Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Хахалина, Анастасия Александровна

• Хахалина, Анастасия Александровна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Хахалина, Анастасия Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фторхинолоны. Молекулярно-генетические механизмы развития устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам

1.2. Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам фторхиноло-ного ряда

1.2.1. Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на плотных сре-

а дах

1.2.2. Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах

1.3. Молекулярно-генетические методы и современные технологии определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам

1.3.1. Молекулярно-генетические методы с электрофоретиче-ской детекцией мутаций, обуславливающих развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis

1.3.2. Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА SSCP И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОММЕРЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ® МУТАЦИЙ В ГЕНАХ gyrA и gyrB MYCOBA CTER1VM TUBERCULOSIS

2.1. Модификация метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis, ответственных за устойчивость к фторхинолонам

2.2. Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRs/» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ-МИШЕНЯХ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФТОРХИНОЛОНАМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

3.1. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах М. tuberculosis

3.2. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости М. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксаци-

3.3. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и с хроническим течением

процесса

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением числа больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МБТ-МЛУ) или широкой лекарственной устойчивостью (МБТ-ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц [74].

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это одновременная устойчивость МБТ к препаратам первого ряда (изониазиду (INH) и ри-фампицину (RIF)). Широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) называют одновременную устойчивость МБТ к основным препаратам первого ряда -INH и RIF и к препаратам второго (резервного) ряда - фторхинолонам и к одному из аминогликозидов и/или капреомицину.

В настоящее время в мире насчитывается около 600 тыс. больных туберкулезом с МЛУ. По данным ВОЗ, доля таких больных возросла с 11% в 2008 г. до 23% в 2012 г. В Российской Федерации (РФ) этот показатель увеличился с 18% до 44% в 2010 г., а доля больных туберкулезом с ШЛУ среди больных с МЛУ возросла с 4% до 19%. В 2012 г. показатель МЛУ среди впервые выявленных больных и больных с хроническим течением туберкулеза составил 3,6% и 20,2% соответственно [63, 79, 87, 115, 116, 117, 118]. Эпидемическая обстановка в Москве также остаётся непростой. Процент больных туберкулёзом с МЛУ среди впервые выявленных в 2009-2011 г. колебался от 12,6% до 14%, в 2012 г. составил 12,8%, а среди контингентов ПТД увеличился с 23,0% в 2008 г. до 30,0 % в 2012 г. [10, 11, 12, 19].

Фторхинолоны являются одними из основных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с МЛУ [35, 40, 120, 121]. Наиболее эффективными из них являются препараты четвёртого поколения, такие как моксифлоксацин (МОХ) и гатифлоксацин (GTX), которые показали высокую активность и низкие значения МИК в отношении не только МБТ-

МЛУ, но и МБТ-МЛУ, устойчивых к офлоксацину (OFX) и ципрофлоксаци-ну (CIP) [125].

Микробиологическое определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ к фторхинолонам с использованием плотной среды Левенштейна-

и о

Иенсена (Л-И) занимает в среднем два месяца. Кроме того, до сих пор не установлены критические концентрации (КК), позволяющие определять устойчивость МБТ к таким новым препаратам, как GTX и спарфлоксацин (SPFX).

Использование жидких питательных сред в автоматизированных системах типа Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson, США) позволяет сократить время получения культуры МБТ до 7-14 дней. Однако в настоящее время зарегистрированных (сертифицированных) культуральных тестов для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам в автоматизированных системах Bactec 960 нет, есть только рекомендованные КК к данным препаратам [9, 53, 62, 93].

В этом отношении молекулярно-генетические методы позволяют не только выявить ДНК МБТ непосредственно в диагностическом материале и охарактеризовать мутации в генах-мишенях, связанных с развитием устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП), но и сократить сроки получения результата до двух суток.

Мишенью действия фторхинолонов в МБТ является бактериальная АТФ-зависимая ДНК-топоизомераза II типа (ДНК-гираза), которая катализирует образование суперспирали ДНК и состоит из двух субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и gyrB соответственно [52, 67, 97, 104, 105].

Регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам (РОУФ) генов gyrA (320 п.н.) и gyrB (375 п.н.), является консервативной областью, где возникают нуклеотидные замены (мутации), связанные с устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Известно, что в 45-85% устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в гене gyrA и около 7% в гене gyrB [101, 111, 122].

В настоящее время описаны следующие нуклеотидные замены в РОУФ гена gyrA: Ala74Ser, Ala90Val, Ser91Pro, Asp94Gly, Asp94Ala, Asp94Tyr, Asp94Asn, Asp94His, Gly88Cys и гена gyrB: Arg485His, Ser486Phe, Asn538Thr, Asn538Asp, Thr539Pro, Asp500Ala, Asp500His, Asp500Asn, Gly509Ala, Glu540Val, Glu540Asp [25, 50, 65, 84, 97]. Замены в гене gyrB встречаются как самостоятельно, так и в сочетании с геном gyrA [54]. Поэтому одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB может дать дополнительную информацию о JI4 к фторхинолонам исследуемого штамма, а также повысить корреляцию молекулярно-генетических данных с микробиологическими результатами J14 МБТ к данным препаратам.

Определение мутаций в исследуемом участке гена может осуществляться различными молекулярно-генетическими методами, первым этапом которых является амплификация (накопление генетического материала) с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР). На этапе детекции применяют различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК, ведущими из которых являются конформационный полиморфизм длин одноцепочечных фрагментов (single-stranded conformation polymorphism - SSCP), определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), аллель-специфическая ПЦР, гетеродуплексный анализ, гибридизация на различных видах носителей, а также секвенирование как «золотой стандарт», с помощью которого можно определять тип мутаций.

Для анализа мутаций гена gyrA были использованы две коммерческие тест-системы, сертифицированные в РФ, для определения J14 МБТ к препаратам второго (резервного) ряда.

Тест-система GenoType MTBDRvZ («Hain Lifescience», Германия) основана на гибридизации ампликонов, полученных после проведения ПЦР, со специфическими ДНК-зондами, иммобилизованными на нейлоновом носителе (стрипе). Тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия) - это технология гибридизационного анализа на биочипах, разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН и апробиро-

ванная в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патомор-фологии Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом.

Для анализа мутаций в гене gyrB ДНК МБТ нами разработана модификация метода SSCP («M-SSCP»), которая позволяет выявлять нуклеотидные замены, ответственные за устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда, непосредственно в диагностическом материале (мокрота) (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»),

Таким образом, применение тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» позволит выявить и охарактеризовать наибольшее количество мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с лекарственной устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Степень разработанности темы исследования

Большой вклад в изучение развития ЛУ МБТ к фторхинолонам внесли зарубежные ученые. В работах Takiff Н.Е, Ginsburg А, Shi R. было показано, что устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в генах gyrA и gyrB [52, 97, 105]. В настоящее время охарактеризовано их значительное количество. В 85% штаммах, устойчивых к фторхинолонам, мутации сосредоточены в РОУФ гена gyrA (320 п.н.), содержащего полиморфные ко-доны 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм Ser95Thr, не влияющий на ЛЧ МБТ к фторхинолонам [122]. Мутации в 90, 91 и 94 кодонах связаны с ЛУ ко всем препаратам группы фторхинолонов [25]. Также описаны мутации вне РОУФ gyrA, вызывающие ЛУ к фторхинолонам [44]. В последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о влиянии мутаций в РОУФ гена gyrB (375 п.н.) на чувствительность МБТ к препаратам фторхинолонового ряда [42, 81]. Замены в гене gyrB могут встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с мутациями в гене gyrA и составляют около 7% среди всех устойчивых МБТ к фторхинолонам [54,111].

