Молекулярно-генетический анализ факторов роста и матриксных металлопротеиназ в невынашивании беременности первого триместра тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Мараховская Татьяна Алексеевна

• Мараховская Татьяна Алексеевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Мараховская Татьяна Алексеевна

Введение

1Обзор литературы ^

1.1Биологическая характеристика факторов роста.............................. ^ ^

1.2 Общая характеристика матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов................................................................................ ^

1.3 Роль факторов роста, матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов

в развитии и течении беременности

1.4 Влияние БМР генов факторов роста и металлопротеиназ на течение беременности

2 Материал и методы исследования

2.1 Материал исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделения нуклеиновых кислот

2.2.2 Анализ степени инфицированности тканей, полученных после спонтанных и медицинских абортов

2.2.3 Анализ однонуклеотидных полиморфизмов

2.2.4 Анализ уровня транскрипции генов факторов роста и матриксных металлопротеиназ в децидуальной и хорионической тканях

2.3Методы статистической обработки результатов 35 2.4 Метаанализ исследуемых полиморфизмов генов факторов роста и матриксных металлопротеиназ

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Исследование полиморфизма генов факторов роста в клетках

материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности первого триместра

3.2 Исследование полиморфизма генов ММР и TIMP в клетках

материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности первого триместра

3.3 Метаанализ ассоциации полиморфных вариантов генов факторов роста, MMP и TIMP в клетках материнского и зародышевого происхождения

с риском репродуктивных потерь на ранних сроках

3.4 Анализ межгенного взаимодействия полиморфных вариантов генов факторов роста, MMP и TIMP в клетках материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности первого триместра

3.4.1 Анализ межгенного взаимодействия полиморфных вариантов генов факторов роста, MMP и TIMP в клетках периферической крови женщин

3.4.2 Анализ межгенных взаимодействий исследуемых полиморфизмов генов в тканях эмбрионального происхождения при невынашивании беременности в первом триместре

3.5 Анализ уровня транскрипции генов факторов роста, металлопротеиназ и их ингибиторов при репродуктивных потерях первого

триместра

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Благодарности

Список использованных источников

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ факторов роста и матриксных металлопротеиназ в невынашивании беременности первого триместра»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. По данным Европейского сообщества репродукции человека и эмбриологии за 2019 год причина бесплодия на 20-30% связана с мужским фактором, 20-35% - с женским фактором, 25-40% -сочетанием обоих факторов. В 10-20% случаев у пар диагностируют бесплодие неясного генеза (ESHRE, 2019).

Причины нарушения репродуктивной функции многочисленны: нарушение морфологии и физиологии репродуктивных органов (патология матки, непроходимость фаллопиевых труб и т.д.), эндокринные нарушения, инфекционные заболевания, социальные факторы (условия труда, стрессы, вредные привычки, питание) (Sabatini L. et al., 2007; Сидельникова В. М. Сухих Г. Т., 2009). Особое место среди причин нарушения репродукции женщины занимают нарушения работы генов: свертывающей системы крови, метаболизма фолиевой кислоты, иммунной системы, функционирование системы глутатиона, дисфункции эпителия, метаболизма гормонов, факторов роста хориона и плаценты (Nonaka T. et al., 2011; Müller A. et al., 2016; Bigdeli R. et al., 2018).

Правильное течение процессов имплантации и плацентации в первом триметре является основополагающим для всего хода беременности. В России из всех зарегистрированных беременностей спонтанные выкидыши составляют 1523%, из них до 80% потерь происходит в I триместре (Доброхотова Ю.Э., 2007; Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2010). Среди всех репродуктивных потерь привычное невынашивание беременности составляет от 5 до 20%, но в половине случаев причины остаются невыявленными (Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2009; Banerjee P. et al., 2013; Айламазян Э.К. и др., 2014).

Нарушение формирования и функционирования фетоплацентарного кровотока является одним из патогенетических механизмов, приводящих к нарушению имплантации и плацентации. Факторы роста, матриксные металлопротеиназы (ММР) и их рецепторы синтезируются уже на стадии бластомеров и экспрессируются в ходе всей беременности (Бурлев В.А. и Павлович

С.В., 1999; Anacker J. et al., 2011; Kumar S. et al., 2016), регулируя степень инвазии, формирование и трансформацию фетоплацентарного кровотока. Параллельно ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMP) способствуют сохранению тканей эндометрия от протеолитической деградации (Mââttâ M. et al., 2000; Naruse K. et al., 2009).

Активность факторов роста, матриксных металлопротеиназ и ингибиторов матриксных металлопротеиназ и их взаимная регуляция отвечают за рецептивность эндометрия, играют ключевую роль в васкуляризации, имплантации и плацентации. Нарушение баланса между генами и их ингибиторами приводит к репродуктивным потерям. Исследования, посвященные уровню транскрипции генов матриксных металлопротеиназ, их ингибитора и факторов роста, и однонуклеотидным заменам этих генов среди женщин с невынашиванием беременности в I триместре немногочисленны и противоречивы. Для женщин популяции европейской части России такие исследования практически отсутствуют.

Цель работы. Изучить роль полиморфных локусов генов факторов роста, матриксных металлопротеиназ, их тканевого ингибитора и их межгенных взаимодействий в потери беременности в первом триместре, и оценить уровень экспрессии исследуемых генов в тканях материнского и зародышевого происхождения.

Задачи исследования.

1. Исследовать частоты аллелей и генотипов генов VEGFA (rs2010963 и rs699947), TGFB1 (rs1800471), MMP1 (rs1799750), MMP9 (rs11697325), ММР20 (rs1784423 и rs2245803), TIMP1 (rs11551797) в клетках крови женщин и в клетках ворсин хориона при нарушении течения беременности I триместра и нормальном течении беременности.

2. Оценить вклад сочетания генотипов исследуемых локусов генов VEGFA, TGFB1, MMP1, MMP9, ММР20, TIMP1 в изменение риска репродуктивных потерь первого триместра.

3. Провести метаанализ ассоциации полимофизмов rs2010963, т699947, т1800471, ^1799750, ^11697325, т1784423 и га2245803 с риском потери беременности в I триместре.

4. Оценить уровень экспрессии исследуемых генов факторов роста, матриксных металлопротеиназ и их тканевого ингибитора в тканях материнского и зародышевого происхождения при нормальном течении беременности и потере беременности в первом триместре.

Научная новизна работы.

Установлена ассоциация полиморфизма -8202A>G гена MMP9 с риском неразвивающейся беременности в первом триместре.

В результате анализа межгенных взаимодействий исследуемых генов факторов роста и матриксных металлопротеиназ среди женщин с репродуктивными потерями выявлено, что сочетание генотипов MMP9 -8202АА / VEGFA -2578CА / MMP1 -1607GGGG ассоциировано с высоким риском невынашивания беременности (OR = 4.12). Низкий риск (OR = 0.098) ассоциирован с сочетанием генотипов MMP9 -8202АG/ VEGFA -2578AА /MMP1 -1607GGG. При генотипе зародышевых клеток MMP1 GG-1607GG / TGFВ1936СС риск прерывания беременности снижается.

