру и особенностям течения. Но в случаях гетерогенности клинических проявлений или мягкой, слабовыраженной клинической картины у пациента предположить форму миотонии затруднительно. Последовательный поиск мутаций

в генах CLCN1 и SCN4A необходим для выяснения причины миотонии [Jurkat-Rott К 2002].

Очевидно, что с развитием молекулярно-генетических методов появилась возможность уточнить диагностические критерии, по которым можно с большой долей достоверности поставить верный диагноз и определить тип наследования миотонии. Например, врачи отделения неврологии голландской клиники при университете в городе Маастрихт (Maastricht) [Trip J. 2008], смогли по клиническим критериям выбрать из голландской базы данных 54 семьи с диагнозом «недистрофическая миотония» (НДМ), которые согласились на сотрудничество и участие в научной работе. Для этой группы пациентов неврологи департамента также подтвердили наличие миотонии с помощью игольчатой ЭМГ и провели дифференциальную диагностику между миотониями Томсена и Беккера и парамиотонией Эйленбурга с калий-зависимыми миотониями, таким образом, предположив, в каком гене следует в первую очередь искать генетические изменения. Проанализировав молекулярно-генетическими методами ДНК всех пробандов и их родственников, данная группа исследователей подтвердила диагноз у всех 54 пациентов. При этом у 32 пробандов из 54 выявлены мутации в гене CLCN1(59%), у остальных 22 - в гене SCN4A (41%). Это самый выдающийся результат в сравнении с аналогичными исследованиями, которые не включали в себя молекулярно-генетический анализ гена SCN4A. В других случаях выявляемость мутация у пациентов варьировала от 40% до 75% в зависимости от размера группы пациентов и входных критериев отбора [Meyer-Kleine С. 1995, FahlkeC. 1997, Colding-Jorgensen Е. 2005].

1.5 СТРОЕНИЕ ХЛОРНОГО КАНАЛА CLC-1

Миотония (от греч. ту о - мышца; от лат. tonus - напряжение) характеризуется задержкой расслабления мышц после произвольного сокращения. Данный феномен возникает вследствие нарушения синхронизации работы ионных каналов в мембране миофибрилл. Во время потенциала действия критическим в механизме противодействия деполяризующему влиянию потенциала калия, накапливающегося в Т-трубочках, является хлорный потенциал. Повторяющийся потенциал действия из-за эффекта накопления ионов калия увеличивает деполяризацию мембраны до 10 мВ и больше. В нормальной мышце это компенсируется стабилизирующим током отрицательно заряженных ионов хлора. При миотонии ток ионов хлора снижен из-за повреждения функциональной активности хлорных ионных каналов, накопление ионов калия в Т-трубочках деполяризует сарколемму и вызывает следующие один за одним потенциалы действия, и мышца постоянно находится в сокращенном состоянии, не успевая расслабиться [Colding-Jorgensen Е. 2005].

Ток ионов хлора осуществляется через потенциал зависимые ионные каналы. В семействе белков хлорных каналов выделяют 9 различных изоформ. Белки CLC-0, CLC-1, CLC-2, CLC-Ka и CLC-Kb принадлежат к ионным каналам плазматической мембраны клеток, тогда как остальные белки семейства относятся к мембранным белкам клеточных органелл.

Белок CLC-1 у человека - главный трансмембранный белок из семейства хлорных каналов, состоящий из 988 аминокислот [Meyer-Kleine С. 1995]. Структура хлорного канала стала понятна после детального анализа единичного реконструированного хлорного канала мраморного электрического ската Torpedo Marmorata в билипидной мембране. Белки хлорных каналов уникальны по своему строению. Они состоят из двух независимых селективных пор, аналогично «двуствольному дробовику» [Fahlke С. 1997], которые функционируют

самостоятельно без вспомогательных субъединиц в отличие от катионных ионных каналов. Селективность каждой субъединицы регулируется независимо быстрым воротным механизмом, в то же время обе поры могут быть одновременно закрыты общим медленным воротным механизмом. Окончательно димерную структуру хлорных каналов детализировали с помощью экспериментов с дифракцией рентгеновских лучей в 2002 году (рис.2). В них использована кристаллическая модель хлорного канала бактерий, и выявлена его гомодимерная структура с независимой порой в каждой субъединице \DutzlerR. 2002].

а

I

Рис.2. Строение субъединиц белка СЬС.

Порообразующие субъединицы идентичны, но антипаралельны друг другу и взаимно противоположно ориентированы в мембране, а - схематичное изображение субъединиц белка СЬС в мембране мышечного волокна; Ь -пространственное изображение 2-х субъединиц белка СЬС по отношению друг к другу, соединенных общим воротным механизмом. Красным на а и Ь отмечены участки, формирующие селективную пору хлорного канала, зелёным - 1Ч-конец белка, голубым - С-терминальные домены. Адаптировано из [Эшг1ег Я. 2002].

Пора сформирована высоко консервативными аминокислотными последовательностями: 08С1Р (124-128), ОКЕвР (230-234), вХРХР (482-486) и У578 (в скобках указаны номера аминокислот). Домены белка аналогично диполям ориентируюутся положительными концами внутрь поры, создавая тем самым наилучшие условия для селективности аниона хлора (рис.3). В опытах Стейенмейера на модели мыши с рецессивной формой миотонии впервые выявлена

мутация гена хлорного канала СЬсп1. Год спустя для миотонии человека картирован локус на хромосоме 7ц35 [АЬс1а11а J.A. 1992]. Вскоре после этого идентифицирован ген, состоящий из 23 кодирующих экзонов, и выявлены мутации гена СЬСШ у пациентов с аутосомно-доминантной и аутосомно-рецессивной миотониями Томсена и Беккера[АЪс/? М.С. 1992].

Рис.3. Структура селективного фильтра канала StCLC (Salmonella enterica serovar typhimurium). а - а-спирали доменов изображены в виде цилиндров, анион хлора показан в виде красной сферы, амино- (положительно зараженные) и карбоксильные (отрицательно заряженные) концы доменов N, D и F изображены синим и красным соответственно, b - полярные (белые прерывистые линии) и гидрофобные (зелёные прерывистые линии) связи иона хлора (красная сфера) с аминокислотами в селективной поре хлорного канала StCLC. Аминокислоты S107, 1109, F348, 1356, F357, Y445 гена хлорного канала StCLC соответствуют аминокислотам S125, 1127, Т475, G483, F484, Y578 гена CLCN1 человека. Адаптировано из [Dutzler R. 2002].

Как правило, патологичные мутации гена CLCN1 расположены в высоко консервативных доменах, участках, формирующих селективную пору и общий воротный механизм. Изменяя полярность, структуру белка они снижают селективность фильтра к ионам хлора, меняют потенциал чувствительность канала, порог деполяризации мембраны миофибриллы.