В России среди ученых, которые занимаются изучением этой проблемы в области диагностики и эпидемиологии лекарственно-устойчивых форм возбудителя, известны имена: Черноусова JI.H., Грядунов Д.А., Антонова О.В., Мокроусов И.В. и другие. Однако работы данных авторов в основном посвящены выявлению мутаций в гене gyrA. В то же время остается мало изученным вопрос о роли мутаций в гене gyrB МБТ или в сочетании с заменами в gyrA в развитии устойчивости ко всем фторхинолонам или к отдельным из них, а также их связь с уровнем устойчивости.

Цель исследования

Выявить мутации в генах gyrA и gyrB и определить их спектр с помощью биологических микрочипов и модификации метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для быстрого и точного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») и оценить эффективность его применения для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis из диагностического материала (мокроты).

2. Провести сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам в гене gyrA с помощью коммерческих тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRs/» в диагностическом материале (мокроте).

3. Провести анализ мутаций в генах gyrA и gyrB М. tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах, выделенных из диагностического материала больных туберкулёзом легких.

4. Определить связь мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину с использова-

нием модифицированных жидких сред Middlebrook 7Н9 в автоматизированной системе Bactec 960.

5. Изучить спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у впервые выявленных больных туберкулезом легких и с хроническим течением процесса.

Научная новизна

Впервые с помощью метода «M-SSCP», разработанного в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, определен вклад мутаций в гене gyrB в развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»).

Впервые разработанный молекулярно-генетический метод «M-SSCP» в сочетании с коммерческой тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволил расширить анализируемый спектр мутаций в генах, ответственных за лекарственную устойчивость М. tuberculosis к фторхинолонам.

Установлена связь между типом мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis и уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину.

На большом количестве биологического материала показано процентное распределение мутаций в двух генах М. tuberculosis, выделенных у впервые выявленных больных и с хроническим течением процесса, что имеет большое эпидемиологическое значение.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены новые данные, демонстрирующие, что одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB позволяет расширить анализируемый спектр мутаций и дать более полную информацию о лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам исследуемого штамма.

Установлено, что коммерческая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет с высокой чувствительностью одновременно выявлять ДНК М. tuberculosis и определять как часто, так и редко встречающиеся мутации в гене gyrA. Применение ее для исследования диагностического материала

позволит сократить время получения результата и тем самым своевременно скорректировать режим химиотерапии. Разработанный метод «M-SSCP» можно применять как скрининг-тест для быстрого выявления мутаций в гене gyrB М. tuberculosis.

Разработанные методические рекомендации «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов», утвержденные Департаментом Здравоохранения города Москвы от 29.09.2008 года, применяются в клинической практике противотуберкулезных учреждений.

Полученные данные анализа мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью метода «M-SSCP» и секвенирования были использованы в разработке тест-системы «ТБ-ТЕСТ», основанной на технологии гидрогелевых биочипов в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Работа поддержана государственным контрактом с Министерством образования и науки РФ № 16.522.11.2003 и программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»). В настоящее время данная тест-система проходит клинические испытания.

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis к препаратам резервного ряда (фторхинолонам). Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлся респираторный материал (мокрота) и культуры М. tuberculosis, полученные от больных туберкулезом легких.

Исследование проводилось в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.

Пациенты и клинические образцы

Исследовано 390 проб ДНК МБТ, выделенных из 316 культур и 74 образцов мокроты, полученных от 154 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 162 больных с хроническим течением процесса. Все больные находились на лечении в филиалах и клиниках ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ. Образцы были отобраны путем случайного выбора по результатам микробиологического определения ЛЧ МБТ к ШН и Я1Б с МЛУ, монорезистентные, а также чувствительные к препаратам первого ряда, так как по данным литературы, среди них встречаются штаммы МБТ, уже устойчивые к фторхинолонам [43].

Данные микробиологического определения ЛЧ МБТ, из которых были выделены 390 образцов ДНК, анализируемые в работе, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Данные микробиологического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и офлоксацину

Лекарственная чувствительность М. tuberculosis Число образцов ДНК М. tuberculosis

выделены из культур выделены из мокроты

INHy, RIFy, OFX4 99 31

INH4, RIF4, OFX4 59 -

INHy, RIF4, OFX4 19 -

INH4, RIF y, OFX4 8 -

INHy, RIFy,OFXy 128 43

INH4,RIFy, OFXy 2 -

INH4, RIF4, OFXy 1 -

INHy, RIF4, OFXy - -

Итого: 316 74

Всего: 390

Примечание: INH4 - изониазид-чувствительные, RIF4 - рифампицин-чувствительные, OFX4 - офлоксацин-чувствительные, INHy - изониазид-устойчивые, RIFy - рифампицин-устойчивые, OFXy - офлоксацин-устойчивые.

По данным микробиологического определения ЛЧ МБТ, представленным в таблице 1, видно, что из 316 культур МБТ, из которых были выделены образцы ДНК, 185 были чувствительными и 131 устойчивыми к ОБХ. Среди

устойчивых культур МБТ к OFX 128 были также устойчивыми к INH и RIF (МБТ-МЛУ), две - устойчивые к RIF и одна - чувствительная к обоим препаратам. Из 185 чувствительных к OFX штаммов МБТ 59 были чувствительными к INH и RIF, 99 устойчивыми к обоим препаратам, 8 - устойчивыми к RIF и 19 - устойчивыми к INH. Результаты выявления ДНК МБТ из 74 образцов мокроты были подтверждены ростом МБТ в Bactec 960. По данным микробиологического определения ЛЧ, все 74 культуры МБТ были устойчивыми к INH и RIF (МБТ-МЛУ), из которых 31 были чувствительными и 43 устойчивыми к OFX.

Специфичность метода «M-SSCP» оценивали, используя музейные штаммы нетуберкулезных микобактерий (M.avium АТСС35712, М intracellulare АТСС35761, М. scrofulaceum АТСС35787), грамотрицательных (Е. coli АТСС25922, Р. aeruginosa АТСС27853) и грамположительных (S.aureus АТСС25923) микроорганизмов, а также культуры, выделенные из диагностического материала больных (К. pneumoniae, S. pneumoniae, S. intermedins, S. agalactiae).

Сбор материала

Сбор материала проводили согласно методическим рекомендациям «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов» разработанным в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ в 2008 г. [14].

Процедура получения анализируемого материала, ограничения по его использованию и условия возможного хранения полученных образцов были следующими:

- мокроту собирали в стерильную пробирку в объеме 5-6 мл.

- культуры МБТ получали из централизованной бактериологической лаборатории (ЦБЛ) МНПЦБТ в пробирках с плотной средой Л-Й и в фирменных пробирках MGIT 960 с жидкой средой М7Н9.

Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis

Определение JI4 МБТ бактериологическими методами осуществляли согласно приказу №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» в ЦБЛ МНПЦБТ. При исследовании ЛЧ МБТ к фторхинолонам методом абсолютных концентраций на среде Л-Й использовали концентрации OFX 2 и 10 мкг/мл.

Определение ЛЧ МБТ к фторхинолонам (выявление мутаций в генах gyrA и gyrB) проводили с использованием двух коммерческих тест-систем, метода «M-SSCP» и секвенирования. Мутации в гене gyrA определяли с помощью тест-систем ТБ-БИОЧИП-2 и Geno Type MTBDRs7, а в гене gyrB с помощью метода «M-SSCP».

