Молекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к формированию цитогенетической нестабильности у населения угольного региона тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Минина, Варвара Ивановна
Минина, Варвара Ивановна
кандидат наук
2016
- Специальность ВАК РФ03.02.07
- Количество страниц 374
Оглавление диссертации кандидат наук Минина, Варвара Ивановна
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................19
1.1. Влияние добычи и переработки угля на живые системы.......................................19
1.2. Хромосомные аберрации в оценке цитогенетического статуса человека............23
1.3. Генетическая обусловленность цитогенетических эффектов воздействия факторов окружающей среды.............................................................................................34
1.3.1. Гены-кандидаты индивидуальной чувствительности человека к действию мутагенов окружающей среды........................................................................................35
1.3.2. Вклад полиморфизма генов-кандидатов в реализацию генотоксических эффектов воздействия окружающей среды....................................................................58
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................69
2.1. Принципы организации цитогенетического обследования......................................69
населения угольного региона .............................................................................................. 69
2.2. Характеристика обследованных групп.................................................................73
2.3. Методы исследования...................................................................................................86
2.3.1. Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека......................86
2.3.2. Выделение геномной ДНК.....................................................................................87
2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.......................................................88
2.4. Статистическая обработка результатов исследования.....................................94
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................99
3.1. Хромосомные нарушения у населения угольного региона....................................99
3.1.1. Характеристика основных цитогенетических показателей у жителей Кемеровской области в целом по базе данных..............................................................99
3.1.2. Хромосомные аберрации у населения................................................................107
сельских районов Кемеровской области......................................................................107
3.1.3 Анализ динамики повреждаемости хромосом....................................................113
у жителей промышленного центра................................................................................113
3.1.4. Хромосомные аберрации у жителей районов с неблагополучной онкоэпидемиологической ситуацией............................................................................121
3.1.5. Хромосомные аберрации у жителей Кемеровской области, работающих на предприятиях угольного цикла......................................................................................125
3.1.6. Хромосомные аберрации у жителей Кемеровской области, подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в бытовых условиях............................133
3.1.7. Уровень и спектр повреждений хромосом в лимфоцитах крови у жителей г. Кемерово больных раком легкого.................................................................................139
3.2. Анализ полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК, антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза в этнических группах жителей Кемеровской области................................................................................................................................. 156
3.3. Полиморфизм генов-кандидатов у жителей Кемеровской области больных раком легкого.................................................................................................................................168
3.4. Изучение ассоциаций полиморфизма генов-кандидатов и изменчивости частоты аберраций хромосом у жителей Кемеровской области..................................................181
3.4.1. Однолокусные эффекты и комбинации генов, сопряженные с изменчивостью частоты хромосомных аберраций у больных раком легкого....................................181
3.4.2. Изучение роли полиморфизма генов в изменчивости частоты аберраций хромосом у детей, проживающих в условиях действия сверхнормативных доз радона...............................................................................................................................193
3.4.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с формированием хромосомных аберраций у рабочих теплоэлектростанций............213
3.4.4. Изучение полиморфизма генов-кандидатов и изменчивости частоты аберраций хромосом у жителей области, не имеющих онкологических заболеваний и профессионально не контактирующих с известными генотоксикантами............228
3.5. Поиск прогностических моделей риска формирования хромосомных аберраций у жителей угольного региона ............................................................................................... 247
3.6. Характеристика системы комплексной оценки генетического статуса населения
угольного региона...............................................................................................................252
ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................256
ВЫВОДЫ................................................................................................................................271
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................274
ПРИЛОЖЕНИЕ А..................................................................................................................326
ПРИЛОЖЕНИЕ Б..................................................................................................................349
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК Активные формы кислорода
БП Бензо(а)пирен
ПАУ Полициклические ароматические углеводороды
ПДК Предельно допустимая концентрация
ПЦР Полимеразная цепная реакция
ТЭС Теплоэлектростанция
ФГА Фитогемагглютинин
ХА Хромосомные аберрации
ADPRT Рoly(ADP-ribose) polymerase 1
AhR Агу1 hydrocarbon receptor (арилгидрокарбоновый рецептор)
APEX1 Аpurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1
АТМ Аtaxia Telangiectasia Mutated
aCGH array-based Comparative Genomic Hybridization
BER base excision repair (эксцизионная репарация оснований)
CAT Catalase
CNV Copy-number variation
CYP1A2, CYP1A1 Cytochrome p450 (гены цитохрома Р-450 1А1 и Р-450 1А2)
GGsTTPl' GSTT1' Glutathione s-transferase М1, Т1, Р1
GPX1 Glutathione peroxidase 1
HR Homologous recombination (гомологичная рекомбинация)
hOGG1 Human 8-Oxoguanine-DNA Glycosylase
M-FISH Multiplex-FISH
OR Odds Ratio (отношение шансов)
М-FISH Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization
MTHFR 5, 10-methylenetetrahydrofolate reductase
MTR Methionine synthase
NBS1 NER
NHEJ
SOD2 SKY SNP Tp53
XRCC1, XRCC2, XRCC3
Nijmegen breakage syndrome 1
Nucleotide excision repair (эксцизионная репарация нуклеотидов)
Non-homologous end joining (негомологичное соединение концов)
Manganese superoxide dismutase Spectral Karyotyping Single nucleotide polymorphism Tumor protein 53
X-ray repair cross-complementing group 1, 2, 3
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Генетика», 03.02.07 шифр ВАК
Изучение молекулярно-генетических и цитогенетических факторов риска развития аденокарциномы легкого2021 год, кандидат наук Баканова Марина Леонидовна
Хромосомные аберрации в лимфоцитах рабочих теплоэнергетического производства и их ассоциации с полиморфными вариантами генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК2015 год, кандидат наук Савченко, Яна Александровна
Чувствительность генома и особенности проявления кластогенных эффектов у детей и подростков, подвергающихся воздействию радона в условиях проживания и обучения2012 год, кандидат биологических наук Ларионов, Алексей Викторович
Анализ ассоциаций показателей микроядерного теста в лимфоцитах с полиморфными вариантами генов ферментов репарации ДНК у работников угледобывающих предприятий2017 год, кандидат наук Синицкий, Максим Юрьевич
Хромосомные аберрации у работников угледобывающих предприятий с профессиональной легочной патологией и их ассоциация с генетическим полиморфизмом2020 год, кандидат наук Волобаев Валентин Павлович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к формированию цитогенетической нестабильности у населения угольного региона»
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования
Глобальной проблемой современного общества является накопление потенциально опасных генетических изменений (повреждений ДНК, патологических проявлений экспрессии генов) при действии различных факторов окружающей среды, которые способны приводить к увеличению генетического груза и росту заболеваемости населения (Бочков и др., 2015). Особенно остро эта проблема стоит для жителей промышленно развитых регионов. Важно определить, что считать фоновым уровнем генетических изменений в конкретных популяциях, выявить очаги повышенной генетической изменчивости, а также определить факторы, связанные с наибольшим риском для стабильности генома человека (Ьеоп-Ме^а е! а1., 2016). Специфика производственной деятельности, спектр действующих мутагенов, масштаб воздействия на живые системы, адаптивные возможности организмов, существенно различаются в разных районах мира. Это определяет необходимость разработки методов генетического мониторинга, учитывающих уникальные экологические, эпидемиологические факторы, этнические и молекулярно-генетические особенности населения.
Степень разработанности темы исследования
Важным внутренним фактором риска патологического изменения генома является наследственная предрасположенность. Она может обусловливать повышение уровня повреждений ДНК в результате действия мутагенов окружающей и производственной среды и в значительной мере определять риск развития злокачественной трансформации клеток. Одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения России и мира занимает рак легкого, этиологически связанный с особенностями индивидуальной чувствительности к факторам окружающей и производственной среды, вредным привычкам, образу жизни (Чиссов, 2012; Кижаев и др., 2015). Фундаментальной научной проблемой является изучение роли наследственной предрасположенности к формированию повреждений хромосом и развитию рака легкого у жителей, проживающих в условиях высокой канцерогенной нагрузки.
Известно, что ключевым моментом для формирования устойчивости организма к мутагенному и канцерогенному влиянию среды являются молекулярные особенности систем защиты генома. Полногеномные исследования ассоциаций (GWAS) выявили локусы, связанные с развитием рака легкого, молочной железы, колоректального рака и других форм (Peters et al., 2012; Poirier et al., 2015; Lindström et al., 2015). С использованием анализа генов-кандидатов выявлено достаточно большое количество маркеров, ассоциированных с формированием геномной нестабильности, в условиях действия генотоксических факторов химической и радиационной природы (Сальникова, 2011; Волков и др., 2013; Литвяков и др., 2013; Мейер и др., 2014; Skjelbred et al., 2011; Kadioglu et a., 2012; Ada et al., 2013; Weinhold et al., 2013; Costa et al., 2014; Hemminki et al., 2014, 2015; Vodicka et al., 2015; Santovito et al., 2015). Были выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксено- и эндобиотиков, антиоксидантного статуса, репарации ДНК, метилирования ДНК, контроля клеточного цикла и апоптоза с формированием повреждений ДНК. Однако эффекты данных локусов оказались крайне неоднозначными, что может быть связано с многообразием действующих факторов среды, расовыми и этническими особенностями, с генетической гетерогенностью популяций, с особенностями ген-генных и ген-средовых взаимодействий, с проблемой множественных сравнений (Barnett et al., 2012). Природа формирования повреждений хромосом, как ранее было показано в отношении генетики мультифакториальных заболеваний, может быть значимо связана с экспрессионными профилями генов, с эпигенетическими изменениями генома (эпимутациями), взаимодействиями ДНК-белок, ДНК-ДНК, белок-белок, которые могут компенсировать влияние неблагоприятных аллелей (Баранов, Баранова, 2016). С другой стороны, выявление профилей генетического риска, основанных на анализе SNP, может помочь стратифицировать индивидов в группах с различными вариантами ответа на то или иное мутагенное воздействие, что важно как для фундаментального понимания процессов, так и для разработки индивидуальных профилактических программ, создания основ современной системы профотбора.