а

b

1.6 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА CLCN1

На данный момент описано более 150 мутаций гена CLCN1, ассоциированных с наследственной миотонией. Спектр мутаций разнороден: миссенс и нонсенс мутации [Meyer-Kleine К. 1995, Wu F.F. 2002], делеции, инсерции и мутации сайта сплайсинга [de Diego С. 1999, Gao F. 2010, Кио H.С. 2006]. Мутации, обуславливающие развитие МТ и МБ, распределены по всей кодирующей последовательности гена CLCN1 (рис.4). В одном из исследований отмечено сосредоточение мутаций с доминантно-негативным эффектом в экзоне 8 гена CLCN1, что заставляет задуматься о том, что этот регион является «горячим» для поиска в нем мутаций при МТ [Fialho D. 2007], но повторных подтверждающих результатов в литературе не встречается. Подавляющее количество мутаций уникальны для каждой семьи или изолированного случая миотонии.

Некоторые мутации, преимущественно миссенс, описаны для семей только с АД типом наследования при МТ, большинство мутаций встречаются в семьях с АР типом наследования миотонии в компаунд - гетерозиготном состоянии [Рарропеп Н. 1999]. Доминантные мутации подразделяются на мутации с полной пенетрантностью (p.Metl28Val, p.Glul93Lys, p.Thr268Met, p.Pro480Leu, p.fs872*) и доминантные с неполной пенетрантностью (р. А1аЗ 13Thr, p.Arg317Gln, p.Pro480Thr, p.Ile556Asn, p.Leul98Val, p.Ala218Thr, p.Leu283Phe, p.Phe307Ser, p.Gly482Arg, p.Phe708Leu). Последние шесть мутаций с неполной пенетрантностью выявлены в семьях с не определенным по тем или иным причинам типом наследования [Lossin С. 2008].

Несколько мутаций встречаются в семьях и с миотонией Томсена, и с миотонией Беккера, например: p.Arg894*, p.Gly200Arg, p.Thr268Met, p.Ala313Val, p.Gln552Arg, p.Ile556Asn, p.Gly230Glu, p.Ala531Val и другие [Chang T.Y. 2007]. Возможно, неполная пенетрантность или вариабельная экспрессия истинно доминантных мутаций может объяснить данный феномен, но подтверждений этой теории нет. Вариабельная тяжесть клинических проявлений и неполная

пенетрантность доминантных мутаций объяснены на данный момент не в полной мере. Существуют теории о гетерогенности в тяжести клинических проявлений, ассоциированной с определенными мутациями [Kubisch С. 1998] или существовании модифицирующих генов, которые влияют на функциональность хлорных каналов или аллельную экспрессию [Dune М. 2011]. Феномен доминантного и рецессивного наследования одних и тех же мутаций является отличительной особенностью для миотоний Томсена и Беккера, но не только для них. Подобная ситуация описана, например, для мутации p.Asp90Ala гена SOD1, ассоциированного с развитием наследственного варианта бокового амиотрофического склероза [Parton M.J. 2002]. В последствии, для всех семей с рецессивным типом наследования установлен эффект основателя. Для повторяющихся мутаций, задействованных в патогенезе миотонии эффект основателя не доказан.

Рис.4. Мутации гена CLCN1 с обозначением типа наследования и распределением их по доменам белка CLC - 1 [Lossin С, George AL Jr. 2008].

Особого внимания заслуживает мутация p.Arg894*, так как она описана в каждом исследовании спектра мутаций гена CLCN1, преимущественно в семьях с

наследования и другие

рецессивным типом наследования или в спорадических случаях в компаунд-гетерозиготном состоянии. Это позволяет предположить, что для нее характерен рецессивный тип наследования. Описаны редкие случаи, когда данная мутация выявлена в гетерозиготном состоянии у пациента в спорадическом случае [MeyerKleine С. 1995]. Исследователи объясняют этот факт обнаруженным в опытах «in vitro» слабым доминант - негативным эффектом, характерным для данной мутации. На наш взгляд более вероятно предположение о другой причине миотонии в подобных случаях, а наличие нонсенс-мутации объясняется высокой частотой популяционного носительства мутации с. 26800Т (p.Arg894*). Частота данной нонсенс-мутации в популяции известна лишь в Финляндии - 0,87%, где зарегистрирована самая высокая распространенность миотоний Томсена и Беккера [Рарропеп Н. 1999]. Возможно, такие большие значения популяционной частоты мутации могут быть объяснены эффектом основателя. Вероятно сочетание с усиливающим эффект или смягчающим клиническую картину фактором или неравная аллельная экспрессия в тех случаях, когда мутация p.Arg894* встречается единственной у пациента в семье с АД типом наследования. Также вероятно, используемые молекулярно-генетические методы не позволяют выявлять протяженные делеции. Это объясняет выявление «рецессивных» мутаций в гетерозиготном состоянии единственными у пациентов в спорадических случаях. В последнее время разработан набор для выявления протяженных делеций и дупликаций. Описано несколько вариантов данных генетических изменений в семьях с АР типом наследования [Modoni А. 2011, Raja Rayan D.L. 2012].

Некоторые доминантные мутации проявляются необычным фенотипом. Мутации p.Gly200Arg, p.Gln552Arg и p.Thr310Met выявлены у пациентов с мягким течением флуктуирующей миотонии [Lerche H. 1993, Wagner S. 1998, Wu F.F. 2002]\ p.Phe428Ser описана в случае проявления фенотипа, характерного для парамиотонии [Wu F.F. 2002\, p.Thr550Met - в случае проявления наряду с миотонией мышечной слабости и дисфагии; и p.Pro932Leu ассоциирована с дистальной миопатией [Nagamitsu S. 2000].

В каждой исследованной группе пациентов выявляют, как правило, мутации, которые встречаются наиболее часто. Например, среди населения северной Америки часто встречается миссенс мутация p.Gly230Glu [George A.L. 1993, Koty P.P. 1996]; среди населения стран Скандинавии - p.Phe413Cys. Мутации p.Phe413Cys и делеция 14 пар оснований в экзоне 13 (c.l437_1450dell4, p.Ile479Ilefs*25) гена CLCN1, приводящая к сдвигу рамки считывания считаются самыми распространенными мутациями среди пациентов с рецессивной формой миотонии в Европе [Koch M.С. 1992, Meyer-Kleine К. 1995]. В исключительных случаях в семье встречается более двух мутаций гена CLCN1, ассоциированных с развитием миотонии [Sun С. 2001]. Наличие пациентов с разными мутациями в компаунд - гетерозиготном состоянии в одной семье может отчасти объяснить клинически вариабельную пенетрантность [Sloan Brown К. 1997].