Подготовка проб

Пробоподготовку (деконтаминацию и разжижение мокроты), экстрагирование ДНК М. tuberculosis из диагностического материала (мокроты) и культур МБТ, выделенных с плотной Л-И и жидкой М7Н9 среды, проводили согласно руководству «Руководство по применению набора реагентов для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и определения их лекарственной чувствительности к фторхинолонам на биологических микрочипах «ТБ-БИОЧИП-2» (Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФРС 2010/08555, 03.10.2010).

Проведение полимеразной цепной реакции и гибридизации Проведение ПЦР и гибридизации на биологических микрочипах для выявления мутаций в гене gyrA проводили согласно прилагаемому руководству, указанному выше, с использованием набора реагентов к тест-системе «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП - ИМБ», Россия).

Проведение ПЦР и гибридизации на стрипах для выявления мутаций в гене gyrA проводили согласно прилагаемому протоколу GenoType MTBDRs/ (GenoType, Hain Lifescience, Германия) [51].

Секвенирование

ДНК секвенирование полученных ампликонов РОУФ генов gyrA и gyrB проводили с использованием праймеров gyrA F (5' СТА TGC ААТ GTT CGA TTC CGG СТТ С 3') и gyrA R (5' ACT GTC ТСС TCG TCG ATT ТСС CT 3'), gyrB F (5' AGA GTT GGT GCG GCG TAA GA 3') и gyrB R (5' AAC АСА TGC CCG TTC TCG AT 3') на автоматическом секвенаторе GS Junior («Roche», Германия).

Регистрация результатов гибридизации

Результаты гибридизации на биологических микрочипах регистрировали с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа изображений биологических микрочипов «Чипдетектор-01». Инсталляцию и эксплуатацию комплекса осуществляли в соответствии с инструкцией по его использованию.

Интерпретацию результатов осуществляли с помощью программы «Imageware» (БИОЧИП-ИМБ, Россия). Результаты гибридизации на стрипах регистрировали визуально с помощью эталона оценки, который поставляется в наборе GenoType MTBDRs/ (Hain Lifescience, Германия).

Определение лекарственной устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам путем выявления мутаций в гене gyrB методом конфор-мационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов (SSCP)

Предлагаемая нами модификация метода SSCP состоит в следующем: для гена gyrB были подобраны пары праймеров и программа амплификации. Также был подобран состав амплификационной реакционной смеси, где важными составляющими являются тип буфера, концентрация трифосфатов, ионов магния, праймеров, ДНК полимеразы и условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида с глицерином и состав буфера), условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура), позволяющие повысить

эффективность разделения одноцепочечных фрагментов исследуемых амли-конов.

Условия проведения полимеразой цепной реакции

Двухстадийную ПЦР участка гена ^гВ размером 414 п.н. проводили в два последовательных этапа с «внешними» и «внутренними» парами прайме-ров по одной программе амплификации. Размер ампликонов после второй стадии ПЦР составил 371 п.н.

Приготовление реакционной смеси для ПЦР-1 с «внешними» прайме-

рами

Объём реакционной смеси для проведения амплификации одной пробы составил 27 мкл для ДНК, выделенной из респираторного материала (ДНК-1) и 29 мкл для ДНК, выделенной из культур МБТ (ДНК-2). Реакционную смесь готовили с учетом числа пробирок с диагностическими пробами (X) и двух дополнительных пробирок, необходимых для постановки положительного (раствор очищенной ДНК МБТ Н37Яу) и отрицательного контроля (без внесения матрицы). Общее число пробирок (]ЧГ), необходимое для подготовки нужного объема реакционной смеси, должно составлять К=Х+2.

В пробирку объёмом 0,5 мл вносили отдельно для каждого компонента пипеткой следующие реагенты набора в указанной ниже последовательности и количестве:

Вода, дистиллированная (для ПЦР)

ПЦР - буфер (х10): 67 мМ трис-НС1 рН 8,6; 2,5 мМ МёС12; 16,6 мМ (МН4)2804;

сШТР по 200 мкМ Праймеры по 5 мкМ

ДНК-полимераза (ВЮТА<3 ДНК-полимераза) 1,511 иБв (Урацил-ДНК-гликозилаза) 0,15и Общий объем (27 х п) (ДНК-1) или (29 х п) мкл (ДНК-2) ПЦР проводили со следующими «внешними» олигонуклеотидными праймерами:

1-ый - 5' AGA GTT GGT GCG GCG TA A GA 3'

2-ой - 5' AAC АСА TGC CCG TTC TCG AT 3'

Полученную реакционную смесь тщательно перемешивали и разносили пипеткой микродозатора по пробиркам, подготовленным для постановки ПЦР, из расчета 27,0 мкл (ДНК-1) или 29,0 мкл (ДНК-2) на пробирку. В каждую пробирку вносили 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации. Последовательность пробирок маркировали.

В контрольные пробирки с реакционной смесью вносили по 3 мкл или 1 мкл «К+» (ДНК H37R.V) и «К-» (дистиллированная вода). В остальные пробирки вносили по 3 мкл (ДНК-1) или 1 мкл (ДНК-2) матрицы. Капли в пробирках собирали центрифугированием в течение 10 с при 1000 об/мин.

Пробирки помещали в амплификатор и проводили амплификацию по следующей программе:

№ шага программы Температура, С° Время выдержки Количество циклов

1 95°(предварительная денатурация ДНК) 4 мин 1

95° (денатурация ДНК) 30 сек

2 59° (отжиг праймеров) 40 сек 25

72° (удаление праймеров) 40 сек

3 72° (завершающая инкубация) 4 мин 1

Приготовление реакционной смеси для ПЦР-2 с «внутренними прайме-рами»

Реакционную смесь, полученную после первой реакции амплификации, использовали в качестве матрицы во второй реакции амплификации с «внутренними» прайм ерами:

1-ый - 5' ТАА GAG CGC С AC CGA CAT CG 3'

2-ой - 5' GCG TGA ACC GGA АСА АСА AC 3'

Реагенты вносили в стерильную пробирку в той же последовательности, без внесения урацил-ДНК-гликозилазы: Вода, дистиллированная (для ПЦР)

ПЦР - буфер (х10): 67 мМ трис-НС1 рН 8,6; 2,5 мМ 16,6 мМ

(ЮадЗС^;

сШТР по 200 мкМ

Праймеры по 5 мкМ

ДНК-полимераза (ВЮТАС) ДНК-полимераза) 1,511

Общий объем (27 х п) мкл (ДНК-1) или (29 х п) мкл (ДНК-2)

Полученную реакционную смесь тщательно перемешивали и разносили пипеткой микродозатора по пробиркам, подготовленным для постановки ПЦР, из расчета 27,0 мкл (ДНК-1) или 29,0 мкл (ДНК-2) на пробирку. В каждую пробирку вносили 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации. Последовательность пробирок маркировали.

Из каждой пробирки после ПЦР-1 по 3 мкл или по 1 мкл амплифика-ционной смеси вносили под масло в пробирки с приготовленной реакционной смесью для ПЦР-2.

Пробирки помещали в амплификатор и проводили амплификацию по программе, указанной для ПЦР-1.