Впервые показано, что при потере беременности первого триместра в децидуальной ткани изменяется характер соотношения уровней мРНК генов VEGFA и TGFВ1. Уровень транскрипции генов матриксных металлопротеиназ ММР1, ММР20 в клетках децидуальной и хорионической тканей имеет тканеспецифичный характер. Для гена ММР9 выявлен тканеспецифичный уровень транскрипции при нарушении течения беременности.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Для генотипа -8202АА гена ММР9 выявлена ассоциация с репродуктивными потерями в первом триместре.

2. Сочетанное носительство генотипов VEGFA -2578CА / MMP9 -8202АА / MMP1 -1607GGGG у женщин коррелирует с повышением риска невынашивания беременности. Для женщин - носителей одного из вариантов сочетания генотипов:

MMP9 -8202АG / VEGFA -2578AА / MMP1 -1607GGG; MMP9 -8202АG / VEGFA -2578^/ MMP1 -1607GGG; MMP9 -8202АG/ VEGFA -2578^/ MMP1 -1607GGGG выявлены пониженные риски репродуктивных потерь.

3. В клетках эмбрионального происхождения двухлокусное сочетание генотипов MMP1 -1607GGGG / TGFВ1915CС связано с пониженным риском выкидышей на сроке 5-11 недель.

4. Уровень мРНК гена TGFВ1 выше в клетках эмбрионального происхождения, чем в клетках децидуальной ткани при нормально протекающей беременности и прямо коррелирует с уровнем мРНК гена VEGFА. При выкидышах сопряженность синтеза мРНК двух данных генов в децидуальной ткани носит обратную зависимость.

5. Содержание мРНК генов ММР1, ММР20 и TIMP1 в клетках децидуальной ткани выше, чем в клетках ворсин хориона при физиологической беременности.

Научно-практическое значение. В результате исследования была показана связь генов матриксных металлопротеиназ и факторов роста в развитии и течении беременности в клетках материнского и эмбрионального происхождения. Статистически значимые данные были получены как для генотипов, так и для транскриптов.

На основании полученных данных генотипирования женщин с преждевременным прерыванием беременности первого триместра и женщин с физиологически протекающей беременностью разработана База данных «Генетические маркеры ранних репродуктивных потерь» (№2016620576). Эти данные могут применяться в медико-генетическом консультировании для поиска причин выкидышей неясного генеза, анализа предрасположенностей к репродуктивным потерям у женщин, готовящихся к беременности, оценки рецептивности эндометрия к эмбриону при имплементации вспомогательных репродуктивных технологий для формирования групп женщин высокого риска репродуктивных потерь, поиска причин неудач имплантаций эмбрионов хорошего качества у пациенток в программах ЭКО.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 6.98.2014/К «Анализ межгенных взаимодействий при нарушении ранних этапов эмбриогенеза человека» и проект 6.6762.2017/БЧ «Исследование функциональной роли генетических полиморфизмов и микро РНК в геноме человека и животных»).

Апробация работы. Полученные данные в рамках диссертационного исследования были доложены на III летней школе по биоинформатике (Москва, 2015); VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015); 2d the International Conference «Research, Innovation and Education» (London, 2015); XIX Международной медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2016); Всероссийской конференции с международным участием «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы» (Москва, 2016); международной научной конференции и молодежной научной конференции памяти члена-корреспондента РАН Д.Г. Матишова «Окружающая среда и человек. Современные проблемы генетики, селекции и биотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2016); 7th Singapore Health & Biomedical Congress (Singapore, 2016); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2017); Научно-практической конференции с международным участием «Генетика - фундаментальная основа инноваций в медицине и селекции» (Ростов-на-Дону, 2017).

Личное участие автора. Представленные в диссертации результаты были получены лично автором. Для проведения исследования специально был освоен ряд методик молекулярно-генетического анализа и работа с программами для статистического анализа. Лично автором были сформулированы выводы и практические рекомендации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 печатных работы, в том числе из них 3 работы в изданиях, входящих в базы данных международных индексов научного цитирования Scopus и Web of Science, 3 работы входит в

Перечни рецензируемых научных изданий ЮФУ и ВАК, 15 тезисов, получено свидетельство на Базу данных «Генетические маркеры ранних репродуктивных потерь» №2016620576 от 10.05.2016 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (168 источников), 5 приложений, изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 39 таблиц и 35 рисунков.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологическая характеристика факторов роста

Факторы роста участвуют в стимулировании дифференцировки и деления клеток, и выявлены у широкого круга организмов, включая растения, насекомых, земноводных и людей.

В таблице 1 представлены данные, полученные при избирательном выключении генов у экспериментальных животных.

Таблица 1 - Нарушение развития у мышей с нокаутом по некоторым генам

факторов роста

Ген Нарушения развития Источник

TGFB1 Множественные нарушения развития (50% эмбриональная смертность, 50% перинатальная летальность). Chang H.et al, 2002 Jones RL.et al, 2006

TGFB2

TGFB3

IGFI Послеродовая летальность, замедление роста, бесплодие и глубокие дефекты в развитии основных систем органов. Liu J.L et al, 2000

IGFIR Сниженная масса при рождении, послеродовая летальность в течение нескольких часов после рождения от дыхательной недостаточности в результате мышечной гипоплазии. Rosenfeld R.G., 2003

VEGF Эмбрионы мышей погибают между 11 и 12 днями беременности при утрате хотя бы одного аллеля. Эмбриональное развитие также нарушается при изменении экспрессии этого гена. Ferrara N. et al, 1996

PlGF У мышей потеря PlGF нарушала VEGF-зависимый ангиогенез сетчатки и желтого тела, не влияя на жизнеспособность и репродукцию. Carmeliet P. et al, 2001

Эпоха исследования факторов роста началась в 1952 году с открытия фактора роста нервов Стэнли Коэном и Ритой Леви-Монтальчини на эмбрионах цыплят, за что в 1986 году они получили Нобелевскую премию (Levi-Montalcini R., 1987). В таблице 2 отражены функции и классификация факторов роста.