Так как мутации распределены по всей кодирующей последовательности гена CLCN1, и для наследственной миотонии характерна аллельная гетерогенность, остается необходимость в прямом автоматическом секвенировании всего гена. При этом анализируются кодирующие экзоны с прилегающими к ним интронными областями, но упускаются протяженные делеции и дупликации. Для постановки диагноза миотонии Томсена или миотонии Беккера выявление нонсенс мутаций и мутаций со сдвигом рамки считывания при молекулярно-генетическом исследовании гена CLCN1 наиболее информативны. Детекция миссенс замены предполагает проведение популяционного исследования и исследования in vivo с целью определения ассоциации этой замены с патологическим фенотипом в данной семье.

Как правило, отсутствия мутаций в кодирующей части гена CLCN1 недостаточно для постановки диагноза или его опровержения. В связи со схожестью фенотипов разных форм НДМ необходимым для верификации диагноза будет молекулярно-генетический анализ гена SCN4A.

1.7 СТРОЕНИЕ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА NAV1.4

Белок натриевого канала Nav1.4 образован порообразующей а - субъединицей и вспомогательной ßl - субъединицей, регулирующую её функцию. Но нарушение функции ßl - субъединицы Nav1.4 не обуславливает ни одного нервно-мышечного заболевания. Порообразующая субъединица содержит 4 домена по 6 трансмембранных сегментов в каждом, всего 16 экстра- и 11 интрацеллюлярных петель (рис.5). Вместе петли канала формируют пору канала. Главная функция поры - ионная селективность, в выполнении которой участвуют аминокислоты петель между сегментами S5 и S6. В потенциал - чувствительности канала задействован каждый четвертый сегмент домена белка Nav1.4, который состоит из положительно заряженных аминокислот [Wu F. 2011]. Внутриклеточная петля между III и IV доменами играет ключевую роль в быстрой инактивации канала путем блокировки его части, обращенной внутрь клетки. Открытие канала в результате изменения мембранного потенциала осуществляется путем скольжения четвертых сегментов каждого домена во внеклеточное пространство. Это обеспечивает ток ионов натрия внутрь клетки и формирование ПД. Механизм быстрой инактивации закрывает пору канала и предохраняет его от открытия до того как настанет время восстановить ток ионов. Тем самым данный механизм регулирует продолжительность ПД и инициирует деполяризацию мембраны мышечной клетки [Simkin D. 2011].

Функции натриевого канала меняют мутации гена SCN4A, кодирующего белок Nav1.4. Основной эффект, который вызывают мутации - это нарушение быстрой инактивации канала. Тогда инактивация канала становится неполной или медленной. Это приводит к внеочередному открытию канала и накоплению ионов натрия внутри мышечной клетки, что деполяризует мембрану и вызывает повторяющиеся одни за одним ПД [Jurkat-Rott К. 2010]. При относительно небольших значениях деполяризации это приводит к длительной гипервозбудимости мышцы, миотонии. А при более высоких значениях эффект

выражается в полном открытии натриевых каналов мембраны клетки, в том числе нормальных (без мутаций), что приводит к параличу [Vicart S. 2005].

1.8 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА SCN4A

Белок Nav1.4 кодирует ген SCN4A, он картирован на хромосоме 17q23-25 [Koch М.С. 1991]. На данный момент описано более 60 миссенс мутаций, первая из которых идентифицирована в семье с ГиперКП. Мутации гена SCN4A оказывают различные эффекты на проводимость сарколеммы, включая отложенную или неполную инактивацию и увеличенную активацию, но в результате эффект состоит в увеличенном токе натрия в клетку. Мутации натриевых каналов вызывают удлинение потенциала действия (ПД) и отсроченное сокращение, реализуясь по механизму усиления функции. Снижение функциональной активности натриевых ионных каналов в результате мутаций в гене SCN4A приводит к невозможности нового сокращения мышцы из-за того, что потенциал покоя на сарколеммы не может быть восстановлен [Lerche Н. 1993].

Одни и те же мутации могут вызывать различные фенотипы НДМ, различных форм периодических параличей и редко приводит к одному типу миастенического синдрома (табл.2) [Lee S.C. 2009, Trip J. 2009].

Внутриклеточные структуры

Ф ГилоКП _| ГиперКП

♦ КЗМ

• ПЭ

О - экзон 12 П - экзон 13 К - экзон 22 ^ - экзон 24

Рис.5. Строение порообразующей альфа - субъединицы натриевого потенциал -зависимого ионного канала и мутации гена SCN4A, обуславливающие развитие нескольких заболеваний. На рисунке выделены участки белка, кодируемые «горячими» экзонами 12, 13, 22 и 24 гена SCN4A. Геометрическими цветными фигурами обозначены мутации, приводящие к различным фенотипам. Все мутации наследуются аутосомно - доминантно и обладают вариабельной пенетрантностью. Адаптировано из [Jurkat-Rott К. 2005].

Особенно сильно перекрываются фенотипы ГиперКП и ПЭ. Мутации, приводящие к развитию этих заболеваний зачастую одинаковы, фенотипы при этом варьируют даже среди членов одной семьи. Самый «чистый» фенотип ГиперКП обусловлен мутациями p.Thr704Met и p.Metl592Val [Rojas C.V. 1991], которые выявляются примерно в 60% и 30% случаев ГиперКП соответственно. Мутации гена SCN4A, обуславливающие развитие НДМ, сконцентрированы в экзонах 12, 13, 22 и 24 (рис.5) [Matthews Е. 2008].

Табл.2. Мутации гена SCN4A и фенотипы (адаптировано из [Vicart S. 2005]).

АМИНОКИСЛОТНАЯ ЗАМЕНА ДОМЕН/СЕГМЕНТ БЕЛКА ФЕНОТИП

p.Arg669His D2/S4 ГипоКП

p.Arg672His/Gly D2/S4 ГипоКП

p.Arg672Ser D2/S4 ГипоКП

p.Arg675Gly/Gln/Thr D2/S4 НормоКП

p.Leu689Ile D2/S4-S5 ГиперКП

p.Thr704Met D2/S5 ГиперКП, ГиперКП/ПЭ

p.Alall56Thr D3/S4-S5 ГиперКП/ПЭ

p.Proll58Ser D3/S4-S5 Холодовым ГипоКП/ПЭ

p.Metl360Val D4/S1 ГиперКП, ГиперКП/ПЭ

p.Metl370Val D4/S1 ГиперКП/ПЭ

p.Argl448Cys D4/S4 ГиперКП/ПЭ

p.Argl448His D4/S4 ГиперКП/ПЭ

p.Phel490Leu+Metl493Ile D4/S5 ГиперКП

p.Ilel495Phe D4/S5 ГиперКП

p.Metl592Val D4/S6 ГиперКП, ГиперКП/ПЭ

Наиболее часто встречаются мутации ко донов 1313, 1448 и 1306, обуславливающие развитие ПЭ (табл.3) [Kinoshita М. 2003]. Для фенотипа флуктуирующей миотонии характерны мутации p.Ser804Phe и p.Glyl306Ala [Mailänder V. 1996, Ricker К. 1994, Lerche Н. 1993]. В случаях перманентной миотонии в том же ко доне 1306 происходит замена глицина на глутаминовую кислоту (p.Glyl306Glu) [Lerche Н. 1993]. Но в подавляющем большинстве случаев мутации в гене SCN4A, оказывают на фенотип сочетанное влияние.