Регистрация и анализ продуктов амплификации

По окончании второй стадии ПЦР проводили горизонтальный электрофорез в 2 % агарозном геле, с этидиум бромидом, при 10В/см в течение 10 минут, в 1-кратном ТВЕ буфере (0,089мМ трис-бората; 0,089М борной кислоты; 2мМ ЕБТА, рН 8,0). По окончании электрофореза гель просматривали в свете ультрафиолетовой лампы трансиллюминатора. При наличии в биологической пробе ДНК МБТ в соответствующих дорожках наблюдались светящиеся полоски, состоящие из выделенных фрагментов ДНК возбудителя, размером 371 п.н. и находящиеся на одном уровне с полоской в дорожке положительного контроля. При этом в дорожке отрицательного контроля светящиеся полоски наблюдаться не должны.

Выявление мутаций в гене gyrB

Проведение тепловой денатурации ПЦР-продукта

Денатурацию проводили при 95°С в течение 10 мин., для этого смешивали 4 мкл образца и 6 мкл денатурирующего раствора (95% формамид, 20мМ EDTA (Boehringer Mannheim, Германия), 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксиленцианол). По окончании денатурации пробирки немедленно помещались на лед.

Проведение вертикального высокоразрешающего электрофореза

Разделение денатурированных ампликонов проводили в 8% полиакри-ламидном геле с 5% глицерином при температуре 8°С, под напряжением 400 В, в течение 5 часов, в 2хТВЕ буфере (pH 8,0). В качестве контроля использовали ампликоны ДНК МБТ H37Rv, чувствительного ко всем ПТП.

Окраска геля

Окраску геля проводили с помощью азотнокислого серебра. Для этого гель переносили в стеклянную посуду с 100 мл 10% этанола для фиксации (40 мл 96% этилового спирта и 344 мл дистиллированная вода) на 5 мин. Затем спирт сливали, гель заливали 1% азотной кислотой на 3 мин, после чего кислоту сливали и дважды споласкивали гель дистиллированной водой в те-

о

чение 3 сек. Далее проводили окрашивание геля в холодном (8 С) растворе 0,012М нитрата серебра (Boehringer Mannheim, Германия) 20 мин, постоянно помешивая на шейкере (Elmi, Латвия), затем дважды промывали дистиллированной водой. Проявляли гель в растворе 0,28М карбоната натрия (Хели-кон, Россия) и 0,019% формалина до появления окрашенных полос денатурированной ДНК. Останавливали проявление 10% уксусной кислотой.

Интерпретация результатов

После окраски гель оценивали при белом свете (визуально) без специального оборудования. Интерпретацию результатов осуществляли путем визуального сравнения расстояния между цепочками ДНК в контроле и исследуемых образцах. Для подтверждения полученных данных использовали се-квенирование. Результаты регистрировали в журнале.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хахалина, Анастасия Александровна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонова, О.В. Биочипы на основе гидрогеля для анализа генома Mycobacterium tuberculosis: методы и применение в клинической практике / О.В. Антонова, ДА. Грядунов, С.А. Лапа, A.B. Кузьмин, А.Ю. Краснова, Л.Н. Черноусова, О.И. Скотникова, A.M. Мороз, A.C. Заседателев // В сб.: молекулярная диагностика. - 2007. - Т. 3. - С. 5-10.

2. Владимирский, М.А. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза / М.А. Владимирский, Ю.С. Аляпкина, Д.А. Варламов, Я.И. Алексеев, Л.К. Шипина, М.В. Шульгина, Л.В. Домотен-ко, K.P. Быкадорова, H.H. Гащенко, Л.Б. Ендоурова, О.В. Иванова, Е.А. Ильина, O.A. Левкова, Т.В. Маркова, ВЛ. Наземцева, Е.П. Павлова, А.И. Полозов, Н.В. Шишкина // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2008. -№4. - С. 38-44.

3. Голышевская, В.И. Сравнительный анализ микробиологических методов определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза / В.И. Голышевская, Э.В. Севастьянова, Л.П. Мартынова, М.В. Шульгина, В.А. Пузанов // Научные труды (к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы): Медицина и жизнь. - 2001. - С. 226-227.

4. Горбунова, В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотера-пию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, B.C. Баранов. - СПб.: Спец. литература, 1997. - 286 с.

5. Дорожкова, И.Р. Состав и лекарственная чувствительность микобак-териальной популяции у больных с подозрением на туберкулез / И.Р. Дорожкова, М.В. Бадлеева, О.И. Скотникова, Е.Ю. Носова, Е.А. Купавцева, С.Е. Борисов, A.M. Мороз // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2005. -№8. - С. 36-38.

6. Дорожкова, И.Р. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг / И.Р. Дорожкова, С.А. Попов,

И.М. Медведева // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2000. - №5. -С. 15-18.

7. Зоркальцева, Е.Ю. Гатифлоксацин (зарквин) в лечении инфекционной патологии / Е.Ю. Зоркальцева // Туберкулез и болезни легких. - 2010 г. -№5. - С. 64-68.

8. Иртуганова, О.А. Культуральное определение чувствительности ми-кобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам / О.А. Иртуганова, Н.С. Смирнова // В сб.: Лабораторная диагностика туберкулеза. - 2001. -С. 39-50.

9. Исаева, Ю.Д. Определение критических концентраций левофлокса-цина для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis в жидкой Middlebrook 7Н9 (ВАСТЕС™ MGIT™ 960) и плотной Левенштей-на-Йенсена питательных сред / Ю.Д. Исаева, А.А. Букатина, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова // Туберкулез и болезни легких. - 2012. - С. 36-42.

10. Литвинов, В.И. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в городе Москве, и организация противотуберкулезной помощи населению (2008 г.) / В.И. Литвинов, П.П. Сельцовский, Л.Н. Рыбка, Е.Я. Кочеткова, Е.С. Овсян-кина, А.В. Горбунов. - М.: МНПЦБТ, 2009. - 149 с.

11. Литвинов, В.И. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в городе Москве и организация противотуберкулезной помощи населению (2010 г.) /

B.И. Литвинов, П.П. Сельцовский, Л.Н. Рыбка, Е.Я. Кочеткова, Е.С. Овсян-кина, А.В. Горбунов. - М.: МНПЦБТ, 2011. - 275 с.

12. Литвинов, В.И. Туберкулёз в городе Москве (2011 г.). Аналитический обзор / В.И. Литвинов, П.П. Сельцовский, Л.Н. Рыбка, Е.Я. Кочеткова, Е.С. Овсянкина, А.В. Горбунов. - М.: МНПЦБТ, 2012. - 249 с.

13. Майерс, Р. Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез / Р. Майерс, В. Шеффилд, Д. Кокс // В кн.: Анализ генома. Методы. - 1990. -

C. 123-175.

14. Мороз, А. М. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов. Методические рекомендации / A.M. Мороз, Е.Ю. Носова, К.Ю. Галкина, М.А. Краснова, A.A. Букатина. -М.: МНПЦБТ, 2008. - 25 с.

15. Низова, A.B. Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.03 /Низова Анастасия Валерьевна. - М., 2009. - 22 с.

16. Носова, Е.Ю. Молекулярно-биологический микрочип «ТБ-БИОЧИП-2» для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью к фторхинолонам у больных с впервые выявленным и хроническим течением туберкулеза / Е.Ю. Носова, К.Ю. Галкина, О.В. Антонова, Ю.Ю. Гармаш, О.И. Скотникова, A.M. Мороз // Вестник РАМН. - 2008. - №3. - С. 16-19.

17. Патрушев, Л.И. Экспрессия генов / Л.И. Патрушев. - М.: Наука, 2000. - 527 с.

18. Приказ №109 МЗ РФ от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». — М., 2003. — 345 с.