Таблица 2 - Функциональная классификация семейств факторов роста (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008)

Семейства факторов роста Факторы роста Функции

Факторы роста гемопоэтических клеток Фактор роста стволовых клеток (kit-ligand, steel factor), Flt3 ligand, IL3, GMCSF, GSCF, MSC, IL7, IL11, эритропоэтин, тромбопоэтин Стимуляция пролиферации и дифференцировки клеток- предшественниц кроветворения, регуляция кроветворения

Семейство интерлейкина 1 и фактора роста фибробластов ILlA, IL1B, рецепторный антагонист IL1, IL18, фактор роста фибробластов Провоспалительное действие, активация специфического иммунитета

Суперсемейство факторов роста нервов, тромбоцитарного ростового фактора и трансформирующих ростовых факторов Семейство факторов роста нервов (NGF), мозговой нейротрофический фактор Регуляция процессов ангиогенеза, эмбрионального развития, работы нейронов, воспаления и регенерации тканей

Факторы роста тромбоцитов (PDGF), ангиогенные ростовые факторы (VEGF)

Семейство TGF: TGFB, аквитины, ингибины, костные морфогенетические белки

Семейство эпидермального ростового фактора EGF, TGFA, гепарин-связывающий белок эпидермального фактора роста (HB-EGF), рецептор ацетилхолина, индуцирующий активность (ARIA), глиальный фактор роста (GGF), Амфирегулин (AR), Эпирегулин (EPR), Бетацеллюлин (BTC), Нейрегулин-1 -4 (NrG1 -4) Стимулирование пролиферации различных типов клеток

Семейство инсулиноподобных ростовых факторов IGF1, IGF2

TGFB продуцируется практически каждой клеткой в организме (Fagerberg L. et al., 2014). Имеет три изоформы - TGFB1, -2, -3 с высокой гомологией между собой (TGFB1 и TGFB2 - 71,4%, с TGFB3- 76% и TGFB3 с TGFB2 - 80%) (Yue J., Mulder K.M., 2001). TGFB1 - основная изо форма, синтезируемая иммунными клетками. Так же клетки трофобласта продуцируют трансформирующий фактор

роста, который участвует в его дифференцировке и инвазии (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).

С одной стороны, через р53-зависимые и р53-независимые пути трансформирующий фактор роста запускает апоптоз клеток эпителия, эндотелия и гематопоэтических клеток. При этом, с другой стороны - усиливает экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (Бабышкина Н.Н. и др., 2010; Марченко Ж.С., Лукина Г.В. 2005; Poniatowski Ь.А. et а1, 2015). Это несоответствие объясняется уровнями экспресии TGFВ1. Показано, что низкие значения способствуют ангиогенезу, а более высокие уровни приводят к ингибированию роста клеток эндотелия и созреванию кровеносных сосудов (Hofer Е. et а1., 2007).

Влияние трансформирующего фактора роста на УЕОБ было показано на опухолевых клетках. В клетках сильно васкуляризованных опухолей, например, таких как гепатоцеллюлярная карцинома, TGFВ индуцирует секрецию VEGFA. Воздействие на трансформирующий фактор роста синтетическим ингибитором киназы Три / II LY2109761 показало уменьшение размера опухоли, плотности сосудов и экспрессии VEGF (Маг70сса А., et а1., 2009).

УЕОБА представлен изоформами: УЕОБА121, УЕОЕА1б5, УЕОБАш, УЕОБА20б. Изоформа УЕОБА^ представлена преимущественно по сравнению с другими изоформами и в основном находится в связанном состоянии во внеклеточном матриксе и на поверхности клетки (Шурыгин М.Г. и др., 2005). Продуцируется УЕОБА практически во всех тканях и является одним из главных регуляторов ангиогенеза, осуществляет увеличение проницаемости сосудов и пролиферацию эндотелиальных клеток (Ба§егЬег§ L, et а1, 2014). Контакт УЕОБА со своим рецептором VEGRF2 в первую очередь отвечает за реакции пролиферации, миграции и выживания эндотелиальных клеток. Взаимодействие с VEGFR1 может вызывать реакции модуляции протеазы и в растворимой форме рецептор выступает в роли ингибитора VEGFA ^ао Б., Lang, R.A.,2010). Передача сигналов играет важную роль в васкулогенезе. Делеция Flt-1 (VEGFR1), Б1к-1 / KDR (VEGFR2) и одного или обоих аллелей VEGF вызывает эмбриональную летальность у мышей (Бо^ О.И. et а!., 1995).

Контроль апоптоза эндотелиальных клеток посредством взаимодействия ТОБВ1 и УЕОБА показан на рисунке 1. В отсутствии TGFВ1 VEGF индуцирует активацию р38 МАРК через £1к-1 и способствует выживанию эндотелиальных клеток. TGFВ1 индуцирует продукцию FGF2, который переводит взаимодействие УЕОБЛ со своим рецептором в проапоптотический сигнал.

Апоптоз Выживание клеток и их пролиферация

Рисунок 1 - Контроль клеточной пролиферации посредством взаимодействия TGFB1 -

VEGFA (Ferrari G. et al., 2006)

1.2 Общая характеристика матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов

Матриксные металлопротеиназы - цинк- и кальций-зависимые эндопептидазы, участвующие в ремоделировании внеклеточного матрикса.

Впервые были выявлены и описаны при исследовании ферментативной активности в хвосте головастика в период метаморфоза в 1962 году. Позже были найдены у человека и других животных (Gross J., Lapiere C.M., 1962; Koizumi M. et al, 2010; Iyer R.P. et al., 2012). На сегодняшний день в семействе ММР известно более 60 различных ферментов, 23 из которых обнаруживаются в тканях человека (Маркелова Е.В. и др., 2016).

Активность матриксных металлопротеиназ максимально высока в период эмбриогенеза, после рождения снижается и на протяжении всей жизни остается достаточно стабильной (Sbardella D. et al., 2012). Полиморфизмы генов ММР выявляются при ревматоидных артритах, остеоартритах, аневризме аорты, периодонтите, аутоиммунных поражениях кожи, раковых заболеваниях (Аксененко М.Б. и Рукша Т.Г., 2013).

Потеря функции одного из генов ММР (таблица 3) у мышей не влияет на жизнеспособность, что объясняется возможной компенсацией за счет активности другой ММР, но приводит к дефектам в развитии. Так у нокаутных мышей по гену MMP7 наблюдается повышенная экспрессия стромелизина1 (MMP3) и стромелизина-2 (MMP10) в матке (Rudolph-Owen L.A., 1997). Исключение составляет потеря функции гена ММР14, приводящая к смерти сразу после рождения. Регулирование активности матриксных металлопротеиназ осуществляется тканевыми ингибиторами (TIMP).

Таблица 3 - Нарушение развития мышей, нокаутных по генам ММР и TIMP

Ген Нарушение развития Источник

MMP1 Потеря гена не оказывает очевидного влияния на рост или развитие, однако у взрослых мышей наблюдалась потеря фертильности Foley C.J. and Kuliopulos A., 2014

MMP2 Наблюдаются дефекты, не влияющие на продолжительность жизни и фертильность Dubois B. et al., 2000

MMP9

ММР12 Clark I.M. et al., 2010

ММР13

ММР20

MMP14 Обширные дефекты костной ткани, смерть через несколько недель после рождения.