Табл.3. Гено-фенотипические корреляции (адаптировано из [VicartS. 2005]).

АМИ НОКИСЛОТНАЯ ЗАМЕНА ДОМЕН/ СЕГМЕНТ ФЕНОТИП ФАКТОРЫ, УСИЛИВАЮЩИЕ миотонию ФАКТОРЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ МЫШЕЧНУЮ СЛАБОСТЬ

Холод Физическая нагрузка к+ Холод Физическая нагрузка г

p.Leu266Val D1/S5 НатМ + 0 - 0 0 -

p.Val445Met D1/S6 HM 0 0 0 0 0 -

p.Ile693Thr D2/S4-S5 ПЭ 0 0 0 + + +

p.Ser804Phe D2/S6 ПЭ ВМ ++ 0 + + 0 + +

p.Ilell60Val D3/S4-S5 АЧМ + + + 0 0 0

p.Vall293Ile D3/S4 ПЭ + + - 0 0 -

p.Glyl306Ala ID3-4 ВМ 0 0 + 0 0 0

p.Glyl306Val ID3-4 ПЭ, НатМ + + + 0 0 +

0 + + 0 0 0

p.Glyl306Glu ID3-4 ПМ 0 - + 0 0 0

p.Thrl313Ala ID3-4 ПЭ ++ + - ++ + -

p.Thrl313Met ID3-4 ПЭ ++ + - + + -

p.Leul433Arg D4/S3 ПЭ + + + - + 0

p.Argl448His D4/S4 ПЭ + + + + 0 0

p.Argl448Pro D4/S4 ПЭ + + - + 0 -

p.Argl448Ser D4/S4 ПЭ 0 + - 0 + 0

p.Glyl456Glu D4/S4 ПЭ ++ + - ++ 0 -

p.Phel473Ser D4/S4-S5 ПЭ + + - + 0 -

p.Vall589Met D4/S6 кзм ++ + ++ 0 0 0

Расшифровка сокращений к табл.3: ГипоКП - гипокалиемический паралич;

НормоКП - нормокалиемический паралич; ВМ - вариабельная миотония;

ГиперКП - гиперкалиеический паралич; ПМ - перманентная миотония;

ПЭ - парамиотония Эйленбурга; НатМ - натриевые миотонии;

НМ - наследственная миотония; АЧМ - ацетозол-чувствительная миотония; -/+ - отсутствие/присутствие влияния данного фактора на проявление симптомов при указанной мутации, 0 - влияние данного фактора не изучено.

Из литературных данных понятно, что недистрофические миотонии представляют собой гетерогенную клинически полиморфную группу заболеваний. Фенотипы больных различными формами НДМ перекрываются и варьируют по пенетрантности как среди пациентов с определенным типом НДМ, так и внутри одной семьи. Миотонии Томсена и Беккера являются аллельными заболеваниями, обусловленными мутациями в гене хлорного канала CLCN1. Натриевые миотонии, периодические параличи также представители аллельной серии только с мутациями в гене SCN4A. На этапе клинического осмотра трудно отличить МТ и МБ между собой. Реже, но, тем не менее, затруднена дифференциальная диагностика ПЭ, ГиперКП и КЗМ друг от друга [Heatwole C.R. 2007, Ryan A.M. 2007]. Тяжелее всего в спорадических случаях с фенотипом МТ предположить ген, мутации в котором вызывают проявления заболевания. Зачастую, верным шагом диагностики является поиск мутаций в гене CLCN1, но в некоторых случаях этого недостаточно для подтверждения диагноза. Только после молекулярно-генетического анализа гена SCN4A можно выявить истинную причину заболевания [ Webb J. 2008, Jurkat-Rott К. 2007]. Скорее всего, некоторые варианты МТ с мягким необычным течением, описанные врачами - неврологами до внедрения в практику молекулярно-генетических методов являются вариантами КЗМ, что на данный момент может быть подтверждено после тандемного анализа генов CLCN1 и SCN4A.

Молекулярно-генетический анализ генов ионных каналов всегда представляет собой довольно трудоемкий и длительный процесс. Это обусловлено большим размером анализируемых генов и широким разнообразием мутаций, распределенным, как правило, по всей кодирующей последовательности данных генов. Так и в случае НДМ, причинами заболеваний являются мутации генов, кодирующих хлорные и натриевые ионные каналы скелетных мышц. Спектры мутаций этих генов представлены подавляющим числом миссенс - замен, наряду с относительно небольшим числом других типов мутаций. Это затрудняет ещё и

трактовку результатов исследования: не всегда очевиден эффект миссенс - замены для конкретного больного, особенно в изолированных случаях, когда сегрегационный анализ невозможен. По этим причинам молекулярно-генетический анализ генов СЬСЫ1 и 8СЫ4А для пациентов с различными НДМ следует проводить в больших группах пациентов, в которых хорошо представлены различные фенотипы и доступен материал родственников пробанда для проведения сегрегационного анализа. Не менее информативными остаются и описания больших семей с внутрисемейным полиморфизмом. Накопление разнообразных данных о мутациях в генах ионных каналов, которые обуславливают развитие различных НДМ, в том числе данных о функциональных исследованиях на клеточных линиях и моделях, способствует развитию наиболее эффективного клинико-молекулярно-генетического алгоритма диагностики НДМ, а также более точного и подробного консультирования пациентов, их детей и ближайших родственников.

Актуальным является проведение подобных исследований для каждой страны, так как в различных регионах наблюдается накопление характерных частых мутаций гена СЬСЫ1 и подтверждается выявление «горячих» экзонов гена 8СЫ4А, что увеличивает эффективность алгоритма поиска мутаций в каждом из генов.

В результате недостатка молекулярно-генетических данных, полученных на больших группах пациентов в различных регионах мира, трудно судить и об истинной частоте НДМ. Обсуждается только распространенность данных заболеваний по результатам редких эпидемиологических исследований. В РФ молекулярно - генетического анализа генов СЬСИ1 и БСША ранее не проводилось.

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Иванова, Евгения Андреевна

V выводы

1. В результате молекулярно - генетического анализа генов СЬСЫ1 и 8СИ4А, выполненного на 84 образцах ДНК выборки российских больных диагноз различных типов НДМ подтвержден у 80 пациентов. Доли «хлорных» и «натриевых» миотоний в выборке российских больных составляют 82% и 18% соответственно.

2. В исследованной выборке пациентов с хлорными миотониями выявлено 40 различных мутаций гена СЬСИ1. Восемнадцать мутаций (45%) неописаны в базах НвМБ и БИР. Выявлены частые мутации: замены р.С1у1908ег, с.14371450с1е1, р.А1а493С1и, р.ТЪг550Ме^ р.Туг686* и р.Аг§894*, которые составили 59% всех хромосом с мутациями. Разработана эффективная система детекции частых мутаций на основе метода МЬРА - анализа с последующей мультиплексной ПЦР. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ.