19. Противотуберкулезная работа в городе Москве. Аналитический обзор статистических показателей по туберкулезу за 2012 г. / Под. ред. д.м.н. Е.М. Богородской и акад. РАМН В.И. Литвинова. - М.: МНПЦБТ, 2013. -164 с.

20. Скотникова, О.И. Характеристика чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду посредством определения мутаций в генах rpoB, katG, inhA, oxyR, , kasA различными молекулярно-биологическими методами / О.И. Скотникова, К.Ю. Галкина, Е.Ю. Носова, М.А. Краснова, A.M. Мороз // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2005.-№8.-С. 42-45.

21. Шемякин, И.Г. Молекулярно-биологичеекая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis', ав-тореф. дис. ... доктора биол. наук: 03.00.07 / Шемякин Игорь Георгиевич. -Оболенск, 2005. - 36 с.

22. Яковлев, В.П. Моксифлоксацин новый антимикробный препарат из группы фторхинолонов / В.П. Яковлев, С.В. Яковлев. - М.: Информэлектро, 2002.- 160 с.

23. Яковлев, С.В. Левофлоксацин новый антимикробный препарат группы фторхинолонов / С.В. Яковлев, В.П. Яковлев. - М.: Дипак., 2006. -240 с.

24. Abuali, М. A comparison of the Sensititre MYCOTB panel and the agar proportion method for the susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis / M. Abuali, R. Katariwala, V. LaBombardi // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. -2012.-Vol. 31, №5.-P. 835-839.

25. An, D. Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with high-level fluoroquinolone resistance in Vietnam / An D., N. Duy-en, N. Lan, D. Hoa, D. На, V. Kiet, D. Thu, N. Chau, N. Dung, D. Sy, J. Farrar, M. Caws // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - Vol. 53, №11. - P. 4835-4839.

26. Antonova, O.V. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchips / O.V. Antonova, D. A. Gryadunov, S. A. Lapa, A.V. Kuz'min, E.E. Larionova, T.G. Smirnova, E.Y. Nosova, O.I. Skotnikova, L.N. Chernousova, A.M. Moroz, A.S. Zasedatelev, V.M. Mikhailovich // Bull. Exp. Biol. Med. -2008.-Vol. 145, №1,-P. 108-113.

27. Bakayev, V. CCM analysis of heteroduplexes of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis / V. Bakayev, A. Bahrmand, G. Samar // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 1999. - Vol. 3. - P. 123-124.

28. Blakemore, R. Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay / R. Blakemore, E. Story, D. Helb, J. Kop, P. Banada, M. Owens,

S. Chakravorty, M. Jones, D. Alland // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, №7. -P. 2495-2501.

29. Boehme, C. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance / C. Boehme, P. Nabeta, D. Hillemann, M. Nicol, S. Shenai, F. Krapp, J. Allen, R. Tahirli, R. Blakemore, R. Rustomjee, A. Milovic, M. Jones, S. O'Brien, D. Persinq, S. Ruesch-Gerdes, E. Gotuzzo, C. Rodriques, D. Alland, M. Perkins // N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol. 363, №11.- P. 1005-1015.

30. Bolon, K. The Newer fluoroquinolones / K. Bolon // Med. Clin. N. Am. -2011.-Vol. 23, №4.-P. 793-817.

31. Brossier, F. Detection by GenoType MTBDR^/ test of complex mechanisms of resistance to second-line drugs and ethambutol in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis complex isolates / F Brossier, N. Veziris, A. Aubry, V. Jarlier, W. Sougakoff// J. Clinic. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, №5. - P. 16831689.

32. Campbell, P. Molecular detection of mutations associated with first- and second-line drug resistance compared with conventional drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis / P. Campbell, G. Morlock, D. Sikeas, T. Dalton, B. Metchock, A. Starks, D. Hooks, L. Cowan, B. Plikaytis, J. Posey // Antimicrob. Agents Chemother. - 2011. - Vol. 55, №5. - P. 2032-2041.

33. Canetti, G. Present aspects of bacterial resistance in tuberculosis / G. Canetti // Am. Rev. Respir. Dis. - 1965. - Vol. 92, №5. - P. 687-703.

34. Chakrabarti, P. Drug targets and drug resistance in mycobacteria / P. Chakrabarti // Proc. Nat. Acad. Sci. (India, B). - 1997. - Vol. 67. - P. 169-179.

35. Chan, E. Treatment and outcome analysis of 205 patients with multi-drug-resistant tuberculosis / E. Chan, V. Laurel, M. Strand, J. Chan, M. Huynh, M. Goble, M. Iseman // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. - 2004. - Vol. 169, №10. - P. 1103-1109.

36. Chang, H. Detection of Mycobacterium tuberculosis complex using realtime polymerase chain reaction / H. Chang, S. Heo, K. Yoo, S. Song, S. Kim, H.

Kim, K. Park, J. Song, J. Lee, S. Park, E. Kim // Korean J. Lab. Med. - 2008. -Vol. 28, №2.-P. 103-108.

37. Chen, J. Characterization of gyrA and gyrB mutations and fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Hubei Province, China / J. Chen, Z. Chen, Y. Li, W. Xia, X. Chen, T. Chen, L. Zhou, B. Xu, S. Xu // Braz. J. Infect. Dis. - 2012. - Vol. 16, №2. - P. 136-141.

38. Chernyaeva, E. Characterization of multiple and extensively drug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates with different ofloxacin-resistance levels / E. Chernyaeva, E. Fedorova, G. Zhemkova, Y. Korneev, A. Kozlov // Tuberculosis (Edinb). - 2013. - Vol. 93, №3. - P. 291-295.

39. Chia, B. Use of multiplex allele-specific polymerase chain reaction (MAS-PCR) to detect multidrug-resistant tuberculosis in Panama / B. Chia, F. Lanzas, D. Rifat, A. Herrera, E. Kim, C. Sailer, E. Torres-Chavolla, P. Naraya-naswamy, V. Einarsson, J. Bravo, J. Pascale, T. Ioerger, J. Sacchettini, P. Kara-kousis // Plos one. - 2012. - Vol. 7, №7. - P. 1-7.

40. Chiang, C. Outcome of pulmonary multidrug-resistant tuberculosis: a 6-yr follow-up study / C. Chiang, D. Enarson, M. Yu, K. Bai, R. Huang, C. Hsu, J. Suo, T. Lin // Eur. Respir. J. - 2006. - Vol. 28, №5. - P. 980-985.

41. Clinical and laboratory standards institute. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved standard second edition. - 2011.-M24-A2.- Vol. 31.-61 p.

42. Cui, Z. Association of mutation patterns in gyrA/B genes and ofloxacin resistance levels in Mycobacterium tuberculosis isolates from East China in 2009 / Z. Cui, J. Wang, J. Lu, X. Huang, Z. Hu // BMC infect. Dis. - 2011. - Vol. 78. - P. 1-5.

43. Delgado, M. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates: associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure. In: Selected PCR protocols for Emerging Infectious Diseases / M. Delgado, A. Telenti // Persing DH, ed., Washington. - 1996.

44. Devasia, R. High proportion of fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates with novel gyrase polymorphisms and a gyrA region associated with fluoroquinolone susceptibility / R. Devasia, A. Blackman, S. Eden, H. Li, F. Maruri, A. Shintani, C. Alexander, A. Kaiga, C. Stratton, J. Warkentin, Y. Tang, T. Sterling // J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50, №4. - P. 1390-1396.