Не изучена роль наследственной предрасположенности в формировании геномной нестабильности у населения угольных регионов. Между тем, известно, что работа предприятий угольного цикла связана со значительным загрязнением
воздушного и водного бассейнов, с изменением ландшафтов, нарушением земель и загрязнением их отходами, изменением радиационного фона, с появлением большого количества загрязнителей, способных непосредственно воздействовать на здоровье человека (Мун, Глушков, 2013; Cabarcas-Montalvo et al., 2012; Fernández-Navarro et al., 2012). Наиболее опасные токсиканты, связанные с добычей и переработкой угля, это угольные пылевые частицы разного размера (преимущественно, от 20 до 50 мкм), кварц, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), тяжелые металлы. Кроме того, уголь содержит природные радиоактивные вещества уранового, актиноуранового и ториевого рядов. Комплексное действие этих радиационных и химических факторов способно вызывать различные виды повреждений ДНК, возможно появление эпигенетических аномалий, изменение экспрессии генов, а на уровне популяции -повышение онкологической заболеваемости населения (Rohr et al., 2013; Guerrero-Castilla et al., 2014; León-Mejíaet al., 2014).
Для оценки генотоксических эффектов воздействия факторов среды в настоящее время применяется широкий спектр тестов, включающих молекулярные, молекулярно-цитогенетические, кариологические и классические цитогенетические методы (например, технологии микрочипового анализа, экзомного или полногеномного секвенирования (Next-generation DNA sequencing - NGS), анализ ^py-number variation (CNV), array-based сomparative genomic hybridization (aCGH), multiplex Fluorescence In Situ Hybridization (М-FISH), spectral karyotyping (SKY), анализ мутантных по локусу Т-клеточного рецептора лимфоцитов, ДНК-комет, микроядер, сестринских хроматидных обменов и другие). Наиболее богатый материал накоплен при использовании анализа нестабильных структурных хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах крови. Изменение уровня и спектра ХА отмечено в результате действия факторов окружающей и производственной среды в различных популяциях мира (Севанькаев и др., 2013; Харченко и др., 2015; Kadioglu et al., 2012; Rossner et al., 2013; Musak et al., 2013; Vozilova et al., 2013; Langie et al., 2015; Costa et al., 2015; Tawn et al., 2016; Santovito et al., 2015). Отмечено повышение уровня повреждений хромосом у рабочих угольных предприятий (Ada et al., 2013; León-Mejía et al., 2016 и др.). На основании цитогенетических исследований у населения Кемеровской области, были разработаны
принципы цитогенетического картографирования эффектов в промышленно развитом регионе (Дружинин, 2003).
В последнее время большое внимание уделяется взаимосвязи между ХА и ошибками репликации, репарации (Ensminger et al, 2014), структурой теломер и эпигенетическими процессами (Vajen et al., 2013; Xu et al., 2013). ХА способны существенно изменять экспрессионный профиль ключевых регуляторов жизнедеятельности клетки, в том числе, онкогенов и генов-супрессоров опухолей (Kloosterman, Hochstenbach, 2014). Тест на ХА используется не только как показатель нестабильности генома, но и в качестве одного из значимых предиктивных биомаркеров риска рака (Peters et al., 2011; Galas, Miszczyk, 2016). ХА в лимфоцитах крови начинают активно использоваться при описании цитогенетического статуса больных солидными опухолями (Vodicka et al., 2010; Vodenkova et al., 2015).
Однако остается много неясного относительно фенотипических эффектов хромосомных перестроек, приводящих к дисбалансу по числу копий множества генов, вовлеченных в различные регуляторные или морфогенетические процессы (Лебедев, 2016). При проведении регионально-ориентированных исследований крайне важным моментом является оценка динамики цитогенетических показателей и верификация фонового уровня повреждений, что возможно лишь при проведении долговременных мониторинговых исследований с применением унифицированных подходов. В настоящее время мало известно о степени риска того или иного типа повреждений хромосом (как для здоровых, так и для уже заболевших), о согласованности процессов мутагенеза и канцерогенеза в различных популяциях мира, о роли наследственной предрасположенности в формировании индивидуальной чувствительности к действию мутагенов у населения промышленных городов и сельских территорий, взрослых и детей, у мужчин и женщин, контактирующих с мутагенами на производстве и в быту. Практически неизученным эти вопросы остаются у жителей угольных регионов, проживающих в условиях напряженной экологической ситуации. Исходя из вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы: на основе комплексного анализа повреждений хромосом и полиморфных локусов генов-кандидатов охарактеризовать цитогенетический статус и
особенности формирования наследственной предрасположенности к цитогененетической нестабильности у населения угольного региона.
Задачи исследования:
1. Провести исследование уровня и спектра хромосомных аберраций у жителей промышленного центра и сельских территорий угольного региона (Кемеровской области) в период c 2001 по 2015 гг. Оценить динамику и верифицировать значения фоновых показателей хромосомной нестабильности в регионе.
2. Изучить уровень и спектр повреждений хромосом у рабочих угольных предприятий (шахты, угольные теплоэлектростанции).
3. Дать оценку цитогенетического статуса жителей Кемеровской области, контактирующих со сверхнормативными дозами радона в быту.
4. Проанализировать уровень и спектр хромосомных аберраций у населения территорий, отличающихся высокой частотой онкологических заболеваний и определить значимость показателей хромосомной нестабильности в клетках крови в качестве предикторов риска рака легкого.
5. Выполнить сравнительный анализ полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1 (del), GSTT1 (del), CYP1A1 (rs4646903 T>C; rs1048943 A>G), CYP1A2 (rs762551 C>A), GSTP1(rs1138272 С>Т; rs1695 A>G), репарации ДНК (XRCC2 (rs3218536 G>A), XRCC3 (rs861539 C>T), XRCC1 (rs25489 G>A; rs25487 A>G; rs1799782 C>T), APEX1 (rs1130409 T>G), hOGG1 (rs1052133 C>G ), ADPRT (rs1136410 T>C), XPG (rs17655 G>C), XPD (rs13181 T>G), XPC (rs2228001 A>C); ATM (rs1801516 G>A), NBS1 (rs1805794 C>G)), антиоксидантной защиты (GPx1(rs1050450 C>T), SOD2 (rs4880 T>C), CAT (rs1001179 C>T)), контроля метилирования и метаболизма фолатов (MTHFR (rs1801133 C>T), MTR (rs1805087 A>G)), контроля клеточного цикла и апоптоза (ТР53 (rs1042522 G>C)) у жителей Кемеровской области, работающих на предприятиях угольного цикла; больных раком легкого и не имеющих онкологических заболеваний; подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в жилых помещениях с учетом этнической принадлежности индивидов.
6. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с хромосомными аберрациями в клетках крови в группах больных раком легкого, рабочих угольных теплоэлектростанций, детей, проживающих в условиях воздействия сверхнормативных доз радона, с учетом этнической принадлежности индивидов.
7. На основе изучения моделей взаимодействия генов ферментов репарации ДНК, биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза выявить ключевые полиморфизмы и оценить значимость их взаимодействия в формировании наследственной предрасположенности к накоплению повреждений хромосом у жителей угольного региона.
8. Разработать систему оценки генетического статуса населения угольного региона с учетом состояния окружающей среды, онкологической заболеваемости и молекулярно-генетических особенностей жителей.
Научная новизна работы
Впервые проведен комплексный анализ хромосомных аберраций у населения угольного региона с учетом наследственной предрасположенности к формированию повреждений хромосом. Впервые выявлено снижение уровня аберраций хромосом у жителей промышленного центра (г.Кемерово) в период 2005- 2013 гг. по сравнению с 1986-2000 гг., что обьясняется сокращением производств, закрытием шахт и как следствие, снижением загрязнения окружающей среды. Установлено, что уровень и спектр повреждений хромосом у жителей сельской местности Кемеровской области, удаленных от промышленных центров и угольных месторождений, в период 2001-2011 гг. не отличался от данных, полученных в этом регионе ранее (1993-2000 гг.), что позволило впервые верифицировать региональный фоновый уровень хромосомных аберраций.
Впервые у жителей промышленного региона изучены повреждения хромосом у больных раком легкого и показана их предиктивная значимость в отношении риска рака легкого с учетом ведущих конфаундеров (возраста, курения, производственного стажа, хронических заболеваний дыхательной системы).
Впервые у населения угольного региона проведено сопоставление цитогенетических биомаркеров эффекта воздействия окружающей среды (хромосомных
u \ с» и т-\ с» и
аберраций) и стандартизованной онкологической заболеваемости. В районах с высокой заболеваемостью злокачественными новообразованиями частота хромосомных аберраций у населения оказалась статистически значимо выше, чем у жителей территорий с благополучной онкоэпидемиологической ситуацией.
В результате молекулярно-генетического анализа получены новые знания о распределении полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК, антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза у жителей Кемеровской области с учетом этнической принадлежности.
Впервые на основе анализа полиморфных вариантов генов у жителей г. Кемерова выявлена ассоциация локуса XPD (rs13181 T>G) с развитием плоскоклеточного рака легкого.
Впервые установлена роль аллельных вариантов полиморфных локусов в увеличении частоты хромосомных аберраций, индуцированных различными факторами окружающей среды угольного региона.
Впервые показано, что ведущую роль в формировании повреждений хромосом при действии сверхнормативных доз радона в быту, играют полиморфные локусы
CYP1A1 (rs1048943 A>G), GSTP1 (rs1695 A>G), XRCC2 (rs3218536 G>A), АТМ (rs1801516 G>A), TP53 (rs1042522 G>C) - у шорцев, XPD (rs13181 T>G) и TP53 (rs1042522 G>C) - у русских.
Формирование повреждений хромосом в результате воздействия факторов производственной среды у рабочих теплоэлектростанций связано с полиморфными вариантами генов CYP1A1 (rs4646903 T>C), hOGG1 (rs1052133 C>G), XRCC1 (rs25489 G>A). У больных раком легкого, проживающих в угольном регионе, формирование повреждений хромосом связано с полиморфными вариантами генов XPD (rs13181 T>G), GSTM1 del и APEX1 (rs1130409 T>G). У здоровых жителей промышленного центра, не работающих на промышленных предприятиях, хромосомные аберрации были ассоциированы с полиморфными вариантами гена АТМ (rs180151 G>A).