3. Определена частота гетерозиготного носительства мутации с.2680С>Т (р.Аг§894*) в гене СЬСИ1, которая составила 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%). Полученные данные сопоставимы с аналогичными в странах Скандинавии (0,87%). Анализ неравновесия по сцеплению аллелей 11 полиморфных маркеров с мутацией с.2680С>Т (р.А^894*) гена СЬСЫ! подтвердил единство происхождения данной мутации в результате эффекта «основателя».

4. Определена расчетная частота миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равная 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26) соответственно, что свидетельствует о гиподиагностике хлорных миотоний на территории РФ вследствие преобладания мягких форм заболевания. Частота МТ и МБ в РФ в разы превосходит расчетную частоту хлорных миотоний в Северной Скандинавии (1:2000 и 1:26570).

5. В результате молекулярно-генетического анализа гена 5СЫ4А выявлено 10 различных миссенс мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов. Пять мутаций выявлены впервые в данном исследовании. Выявленные мутации сконцентрированы в «горячих» экзонах 12, 13 и 22 гена БСША (79% случаев).

6. Предложен алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с различными формами НДМ, учитывающий данные клинического осмотра, ЭМГ, тип наследования заболевания в семье, частоты распространенности хлорных и натриевых миотоний и особенности спектра мутаций в генах СЬСИ1 и БСША. Информативность разработанного алгоритма составляет 95%.

VI СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.А. Ivanova, V.P. Fedotov, S.A. Kyrbatov, A.V. Polyakov. The novel mutation in CLCN1 gene resulting in recessive form of the myotonia congenita // European Journal of Human Genetic. 2009. V.17. P. 379.

2. Иванова E.A., Федотов В.П., Курбатов СЛ., Поляков А.В. Молекулярно-генетический анализ причин наследственной миотонии Томсена - Беккера // Медицинская генетика. 2009. Т. 8. №12. С.38.

3. Е. Ivanova, V. Fedotov, Е. Dadali, G. Rudenskaya, S. Kurbatov. Myotonia congenita (MC) in Russia: the two frequent mutations in CLCN1 gene allows to reveal 14% mutant chromosomes of patients with MC // European journal of Human Genetics. 2010. V.18. P. 87-88.

4. Иванова E.A., Федотов В.П., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Курбатов С.А., Поляков А.В. Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний // Медицинская генетика. Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков 2010. С.72.

5. Курбатов С.А., Федотов В.П., Иванова Е.А., Галева Н.М. Фено-генотипические корреляции наследственных миотонических синдромов // Медицинская генетика. Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков 2010. Стр.99.

6. S. A. Kurbatov, V. P. Fedotov, Е. A. Ivanova. Genotype-phenotype correlation in cohort of patients with myotonia congenita and frequent CLCN1 gene mutation Arg894* // European journal of Human Genetics. 2011. V.19. P.426

7. Иванова E.A., Дадали E.JI., Федотов В.П. с соавт. Спектр мутаций в гене CLCN1 у пациентов с недистрофическими миотониями Томсена и Беккера // Генетика. 2012. Т. 48. № 9. С. 1113-1123. (Ivanova Е.А., Dadali E.L., Fedotov

V.P. et al. The spectrum of CLCN1 gene mutations in patients with nondystrophic Thomsen's and Becker's myotonias // Rus. J. Genetics. 2012. V. 49. № 9. P. 952961.)

8. S.A. Kurbatov, V.P. Fedotov, E.A.Ivanova, N.M.Galeeva, A.V.Polyakov. Genotype - phenotype correlation in cohort of patients with myotonic syndromes // European journal of Human Genetics. 2012. V.20. P.86.

9. E. Ivanova, V. Fedotov, S. Kurbatov, E. Dadali, G.Rudenskaya, A.Polyakov. Frequent CLCN1 gene mutations in patients from Russian Federation (RF) with non - distrophic Thomsen and Becker myotonias // European journal of Human Genetics. 2012. V. 20. P.321.

10. В.П. Федотов, С.А. Курбатов, Е.А.Иванова, Н.М.Галеева, А.В.Поляков. Клинико - электромиографические критерии диагностики наследст венных миотонических синдромов // Нервно - мышечные болезни. 2012. №2. С.53 -64.

11. Иванова Е.А., Поляков А.В. Недистрофические миотонии: клинико -генетические формы, механизмы этиопатогенеза, ДНК - диагностика // Медицинская генетика. 2012. Т. 11. №6. С. 3 - 10.

12. Руденская Г.Е., Иванова Е.А., Галеева Н.М. Случай миотонии Беккера с эквинной деформацией стоп // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. 2012. №8. С.70-71.

IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики для недавно выделенной группы заболеваний - недистрофические миотонии. На данном этапе внедренные в работу лаборатории ДНК - диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН молекулярно-генетические методы для поиска мутаций в генах СЬСИ1 и 8СИ4А позволяют выявить мутации и подтвердить диагноз определенной формы НДМ в 95% случаев. Среди них остается 10 случаев (12%) с одной выявленной мутацией, но явно рецессивной формой хлорной миотонии. Также в данной выборке 4 случая (5%) с фенотипом НДМ и без выявленных мутаций в причинных генах. В связи с этим в ближайшее время планируется внедрение новых разработок молекулярно-генетической диагностики НДМ на основе метода количественного МЬРА - анализа для выявления протяженных делеций и дупликаций гена СЬСИ1.

Несмотря на наличие довольно яркого симптомокомплекса, характерного для пациентов с НДМ, миотонии Томсена и Беккера а также некоторые стертые формы натриевых миотоний практически неотличимы на стадии клинического осмотра. Это обстоятельство ещё более увеличивает значимость разработанных алгоритмов молекулярно-генетического анализа генов СХСУ7 и 8СИ4А, их оптимизация с учетом времени проведения исследования и материальных затрат пациента, основанных на частотах встречаемости различных генетических вариантов НДМ а также потребность разработки новых методов для выявления 100% мутаций в указанных выше генах.

Благодаря тому, что выборка пациентов сформирована в достаточно большом объеме (84 пациента) и лаборатория ДНК - диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН обладает возможностями применения большого спектра современных молекулярно-генетических методов, удалось описать спектр мутаций генов СЬСИ1 и 8СИ4А, мутации в которых являются причинами развития НДМ, выявить частые мутации гена СЬСИ1 и «горячие» экзоны гена 8СЫ4А, провести ряд исследований и обсчетов, которые позволяют расчитать частоты миотоний Томсена и Беккера в РФ.