TIMP1 Сокращение репродуктивного периода у самок Nothnick W.B., 2001

TIMP3 Спонтанная эмфизема Clark I.M. et al., 2010

Строение ММР представлено на рисунке 2:

• сигнальный участок обеспечивает направленную секрецию;

• каталитический домен содержит последовательность аминокислот PRCGxPD с неспаренным остатком цистеина (цистеиновый переключатель);

• цинковый палец содержит активный сайт с аминокислотной последовательностью HExxHxxGxxH. Остатки гистидина связывают ион цинка;

• гемопексин-подобный домен раскручивает молекулу коллагена и направляет ее по отношению к ферменту и обеспечивает связь с тканевым ингибитором MMP (Bhupinder S.S., 2010);

• домен субстратной специфичности (фибронектин-связывающий, трансмембранный и другие домены) (Бобкова И.Н. и др., 2008).

Маприлизины

{7. 26)

Колпагвназы

[ 1. е, 13. 18|

Стромслиэишл

[3, 1С")

сигнальный участок внопщ №1ш1нчихнй ДОМЕН

ClITILUIllIlDi участок щнцшшц вкншнчесвп до иен;

гкм[)т:ктнн

Жслатиназы

(2. 9)

мт-шт

ТМД ( 14 15, 1-е, 24) ГФИ ( 17, 25}

СИГНАЛЬНЫЯ УЧАСТОК ТЦЧИКНТНД HUAJIIlTWIECKllfl ф ф ф ДОМЕН ГВМОПЕКСНН

сигнальный участок ПГОПЕПТЦД ФУ клгллшнчкский ДОМП[ ГВИОЛЕВСНН тмл/ГФИ

>

Рисунок 2 - Общий план строения MMP (Бобкова И.Н. и др., 2008)

Ф - фибронектин-связывающий участок, ФУ - фурин-расщепляемый участок, ТМД -трансмембранный домен, ГФИ - гликозилфосфатидилинозитол

Контакт цистеинового переключателя и пропептида предотвращает взаимодействие молекулы воды с Zn2+ и держит ММР в неактивной форме. Действия ферментов, автокатализ (фурин, плазмин или другой MMP), изменение рН, температуры активируют металлопротеиназу (Bhupmder S.S., 2010; SbardeПa D. et б1., 2012).

На рисунке 3 представлена общая модель регуляции экспрессии MMP. Большая часть матриксных металлопротеиназ находятся в неактивной форме (proMMP) и активируются во внеклеточном пространстве другими протеиназами. Мембранно-связанные ММР активируются после воздействия фурина и встраиваются в мембрану в активной форме. Активная ММР расщепляет внеклеточный мактрикс, что приводит к его деградации. Связывание ММР

ингибиторами, такими как TIMP, приводит к ее деактивации (Curry T.E. et al., 2003).

Одной из широко распространенных металлопротеиназ подсемейства коллагеназ является MMP1. Активация латентной формы ММР1 происходит с помощью ММР2 или ММР7. Активированная ММР1 расщепляет коллагены I, II, III, VII, VIII, X типа, желатин, казеин, аггрекан, энтактин, перлекан, внутриклеточные протеины. EGF, IL-1, IL-6, TNFA стимулируют синтез ММР1 (Румянцев В.А. и Жигулина В.В., 2014). Показано, что тромбин стимулирует выработку ММР1 в культуре эндометриальных стромальных клеток и в культуре клеток оболочки плода (Mogami H. et al., 2014).

ММР9 (желатиназа В) расщепляет коллаген IV типа и желатин и играет главную роль в процессе имплантации. Было выявлено, что ингибирование ММР9 in vitro угнетает миграцию и разрушение внеклеточного матрикса клетками трофобласта у мышей (Кореновский Ю.В. и др., 2012). Во время беременности ММР9 совместно с VEGF влияют на ангиогенез и васкулогенез. На крысах было показано, что ММР9 расщепляет внеклеточный домен VEGFR2 и препятствует

Актив анионный Субстрат

Рисунок 3 - Схема синтеза и активации (Curry T.E. et al., 2003)

связыванию VEGFA со своим рецептором (Palei A.C. et al., 2010; Luizon M.R. et al., 2012).

Для ММР20 много научных публикаций, посвященных участию этого белка в развитии зубной эмали. При его нарушении эмаль истончается и содержит больше воды и белков, чем минеральных солей (Yang X. et al., 2011; Khan F. et al., 2012; Маркелова Е.В. и др., 2016). Для полиморфизма rs1711437 гена MMP20 показана ассоциация со старением почек. Определенную роль MMP20 играет при поражениях спинного мозга, что было показано у крыс на экспериментальной модели компрессионного повреждения спинного мозга (Ярмолинская М.И. и др., 2012).

Ингибитор матриксных металлопротеиназ представлен: Т1МР1 и Т1МР2 в растворимой форме во внеклеточном пространстве, Т1МР3 - связан с компонентами внеклеточного матрикса, образуют комплексы с ММР в соотношении 1:1. Каждый Т1МР может ингибировать практически любую ММР, константы ингибирования в разных тканях различны. Однако наблюдается некоторая специализация: Т1МР1 главным образом ингибирует желатиназу В (ММР9), Т1МР2 - желатиназу А (ММР2), а Т1МР3 - как ММР2, так и ММР9 (Маркелова Е.В. и др., 2016). Эмбрион во время имплантации продуцирует хорионический гонадотропин, ингибирующий экспрессию TIMP1, TIMP2 и TIMP3 в децидуализированных клетках стромы эндометрия, тем самым регулируя активность ММР (Gellersen B. et al., 2010). У женщин с эндометриозом в эндометрии было выявлено снижение экспрессии мРНК TIMP2 и повышение активности генов ММР2 и MMP3 (Sokalska A. et al., 2012).

1.3 Роль факторов роста, матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в развитии и течении беременности

Уже на стадии 4-х бластомеров выявляется TGFA и внутриклеточный домен к рецептору EGF. На стадии 8- и 14-ти клеток обнаружены внутри- и внеклеточные домены к IGF1 и его рецептору (Бурлев В.А., Павлович С.В., 1998).

Трансмембранная форма TGFА, находящаяся на поверхности клеток эндометрия через непосредственный контакт с рецептором EGF клеток эмбриона и эндометриальных клеток играет определенную роль в подготовке эмбриона и эндометрия к имплантации (Bush M.R., 1998). CSF1 и ТGFВ участвуют в развитии, пролиферации и дифференцировке трофобласта и синтезируются натуральными киллерами и клетками стромы децидуальной оболочки. Протеины инсулиноподобных факторов роста играют роль в процессе имплантации, в моделировании сосудистых реакций, регулировании роста миометрия. IGF1 продуцируется клетками плаценты и участвует в транспорте питательных субстратов через плаценту к плоду и таким путем обеспечивает его рост и развитие (Сидельникова В. М. и Сухих Г. Т., 2009).