Теоретическая и практическая значимость
Результаты работы вносят вклад в общее представление об особенностях мутационного процесса у населения, проживающего на территориях с развитой угольной промышленностью. Полученные данные имеют важное значение при оценке токсико-генетических эффектов в других популяциях со сходным спектром действующих факторов окружающей и производственной среды. Полученные сведения вносят вклад в понимание структуры наследственной предрасположенности к формированию хромосомных повреждений при действии различных факторов окружающей и производственной среды. Результаты исследования структурных повреждений хромосом, генов-кандидатов, особенности их ассоциации с аберрациями хромосом в выборках, дифференцированных по полу и этнической принадлежности, целесообразно использовать в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска. Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования.
Методология и методы исследования
Методологическую основу работы составил системный подход, основанный на использовании комплекса методов цитогенетики, молекулярной генетики, онкоэпидемиологии, медицинской статистики, анализа результатов исследований ведущих отечественных и зарубежных ученых в области экологической и медицинской генетики. Единообразный подход к организации и проведению цитогенетических исследований позволил сопоставить параметры цитогенетического статуса у представителей различных групп жителей угольного региона. Были унифицированы все используемые лабораторные методы (условия культивирования клеток, подготовка препаратов, анализ хромосомных аберраций, верификация результатов). Цитогенетический анализ был дополнен изучением молекулярно-генетических особенностей индивидуумов, оказывающих существенное влияние на индивидуальную токсико-генетическую чувствительность к факторам среды.
Источниками информации для проведения систематического анализа служили: банк цитогенетических данных, банк ДНК, данные медицинской документации, специальные анкеты больных раком легкого и здоровых жителей Кемеровской области.
Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории цитогенетики ФИЦ УУХ СО РАН и на кафедре генетики КемГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Выраженные мутагенные эффекты у населения угольного региона обусловлены комплексным воздействием факторов производственной среды угольных предприятий и контактом со сверхнормативными дозами радона в быту. Наиболее высокая частота клеток с хромосомными аберрациями отмечена у шахтеров - 5,21 ± 0,23%, сотрудников угольных теплоэлектростанций - 3,91 ± 0,15% и у жителей, подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в домах (4,25 ± 0,13%).
2. Полиморфизм генов ферментов репарации ДНК, антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза в этнических группах (русских, шорцев), проживающих в Кемеровской области, характеризуется широким аллельным разнообразием. Межэтнические различия выявлены по распределению полиморфных вариантов генов hOGGl (rs1052133 C>G) , ADPRT (rs1136410 T>C), XPG (rs17655 G>C), GSTM1 (del), GSTP1 (rs1138272 С>Т), CYP1A1 (rs1048943 A>G), АТМ (rs1801516 G>A), SOD2 rs4880 Т>С.
3. С формированием хромосомных аберраций под действием сверхнормативных доз радона в быту у шорцев ассоциированы полиморфные варианты генов CYP1A1 (rs1048943 A>G), GSTP1 (rs1695 A>G), XRCC2 (rs3218536 G>A), АТМ (rs1801516 G>A), TP53 (rs1042522 G>C), а у русских - XPD (rs13181 T>G) и TP53 (rs1042522 G>C). У рабочих угольных теплоэлектростанций формирование хромосомных нарушений ассоциировано с полиморфными локусами CYP1A1 (rs4646903 T>C), hOGG1 (rs1052133 C>G) и XRCC1 (rs25489 G>A). Наследственная предрасположенность к формированию плоскоклеточного рака легкого и к накоплению хромосомных аберраций в клетках крови у больных связана с вариантами гена XPD (rs13181 T>G).
Степень достоверности и апробация результатов
Использование современных молекулярно-биологических, цитогенетических и биостатистических методов, большой объем выполненных лабораторных исследований
подтверждает достоверность результатов проведенной работы. Полученные данные соответствуют результатам, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Статистический анализ подтверждает достоверность полученных результатов. Выводы полностью и в логической последовательности отражают полученные результаты.
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на собраниях европейского общества мутагенов окружающей среды (Annual Meeting European Environmental Mutagen Society: Salzburg, 1998; Budapest, 2000; Aberdeen, 2003; Maastricht, 2004; Oslo, 2010), 6th Conference of the Pan African Environmental Mutagen Society (Cape Town, South Africa, 2008), 10th International Conference on Enviromental Mutagens (Firenze, Italy, 2009), съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; г. Санкт-Петербург, 2015), V Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2009), съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009; г. Ростов-на-Дону, 2014), пленумах Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации (Москва, 2010, 2011), конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2011), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской генетики» (Барнаул, 2015), VI Международной научно-практической конференции «Aктуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на Дону, 2015), Петербургском онкологическом форуме «Белые ночи-2015» (Санкт-Петербург, 2015).
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 07-04-96026-р_урал_а , 12-0432117, №13-06-98014 р-Сибирь-а, Государственных контрактов № 02.512.11.2233, №16.512.11.2062, в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственного задания Минобрнауки РФ №2014/64 и гранта РНФ №. 16-1500034.
Личный вклад автора
Автором исследования лично разработана идея и дизайн исследования. Все результаты генетических исследований, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора. Автор являлся организатором и непосредственным участником экспедиций по изучению генома жителей Кемеровской области. Автором самостоятельно осуществлен весь объем статистического анализа диссертационных материалов и выполнено обобщение полученных результатов. Переработан и значительно увеличен (на 1978 человек) банк цитогенетических данных (хромосомные аберрации) у жителей Кемеровской области. Проведен анализ динамики цитогенетических характеристик у населения Кемеровской области за период 1986 -2015 гг. Собрана коллекция ДНК жителей Кемеровской области, стратифицированная по национальности, месту жительства, профессии, состоянию здоровья. Создан банк данных о распределении генетических маркеров у представителей коренного (шорцы) и пришлого (русские) населении Западной Сибири, содержащий информацию о распределении частот аллелей и генотипов полиморфных локусов, кодирующих белки репарации ДНК, антиоксидантной защиты, метаболизма ксенобиотиков и фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза. В сотрудничестве с коллегами (онкоэпидемиологи к.м.н. С.А.Мун, к.м.н. С.А.Ларин) сопоставлены показатели онкологической заболеваемости и хромосомного мутагенеза у жителей различных территорий Кемеровской области.
Публикации
По теме диссертационного исследования опубликовано 46 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук и в том числе 19 статей, индексируемых в базах Web of Science или Scopus. По результатам работы был зарегистрирован патент РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа «Молекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к формированию цитогенетической нестабильности у населения угольного региона» соответствует формуле специальности «03.02.07 - Генетика
(биологические науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Генетика человека. Медицинская генетика».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 374 страницах, иллюстрирована 51 таблицей и 85 рисунками. Список литературы содержит 466 источников, из них 400 зарубежных.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Влияние добычи и переработки угля на живые системы
Экологические исследования, проводимые в различных регионах мира, свидетельствуют о существовании выраженного негативного влияния горного производства на воздушный, водный бассейн, состояние ландшафтов и биогеоценозов. В результате работы предприятий по добыче и переработке угля происходят изменения на всех уровнях: глобальном (загрязнение атмосферы и гидросферы), региональном (геохимические аномалии, поражение растительных, животных сообществ и человека) и локальном - в пределах предприятий (ликвидация или проседание почв, изменение уровня подземных и грунтовых вод, исчезновение или значительное поражение биоты). Воздействие угольных предприятий на окружающую среду носит комплексный и длительный характер, что превращает локальную проблему предприятия в глобальную экологическую проблему (Zhuravleva et al., 2016).
Многие исследователи сообщают не только о высоком уровне профессионально обусловленной патологии у угольщиков (Семенихин, 2006), но и о прямой взаимосвязи между добычей угля и возрастанием заболеваемости и смертности, связанной с легочными, онкологическими, сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями у населения, проживающего вблизи угольных шахт (Мун и др., 2013; 2014; Fernández-Navarro et al., 2012).
Эти негативные эффекты связаны с тем, что добыча и переработка угля связана с появлением большого количества токсикантов, способных воздействовать на здоровье человека, вызывать повреждения ДНК, изменять уровень экспрессии генов (Simmons et al., 2009; Guerrero-Castilla et al., 2014). Уголь содержит природные радиоактивные вещества уранового, актиноуранового и ториевого рядов, способные непосредственно повреждать ДНК. Установлено, например, что воздействие a-частиц радона, способно индуцировать повышение частоты аберраций хромосом и риск рака легкого у шахтеров (Smerhovsky et al., 2002).
Похожие диссертационные работы по специальности «Генетика», 03.02.07 шифр ВАК
Хромосомные аберрации в лимфоцитах крови у представителей коренного и пришлого населения Кемеровской области в связи с полиморфизмом генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков2010 год, кандидат биологических наук Ахматьянова, Венера Ринатовна
Молекулярные и клеточные маркеры чувствительности буккальных эпителиоцитов человека к воздействию излучений радона в бытовых условиях2013 год, кандидат наук Мейер, Алина Викторовна
Гигиенические аспекты формирования хромосомных аберраций у рабочих коксохимического производства2000 год, кандидат биологических наук Минина, Варвара Ивановна
Генетическая детерминация эффектов ионизирующих излучений: цитогенетические и эпидемиологические показатели2011 год, доктор биологических наук Сальникова, Любовь Ефимовна
Цитогенетические эффекты нейтронной терапии у больных злокачественными новообразованиями2013 год, кандидат наук Мельников, Александр Александрович
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Минина, Варвара Ивановна, 2016 год
Источники данных
Данные о состоянии окружающей среды: проанализированы Государственные доклады о состоянии и охране окружающей среды Кемеровской области за 19982015 гг., которые включают сведения о качестве окружающей среды, состоянии природных ресурсов, анализ воздействия видов экономической деятельности на
состояние окружающей среды и экологическая обстановка в промышленных центрах угольного региона.
Данные об онкологической заболеваемости населения: изучены эпидемиологические данные о стандартизованной заболеваемости злокачественными новообразованиями в Кемеровской области за период 1986 -2015 гг., которые были любезно предоставлены к.м.н. С.А.Лариным и к.м.н. С.А.Мун.
Данные об этническом составе населения: проанализированы данные Федеральной службы государственной статистики по Кемеровской области о национальном составе населения региона и расселении коренных малочисленных народов.