Полученные данные также позволяют оценить и скорректировать медико-генетическое консультирование пациентов с НДМ в России. Так как ранее врачи -генетики располагали данными исключительно о распространенности МТ и МБ в РФ, чаще пациентам с симптомокомплексом хлорной миотонии устанавливался диагноз миотонии Томсена, что предполагает наследование выявленной мутации гена СЬСЫ1 по АД типу. Данное исследование показало, что в России рецессивно наследуемая миотония Беккера встречается в 11 раз чаще доминантной миотонии Томсена. Это значительно меняет тактику медико-генетического консультирования пациентов с хлорной миотонией и расчет рисков заболевания для потомства в отягощенных семьях. На данный момент данные о распространенности МТ и МБ предполагают наличие не более 3-5 случаев на 100 ООО населения. Полученные данные о частотах миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равной 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26) соответственно свидетельствуют о явной гиподиагностике данных заболеваний в стране. Также известно о наличии практически бессимптомных форм НДМ, выявляющихся только по результатам ЭМГ у родственников пациента или случайно в ходе неврологического обследования. Зачастую даже заметные для пациента симптомы миотонии не доставляют ему особых неудобств для адаптации к повседневной жизни. Данная группа заболеваний характеризуется доброкачественным течением, редко прогрессирующим в тяжелые инвалидизирующие формы. Возможно, эти обстоятельства и обуславливают такую разницу в частоте и распространенности НДМ. Пациенты довольно редко нуждаются в серьезной врачебной помощи и доходят до специалиста. Они адаптируются к особенностям мышечного сокращения в течение жизни, выбирают соответственную профессию, даже занимаются отдельными видами спорта, не требующими резкого старта и быстрой реакции, например.

Вышеописанные аспекты заставляют задуматься не только о правильности медико-генетического консультирования и оптимизации молекулярно-генетической диагностики. В работе поднимается вопрос о норме и патологии применительно к недистрофическим миотониям. Большинство пациентов не нуждаются в специальной помощи и принимают имеющиеся отклонения от нормы с точки зрения неврологов всего лишь за особенности организма и легко приспосабливаются. Мы знаем об их наличии лишь благодаря популяционному исследованию и подсчитанной частоте МТ и МБ. Часть же пациентов приходит к врачам неврологам и генетикам, так как считают наличие симптомов миотонии явным недостатком и заболеванием, которое им бы не хотелось передать потомкам. Они нуждаются в грамотной помощи, чтобы справиться с проявлениями заболевания и социальной адаптацией. О соотношении численностей описанных групп пациентов пока можно только догадываться. Для того чтобы описать все разнообразие признаков НДМ и степени их проявления у различных пациентов, об их вариабельности даже среди членов одной семьи необходимо проведение ещё более объемного исследования с вовлечением врачей неврологов и генетиков, специалистов по проведению ЭМГ.

Также актуальным остается поиск генетических факторов, модифицирующих степень о диапазон клинических проявлений у пациентов с НДМ. На данный момент предпринимаются попытки объяснить взаимосвязь экспансии повторов в генах ИМРК и 21ЯР9, ответственных за развитие миотонической дистрофии 1 и 2 типов и модификацией сплайсинга гена СЬСЫ1, например. Но пока это только теоретические изыскания, подтвержденные отдельными экспериментальными данными. Может ли разное количество повторов в промоторных областях генов БМРК и 2ЫР9 как-то влиять на тяжесть проявления миотоний Томсена и Беккера не понятно и не доказано на данный момент.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Иванова, Евгения Андреевна, 2013 год

VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abdalla J.A., Casley W.L., Cousin H.K. et al. Linkage of Thomsen disease to the T-cell-receptor beta (TCRB) locus on chromosome 7q35 // Am J Hum Genet. 1992. V. 51.№3.P.579-584.

2. Accardi A., Pusch M. Fast and slow gating relaxations in the muscle chloride channel CLC-1 // The Journal of general physiology. 2000. V.116. №3. P. 433438.

3. Bengtsson B.O., Thomson G. Measuring the strength of associations between HLA antigens and diseases // Tissue antigens. 1981. V. 18. P. 356-363.

4. Cannon S.C. Spectrum of sodium channel disturbances in the nondystrophic myotonias and periodic paralyses // Kidney Int. 2000. Vol.57. №3. P.772-779.

5. Chang T.Y., Кио H.C., Hsiao K.M., Huang C.C. Phenotypic variability of autosomal dominant myotonia congenita in a Taiwanese family with muscle chloride channel (CLCN1) mutation // Acta Neurol Taiwan. 2007. V.16. №4. P.214-220.

6. Colding-Jorgensen E. Phenotypic variability in myotonia congenita // Muscle & nerve. 2005. V.32. №1. P. 19-34.

7. de Diego C., Gamez J., Plassart-Schiess E. et al. Novel mutations in the muscle chloride channel CLCN1 gene causing myotonia congenita in Spanish families // J Neurol. 1999. Vol.246. №9. P.825-829.

8. Duffield M., Rychkov G., Bretag A., Roberts M. Involvement of helices at the dimer interface in C1C-1 common gating // The Journal of general physiology. 2003. V. 121. №2. P. 149-61.

9. Duno M., Colding-Jorgensen E. Myotonia Congenita // GeneReviews. Seattle (WA): University of Washington, Seattle, 2011.

10.Duno M., Colding-Jergensen E., Grunnet M. Difference in allelic expression of the CLCN1 gene and the possible influence on the myotonia congenita phenotype // Eur. J. Human Genetics. 2004. V. 12. № 9. P. 738-743.

11 .Dupre N., Chrestian N., Bouchard J.P. et al. Clinical, electrophysiologic, and genetic study of non-dystrophic myotonia in French-Canadians // Neuromuscul Disord. 2009. V. 19. № 5. P. 330-334.

12.Dutzler R., Campbell E.B., Cadene M. et al. X-ray structure of a C1C chloride channel at 3.0. A reveals the molecular basis of anion selectivity // Nature. 2002. V.415. №6869. P. 287-94.

13.Fahlke C., Durr C., George A.L. Mechanism of ion permeation in skeletal muscle chloride channels // The Journal of general physiology. 1997. V.l 10. №5. P.551-64.

14.Fialho D., Kullmann D.M., Hanna M.G., Schorge S. Non-genomic effects of sex hormones on CLC-1 may contribute to gender differences in myotonia congenita //Neuromuscul Disord. 2008. V.l8. №11. P.869-872.

15.Fialho D., Schorge S., Pucovska U. et al. Chloride channel myotonia: exon 8 hotspot for dominant-negative interactions // Brain. 2007. V.130. №12. P.3265-3274.

16. Gao F., Ma F.C., Yuan Z.F. et al. Novel chloride channel gene mutations in two unrelated Chinese families with myotonia congenital // Neurol India. 2010. V.58. №5. P.743-746.

17. George A.L., Crackower M.A., Abdalla J.A. et al. Molecular basis of Thomsen's disease (autosomal dominant myotonia congenita) // Nature genetics. 1993. V.3. №4. P. 305-310.