Имплантация эмбриона происходит в условиях гипоксии. ШЕ-1А активирует промотор VEGFA (Young R.J., Möller A., 2009). Фактор роста эндотелия сосудов активирует протеиназу В (Akt), которая в свою очередь фосфорилирует eNOS (Palei A.C., 2010; Luizon M.R., 2012). Под влиянием этого фермента при участии NO-синтазы L-аргинин окисляется с выделением NO (Назаренко М.С. и др., 2012) (рисунок 4).

VEGI or Fl

i

X-Akt

P T P

NO

Ангиогенез, васкулогенез и васкулярный гомеостаз

Рисунок 4 - Возможные взаимодействия между eNOS, MMP-9 и VEGF при нормальном течении беременности (Luizon M.R. et а!., 2012)

В свою очередь VEGF усиливает активность Са-зависимой NO-синтетазы, стимулирует высвобождение кальция из внутриклеточных депо (Cuevas P. et al., 1991). Недостаток NO приводит к остановке развития эмбриона, а избыток - к разрушению эмбриональных клеток (Krause B.J. et al, 2011).

Васкулогенез происходит в эмбриональных органах, а также во внеэмбриональных тканях, таких как плацента, желточный мешок и аллантоис (Caprioli A, et al., 2001). Первые признаки плацентарного ангиогенеза наблюдаются на 3 неделе беременности. В первые недели беременности клетками цитотрофобласта интенсивно экспрессируется хорионический гонадотропин, оказывающий положительный эффект на ангиогенез и экспрессию эндотелиального фактора роста сосудов (Schumacher A. et al, 2009) и стимулирует дифференциацию трофобласта. Ангиогенез продолжается до срока созревания кровеносных сосудов и развития более сложной сосудистой сети для облегчения экспоненциального роста плода (Pereira R.D. et al., 2015). В ходе беременности наблюдается рост метаболических потребностей у плода, и, как следствие наблюдается увеличение активности митохондрий в клетках плаценты и активности митохондриальных ферментов. Это способствует повышению уровня активных форм кислорода (Myatt L. and Cui X., 2004) (рисунок 5).

Рисунок 5 - Плацентарный ангиогенез (Pereira R.D. et я1., 2015) 1 - миометрий, 2- децидуальная оболочка, 3 - спиральные артерии, 4 - клетки

трофобласта, 5 - ворсины

На 11 неделе беременности активность VEGF снижается, оставаясь стабильной до 34 недель беременности (Сидельникова В. М. и Сухих Г. Т., 2009; Su M-T. et al, 2011). Между 8 и 12 неделями беременности цитотрофобластические пробки, образованные эндоваскулярным цитотрофобластом, высвобождаются, способствуя перфузии клеток трофобласта материнской кровью (рисунок 5) (Wang Y. and Zhao S., 2010; Hung T-H. et al., 2010; Bassi R. et al., 2011). К концу первого триместра в плаценте выявляются максимальные значения TGFB, EGF, FGF и IGF, которые снижаются ко второму триместру (Крукиер И.И., 2003). Это совпадает с резким увеличением концентрации кислорода в тканях зародыша и плаценте. Примерно с 9-ой по 23 недели беременности происходит расширение капиллярного слоя плода путем ветвления (Wang Y. and Zhao S., 2010; Hung T-H. et al., 2010; Bassi R. et al., 2011), что характеризуется высокой экспрессией VEGF и умеренной PlGF (Ульянина Е.В. и Фаткуллин И.Ф., 2015).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мараховская Татьяна Алексеевна, 2022 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. ред. Акушерство: Национальное руководство. -М.: ГЭОТАР- Медиа; 2014 с.

2. Аксененко М.Б., Рукша Т.Г. Оценка взаимосвязи ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 и содержания коллагеновых волокон в различных органах // Сиб. мед.журн. - 2013. - № 2. - С. 56-58.

3. Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Стахеева М.Н., Волкоморов В.В., Уфандеев А.А., Слонимская Е.М. Роль трансформирующего ростового фактора ТОБ-р1 в патогенезе рака молочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - №6 (42). - С. 63-70.

4. Барков И.Ю. Совершенствование системы пренатального скрининга анеуплоидий плода внеклеточной крови ДНК материна основе анализа // Диссертация на соискание степени к.б.н. - 2018. - 151с.

5. Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Ли О.А. Матриксные металлопротеиназы в патогенезе острых и хронических заболеваний почек (Обзор литературы) // Нефрология и диализ. - 2008. - Т. 10. - № 2. 105 - 111.

6. Бурлев В.А., Павлович С.В. Ангиогенез и ангиогенные факторы роста в регуляции репродуктивной системы у женщин // Пробл репрод. -1999. - № 5. - С. 6-14.

7. Воронин Д.Н. Роль децидуальных естественных киллеров в регуляции инвазивных свойств трофобласта при неосложнённой беременности и самопроизвольном выкидыше на ранних сроках гестации: автореф. дис. канд. б. н. Москва, 2011. - 24 с.

8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика,1999.-459с.

9. Горбунова В.Н. Медицинская генетика. Учебник для студентов медицинских вузов и слушателей последипломного образования - СПб.: СПбГПМУ, 2015. — 357с.

10. Доброхотова Ю.Э. Актуальные вопросы невынашивания беременности. Сборник клинических лекций. М., 2007. - 96 с.

11. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991.— 270c.

12. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. — СПб: ООО «Издательство Фопиэиг», 2008. — 552 с.

13. Козырева Е.В., Давидян Л.Ю. Роль факторов роста в патогенезе бесплодия и невынашивания беременности // Современные проблемы науки и образования. -2015. - № 4. URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=20811 (дата обращения: 16.04.2015).

14. Кононенко И.С. Полиморфизмы генов трансформирующего ростового фактора ß1 и матриксной металлопротеиназы 9 как молекулярно-генетические предикторы формирования истмико-цервикальной недостаточности у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани // Вестник Витебского государственного медицинского университета - 2020. - Т. 19. - № 3. - С. 50-58.

15. Кореновский Ю.В., Ельчанинова С.А., Шабалина Ю.В. Матриксные металлопротеиназы и тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ при перинатальном поражении центральной нервной системы // Мать и дитя в Кузбассе. - 2012. - Т. 49. - №2. - С. 14- 17.

16. Крукиер И.И. Факторы роста в развивающейся плаценте Факторы роста в развивающейся плаценте // Известия высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Естественные науки. - 2003.- № 4. -С. 57-60.

17. Кудряшова А.В. Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развтия плода: автореф. дис. д-ра биол.наук. - Москва, 2006. - 48 с.

18. Лавряшина М.Б., Ульянова М.В., Балаганская О.А., Балаганский А.Г., Балановская Е.В. Генетический портрет десяти малых народов южной Сибири. Сообщение II. Гетерозиготность и подразделенность генофонда по данным об аутосомных ДНК-маркерах // Медицинская генетика. - 2010. - Т. 9 . - № 9,- С. 1623.