45. Devasia, R. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis: an assessment of MGIT 960, MODS and nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross-resistance / R. Devasia, A. Blackman, C. May, S. Eden, T. Smith, N. Hooper, F. Maruri, C. Stratton, A. Shintani, T. Sterling // J. Antimic. Chemother. -2009. - Vol. 63, №6. - P. 1173-1178.

46. Dong, Y. Fluoroquinolone action against mycobacteria: effects of C-8 substituents on growth, survival, and resistance / Y. Dong, C. Xu, X. Zhao, J. Do-magala, K. Drlica // Antimicrob. Agents. Chemother. - 1998. - Vol. 42, №11. - P. 2978-2984.

47. Doom, H. Fluoroquinolone resistance detection in Mycobacterium tuberculosis with locked nucleic acid probe real-time PCR / H. Doom, D. An, M. Jong, N. Lan, D. Hoa, H. Quy, N. Chau, P. Duy, D. Tho, N. Chinh, J. Farrar, M. Caws // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2008. - Vol. 12, №7. - P. 736-742.

48. Espasa, M. Evaluation of the VersaTREK system compared to the Bac-tec MGIT 960 system for first-line drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis / M. Espasa, M. Salvado, E. Vicente, G. Tudó, F. Alcaide, P. Coll, N. Martin-Casabona, M. Torra, D. Fontanals, J. González-Martín // J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50, №2. - P. 488-491.

49. Evans, J. Novel multiplex allele-specific PCR assays for the detection of resistance to second-line drugs in Mycobacterium tuberculosis / J. Evans, H. Segal // J. Antimicrob. Chemother. - 2010. - Vol. 65, №5. - P. 897-900.

50. Feuerriegel, S. Sequence analyses of just four genes to detect extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in multidrug-resistant tuberculosis patients undergoing treatment / S. Feuerriegel, H. Cox, N. Zarkua, H. Karimo-

vich, K. Braker, S. Riisch-Gerdes, S. Niemann // Antimierob. Agents Chemother. -2009. - Vol. 53, №8. - P. 3353-3356.

51. Genotype MTBDR/;/«.?: a Further step toward rapid identification of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. - 2008. - P. 393394.

52. Ginsburg, A. Fluoroquinolones, tuberculosis, and resistance / A. Ginsburg, J. Grosset, W. Bishai // Lancet infect, dis. - 2003. - Vol. 3. - P. 432-442.

53. Grace Lin, S-Y. Multicenter evaluation of Bactec MGIT 960 system for second-lane drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex / S-Y Grace Lin, E. Desmond, D. Bonato, W. Gross, S. Siddiqi // J. Clinic. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, №11. - P. 3630-3634.

54. Groll, A. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in gyrA and gyrB / A. Groll, A. Martin, P. Jureen, S. Hoffner, P. Vandamme, F. Portaels, J. Palomino, P. Silva // Antimierob. Agents Chemother. -2009. - Vol. 53, №10. - P. 4498-4500.

55. Grompe, M. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids / M. Grompe // Nature Genet. - 1993. - Vol. 5, №2. - P. 111-116.

56. Hall, L. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtiter plate format / L. Hall L, K. Jude, S. Clark, N. Wengenack // J. Vis. Exp. - 2011. - Vol. 52.-P. 1-4.

57. Hegde, S. A fluoroquinolone resistance protein from Mycobacterium tuberculosis that mimics DNA / S. Hegde, M. Vetting, S. Roderick, L. Mitchenall, A. Maxwell, H. Takiff, J. Blanchard // Science. - 2005. - Vol. 308. - P. 1480-1483.

58. Heifets, L. Drug susceptibility testing in mycobacteriology / L. Heifets // Clin. Lab. Med. - 1996. - Vol. 16. - P. 641-656.

59. Heifets, L. Two liquid medium systems, Mycobacteria growth indicator tube and MB redox tube, for Mycobacterium tuberculosis isolation from sputum specimens / L. Heifets, T. Linder, T. Sanchez, D. Spencer, J. Brennan // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38, №3. - P. 1227-1230.

60. Helb, D. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology / D. Helb, M. Jones, E. Story, C. Boehme, E. Wallace, K. Ho, J. Kop, M. Owens, R. Rodgers, P. Banada, H. Safi, R. Blakemore, N. Lan, E. Jones-Lopez, M. Levi, M. Burday, I. Ayakaka, R. Mugerwa, B. Millan, E. Winn-Deen, L. Christel, P. Dailey, M. Perkins, D. Persing, D. Alland // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, №1. - P. 229-237.

61. Hillemann, D. Feasibility of the GenoType MTBDRsl assay for fluoroquinolone, amikacin-capreomycin, and ethambutol resistance testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens / D. Hillemann, S. Rüsch-Gerdes, E. Richter // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, №6. - P. 1767-1772.

62. Isaeva, Y. Determination of critical concentrations of moxifloxacin and gatifloxacin for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in the BACTEC MGIT 960 system / Y. Isaeva, A. Bukatina, L. Krylova, E. Nosova, M. Makarova, A. Moroz // J. Antimicrob. Chemother. - 2013. - Vol. 10. - P. 1-8.

63. Jain, A. Multidrug resistant to extensively drug resistant tuberculosis: What is next? / A. Jain, P. Dixit // J. Biosci. - 2008. - Vol. 33, №4. - P. 605-616.

64. Kam, K. Stepwise decrease in Moxifloxacin susceptibility amongst clinical isolates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: correlation with Ofloxacin susceptibility / K. Kam, C. Yip, T. Cheung, H. Tang, O. Leung, M. Chan // Microb. Drug Resist. - 2006. - Vol. 12, №1. - P. 7-11.

65. Kim, H. Impact of the E540V amino acid substitution in GyrB of Mycobacterium tuberculosis on quinolone resistance / H. Kim, C. Nakajima, K. Yoko-yama, Z. Rahim, Y. Kim, H. Oguri, Y. Suzuki // Antimicrob. Agents Chemother. -2011. - Vol. 55, №8. - P. 3661-3667.

66. Kruuner, A. Evaluation of MGIT 960-based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first- and second-lane antimicrobial drugs with drug-resistant clinical strains of Mycobacterium tuberculosis / A. Kruuner, M. Yates, F. Drobniewski // J. Clinic. Microbiol. - 2006. - Vol.44, №3. -P. 811-818.

67. Lau, R. Molecular characterization of fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis: Functional analysis of gyrA mutation at position 74 / R. Lau, P. Ho, R. Kao, W. Yew, T. Lau, V. Cheng, K. Yuen, S. Tsui, X. Chen, W. Yam // Antimicrob. Agents Chemother. - 2011. - Vol. 55, №2. - P. 608-614.

68. Li, J. Association of gyrA/B mutations and resistance levels to fluoroquinolones in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis / J. Li, X. Gao, T. Luo, J. Wu, G. Sun, Q. Liu, Y. Jiang, Y. Zhang, J. Mei, Q. Gao // Emerging microbes and infections. - 2014. - Vol. 3. - P. 1-5.

69. Long, Q. gyrA/B fluoroquinolone resistance allele profiles amongst Mycobacterium tuberculosis isolates from mainland China / Q. Long, W. Li, Q. Du, Y. Fu, Q. Liang, H. Huang, J. Xie // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2012. - Vol. 39, №6. - P. 486-489.

70. Louw, G. A Balancing Act: Efflux/Influx in Mycobacterial Drug Resistance / G. Louw, R. Warren, N. Pittius, C. Evoy, P. Helden, T. Victor // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - Vol. 53, №8. - P. 3181-3189.