18.Groome J.R., Fujimoto E., Ruben P.C. et al. K-aggravated myotonia mutations at residue G1306 differentially alter deactivation gating of human skeletal muscle sodium channels // Cell. Mol. Neurobiol. 2005. V.25. №7. P.1075-1092.

19.Heatwole C.R., Moxley R.T.. The nondystrophic myotonias //Neurotherapeutics. 2007. V.4. P.238-251.

20. Jurkat-Rott K., Lerche H., Lehmann-Horn F. Skeletal muscle channelopathies // J Neurol. 2002. V.249. №11. P.1493-1502.

21 .Jurkat-Rott K., Lehmann-Horn F.. Genotype-phenotype correlation and

therapeutic rationale in hyperkalemic periodic paralysis // Neurotherapeutics. 2007. V.4. №2. P.216-224.

22.Jurkat-RottK., Mitrovic N., Hang C. et al. Voltage-sensor sodium channel mutations cause hypokalemic periodic paralysis type 2 by enhanced inactivation and reduced current // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. V.97. №17. P.9549-9554.

23.Jurkat-Rott K., Holzherr B., Fauler M., Lehmann-Horn F.. Sodium channelopathies of skeletal muscle result from gain or loss of function // Pflugers Arch. 2010. V.460. №2. P.239-248.

24.Kinoshita M, Sasaki R., Nagano Tet al.. Thrl313Met mutation in skeletal muscle sodium channels in a Japanese family with paramyotonia congenital // Intern Med. 2003. V.42. №9. P.856-861.

25.Koch M.C., Ricker K, Otto M. et al. Linkage data suggesting allelic heterogeneity for paramyotonia congenita and hyperkalemic periodic paralysis on chromosome 17 // Hum Genet. 1991. V.88. №1. P.71-74.

26.Koch M.C., Steinmeyer K, Lorenz C. et al. The skeletal muscle chloride channel in dominant and recessive human myotonia // Science. 1992. V.257. № 5071. P. 797-800.

27.Koty P.P., Pegoraro E., Hobson G. et al. Myotonia and the muscle chloride channel: dominant mutations show variable penetrance and founder effect // Neurology. 1996. V.47. №4. P.963-968.

28.Kubisch C., Schmidt-Rose T., Fontaine B. et al. ClC-1 chloride channel mutations in myotonia congenita: variable penetrance of mutations shifting the voltage dependence // Hum Mol Genet. 1998. V.7. №11. P. 1753-1760.

29.Kuo H.C., Hsiao K.M., Chang L.I. et al. Novel mutations at carboxyl terminus of CIC-1 channel in myotonia congenital // Acta Neurol Scand. 2006. V.l 13. №5. P.342-346.

30. Lee S.C., Kim H.S., Park Y.E. et al. Clinical Diversity of SCN4A-Mutation-Associated Skeletal Muscle Sodium Channelopathy // J. Clin. Neurol. 2009. V.5.

№4. P. 186-191

31.Lehmann-Horn F., Jurkat-Rott K. Voltage-gated ion channels and hereditary disease // Physiol Rev. 1999. V.79. №4. P.1317-1372.

32.Lehmann-Horn F., Mailänder V., Heine R., George A.L. Myotonia levior is a chloride channel disorder // Hum Mol Genet. 1995. V.4. №8. P. 1397-1402.

33.Lerche H., Heine R., Pika U. et al. Human sodium channel myotonia: slowed channel inactivation due to substitutions for a glycine within the III-IV linker // J Physiol. 1993. V.470. P.13-22.

34.Lin MJ, You TH, Pan H et al. Functional characterization of CLCN1 mutations in Taiwanese patients with myotonia congenita via heterologous expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 351. № 4. P. 1043-1047.

35.Lossin C., George A.L. Jr. Myotonia congenita // Adv Genet. 2008. V.63. - P.25-55.

36. Mailänder V., Heine R., Deymeer F., Lehmann-Horn F. Novel muscle chloride channel mutations and their effects on heterozygous carriers // Am J Hum Genet. 1996. V.58. №2. P.317-324.

37.Mankodi A. Myotonic disorders //Neurol India. 2008. V.56. №3. P.298-304.

38.Matthews E., Fialho D., Tan S. V. et al. The non-dystrophic myotonias: molecular pathogenesis, diagnosis and treatment // Brain : ajournai of neurology. 2010. V.133. № 1. P. 9-22. Matthews E., Tan S. V., Fialho D. et al. What causes paramyotonia in the United Kingdom? Common and new SCN4A mutations revealed // Neurology. 2008. V.70. №1. P.50-53.

39.Mazôn M.J., Barros F., De la Pena P. et al. Screening for mutations in Spanish families with myotonia. Functional analysis of novel mutations in CLCN1 gene // Neuromuscular Disorders. 2012. V. 22. №3. P. 303-304.

40.McClatchey A.L, McKenna-Yasek D., Cros D. et al. Novel mutations in families with unusual and variable disorders of the skeletal muscle sodium channel // Nat Genet. 1992. V.2. №2. P.148-152.

41. Meyer-Kleine C., Ricker K., Otto M., Koch M.C. A recurrent 14 bp deletion in

the CLCN1 gene associated with generalized myotonia (Becker) // Human molecular genetics. 1994. V.3. №6. P. 1015-6.

4,2. Meyer-Kleine C., Steinmeyer K, Riecher K. et al. Spectrum of mutations in the major human skeletal muscle chloride channel gene (CLCN1) leading to myotonia // Am. J. Human Genetics. 1995. V.57. №6. P. 1325-1334.

A3.Michel P., Sternberg D., Jeannet P.Y. et al. Comparative efficacy of repetitive nerve stimulation, exercise, and cold in differentiating myotonic disorders // Muscle Nerve. 2007. V.36. №5. P.643-650.

44. Modoni A., DAmigo A., Dallapiccola B. et al. Low-rate repetitive nerve stimulation protocol in an Italian cohort of patients affected by recessive myotonia congenital // J. Clin. Neurophysiol. 2011. V.28. №1. P.39-44.

45.Nagamitsu S., Matsuura T., Khajavi M. et al. A "dystrophic" variant of autosomal recessive myotonia congenita caused by novel mutations in the CLCN1 gene // Neurology. 2000. V.55. №11. P.1697-1703.

A6.Nurputra D.K., Nakagawa T., Takeshima Y. et al.. Paramyotonia congenita: From clinical diagnosis to in silico protein modeling analysis // Pediatr. Int. 2012. V.54. №5. P.602-612.

AI .Ohnesorg T., Turbitt E., White S.J. The many faces of MLPA // Methods Mol. Biol. 2011. V.687. P. 193-205.

AS.Papponen H., Toppinen T., Baumann P. et al. Founder mutations and the high prevalence of myotonia congenita in northern Finland // Neurology. 1999. V.53. №2. P.297-302.