19. Маркелова Е.В., Здор В.В., Романчук А.Л., Бирко О.Н. Матриксные металлопротеиназы их взаимосвязь с системой цитокинов, диагностический и прогностический потенциал // Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2016. - №2. - С. 11-22.

20. Марченко Ж.С., Лукина Г.В. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста в патогенезе ревматоидного артрита // Научно-практическая ревматология. -2005. - №1. - С. 57 - 60.

21. Назаренко М.С., Боткина О.Ю., Пузырев В.П.. Полиморфные варианты гена эндотелиальной синтазы оксида азота и риск невынашивания беременности // Молекулярная медицина. - 2012. - №4. - С. 1-4.

22. Орлов А.В., Крукиер И. И., Друккер Н. А., Каушанская Л. В. Роль факторов роста в патогенезе неразвивающейся беременности // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2005. — № 3. — С. 4-6.

23. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеиназы: строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний // Мед образ. Сиб. - 2010. - № 5. - С. 52-58.

24. Пузырев В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим // Мед. генетика. -2003. -Т. 2. - №12. -С. 498-508.

25. Румянцев В.А., Жигулина В.В. Матриксные металлопротеиназы, их роль в развитии пародонтита // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

.-2014. -№8-1.-С. 321-327.

26. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Актуальные проблемы невынашивания. Руководство для практических врачей. -М.: Триада-Х; 2009. - 561 с.

27. Третьякова Т.Б., Башмакова Н.В., Демченко Н.С. Роль полиморфных вариантов гена сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF-А в формировании неразвивающейся беременности // Проблемы репродукции. - 2016. - Т. 22. - № 6. - С. 33-37. https://doi.org/10.17116/repro201622633-37

28. Ульянина Е.В., Фаткуллин И.Ф. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста в прогнозе сосудистых нарушений у беременных с синдромом задержки развития плода // Казанский медицинский журнал. - 2015. - Т. 96. - №2. - С. 220223.

29. Хашукоева А.З., Свитич О.А., Маркова Э.А., Хлынова С.А. Оценка цитокинового профиля (TNF-A, IFN-A, TGF-P1) при фотосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза в анамнезе // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т. 8 . - № 2 (17). - С. 167-176.

30. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Шурыгина И.А., Мачхин И.Н. Основные активаторы ангиогенеза и их применение в кардиологии // Бюллетень Восточно -сибирского научного центра сибирского отделения российской академии медицинских наук. - 2005. - №6. - С. 199 - 207.

31. Ярмолинская М.И., Молотков А.С., Денисова В.М. Матриксные металлопротеиназы и ингибиторы: классификация, механизм действия // Журнал акушерства и женских болезней. - 2012. - Т. LXI. - № \ . - С. 113-125.

32. 1000 Genomes Project Consortium, Abecasis G.R., Auton A., Brooks L.D., DePristo M.A., Durbin R.M., Handsaker R.E., Kang H.M., Marth G.T., McVean G.A. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes // Nature. - 2012. -Vol. 491. - P. 56-65.

33. Aggarwal S., Parveen F., Faridi R.M., Phadke S., Borkar M., Agrawal S. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms in North Indian patients with recurrent miscarriages // Reprod Biomed Online. - 2011. - Vol. 22. - № 1. - Р. 59-64. doi: 10.1016/j.rbmo.2010.08.005. - PMID: 21126911

34. Almawi W.Y., Saldanha F.L., Mahmood N.A., Al-Zaman I., Sater M.S., Mustafa F.E. Relationship between VEGFA polymorphisms and serum VEGF protein levels and recurrent spontaneous miscarriage // Hum Reprod. - 2013. - Vol. 28. - No. 10. - P. 26282635.

35. Amani D., Dehaghani A.S., Zolghadri J., Ravangard F., Niikawa N., Yoshiura K., Ghaderi A. Lack of association between the TGF-beta1 gene polymorphisms and recurrent spontaneous abortion // J Reprod Immunol. 2005. - Vol. 68. - No. 1-2. - P. 91103.

36. Anacker J., Segerer S.E., Hagemann C., Feix S., Kapp M., Bausch R., Kämmerer U. Human decidua and invasive trophoblasts are rich sources of nearly all human matrix metalloproteinases // Mol Hum Reprod. - 2011. -Vol. 17. - I. 10. - P. 637-652.

37. Banerjee P., Ghosh S., Dutta M. Identification of key contributory factors responsible for vascular dysfunction in idiopathic recurrent spontaneous miscarriage // PLoS One. - 2013. - Vol. 8. - No. 11. - P. e80940.

38. Basel-Vanagaite L., Davidov B., Friedman J., Yeshaya Y., Magal N., Drasinover V., Shohat M. Amniotic trisomy 11 mosaicism--is it a benign finding? // Prenat Diagn. -2006. - Vol. 26. - № 9. - P. 778-81. doi: 10.1002/pd.1501. PMID: 16810710

39. Bassi R., Kaur M., Sharma S. Study of changes in lipid profile, lipid peroxidation and superoxide dismutase during normal pregnancy // Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences. - 2011. - Vol. 1. - P. 249-254.

40. Behforouz A., Dastgheib S.A., Abbasi H., Karimi-Zarchi M., Javaheri A., Hadadan A., Tabatabaei R.S., Meibodi B., Neamatzadeh H.. Association of MMP-2, MMP-3, and MMP-9 Polymorphisms with Susceptibility to Recurrent Pregnancy Loss // Fetal Pediatr Pathol. - 2021. - Vol. 40. - № 5. - P. 378-386. doi:10.1080/15513815.2019.1710879. -PMID: 31955640.

41. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing // Journal of the Royal Statistical Society, Series B.

- 1995. - V. 57/ - № 1. -P. 289-300. MR 1325392.

42. Benson C.S., Babu S.D., Radhakrishna S., Selvamurugan N., Ravi Sankar B. Expression of matrix metalloproteinases in human breast cancer tissues// Dis Markers. -2013. - Vol. 34. - No. 6. - P. 395-405.

43. Bhupinder S.S. Matrix metalloproteinases - an overview // Research and Reports in Biology. - 2010. - V. 1. - P. 1-20.

44. Bigdeli R., Younesi M.R., Panahnejad E., Asgary V., Heidarzadeh S., Mazaheri H., Aligoudarzi S.L. Association between thrombophilia gene polymorphisms and recurrent pregnancy loss risk in the Iranian population // Syst Biol Reprod Med. - 2018.

- P. 1-9.

45. Blankenship T., Enders A. Trophoblast cell-mediated modifications to uterine spiral arteries during early gestation in the macaque // Acta Anatomica. - 1997. - V. 158.

- P. 227-236.

46. Bruner-Tran K.L., Osteen K.G., Duleba A.J. Simvastatin protects against the development of endometriosis in a nude mouse model // J Clin Endocrinol Metab. - 2009.