71. Malik, S. New insights into fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis: functional genetic analysis of gyrA and gyrB mutations / S. Malik, M. Willby, D. Sikes, O. Tsodikov, J. Posey // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, №6. -P. 1-10.

72. Matrat, S. Functional Analysis of DNA Gyrase Mutant Enzymes Carrying Mutations at Position 88 in the A Subunit Found in Clinical Strains of Mycobacterium tuberculosis Resistant to Fluoroquinolones / S. Matrat, N. Veziris, C. Mayer, V. Jarlier, C. Truffot-Pernot, J. Camuset, E. Bouvet, E. Cambau, A. Aubry // Antimicrob. Agents Chemother. - 2006. - Vol. 50, №12. - P. 4170^173.

73. Merle, C. A pivotal registration phase III, multicenter, randomized tuberculosis controlled trial: design issues and lessons learnt from the Gatifloxacin for TB (OFLOTUB) project / C. Merle, C. Sismanidis, O. Sow, M. Gninafon, J. Horton, O. Lapujade, M. Lo, D. Mitchinson, C. Perronne, F. Portaeis, J. Odhiam-bo, P. Olliaro, R. Rustomjee, C. Lienhardt, K. Fielding // Trials. - 2012. - Vol. 13, №62.-P. 1-10.

74. Migliori, G. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in the West Europe and United States: epidemiology, surveillance and control / G. Migliori, M. Richardson, G. Sotgiu, C. Lange // Clin. Chest Med. - 2009. -Vol. 30, №4. - P. 637-665.

75. Mokrousov, I. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia /1. Mokrousov, T. Otten, O. Maniche-va, Y. Potapova, B. Vishnevsky, O. Narvskaya, N. Rastogi // Antimicrob. Agents Chemother. - 2008. - Vol. 52, №8. - P. 2937-2939.

76. National of Clinical Laboratory Standards: Antimycobacterial Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis II Tentative standard. NCCLS Document. - 1995. - M24T. - 44 p.

77. Neu, H. The crisis in antibiotic resistance / H. Neu // Science. - 1992. -Vol. 257, №5073. - P. 1064-1073.

78. Nosova, E. Analysis of mutations in the gyrA and gyrB genes and their association with the resistance of Mycobacterium tuberculosis to levofloxacin, moxifloxacin and gatifloxacin / E. Nosova, A. Bukatina, Y. Isaeva, M. Makarova, K. Galkina, A. Moroz // J. Med. Microbiol. - 2013. - Vol. 62, Pt. 1. - P. 108-113.

79. Olson, S. The new profile of drug-resistant tuberculosis in Russia: A global and local perspective: Summary of a joint workshop / S. Olson, R. English, A. Claiborne // National Academy of Sciences. - 2011. - P. 1-123.

80. Orita, M. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism / M. Orita, H. Iwahana, H. Kana-zawa // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1989. - Vol. 86. - P. 2766-2770.

81. Pantel, A. DNA gyrase inhibition assays are necessary to demonstrate fluoroquinolone resistance secondary to gyrB mutations in Mycobacterium tuberculosis / A. Pantel, S. Petrella, S. Matrat, F. Brossier, S. Bastian, D. Reitter, V. Jarlier, C. Mayer, A. Aubry // Antimicrob. Agents Chemother. - 2011. - Vol. 55, №10.-P. 4524-4529.

82. Pasca, M. Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c, an ABC Fluoroquinolone efflux pump in Mycobacterium tuberculosis / M. Pasca, P. Guglierame, F. Arcesi, M.

Bellinzoni, E. Rossi, G. Riccardi // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - Vol. 48,№8.-P. 3175-3178.

83. Piana, A. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis strains by single-strand conformation polymorphism analysis and restriction fragment length polymorphism / A. Piana, M. Orru, M. Masia, G. Sotgiu, E. Muresu, A. Maida // New Microbiol. - 2003. - Vol. 26, №4. - P. 375381.

84. Pitaksajjakul, P. Mutations in the gyrA and gyrB genes of fluoroquino-lone-resistant Mycobacterium tuberculosis from TB patients in Thailand / P. Pitaksajjakul, W. Wongwit, W. Punprasit, B. Eampokalap, S. Peacock, P. Ramasoota // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 2005. - Vol. 36, Suppl 4. - P. 228-236.

85. Poissy, J. Should Moxifloxacin be used for the treatment of extensively drug-resistant tuberculosis? An answer from a murine model / J. Poissy, A. Aubry, C. Fernandez, M. Lott, A. Chauffeur, V. Jarlier, R. Farinotti, N. Veziris // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2010. - Vol. 54, №11. - P. 4765-4771.

86. Ramaswamy, S. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update / S. Ramaswamy, J. Musser // Tubercle. Lung Dis. - 1998. - Vol. 79, №1. - P. 3-29.

87. Raviglione, M. XDR tuberculosis-implications for global public health / M. Raviglione, I. Smith // N. Engl. J. Med. - 2007. - Vol. 356, №7. - P. 656-659.

88. Roberts, G. Evaluation of the Bactec radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis / G. Roberts, N. Goodman, L. Heifets, H. Larsh, T. Lindner, J. Clatchy, M Ginnis, S. Siddiqi, P. Wright // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 18, №3. - P. 689-696.

89. Rodrigues, C. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against second-lane drugs using the Bactec MGIT 960 system / C. Rodrigues, J. Jani, S. Shenai, P. Thakkar, S. Siddiqi, A. Mehta // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2008.-Vol. 12, №12.-P. 1449-1455.

90. Rodriguez, J. In vitro activity of moxifloxacin, levofloxacin, gatifloxacin and linezolid against Mycobacterium tuberculosis / J. Ro-driguez, M. Ruiz, M. Lopez, G. Royo // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2002. - Vol. 20, №6. - P. 464-467.

91. Rothberg, J. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J. Rothberg, W. Hinz, T. Rearick, J. Schultz, W. Mileski, M. Davey, J. Leamon, K. Johnson, M. Milgrew, M. Edwards, J. Hoon, J. Simons, D. Marran, J. Myers, J. Davidson, A. Branting, J. Nobile, B. Puc, D. Light, T. Clark, M. Huber, J. Branciforte, I. Stoner, S. Cawley, M. Lyons, Y. Fu, N. Homer, M. Sedova, X. Miao, B. Reed, J. Sabina, E. Feierstein, M. Schorn, M. Alanjary, E. Dimalanta, D. Dressman, R. Kasinskas, T. Sokolsky, J. Fidanza, E. Namsaraev, K. Kernan, A. Williams, G. Roth, J. Bustillo // Nature. - 2011. - Vol. 475, №7356. -P. 348-352.

92. Rüsch-Gerdes, S. Multicenter evaluation of the Mycobacteria growth Indicator tube for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs / S. Rüsch-Gerdes, C. Domehl, G. Nardi, M. Gismondo, H. Welscher, G. Pfyffer // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, №1. - P. 45-48.

93. Rusch-Gerdes, S. Multicenter laboratory validation of the BACTEC MGIT 960 technique for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to classical second-lane drugs and newer antimicrobials / S. Rusch-Gerdes, G. Pfyffer, M. Casal, M. Chadwick, S. Siddiqi // J. Clinic. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, №3.-P. 688-692.

94. Sahly, H. Incidence of moxifloxacin resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Houston, Texas / H. Sahly, L. Teeter, K. Jost, D. Dunbar, J. Lew, E. Graviss // J. Clinic. Microbiol. - 2011. - Vol. 49, №8. - P. 2942-2945.