A9.ParkJ.H., Lee Y. W., Park S.A. et al.. A case of paramyotonia congenita without periodic paralysis: electrophysiological and molecular genetic studies // Neurologist. 2010. V.16. №3. P.203-205.

50.Parasivam S., Krupa M., Slee M., Thyagarajan D.E. et al. Clinical,

electrophysiological and genetic features of a large Australian family with paramyotonia congenital // Med. J. 2009. V.190. №6. P.334-336.

51 .Parton M.J., Broom W., Andersen P.M. et al. D90A SOD1 ALS Consortium.

D9ÛA-S0D1 mediated amyotrophic lateral sclerosis: a single founder for all cases with evidence for a Cis-acting disease modifier in the recessive haplotype // Hum Mutat. 2002. V.20. №6. P.473.

52.Ptdcek L.J., Tawil R., Griggs R.C. et al. Sodium channel mutations in acetazolamide-responsive myotonia congenita, paramyotonia congenita, and hyperkalemic periodic paralysis // Neurology. 1994. V.44. №8. P. 1500-1503.

53.Pusch M. Myotonia caused by mutations in the muscle chloride channel gene CLCN1II Hum Mutat. 2002. V. 19. №4. P.423-434.

54.Richer K., Moxley R.T. 3rd, Heine R., Lehmann-Horn F. Myotonia fluctuans. A third type of muscle sodium channel disease // Arch Neurol. 1994. V.51. №11. P.1095-1102.

55.Raja Rayan D.L., Haworth A., Sud R.. A new explanation for recessive myotonia congenital: exon deletions and duplications in CLCN1 //Neurology. 2012. V.78. №24. P.1953-1958.

56.Ryan A.M., Matthews E., Hanna M.G. et al. Skeletal-muscle channelopathies: Periodic paralysis and nondystrophic myotonias // Curr. Opin. Neurol. 2007. V.20. P.558-563.

57 .Rojas C. V., Wang J. Z., Schwartz L. S. et al. A Met-to-Val mutation in the skeletal muscle Na+ channel alpha-subunit in hyperkalaemic periodic paralysis // Nature. 1991. V.354. №6352. P.387-389.

58.Sanger F., Air G.M., Barrell B.G. et al. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA // Nature. 1977. V.265, №5596. P. 687-95.

59.Sangiuolo F., Botta A., Mesoraca A., et al. Identification of five new mutations and three novel polymorphisms in the muscle chloride channel gene (CLCN1) in 20 Italian patients with dominant and recessive myotonia congenita // Human Mutation. 1998. V. 11. №4. P. 331.

60.Shalata A., Furman H., Adir V. et al. Myotonia congenita in a large

consanguineous Arab family: Insight into the clinical spectrum of carriers and double heterozygotes of a novel mutation in the chloride channel CLCN1 gene //

Muscle & Nerve. 2009. V.41. №4. P. 464-469.

61. Simkin D., Léna I., Landrieu P. et al.. Mechanisms underlying a life-threatening skeletal muscle Na+ channel disorder // J. Physiol. 2011. V.589. №13. P.3115-3124.

62. Sloan Brown K., George A.L. Jr. Inheritance of three distinct muscle chloride channel gene (CLCN1) mutations in a single recessive myotonia congenita family. //Neurology. 1997. V.48. №2. P.542-543.

63.Snoeckx R.L., Huygen P.L., Feldmann D. et al.. GJB2 mutations and degree of hearing loss: a multicenter study // Am. J. Hum. Genet. 2005. V.77. №6. P.945-957.

64 .Steinmeyer K., Lorenz C., Push M. et al. Multimeric structure of C1C-1 chloride channel revealed by mutations in dominant myotonia congenita (Thomsen) // The EMBO journal. 1994. V.13. №4 P. 737-43.

65. Struyk A.F., Scoggan K.A., Bulman D.E., Cannon S.C. The human skeletal muscle Na channel mutation R669H associated with hypokalemic periodic paralysis enhances slow inactivation // J Neurosci. 2000. V.20. №23. P.8610-8617.

66.Sun C., Tranebjaerg L., Torbergsen T. et al. Spectrum of CLCN1 mutations in patients with myotonia congenita in Northern Scandinavia // Eur J Hum Genet. 2001. V.9. №12. P.903-909.

67. Trip J., Drost G., Ginjaar H.B. et al. Redefining the clinical phenotypes of non-dystrophic myotonic syndromes // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2009. V.80. №6. P.647-652.

6%. Trip J., Drost G., Verbove D.J. et al. In tandem analysis of CLCN1 and SCN4A greatly enhances mutation detection in families with non-dystrophic myotonia // Eur J Hum Genet. 2008. V.16. №8. P.921-929.

69. Vicart S., Sternberg D., Fontaine B., Meola G. Human skeletal muscle sodium channelopathies //Neurol Sci. 2005. V.26. №4. P.194-120.

70. Wagner S., Deymeer F., Ktirz L.L. et al. The dominant chloride channel mutant

G200R causing fluctuating myotonia: clinical findings, electrophysiology, and channel pathology// Muscle Nerve. 1998. V.21. №9. P. 1122-1128. 1 X.Webb J., Cannon S.C.. Cold-induced defects of sodium channel gating in atypical periodic paralysis plus myotonia // Neurology. 2008. V.70. №10. P.755-761.

72. Wu F., Mi W., Bums D.K. et al.. A sodium channel knockin mutant (NaVl .4-R669H) mouse model of hypokalemic periodic paralysis // J. Clin. Invest.

2011. V. 121. №10. P.4082-4094.

73. Wu F.F., Ryan A., Devaney J. et al. Novel CLCN1 mutations with unique clinical and electrophysiological consequences // Brain. 2002. V. 125. №11. P.2392-2407.

74. Yoshinaga H., Sakoda S., Good J. M. et al.. A novel mutation in SCN4A causes severe myotonia and school-age-onset paralytic episodes // J. Neurol. Sci.

2012. V.315. №1-2. P.15-19.

IS.Zielonka D., Jurkat-Rott K., Stachowiak P. et al. A Becker myotonia patient with compound heterozygosity for CLCN1 mutations and Prinzmetal angina pectoris //Neuromuscular Disorders. 2012. V. 22. № 4. P. 355-360. Тб.Галеева H.M., Клейменова И.С., Ненашева С.А., Котлукова Н.П., Поляков А.В.. Наследственная метгемоглобинемия I и II типов: описание трех случаев с молекулярно-генетической верификацией // Медицинская генетика. 2012. Т.11, №6 (120). С.39-45.

77.Гехт Б.М., Ильина Н.А. Нервно-мышечные болезни. // М.:Медицина, 1982,- 149-156с., 164-166с., 173-176с.

78.Гузеева В.И. Руководство по детской неврологии. СПб: Медицинское информационное агенство, 2009. 646 с.

79.Животовский Л.А.. Популяционная биометрия //М.: Наука. 1991.

S0.Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии. -М.: Медицинское информационное агенство, 2002. - 205-210с.