- Vol. 94. - No. 7. - P. 2489-94.

47. Buroker N.E. VEGFA rSNPs, transcriptional factor binding sites and human disease // J Physiol Sci. - 2014. - № 64. - P. 73-76. https://doi.org/10.1007/s12576-013-0293-4

48. Bush M.R., Mele J.M., Couchman G.M., Walmer D.K. Evidence of yuxtacrine signaling for transforming growth factor-a in human endometrium // Biol Reprod. - 1998.

- Vol. 59. - P. 1522-1529.

49. Caprioli A., Minko K., Drevon C., Eichmann A., Dieterlen-Lievre F., Jaffredo T. Hemangioblast commitment in the avian allantois: cellular and molecular aspects // Developmental Biology. - 2001. - Vol. - 238. - No 1. - P. 64-78.

50. Carmeliet P., Moons L., Luttun A., Vincenti V., Compernolle V., De Mol M., Wu Y., Bono F., Devy L., Beck H., Scholz D., Acker T., DiPalma T., Dewerchin M., Noel A., Stalmans I., Barra A., Blacher S., VandenDriessche T., Ponten A., Eriksson U., Plate K.H., Foidart J.M., Schaper W., Charnock-Jones D.S., Hicklin D.J., Herbert J.M., Collen D., Persico M.G. Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions // Nat Med. - 2001. - Vol. 7 - No. 5 - P. 575-583.

51. Chang H., Brown C.W., Matzuk M.M. Genetic Analysis of the Mammalian Transforming Growth Factor-P Superfamily // Endocrine Reviews. - 2002. - Vol. 23. -I. 6. - P. 787-823.

52. Chen L., Wang X., Carter S., Shen Y.H., Bartsch H.R., Thompson R.W., Coselli J.S., Wilcken D.L., Wang X.L., LeMaire S.A. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase 9 gene (-8202A/G) is associated with thoracic aortic aneurysms and thoracic aortic dissection // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2006. Vol. 131. - P. 10451052.

53. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. -1987. - Vol. 162. - P. 156-159.

54. Chung I., Yelian F., Zaher F., Gonik B., Evans M.I., Diamond M.P., Svinarich D.M. Expression and regulation of vascular endothelial growth factor in a first trimester trophoblast cell line // Placenta.- 2000.- Vol. 21.-P. 320-324.

55. Cuevas P., Carceller P. F., Ortega S., Zazo M., Nieto I., Giménez-Gallego G. Hypotensive activity of fibroblast growth factor // Science. - 1991. - Vol. 254. - P. 12081210.

56. Curry T.E. Jr., Osteen KG. The matrix metalloproteinase system: changes, regulation, and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle // Endocr Rev. - 2003. - Vol. 24. - P. 428-465.

57. Devi S.G., Kumar A., Kar P., Husain S.A., Sharma S. Association of pregnancy outcome with cytokine gene polymorphisms in HEV infection during pregnancy // J Med Virol. - 2014. - Vol. 86. - I. 8 - 2014. - P. 1366-1376.

58. Dubois B., Arnold B., Opdenakker G. Gelatinase B deficiency impairs reproduction // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - No. 5. - P. 627-8.

59. Eller A.G., Branch D.W., Nelson L., Porter T.F., Silver R.M. Vascular endothelial growth factor-A gene polymorphisms in women with recurrent pregnancy loss // J Reprod Immunol. - 2011. - Vol. 88. - № 1. - P. 48-52. doi: 10.1016/j.jri.2010.06.159. - PMID: 20977975.

60. European Society of Human Reproduction and Embryology, ART fact sheet, 18 February 2019.

61. Fagerberg L., Hallstrom B.M., Oksvold P., Kampf C., Djureinovic D., Odeberg J., Habuka M., Tahmasebpoor S., Danielsson A., Edlund K., Asplund A., Sjostedt E., Lundberg E., Szigyarto C.A., Skogs M., Takanen J.O., Berling H., Tegel H., Mulder J., Nilsson P., Schwenk J.M., Lindskog C., Danielsson F., Mardinoglu A., Sivertsson A., von Feilitzen K., Forsberg M., Zwahlen M., Olsson I., Navani S., Huss M., Nielsen J., Ponten F., Uhlén M. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide

integration of transcriptomics and antibody-based proteomics // Mol Cell Proteomics. -2014. - Vol. 13. - No 2. - P. 397-406. doi: 10.1074/mcp.M113.035600.

62. Fang X., Li H., Diao Y., Shan R., Dong J., Li H., Ma Q., Hou Y., Kong B., Cui J. Polymorphisms in the MTHRF, VDR, MMP-9 and IL-P genes and the risk of premature rupture of membranes // Gynecologic and Obstetric Investigation. - 2010. - Vol. 70. - No. 3. - P. 206-214.

63. Femández-Perea Y., García-Díaz L., Sánchez J., Antiñolo G., Borrego S. Ultrasound, Echocardiography, MRI, and Genetic Analysis of a Fetus with Congenital Diaphragmatic Hernia and Partial 11q Trisomy // Case reports in obstetrics and gynecology. - 2017. - 1471704. https://doi.org/10.1155/2017/1471704

64. Ferrand P.E., Parry S., Sammel M., Macones G.A., Kuivaniemi H., Romero R., Strauss J.F. 3rd. A polymorphism in the matrix metalloproteinase-9 promoter is associated with increased risk of preterm premature rupture of membranes in African Americans // Molecular Human Reproduction. - 2002. - Vol. 8. - No. 5. - P. 494-501.

65. Ferrara N., Carver-Moore K., Chen H., Dowd M., Lu L., O'Shea K.S., Powell-Braxton L., Hillan K.J., Moore M.W. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene // Nature. - 1996. - Vol. 380. - P. 439-442.

66. Ferrari G., Pintucci G., Seghezzi G., Hyman K., Galloway A.C., Mignatti P. VEGF, a prosurvival factor, acts in concert with TGF-beta1 to induce endothelial cell apoptosis // Proc Natl Acad Sci US A. - 2006. - Vol. - 103. - No 46. - P. 17260-5. doi: 10.1073/pnas.0605556103. PMID: 17088559.

67. Fong G.H., Rossant J., Gertsenstein M., Breitman M.L. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium // Nature. - 1995. -Vol. - 376. - No 6535. - P. 66-70.

68. Gallos C.I., Chu J., Bourne T., Quenby S., Brosens J.J., and Arri Co-omarasamy, Conventional and modern markers of endometrial receptivity: a systematic review and meta-analysis // Human Reproduction Update. - 2019. - P. 1-22.

69. Gellersen B., Reimann K., Samalecos A., Aupers S., Bamberger A.M. Invasiveness of human endometrial stromal cells is promoted by decidualization and by trophoblast-derived signals // Hum Reprod. - 2010. - Vol. 25. - I. 4. - P. 862-873.