Данные об эколого-генетических исследованиях: изучены результаты биоиндикационных исследований (тест Эймса и тест на индукцию доминантных летальных мутаций у дрозофилы), проводившихся сотрудниками лаборатории генетического мониторинга Института экологии человека и гигиены окружающей среды им. Сысина; проанализированы данные о содержании валовых и подвижных форм металлов, выполненных сотрудниками аналитической лаборатории Испытательного центра по агрохимическому обслуживанию сельскохозяйственного производства ФГУ Центр агрохимической службы «Кемеровский»; изучены результаты биодозиметрических исследований (замеры мощности экспозиционной дозы внешнего у - излучения, объемной активности радона, определение суммарной объемной активности а- и в -излучающих радионуклидов), выполненных сотрудниками кафедры генетики Кемеровского государственного университета.
Данные об цитогенетических исследованиях - изучены результаты мониторинга хромосомных аберраций у жителей Кемеровской области, проводившегося в период 1986- 2000 гг. сотрудниками кафедры генетики Кемеровского государственного университета (данные любезно предоставлены профессором В.Г.Дружининым).
Анализ вышеперечисленных данных послужил основой для выбора приоритетных для цитогенетического обследования групп населения Кемеровской области. Дизайн исследования (рис. 1) был утвержден комитетом по этике Института экологии человека Федерального исследовательского центра угля и углехимии СО РАН.
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ТИПУ «СЛУЧАЙ-КОНТРОЛЬ»
Группы сравнения
Учет конфаундеров
О
Рабочие угольных предприятий
Жители угольного
региона, контактирующие со сверхнормативными дозами радона в быту
Проживающие в зонах
высокого канцерогенного риска
Больные раком легкого
Не работающие на производстве
Критерии оценивания
О
О
Этническая принадлежность
Индивиды без онкозаболеваний
Пол
Возраст
Вредные привычки (курение)
Уровень и спектр хромосомных аберраций
Анализ 8КР в генах-кандидатах
Анализ результатов
О
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с формированием хромосомных аберраций
Идентификация генетических маркеров риска формирования хромосомных аберраций
Рисунок 1. Дизайн исследования.
2.2. Характеристика обследованных групп
Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинский исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации» (утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 2660). План исследования был утвержден комитетом по этике Института экологии человека Федерального исследовательского центра угля и углехимии СО РАН. Участие людей в исследовании базировалось на принципах добровольности и информированности о целях, методах и результатах работы. Все участники (у детей - их законные представители) подписывали информированное согласие и предоставляли подробные анкетные данные.
В период 2001-2015 гг. было обследовано 1978 жителей Кемеровской области, в том числе 1308 мужчин и 670 женщин (табл.1).
Таблица 1- Общая характеристика обследованных групп жителей Кемеровской области
Параметры Жители сел * Жители г.Кемерово Рабочие угольных предприятий Больные раком легкого Жители г.Таштагол Всего
Всего обследовано 391 411 395 410 371 1978
Возраст, лет (Меап ± St.err) 21,5 ± 0,7 48,0 ± 0,5 44,9 ± 0,5 58,9 ± 0,4 12,9 ± 0,1 37,8 ± 0,4
Мужчин 169 262 332 350 195 1308
Женщин 222 149 63 60 176 670
Курильщиков (%) 28,0 40,0 50,2 83,9 12,4 58,7
Примечание. Здесь и далее Меап - среднее значение; St.cn- - стандартная ошибка среднего значения
*- с.Красное (Ленинск-Кузнецкий район), с.Раздолье, с.Зарубино (Топкинский район), с.Плотниково (Промышленновский район) с.Тараданово (Крапивинский район), п.Юрты-Константиновы , п. Ленинский (Яшкинский район), с.Беково (Беловский район)
Состояние здоровья оценивали на основании данных медицинских карт и заключений специалистов - онкологов (для больных РЛ). Подавляющее большинство индивидов были русской национальности. Кроме того, были обследованы шорцы (г. Таштагол), телеуты (с. Беково), сибирские татары (п. Юрты-Константиновы). Шорцы и телеуты относятся к коренным малочисленным народам России (табл.2). Численность шорцев в Российской Федерации составляет порядка 14 000 человек, а телеутов 2700.
Таблица 2 - Этнический состав обследованного населения Кемеровской области
Русские Шорцы1 Метисы2 Телеуты3 Татары4 Другие 5 этносы
Объем выборки 1548 214 76 62 32 46
Возраст, лет (Mean ± St.err) 43,3 ± 0,4 12,6 ± 0,2 13,5 ± 0,3 28,4 ± 0,2 46,5 ± 0,2 14,7 ± 0,5
Муж/жен 1091/457 105/109 48/28 30/32 20/12 23/23
районе;
2 3
метисы шорцы/русские; телеуты- коренной малочисленный народ Сибири,
проживают в Беловском районе, - сибирские татары, проживающие в п.Юрты-Константиновы (Яшкинский район); 5 группа смешанного этнического состава (немцы, белорусы, украинцы, метисы: русские/чуваши, русские/немцы, русские/татары, русские/белорусы)
Критерии исключения для всех изученных групп - психические, наследственные, инфекционные, аллергические, аутоиммунные, онкологические заболевания (кроме группы с РЛ), рентгенологическое облучение и прием лекарственных препаратов до забора крови для анализа; повышенная температура, субъективно плохое самочувствие (в том числе, обострение хронических заболеваний, депрессия, психологический стресс) в момент исследования.
В ходе экспедиций 2001-2011 гг. было обследовано население сельских районов Кемеровской области (табл.3). Критерии включения - удаленность сельских населенных пунктов от промышленных центров области (не менее 100 км), отсутствие предприятий на территории самих сел. В группу включались дети (N=267) и взрослые (N=124), из них на долю курильщиков приходился 31%. Средний возраст обследованных в период 20012011 гг. составил 21,5 ± 0,7 лет. Для сравнения использовались результаты цитогенетических наблюдений, проводившихся в сельских районах Кемеровской области в период 1993-2000 гг. В данную группу входило 110 человек (95 детей,
средний возраст: 14,3 ± 0,2 лет; 15 взрослых, средний возраст: 38,8 ± 1,7 лет; 9% курильщиков), в том числе 83 женского и 27 мужского пола.
Таблица 3 - Характеристика групп жителей сельских районов Кемеровской области
Населенный пункт Год Обследовано всего Возраст, лет (Mean ± St.err) Муж Жен
с. Беково_(Беловский район) 2001 62 28,4 ± 2,2 30 32
с. Плотниково (Промышленновский район) 2001 22 15,3 ± 0,2 22
с. Тараданово (Крапивинский район) 2002 40 16,2 ± 0,4 15 25
с. Раздолье (Топкинский район) 2002 25 21,8 ± 2,5 10 15
п. Юрты-Константиновы (Яшкинский район) 2003 32 46,5 ± 3,2 12 20
п. Ленинский (Яшкинский район) 2003 24 39,5 ± 0,7 19 5
с. Пача (Яшкинский район) 2008 53 12,8 ± 0,2 27 27
с. Красное (Ленинск-Кузнецкий район) 2008 41 16,8 ± 0,2 10 31
с. Зарубино (Топкинский район) 2011 92 14,3 ± 0,3 47 45
ИТОГО: дети 267 14,2 ± 0,1 116 151
взрослые 124 37,2 ± 0,5 53 71
Суммарно 391 21,5 ± 0,7 169 222
Цитогенетический мониторинг у жителей промышленного центра (г. Кемерово), проводился в период 2005-2013 гг. (табл.4). Критерии включения - возраст старше 20 лет, русская национальность. На долю курильщиков приходилось 39% обследованных. Для сравнения использовались результаты цитогенетических наблюдений, проводившихся в г. Кемерово в период 1986-1998 гг. В обследованную тогда группу
входили 96 человек (52 мужчины, 44 женщины, 25% курильщиков; средний возраст 45,9 ± 0,6 лет).
Таблица 4 - Характеристика обследованных жителей г. Кемерово
Год обследования Обследовано всего Возраст, лет (Mean ± St.err) Муж Жен
2005 79 45,5 ± 0,9 24 55
2008 62 42,5 ± 0,3 48 14
2009 21 57,1 ± 0,9 14 7
2010 20 42,4 ± 0,2 9 11
2011 43 55,8 ± 0,9 27 16
2012 174 48,0 ± 0,5 165 9
2013 12 58,4 ± 0,9 9 3
Итого 411 47,9 ± 0,5 296 115
Для изучения цитогенетических характеристик у населения территорий Кемеровской области с высокой онкологической заболеваемостью были использованы как результаты собственных цитогенетических исследований, так и данные, полученные кафедрой генетики КемГУ в: г. Топки (1993 г), г. Новокузнецк (1998 г.), г. Осинники (1995 г.), г. Мыски (1995 г.), г. Таштагол (1992 г.), Крапивинский район (1994 г.), г. Анжеро-Судженск (1995 г.). Для проведения сопоставлений было сформировано две группы, половозрастные характеристики которых представлены в табл.5.
Критерии включения: в Группу I включали жителей населенных пунктов с повышенной заболеваемостью злокачественными новообразованиями (более 3 случаев на 1000 человек): Таштагольский район, Топки, Новокузнецк, Осинники, Мыски. Показатель стандартизованной онкологической заболеваемости в Кемеровской области составил среднем 2,82 %о (в период 1990-2010 гг.). Тогда как для группы I данный показатель был равен 3,69 %о (за тот же период). Города группы I характеризуются высоким уровнем загрязнения окружающей среды потенциальными канцерогенами.
г.Новокузнецк - это промышленный город, где размещаются предприятия металлургии, машиностроения, энергетического комплекса, угольной промышленности.