95. Sanders, C. Validation of the use of Middlebrook 7H10 agar, BACTEC MGIT 960, and BACTEC 460 12B Media for testing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Levofloxacin / C. Sanders, R. Nieda, E. Desmond // J. Clinic. Microbiol. - 2004. - Vol. 42, №11. - P. 5225-5228.

96. Shendure, J. Next-generation human genetics / J. Shendure, H. Ji // Genome Biol. - 2008. - Vol. 26, №10. - P. 1135-1145.

97. Shi, R. Emergence of ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China as determined by gyrA mutation analysis using denaturing high-pressure liquid chromatography and DNA sequencing / R. Shi, J. Zhang, C. Li, Y. Kazumi, I. Sugawara // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, №12.-P. 4566-4568.

98. Sirgel, F. gyrA mutations and phenotypic susceptibility levels to ofloxacin and moxifloxacin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis / F. Sirgel, R. Warren, E. Streicher, T. Victor, P. Helden, E. Bottger // J. Antimicrob. Chemother. - 2012. - Vol. 67, №5. - P. 1088-1093.

99. Spratt, B. Resistance to antibiotics mediated by target alterations / B. Spratt // Science. - 1994. - Vol. 264, №5157. - P. 388-393.

100. Sreevatsan, S. Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination / S. Sreevatsan, X. Pan, K. Stockbauer, N. Connell, B. Kreiswirth, T. Whittam, J. Musser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. - Vol. 94, №18. - P. 9869-9874.

101. Sulivan E. Emergence of fluoroquinolone-resistant tuberculosis in New York City / E. Sullivan, B. Kreiswirth, L. Palumbo, V. Kapur, J. Musser, A. Ebrahimzadeh, T. Frieden // Lancet. - 1995. - Vol. 345, №8958. - P. 1148-1150.

102. Surcouf, C. Molecular detection of fluoroquinolone resistance in multidrug resistant tuberculosis in Cambodia suggests low association with XDR pheno-types / C. Surcouf, S. Heng, C. Pierre-Audigier, V. Cadet-Daniel, A. Namouchi, A. Murray, B. Gicquel, B. Guillard // BMC infect. Diseas. - 2011. - Vol. 11, №255. -P. 1-8.

103. Suzuki, Y. Sensitivities of ciprofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates to fluoroquinolones: role of mutant DNA gyrase subu-nits in drug resistance / Y. Suzuki, C. Nakajima, A. Tamaru, H. Kim, T. Matsuba, H. Saito // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2012. - Vol. 39, №5. - P. 435-439.

104. Taghavi, K. Rapid detection of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis by a single multiplex allele-specific polymerase chain reaction assay / K. Taghavi, P. Farnia, M. Varahram, F. Sheikhoslami, M. Ahmadi, M. Kazem-poor, M. Masjedi, A. Velayati // Cell. J. - 2011. - Vol. 13, №2. - P. 97-102.

105. Takiff, H. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detection of quinolone resistance mutations / H. Takiff, L. Salazar, C. Guerrero, W. Philipp, W. Huang, B. Kreiswirth, S. Cole, W. Jacobs, A. Telenti // Antimicrob. Agents Chemother. - 1994. - Vol. 38, №4. - P. 773-780.

106. Tao, J. Mycobacterium fluoroquinolone resistance protein B, a novel small GTPase, is involved in the regulation of DNA gyrase and drug resistance / J. Tao, J. Han, H. Wu, X. Hu, J. Deng, J. Fleming, A. Maxwell, L. Bi, K. Mi // Nucleic Acids Res. - 2013. - Vol. 41, №4. - P. 2370-2381.

107. Torres, M. Use of real-time PCR and fluorometry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis / M. Torres, A. Criado, I. Palomares, J. Aznar // J. Clin. Microbiol. - 2000. -Vol. 38, №9.-P. 3194-3199.

108. Vadwai, V. Multiplex allele specific PCR for rapid detection of extensively drug resistant tuberculosis / V. Vadwai, A. Shetty, C. Rodrigues // Tuberculosis (Edinb). - 2012. - Vol. 92, №3. - P. 236-242.

109. Vareldzis, B. Drug-resistant tuberculosis: laboratory issues. World Health Organization recommendations / B. Vareldzis, J. Grosset, I. Kantor, J. Crofton, A. Laszlo, M. Felten, M. Raviglione, A. Kochi // Tuber. Lung. Dis. -1994.-Vol. 75, №1.-P. 1-7.

110. Viveiros, M. Mycobacterial efflux pumps and chemotherapeutic implications / M. Viveiros, C. Leandro, L. Amaral // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2003. - Vol. 22, №3. - P. 274-278.

111. Wang, J. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates: associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure /

J. Wang, L. Lee, H. Lai, S. Wang, I. Jan, C. Yu, P. Hsueh, P. Yang // J. Antimi-crob. Chemother. - 2007. - Vol. 59, №5. - P. 860-865.

112. Watterson, S. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis / S. Watterson, S. Wilson, M. Yates, F. Drobniewski // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, №7. - P. 19691973.

113. Williams, D. PCR-heteroduplex detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis / D. Williams, C. Limbers, L. Spring // In: PCR protocols for emerging infectious diseases. D. Persing (ed.). - 1996. - P. 122-129.

114. World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs. - WHO.: Geneva, Switzerland, 2008. - 392 p.

115. World Health Organization. Global Tuberculosis Control. A short update to the 2009 report. - WHO.: Geneva, Switzerland, 2009. - 39 p.

116. World Health Organization. Global Tuberculosis Control report 2010. -WHO.: Geneva, Switzerland, 2010. - 204 p.

117. World Health Organization. Global Tuberculosis Control report 2011. -WHO.: Geneva, Switzerland, 2011. - 246 p.

118. World Health Organization. Global Tuberculosis report 2013. - WHO.: Geneva, Switzerland, 2013. - 289 p.

119. Xu, P. Prevalence of fluoroquinolone resistance among tuberculosis pa-tiens in Shanghai, China / P. Xu, X. Li, M. Zhao, X. Gui, K. DeRiemer, S. Gagneux, J. Mei, Q. Gao // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - Vol. 53, №7. -P. 3170-3172.

120. Yin, X. Mutation characterization of gyrA and gyrB genes in levofloxa-cin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Guangdong Province in China / X. Yin, Z. Yu // J. Infect. - 2010. - Vol. 61, №2. - P. 150-154.

121. Yew, W. Outcomes of patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis treated with ofloxacin/levofloxacin-containing regimens / W. Yew, C.

Chan, C. Chau, C. Tarn, C. Leung, P. Wong, J.'Lee // Chest. - 2000. - Vol. 117, №3. - P. 744-751.

122. Yew, W. Genotypic and phenotypic resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicins and fluoroquinolones / W. Yew, E. Chan, C. Chan, A. Cheng // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2002. - Vol. 6, №10. - P. 936-937.

123. Zhang, J. The impact of next-generation sequencing on genomics / J. Zhang, R. Chiodini, A. Badr, G. Zhang // J. Genet. Genomics. - 2011. - Vol. 38, №3. - P. 95-109.

124. Zhang, Y. The magic bullets and tuberculosis drug targets / Y. Zhang // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2005. - Vol. 45. - P. 529-564.

125. Zhao, B. Fluoroquinolone action against clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis: effects of a C-8 methoxyl group on survival in liquid media and in human macrophages / B. Zhao, R. Pine, J. Domagala, K. Drlica // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43, №3. - P. 661-666.