Таблица 5 - Половозрастная характеристика отдельных групп жителей Кемеровской области
Группа/ территория Обследовано всего ОЗ* %0 Возраст, лет (Mean ± St.err) Муж Жен
Группа I
Таштагольский район 399 3,57 13,1 ± 0,1 210 189
г. Топки 26 5,19 12,9 ± 0,5 12 14
г. Новокузнецк 104 3,21 28,3 ± 1,4 39 65
г. Осинники 18 3,38 11,7 ± 0,5 12 6
г. Мыски 26 3,08 15,7 ± 0,1 3 23
Вся группа 573 3,69 15,9 ± 0,4 276 297
Группа II
Крапивинский район 96 2,80 15,5 ± 0,2 25 71
Беловский район 35 2,55 15,2 ± 1,1 19 16
Промышленновский район 22 2,74 15,3 ± 0,2 22
Чебулинский район 14 2,42 14,8 ± 0,4 3 11
Яшкинский район 65 2,39 14,3 ± 0,5 33 32
Ленинск - Кузнецкий район 41 2,29 16,8 ± 0,2 10 31
г. Анжеро-Судженск 35 2,52 15,7 ± 0,1 15 20
Вся группа 308 2,54 15,4 ± 0,2 105 203
Примечание. *ОЗ - стандартизованный показатель онкологической заболеваемости населения данной территории в период 1990-2011 гг. (оба пола, все формы) по данным литературы (Мун и др., 2009; 2013).
Суммарные выбросы опасных загрязняющих веществ (формальдегид, бензо(а)пирен, взвешенные вещества и др.) в атмосферный воздух г. Новокузнецк являются самыми высокими в Кузбассе (Государственный доклад ..., 2015). Города Осинники (угольная промышленность) и Мыски (энергетика) по объему выбросов загрязняющих веществ также входят в пятерку самых загрязненных территорий области. Антропогенная нагрузка на одного жителя в г.Мыски составляет 1282 кг/человек, а в г. Осинники - 759 кг/человек. Высокие показатели онкологической заболеваемости в г.Топки могут быть связаны с влиянием на окружающую среду цементного завода. г.Таштагол относится к радоноопасным территориям (Смыслов и др., 1995). Кроме того, в данном районе в связи с интенсивной разработкой угольных и рудных месторождений, сопровождающейся массовыми вскрышными работами, в непосредственной близости от населенных пунктов сформировались долговременные, потенциально опасные по радиационному загрязнению участки (золо- и шлакоотвалы, хранилища отходов и др.). Всего в группу I вошло 573человека. Из них 29 курильщиков и 544 некурящих. Критерием включения в Группу II (контроль) было проживание в «благополучных» с онкоэпидемиологической точки зрения, территорий (удалены от промышленных зон; онкологическая заболеваемость ниже среднеобластных). Были обследованы жители Крапивинского, Беловского, Промышленновского, Чебулинского, Яшкинского, Ленинск-Кузнецкого районов и города Анжеро-Судженск. В группу II вошло 308 человек, из них 24 курильщика и 284 некурящих. Взаиморасположение изученных территорий представлено на рис.1.
При проведении исследований по принципу «случай-контроль» группы формировались с учетом возраста, пола, этнической принадлежности и влияния факторов среды.
Для изучения влияния производственной среды угольных предприятий были обследованы 115 шахтеров-подземщиков, работающих на угольных шахтах Кузбасса (проходчики, горнорабочие очистного забоя, горные мастера) и 280 рабочих угольных теплоэлектростанций (ТЭС) г. Кемерово, выполняющих основные производственные операции (машинисты, слесари). Половозрастной состав производственных и контрольных групп представлен в таблицах 6, 7.
Рисунок 2. Карта Кемеровской области
Темно-серым обозначены территории с высокой онкологической заболеваемостью (выше 3 %), а светло-серым - районы с низкой заболеваемостью злокачественными новообразованиями (оба пола)
Таблица 6 - Характеристика группы шахтеров Кемеровской области
Показатели Рабочие угольных шахт Контроль
Обследовано всего 115 103
Средний возраст, лет 53,4 ± 0,5 52,7 ± 0,4
Возраст (мин-макс) 40-65 46-67
Мужчин 115 103
Женщин - -
Курильщики 41 50
Не курящие 59 53
Стаж работы под 25 -
землей, лет
Таблица 7 - Характеристика группы рабочих теплоэлектростанции г. Кемерово
Показатели Рабочие ТЭС Контроль
Обследовано всего 280 288
Средний возраст, лет 41,5 ± 0,6 45,8 ± 0,5
Возраст (мин-макс) 22-65 21-68
Мужчин 217 201
Женщин 63 87
Курильщики 150 141
Не курящие 130 147
Стаж работы на ТЭС, 14,4 -
лет
В качестве контроля к группе шахтеров использовались результаты цитогенетического исследования жителей г. Кемерово, не работающих промышленных предприятиях. Критерии включения - мужской пол, возраст 40 и более лет, русская национальность. В качестве контроля к группе рабочих ТЭС были обследованы жители г.Кемерово, не работающие промышленных предприятиях. Критерии включения -возраст старше 20 лет, русская национальность.
Следует отметить, что как у обследованных шахтеров, так и рабочих ТЭС отмечалось превышение ПДК по угольной пыли в воздухе рабочих зон (4 мг/м3). У шахтеров среднесменная концентрация пыли на рабочем месте у горнорабочих очистного забоя составила 68,1 мг/м3, у проходчиков - 96,6 мг/м3 (максимальные
значения достигали 180 мг/м3), у электрослесарей -51,2 мг/м3, у горных мастеров - 42,5 мг/м3. У рабочих ТЭС среднесменная концентрация угольной пыли в воздухе рабочих зон машинистов топливоподачи составляла 23 мг/м3, у слесарей - 11 мг/м3.
Для изучения эффекта воздействия сверхнормативных доз радона в быту на показатели повреждаемости хромосом была изучена группа детей, проживающих в школе-интернат г.Таштагол (юг Кемеровской области), в котором при радиологических исследованиях ранее были отмечены высокие значения объемной активности радона в жилых, учебных и хозяйственных помещениях (табл. 8).
Таблица 8 - Результаты измерений объемной активности радона (ОА) в воздухе помещений обследованных территорий*
Населенный пункт Дата Точек ОА радона, Бк/м3 Размах ОА, Бк/м3
/год замеров замера (Меап ± Б1.егг) (Мт-Мах)
г. Таштагол
2007 20.12 11 235 ± 44 68 - 583
2008 06.02 6 415 ± 53 232 - 617
13.05 5 200 ± 42 101 - 334
2009 04.02 7 432±116 118 - 991
11.02 7 730 ± 77 192 - 1285
2010 10.02 10 905 ± 234 680-1143
2011 11.05 18 347± 101 74 - 749
Контрольная группа 25.01 12 106 ± 17 39 - 203
д. Красная/ 2008
с. Пача/ 2008 15.05 6 64 ± 22 20 - 135
с. Зарубино/ 2011 6.04.11 31 200 ± 23 53-534
Примечание. *По данным: Дружинин и др.,2009; Мейер, 2013.
Половозрастная характеристика обследованных групп детей представлена в таблице 9. В качестве контроля была обследована группа детей сел и деревень, проживающих в домах, где уровень объемной активности радона не превышает 200 Бк/м3 (согласно нормам радиационной безопасности это допустимый уровень для эксплуатируемых зданий). Критерии включения - возраст 8-18 лет, наличие данных об уровне объемной активности радона в месте проживания.
Таблица 9 - Характеристика обследованных групп детей
Населенный пункт / Объем Возраст, лет Мальчиков Девочек
Год обследования выборки Mean ± St.err
г. Таштагол
2004 49 13,3 ± 0,3 21 28
2007 68 12,6 ± 0,3 37 31
2009 92 13,9 ± 0,2 52 40
2010 69 11,7 ± 0,4 36 33
2011 93 12,7 ± 0,3 49 44
Всего 371 12,9 ± 0,1 195 176
Контрольная группа с. Пача/ 2008 53 12,8 ± 0,2 27 26
д. Красная/ 2008 41 16,7 ± 0,2 10 31
с. Зарубино/ 2011 92 14,3 ± 0,3 46 46
Всего 186 14,4 ± 0,3 83 103
Для изучения цитогенетических эффектов у больных раком легкого всего было обследовано 700 человек, первично обратившихся в Кемеровский областной онкологический диспансер для диагностики и лечения. Кровь забиралась в первый день поступления в стационар. Из данной группы отбирались индивиды в соответствии с критериями включения/исключения. Критерии включения: жители г.Кемерово 40 и более лет, русской национальности, первично обратившиеся в Кемеровский областной онкологический диспансер для постановки диагноза и последующего лечения. Критериями исключения (дополнительно к вышеописанным) являлись: наличие родственников с онкологическими заболеваниями (семейные случаи), прием химиотерапевтических препаратов или рентгенологическое облучение до забора крови для анализа. После проведения комплексного клинико-инструментального исследования лечащими врачами и специалистами Кемеровского областного онкологического диспансера и подтверждения диагноза РЛ, после проверки на соответствие критериям включения/исключения в итоговую группу пациентов с РЛ вошли 410 человек (табл. 10). В группу контроля вошли 335 здоровых жителей г. Кемерово (без онкологических заболеваний), являвшихся донорами областной станции переливания крови, русской национальности, в возрасте 40 и более лет, отобранные в соответствии с принятыми критериями включения/исключения.
Таблица 10 - Характеристика групп больных РЛ и здоровых жителей г. Кемерово, включенных в анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови
Показатели Больные РЛ Контроль
Средний возраст, лет (Mean ± St.err) 58,9 ± 0,4 57,1 ± 0,4
Возраст (мин-макс) 40-81 40-75
Обследовано Всего 410 335
Мужчин 350 263
Женщин 60 72
Курение статус Курильщики 345 156
Не курящие 65 179
Курение индекс Пачки/лет (в %) 32,5 30,6
Производственный риск Производственный риск (да/нет) 255/155 136/199
Стаж работы во «вредных» условиях 19,8 18,8
Тип рака Мелкоклеточный РЛ 30 -
Плоскоклеточный 215
Аденокар цинома 121
Крупноклеточный 44
н а 0, I, II 209
III, IV 192
Анамнез курения рассчитывался в терминах «статус курения» (курит/не курит) и «индекс курения». Последний рассчитывался в общепринятых единицах «пачки/лет» (pack/years, PY) (GOLD, 2011) по формуле:
= N * n ; 20 '
где: N - количество сигарет выкуриваемых в день, п - стаж курения, лет, 20 - число сигарет в одной пачке.
Молекулярно-генетический анализ 8КР был поведен у 1184 жителей Кемеровской области (табл. 11). Основными критериями для выбора однонуклеотидных замен были: распространенность в популяции, известны функциональные эффекты замен на молекулярном уровне, наличие сведений о возможности влияния на уровень повреждений генома. Всего было изучено 25 полиморфных вариантов 22 генов.
Таблица 11 - Объем выборок, изученных по полиморфным локусам генов
Ген Жители Рабочие Больные Жители Жители Всего
RefSNP г.Кемерово ТЭС РЛ г.Таштагол сел
hOGGl rs1052133 335 202 215 271 161 1184
ADPRT rs1136410 335 202 215 271 161 1184
XRCC1 rs25489 335 202 215 271 161 1184
XRCC1 rs1799782 283 - - 271 161 678
XRCC1 rs25487 335 202 215 271 161 1184
XPD rs13181 335 202 215 271 161 1184
XPG rs17655 335 202 215 271 161 1184
XPC rs2228001 335 202 215 271 161 1184
АТМ rs1801516 335 202 215 271 161 1184
NBS1 rs 1805794 335 202 215 271 161 1184
XRCC2 rs3218536 335 202 215 271 161 1184
XRCC3 rs861539 335 202 215 271 161 1184
ТР53 rs1042522 335 202 215 271 161 1184
GSTP1 rs 1138272 335 202 215 271 161 1184
GSTP1 rs1695 335 202 215 271 161 1184
GSTM1 deletion 335 202 215 271 161 1184
GSTT1 deletion 335 202 215 271 161 1184
Продолжение таблицы 11
Ген Жители Рабочие Больные Жители Жители Всего
RefSNP г.Кемерово ТЭС РЛ г.Таштагол сел
CYP1A1 rs4646903 335 202 215 271 161 1184
CYP1A1 rs1048943 283 - - 271 161 678
CYP1A2 rs762551 335 202 215 271 161 1184
SOD2 rs4880 335 202 215 271 161 1184
GPx1 rs1050450 335 202 215 271 161 1184
MTHFR rs1801133 335 202 215 271 161 1184
MTR rs1805087 335 202 215 271 161 1184
CAT rs1001179 335 151 215 271 161 1133
Для исследования ассоциаций между полиморфными вариантами генов-кандидатов и ХА были сформированы группы, включающие индивидов с полной информацией по молекулярно-генетическим и цитогенетическим маркерам. Характеристика групп представлена в таблице 12.
Таблица 12 - Характеристика групп, включенных в исследование ассоциаций полиморфных вариантов генов и хромосомных аберраций
Показатели Рабочие ТЭС* Больные РЛ * Взрослые Здоровые* Таштагол шорцы Таштагол русские Жители сел**
Обследовано всего 202 215 335 209 62 161
Возраст, лет (Mean ± St.err) 43,9 ± 0,7 59,8 ± 0,4 57,1 ± 0,4 12,6 ± 0,2 12,9 ± 0,3 14,4 ± 0,2
Мужчин 152 215 263 102 34 73
Женщин 50 - 72 107 28 88
Курильщики 92 215 156 15 - 24
Не курящие 110 - 179 194 62 137
Примечание. КО - Кемеровская область, *жители г.Кемерово русской национальности, ** дети: с.Красное (Ленинск-Кузнецкий район КО), с.Зарубино (Топкинский район КО), с.Пача (Яшкинский район КО), которые согласно данным радиологических исследований в домах не подвергались воздействию сверхнормативных доз радона
2.3. Методы исследования 2.3.1. Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека
Материалом для исследования хромосомных аберраций (ХА) служила цельная периферическая кровь (1мл), которая забиралась квалифицированным медицинским работником в асептических условиях в системы «Вакутейнер» с гепарином в качестве антикоагулянта. Культивирование клеток крови проводили по стандартному полумикрометоду (Hungerford, 1965). Смесь для культивирования готовили из расчета: среда RPMI-1640 с гентамицином (4,5 мл), эмбриональная телячья сыворотка (1 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко) и помещали в стерильные культуральные флаконы. Затем в каждый флакон добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Для каждого человека готовилось две культуры. Культуральные флаконы выдерживали при 370С в течение 48 ч. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки 0,55 % KCl (в течение 20 мин) и фиксации клеток в 3 сменах охлажденного метанол-уксусного фиксатора (3:1) суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали. Препараты окрашивали 1% красителем Гимза (Merk) и анализировали при помощи микроскопов Carl Zeiss: AxioImager M2, AxioScope.A1, Axioskop 2 plus.
Учет аберраций хромосом проводили на зашифрованных препаратах. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Бочков и др., 2001; Carrano, Natarajan, 1988). На каждого человека анализировали 100-1000 метафаз (в среднем, 200 клеток). Долю аберрантных метафаз определяли как отношение числа клеток c аберрациями хромосом к общему числу изученных клеток. Учитывали аберрации хроматидного (одиночные фрагменты и межхроматидные обмены) и хромосомного типов (парные фрагменты, дицентрические хромосомы с фрагментами и без, кольцевые хромосомы, атипичные моноцентрики). Ахроматические пробелы в число аберраций не включали. Мультиаберрантные, rogue cells в общий анализ не включали, а учитывали отдельно. Верификацию спорных вариантов осуществляли путем повторного анализа разными исследователями. Результаты анализа ХА заносили в электронную базу данных.
2.3.2. Выделение геномной ДНК
ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Кровь 4 мл набирали в системы «Вакутейнер» с антикоагулянтом 0,25 мМ ЭДТА-Na, затем переносили в пробирки типа Эппендорф. Из отстоявшейся крови забирали надосадочный слой (плазму) и кольцо лейковзвеси, которые переносили в чистую пробирку и центрифугировали (2000 об/мин, 5 мин). Плазму удаляли, а к осадку добавляли 500 мкл NH4Cl, ресуспендировали, отстаивали 10 мин и вновь центрифугировали. Вновь вносили 500 мкл NH4Cl и повторяли процедуру до получения белого осадка лейковзвеси, который далее хранили при -200С.
Пробирки с клиническими образцами центрифугировали 5 минут на максимальной скорости (14 т. о./мин.). Осадок ресуспендировали в 300 мкл. раствора № 1 (100mM Tris HCl pH = 8, 100mM NaCl, 10mM EDTA). Добавляли 40 мкл. раствора № 2 (10% додецил сульфат натрия (SDS) и 10 мкл. протеиназы К (10 мг/мл). Хорошо перемешивали и инкубировали при 55 °С, 1 час. Добавляли 200 мкл. фенола и 200 мкл. хлороформа. Интенсивно перемешали и центрифугировали 10 минут на максимальной скорости. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, не трогая лишнего и интерфазу. Добавляли 400 мкл. хлороформа. Перемешивали и центрифугировали 5 минут на максимальной скорости (14 т. о./мин.). Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку. Добавляли 10 мкл. ЛПААГ, 40 мкл. 3М Ас№ pH = 5,4, перемешивали. Добавляли 800 мкл. 96% этанола, перемешивали. Инкубировали ночь на +4 °С. Центрифугировали 15 минут на максимальной скорости. Супернатант удаляли, осадок промывали 400 мкл. 75% этанола. Сушили пробирки с открытыми крышками в термостате для микропробирок при 37 °С в течение 15 минут до исчезновения запаха спирта. Осадок растворяли в 300 мкл. ТЕ-буфера (10mM Tris HCl pH = 8, 0,5 mM EDTA). Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 °С. Проверку качества выделенной ДНК (концентрацию в базовых и рабочих растворах) проводили при помощи NanoPhotometer p330 (Implen).
2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Анализ полиморфных локусов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторах: CFX96 (Bio-Rad, США), iCycler iQ5 (Bio-Rad, USA), «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для различных методов ПЦР-анализа представлены в табл. 13-15.
Типирование локусов XRCC2 (rs3218536), XRCC3 (rs861539), GPxl (rs1050450), SOD2 (rs4880), MTHFR (rs1801133), MTR (rs1805087), GSTP1 (rs1695, rs1138272), ТР53 (rs1042522), CYP1A1 (rs1048943), CYP1A2 (rs762551) проводили методом real-time ПЦР с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов с использованием наборов реактивов СибДНК (СибДНК, Новосибирск). Каждый образец амплифицировался с использованием пары специфических праймеров и двух зондов, несущих «гаситель» на З'-конце (BHQ) и флуоресцентных красителей (FAM и R6G) на 5'-конце (таблица 13).
Таблица 13 - Характеристика локусов, изученных методом real-time PCR
Ген Локализация в геноме RefSNP полиморфный локус Аллели
TP53 17p 13.1 rs1042522 215 G>C /Arg72Pro G, C
XRCC2 7q36.1 rs3218536 563G> A /Arg188His G, A
XRCC3 14q32.3 rs861539 722C>T/ Thr241Met C, T
GSTP1 11q13 rs1695 313A>G/ Ile105Val A, G
11q13 rs1138272 341С>Т/ Ala114Val C, T
CYP1A1 15q22 rs4646903 3801T>C / CYP1A1*2A T, C
CYP1A2 15q22 rs762551 -163C>A/ CYP1A2*1F C, A
GPx1 3р21.3 rs1050450 599C>T / Pro198Leu C, T
SOD2 6q25.3 rs4880 47 Т>С /Ala16Val Т, С
MTHFR 1p36.3 rs1801133 677C>T/Ala222Val C, T
MTR 1q43 rs1805087 2756 A>G/ Asp919Gly A, G
Таблица 14 - Характеристика праймеров и зондов, использованных для типирования SNP методом real-time PCR
Ген/ RefSNP Последовательность праймеров Последовательность зондов Ta, 0С
CYP1A1 rs4646903 5' - TAAGGCAGGTGGATCACTTGAG-3' 5' - CTGGTACCATTTTGTTTCACTGTAAC-3' 5' - FAM - TGAGACCATTGCCCGCTG -BHQ-3' 5' - R6G - TGAGACCGTTGCCCGCTG -BHQ-3' 64
CYP1A2 rs762551 5'-ATTCTGTGATGCTCAAAGGGTG-3' 5'-AAGGAGGGACTAGGCTGAGG-3' 5' -FAM-CTGTGGGCACAGGACGCA-BHQ-3' 5'-R6G-CTGTGGGCCCAGGACGC-BHQ-3' 62
GPxl rs1050450 5'-GCTTCCAGACCATTGACATC-3' 5'-GAGGTGGTATTTTCTGTAAGATC-3' 5' -R6G -CTCAAGGGCTCAGCTGTGC-BHQ- 3' 5'-FAM-CTCAAGGGCCCAGCTGTGC- BHQ-3' 60
SOD2 rs4880 5' -CGTTGATGTGAGGTTCCAG-3' 5' -CTGTGCTTTCTCGTCTTCAG-3' 5'-FAM-CTGGCTCCGGCTTTGGGG-RTQ-3' 5'-R6G-CTGGCTCCGGTTTTGGGG-FQ-3' 60
MTHFR rs1801133 5'-C TGAAGCAC TTGAAGGAG-3', 5'-TCACAAAGCGGAAGAATG-3' 5 -R6G- CTGCGGGAGCCGATTTC BHQ- 3', 5'- FAM -CTGCGGGAGTCGATTTCAT BHQ -3' 62
MTR rs1805087 5'- CTATCTTGCATTTTCAGTGTTCC -3' 5'- ATCTGTTTCTACCACTTACCTTGAG -3' 5' -FAM-CTCATAATGGTCCTGTCTAA-BHQ-3', 5'-R6G -CTCATAATGGCCCTGTCTAA- BHQ-3' 58
GSTP1 rs1695 5' -GATGCTCACATAGTTGGTGTAG-3' 5' - GGTGGACATGGTGAATGAC-3' 5'-FAM-CTGCAAATACATCTCCCTCAT-BHQ-3' 5'-R6G-CGCAAATACGTCTCCCTCAT-BHQ-3' 60
GSTP1 rs1138272 5' -CAGCAGGGTCTCAAAAGGC-3 5' -GGAGCAAGCAGAGGAGAATC-3' 5'-R6G- CTTGCCCACCTCCTGC-BHQ-3' 5'-R6G-CTTGCCCACCTCCTGC-BHQ-3' 60
XRCC2 rs3218536 5'- GTTCTCAGTGCTTAGAGAAGCT-3' 5'- GCATTATAGTTTGTGTCGTTGC-3' 5'-FAM-TGACTATCGCCTGGTTCTT- BHQ-3' 5'-R6G-TGACTATCACCTGGTTCTT- BHQ-3' 60
XRCC3 rs861539 5' - CCATTCCGCTGTGAATTTGAC -3' 5' - TCTGGAAGGCACTGCTCAGC-3' 5'-FAM-CACGCAGCGTGGCCCC-BHQ-3' 5'-R6G-CACGCAGCATGGCCCC-BHQ-3' 63
TP53 rs1042522 5' - GCTCCCAGAATGCCAGAG-3' 5' - GGGAAGGGACAGAAGATGAC -3' 5' - FAM- CTCCCCGCGTGGCCC BHQ-3' 5' - R6G - CTCCCCCCGTGGCCC BHQ-3' 62
Ta- аппеаНп§ temperature (температура отжига праймеров)
Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40-100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200 нМ Taqman-зондов, коньюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, амплификационный буфер, термостабильную Taq-полимеразу - 0.5 ед.акт./реакц. Амплификацию проводили с помощью амплификатора iCycler iQ 5, Bio-Rad CFX (Bio-Rad, США). Результаты интерпретировали, исходя из анализа графиков накопления флуоресценции. Температурный режим: Начальная денатурация - 950С - 15 мин; 40-60 циклов амплификации: денатурация - 950С, 15 сек; отжиг - 60-650С, 30 сек; элонгация - 720С, 30 сек. Результаты интерпретировали, исходя из результатов аллельной дискриминации и анализа отдельных графиков накопления флуоресценции с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028. Пример получаемых графиков представлен на рис. 2.
Анализ полиморфных вариантов генов XRCC1 (rs25489, rs25487, rs1799782), APEX1 (rs1130409), hOGGl (rs1052133), ADPRT (rs1136410), XPG (rs17655), XPD (rs13181), XPC (rs2228001), ATM (rs1801516), NBS1 (rs1805794), CYP1A1 (rs1048943) определяли методом аллель-специфической ПЦР с использованием наборов «SNP-экспресс» (НПФ «Литех», г. Москва). ПЦР проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) с использованием двух праймеров (табл.15), ключевой нуклеотид каждого из них комплементарен нуклеотиду замены. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли при помощи электрофореза в горизонтальном 3% агарозном геле. После чего гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Gel Doc (Bio-Rad, США).
Делеции в генах GSTM1 и GSTT1 анализировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием интеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I (ООО «СибДНК», г. Новосибирск). Праймеры для ПЦР (табл. 16) были выбраны внутри области GSTM1 и GSTT1 таким образом, что отсутствие синтеза соответствующего продукта ПЦР соответствовало делеции GSTM1 del или GSTT1 del. Для того, чтобы отличить наличие гомозиготной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 от отсутствия ДНК матрицы или ингибирования реакции ПЦР в амплификационную смесь вводили внутренний контроль, в качестве которого использовали фрагмент генома LTM (от «low temperature melting»). Последовательность праймеров представлена в табл.16.
5000 --
4000 --
© 3000
ш
О
2000 --
1000 --
0 --
a) TP53 GG
Амплификация
HEX
FAM
....................1.....
20 30
Циклы
б)ТР53 СС
40 so
Логарифмическая шкала
в) ТР53 GC
Рисунок 2. Графики накопления флуоресценции продуктов ПЦР локуса
TP53 (rs1042522)
Примечание. Гомозиготность по аллелю G определяли по накоплению флуоресценции красителем FAM (а), а гомозиготность по аллелю C красителем НЕХ (R6G). Оба флуоресцентных сигнала свидетельствовали о наличии у индивидуума гетерозиготного генотипа (в). По оси ординат относительные единицы флуоресценции (ОЕФ), по оси асбцисс -циклы.
Таблица 15 - Характеристика локусов и праймеров, использованных для их анализа
методом аллель-специфической ПЦР
Ген полиморфный локус / Ref SNP Аллели Праймеры (5'^ 3')
XPD (ERCC2) 2251 T>G rs13181 T, G F: 5'-tcaaacatcctgtccctact-3' R: 5'-ctgccgattaaaggctgtgga-3'
XPG (ERCC5) 3310 G> C rs17655 G, C F: 5' -ttacgtctttgcgacaaattcatt-3' R: 5'- cattaaagatgaactttcagcat-3'
XPC 2815 A>C rs2228001 A,C F: 5' - tcccatttgagaagctgtgag -3 ' R: 5'- ttcccatttgagcagctgtgagc - 3'
APEX1 444 T>G rs1130409 T, G F: 5'-attgaggtctccacacagcaca-3' R: 5' -aattctgtttcatttctataggcgag-3'
hOGG1 977 C>G rs1052133 C, G F: 5' -ggaaggtgcttggggaat-3' R: 5' -actgtcactagtctcaccag-3'
ADPRT 2285 T>C rs1136410 T ,C F: 5'-сtgctgcctatacagtcacttt-3' R: 5'-gtggccatcacattcgtcagat-3'
XRCC1 1196A>G rs25487 A, G G, A C, T F: 5 '-caagtacagccaggtcctag-3', R: 5'-ccttccctcactggagtac-3' F: 5' -tggggcctggattgctgggtctg-3' R: 5' -cagcaccactaccacaccctgaagg-3' F: 5' -gccccgtcccaggta-3', R: 5'-agccccaagacccttt-3'
839 G>A rs25489
589 C>T rs1799782
АТМ 5557 G>A rs1801516 G, A F: 5' taatatgtcaacggggcatg- 3' R: 5' - atttctccatgattcatttggat -3'
NBS1 535 G>G rs1805794 С, G F : 5'-gcagtgaccaaagaccgacttcta-3' R: 5'- tgaggttacctcagtgccatttact-3'
CYP1A1 2455 A>G rs1048943 A, G F: 5'-gaactgccacttgagctgtct-3' R: 5'-gaaagacctcccagcggtca-3'
САТ -262 C>Trs1001179 C,T F: 5'- agagcctcgccccgccggaccg-3' R: 5'- taagagctgagaaagcatagct-3'
Таблица 16 - Характеристика локусов, исследованных методом мультиплексной ПЦР
Ген Аллели Локализация в геноме Последовательность праймеров целевых генов Последовательность праймеров LTM *
GSTM1 GSTM1del / GSTM1 n 1p13.3 5' -ggtcaaggacatcatagacgaga-3' 5' -ctcaggagaaactgaagccaaa-3' 5' tgggtgctagaggtataatcg3' 5' ttagaggaagctgggtaagag3'
GSTT1 GSTT1del / GSTT1 n 22q11.2 5' -gctagttgctgaagtcctgctta-3' 5' -cttggccttcagaatgacct-3'
Примечание. * LTM (low temperature melting) - внутренний положительный контроль
Реакционная смесь содержала: 40-100нг ДНК; 65 mM Tris-HCl (pH8.9); 0.05% Tween 20; 16 mM (NH4)2SO4; 2.4 mMMgCl2;0.2mM dNTP; 0.3^M праймеров; 0.8 X SYBR Green I и
0.5 ед.ак. термостабильной Taq-полимеразы. Амплификация проводилась с использованием амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 96°С, далее 48 циклов при следующих условиях: денатурация 5сек. при 96°С, отжиг праймеров 5 сек. при 64°С, элонгация 5 сек. при 72°С, регистрация флуоресцентного сигнала 10 сек. при 75°С. Затем регистрировали кривые плавления в интервале 65-960С с повышением температуры на 0,5°С в каждом цикле (начальная температура составила 65°С для GSTM1+LTM и 70°С для GSTT1+LTM), регистрацию флуоресцентного сигнала производили в каждом цикле. Полученные результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивалась с помощью кривой плавления. Для LTM температура плавления составляла 78°С, для GSTM1 - 86,5 °С, а GSTT1 - 91 °С. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена (del). Гетерозиготы по мутации рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов (n). Примеры графиков производных кривых плавления продуктов ПЦР анализа GSTM1 и GSTT1 полиморфных локусов представлен на рис 3. и рис 4.
70 75 30 35 90 95
Температура, в градусах Цельсир
Рисунок 3. График производной кривой плавления продуктов ПЦР полиморфного локуса ОБТЫ!
Гик плавлении
90 --
30
70
60 --■
ш
О 40
30 --
20 --
10 --
0
Температура, в градуса* Цельсия
Рисунок 4. График производной кривой плавления продуктов ПЦР полиморфного локуса GSTТ1
Контроль качества генотипирования проводился повторным генотипированием 10% образцов.
Статистическая обработка данных проводился с использованием пакетов прикладных программ: «MedCalc Statistical Software version 14.8.1 (MedCalc Software, Belgium), SNPstats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats), «Statistica 8.0» (StatSoft, Inc., USA), MDR (http://www.multifactordimensionalityreduction.org). Для анализа количественных цитогенетических показателей рассчитывались: медианы, размахи, нижняя /верхняя квартиль, средние величины, стандартные отклонения, стандартные ошибки, ассиметрии, эксцессы. С использованием критерия Колмогорова-Смирнова проводили проверку соответствия распределения количественных показателей закону нормального распределения. Было установлено статистически значимое отклонение распределений от нормального всех изучаемых цитогенетических параметров (p<0,05). Сравнение групп проводилось с помощью непараметрических критериев: Kruskal-Wallis test (для сравнения нескольких групп), Mann-Whitney U Test (для парных сравнений).
2.4. Статистическая обработка результатов исследования
Определение частот генотипов (Р;) и аллелей (р;), проводили по стандартной формуле (Животовский, 1991): P,=N/N, где N - число /-тых генотипов (аллелей), N - объем выборки. При сравнении частот генотипов и аллелей в группах использовался критерий Х2 с поправкой Йетса. Оценку частоты редкого аллеля, соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (х2) статистическую значимость различий между группами по частотам аллелей и генотипов для теста х2 на гомогенность выборок и значение P-value для теста проводили с помощью доступного онлайн-ресурса: http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl; статистически значимыми считали различия при р< 0.05.
Частоты гаплотипов, величину неравновесия между парами локусов оценивали с
2 (
помощью коэффициента D' (Левонтина) и коэффициента корреляции г ^Пирсона), анализ ассоциации гаплотипов сцепленных локусов в аддитивной модели проводили программе SNPStats.
Логистическую регрессию использовали для выявления ассоциации полиморфных локусов и гаплотипов сцепленных локусов в различных моделях
/ и и \J XJ \
(аддитивной, доминантной, сверхдоминантой, рецессивной, лог-аддитивной) с учетом количественных и бинарных признаков (пол, возраст, этническая принадлежность, статус и индекс курения, стаж работы), вводимых в уравнение регрессии в качестве независимых переменных. На основе коэффициента t-статистики (t= beta/SE, где beta -стандартизированные эквиваленты коэффициентов регрессии для независимой переменной, SE - стандартная ошибка оценки) и уровня значимости (P-value) для коэффициента проводили проверку гипотез о значимости отдельных факторов. Экспоненту отдельного коэффициента регрессии (beta) рассматривали как отношение шансов (OR) для логистической модели с расчетом 95%-ного доверительного интервала. Гипотезу о существенности построенной модели с учетом всех переменных проверяли на основании теста отношения правдоподобия и его значимости Padj. Для выбора лучшей модели использовали информационный критерий Акайке (AIC):
где к — число параметров в статистической модели, и Ь - максимизированное значение функции правдоподобия модели.
Л1С = 2k
При этом выбрали модели с наименьшим значением AIC из всех статистически значимых (P adj< 0.05).
Регрессионный анализ проводился также для оценки взаимодействия полиморфного локуса и фактора среды (статуса и индекса курения, стажа работы) с использованием пакета SNPStats. Для минимизации статистической ошибки первого типа применяли поправку на множественность сравнений FDR (False discovery rate) (Benjamini, Hochberg, 1995), используя онлайн-калькулятор http://www.sdmproject.com/ utilities/?show=FDR, с получением нового значения Pcor.
При помощи ROC-анализа (Zweig, Campbell, 1993) были рассчитаны пороговые значения уровня повреждений ДНК, что позволило условно разделить исследуемую группу на выборки с низкой и высокой частотой генетических повреждений. При проведении ROC-анализа значения частоты аберраций хромосом были разбиты на интервалы от минимального до максимального и подсчитана доля человек в каждом из интервалов как в группе контроля, так и в опытной группе. Для каждого из интервалов были определены чувствительность (SE) и специфичность метода (SP) по следующим формулам:
SE = а/(а + с); SP = d/(b + d),
где a - доля носителей маркера в опытной группе, с - доля лиц, свободных от маркера в опытной группе; d - доля лиц, свободных от маркера в контрольной группе, b - доля носителей маркера в контрольной группе.
На следующем этапе анализа строился график ROC-кривой, который отражал взаимозависимость частоты истинно-положительных (чувствительность), ложно-положительных (специфичность) результатов. Для более точного определения порогового значения уровня хромосомных аберраций в каждом из интервалов был рассчитан показатель L, определяющий наименьшее расстояние от ROC-кривой до точки на оси ординат, соответствующей максимальной чувствительности, по следующей формуле:
L=V(1-SP)2+(1-SE)2
Минимальное значение показателя L соответствует интервалу с наибольшей чувствительностью и специфичностью, верхняя граница которого является пороговым значением уровня хромосомных аберраций.
Для оценки прогностического качества уровня хромосомных аберраций как маркера негативного воздействия генотоксических факторов окружающей среды на организм человека - рассчитывали его разрешающую способность AUC (Area Under Curve), которая определяется по площади под характеристической кривой:
AUC= (SP+SE)/2;
При AUC=0,90-1,0 качество модели признается отличным, при 0,80-0,89 - очень хорошим, при 0,70-0,79 - хорошим, 0,60-0,69 - средним, 0,50-0,59 -неудовлетворительным.
Для построения прогностической модели оценки риска формирования высокого уровня ХА на фоне действия различных факторов среды была использована общая многомерная линейная модель дискриминантного анализа, реализованная в GDA-модуле Statistica 10.0 (Manugistic Inc., США). В данной модели зависимая категориальная переменная представляется векторами с кодами, обозначающими группы для каждого наблюдения. При выполнении анализа использовалось пошаговое включение предикторов и выбор их наилучшего подмножества (на основе многомерной статистики лямбда Уилкса). В результате проведения анализа были определены дискриминантные модели, позволяющие классифицировать объект наиболее оптимальным образом, рассчитаны стандартизованные коэффициенты дискриминантных функций и коэффициенты функций классификации.
Для исследования межгенных взаимодействий использовали метод Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) (Moore et al., 2006; http://www.multifactordimensionalityreduction.org), который позволяет оценивать все возможные двухлокусные (2n), а также 3n, ^-локусные модели комбинаций SNP. Важным преимуществом метода MDR является возможность статистической оценки воспроизводимости тестируемых моделей, а также расчет точности предсказания модели путем отделения части данных в качестве независимого тестируемого набора. Таким образом, из всех предложенных вариантов моделей выбирается статистически
значимая модель, с наибольшей сбалансированной точностью, и, соответственно, с наименьшей ошибкой предсказания, которая в наибольшем числе перекрестных проверок была признана лучшей (Lou et al., 2007). На основании полученных моделей был проведен кластерный анализ взаимодействия генов, построены дендрограммы результатов моделирования межгенных взаимодействий. Статистические параметры моделей включали:
• точность классификации (accuracy) - число примеров, верно отнесённых к «случаю» или «контролю» деленное на число всех случаев;
• сбалансированная точность модели (Balanced Accuracy, Bal.Acc.) Bal. Acc.= Sp+Se/2 (Sp специфичность, Se-чувствительность);
• ошибка предсказания (Prediction Error) модели Prediction Error = 100 -Testing Balanced Accuracy;
• чувствительность модели (Sensitivity, Se);
• специфичность модели (Specificity, Sp);
• точность модели (precision) - число верно определённых примеров TP/(TP+FP);
• Отношение шансов (odds ratio) (TP*TN)/(FP*FN), где
где TP (True Positives) - верно классифицированные как «случай», TN - число примеров, правильно отнесённых к «контролю» (True negative), FP (False positive) примеры, неправильно классифицированные как «случай»; FN - примеры, неправильно отнесённые к «контролю» (False negative).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Хромосомные нарушения у населения угольного региона
3.1.1. Характеристика основных цитогенетических показателей у жителей Кемеровской области в целом по базе данных
Цитогенетический мониторинг, проводившийся в данном исследовании у жителей Кемеровской области в период 2001-2015 гг. позволил получить новые характеристики частот хромосомных аберраций, отражающие ситуацию в регионе. Распределение основного цитогенетического показателя «частота метафаз с хромосомными аберрациями» представлено на рис.5.
800 700
3 600
X X
го
§ 500
4 а)
й 400 о
0
Ь 300 а> т
1 200 100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Частота метафаз с хромосомными аберрациями, %
Рисунок 5. Распределение значений частоты аберрантных метафаз в общей выборке жителей Кемеровской области
Данное распределение значений статистически значимо отличалось от нормального (тесты: Колмогорова Смирнова д=0,1725; И<0,05; Лилиефорса р<0,01). У 91% от общего числа обследованных индивидов и у 90% жителей угольного региона, не работающих на промышленных предприятиях, были зарегистрированы клетки с аберрациями хромосом. Чаще всего встречалось 1-3% клеток с повреждениями хромосом (у 47% обследованных с аберрациями). У 53% обследованного населения частота ХА превышала региональный фоновый уровень (2,87%). Частоты основных типов ХА
(рассчитывались как отношение числа аберраций определенного типа к числу проанализированных метафаз) представлены в таблице 17.
Таблица 17 - Статистические характеристики параметров хромосомных нарушений у жителей Кемеровской области в целом по базе данных (N=1978)
Показатель Mean ± St.err Ме Мо Нижняя /верхняя квартиль MinMax Асси-метрия Эксцесс
Аберрантные метафазы (%) 3,20 ± 0,05 3,00 3,00 1,00/4,50 0-13,50 0,94 0,87
Число аберраций на 100 клеток 3,27 ± 0,05 3,00 3,00 1,00/4,90 0-14,00 0,99 1,11
Хроматидные фрагменты(%) 2,41 ± 0,05 2,00 1,00 1,00/3,50 0-13,00 1,18 1,79
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.