70. Ghosh S., Basu M., Roy S.S. ETS-1 protein regulates vascular endothelial growth factor-induced matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-13 expression in human ovarian carcinoma cell line SKOV-3 // J Biol Chem. - 2012. - Vol. 287. - No. 18.

- P. 15001-15015.

71. Goyal R., Yellon S., Longo L., Mata-Greenwood E. Placental gene expression in a rat 'model' of placental insufficiency // Placenta. - 2010. - Vol. 31. - No. 7. - P. 568-575.

72. Grati F.R., Gallazzi G., Branca L., Maggi F., Simoni G., Yaron Y. An evidence-based scoring system for prioritizing mosaic aneuploid embryos following preimplantation genetic screening // Reprod Biomed Online. - 2018. - Vol. 36.- № 4. -P. 442-449. doi: 10.1016/j.rbmo.2018.01.005. - PMID: 29433970.

73. Grimberg J., Nawoschik S., Belluscio L., McKee R., Turck A., Eisenberg A. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood // Nucleic Acids Res. - 1989. - Vol. 17. - No. 20:8390.

74. Gross J., Lapiere C.M. Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1962. - Vol. 48. - P. 1014-1022.

75. Guo C., Cao X., Wang Q., Wang G., An L., Du M., Qiu Y., Yang Y., Li H., Wang Y., Wang S., Wang X., Ma X. Contribution of TIMP3 polymorphisms to the development of preeclampsia in Han Chinese women // J Assist Reprod Genet. - 2015. - Vol. 32. -No. 10. - P. 1525-1530.

76. Halder A., Fauzdar A. Skewed sex ratio & low aneup loidy in recurrent early missed abortion // Indian J. Med. Res. - 2006. -Vol. 124. - P. 41-50.

77. Hochstenbach R., Krijtenburg P.J., van der Veken L.T., van der Smagt J., Roeleveld-Versteegh A., Visser G., Terhal P. Monosomy 20 mosaicism revealed by extensive karyotyping in blood and skin cells: case report and review of the literature // Cytogenet Genome Res. 2014. - Vol. 144. - № 3. - P. 155-62. doi: 10.1159/000369606.

- PMID: 25502965.

78. Homer L.; Le Martelot M-T.; Morel F.; Amice V.; Kerlan V.; Collet M., De Braekeleer M. 45,X/46,XX mosaicism below 30% of aneuploidy: clinical implications in adult women from a reproductive medicine unit // European Journal of Endocrinology. 2010. - Vol. 162. - № 3. - P. 617-623. doi:10.1530/EJE-09-0750

79. Huisman M.A., Timmer A., Zeinstra M., Serlier E.K., Hanemaaijer R., Goor H., Erwich J. Matrix-metalloproteinase activity in first trimester placental bed biopsies in further complicated and uncomplicated pregnancies // Placenta. - 2004. - V. 25. - P. 253258.

80. Hung T-H., Lo L-M., Chiu T-H., Li M.J., Yeh Y.L., Chen S.F., Hsieh T.T. A Longitudinal study of oxidative stress and antioxidant status in women with uncomplicated pregnancies throughout gestation // Reproductive Sciences. - 2010. - Vol. 17. - No. 4. - P. 401-409.

81. Iarmolinskaia M.I., Molotkov A.S., Bezhenar V.F., Shved N.Iu., Ivashchenko T.E., Baranov V.S. Association of matrix metalloproteinases' polymorphisms of MMP3 and MMP9 with development of genital endometriosis // Genetika. - 2014. - Vol. 50. - No. 2. - P. 230-235.

82. Iyer R.P., Patterson N.L., Fields G.B., Lindsey M.L. The history of matrix metalloproteinases: milestones, myths, and misperceptions // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2012. - Vol. 303. - No. 8. - P. H919-30.

83. Jokimaa V., Oksjoki S., Kujari H., Vuorio E., Anttila L. Altered expression of genes involved in the production and degradation of endometrial extracellular matrix in patients with unexplained infertility and recurrent miscarriages // Molec. Human Reproduction. - 2002. - Vol. 8. - No. 12. - P. 1111-1116.

84. Jones R.L., Stoikos C., Findlay J.K., Salamonsen L.A. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta // Reproduction. -2006. - Vol. 132. - No. 2. - P. 217-32.

85. Joo J.G., Beke A., Toth-Pal E., Hargitai B., Szigeti Z., Papp C., Papp Z. Trisomy 20 mosaicism and nonmosaic trisomy 20: a report of 2 cases // J Reprod Med. - 2006. -Vol. 51. - № 3. - P. 209-12. PMID: 16674019.

86. Khalil M.S., El Nahas A.M., Blakemore A.I. Transforming growth factor-beta1 SNPs: genetic and phenotypic correlations in progressive kidney insufficiency// Nephron Exp. Nephrol. - 2005. - Vol. 101. - No. 2. - P. e31-41.

87. Khan F., Li W., Habelitz S. Biophysical characterization of synthetic amelogenin C-terminal peptides // Eur J Oral Sci. - 2012. - Vol. 120. - I. 2. - P. 113-122.

88. Kim S.Y., Lim J.H., Park S.Y., Yang J.H., Kim M.Y., Kim M.H., Ryu H.M. Transforming growth factor-beta 1 gene polymorphisms in Korean patients with pre-eclampsia // American Journal of Reproductive Immunology. - 2010. - Vol. 63. - I. 4. -P. 291-298.

89. Koippallil G.N.A.R., Pandit H., Warty N., Madan T. Endometriotic mesenchymal stem cells exhibit a distinct immune phenotype // Int Immunol. - 2015. - Vol. 27. - No. 4. - P. 195-204.

90. Koizumi M., Momoeda M., Hiroi H., Nakazawa F., Nakae H., Ohno T.,Yano T., Taketani Y. Inhibition of proteases involved in embryo implantation by cholesterol sulfate // Hum Reprod. - 2010. - Vol. 25. - I. - 1. - P. -192-197.

91. Krause B.J., Hanson M. A., Casanello P. Role of nitric oxide in placental vascular development and function // Placenta. - 2011. - Vol. 32. - No. 11. - P. 797-805.

92. Kumar S., Tinson A., Mulligan B.P., Ojha S. Gelatin Binding Proteins in Reproductive Physiology // Indian J Microbiol. - 2016. - Vol. 56. - No. 4. - P. 383-393.

93. Langer A.M.J., Verspaget H.W., Hommes D.W., Sie C.F.M. Single-nucleotide polymorphisms of matrix metalloproteinases and their inhibitors in gastrointestinal cancer // World J Gastrointest Oncol. - 2011. - Vol. 3. - I. 6. - P. 79-98.

94. Lee H.H., Hong S.H., Shin S.J., Ko J.J., Oh D., Kim N.K. Association study of vascular endothelial growth factor polymorphisms with the risk of recurrent spontaneous abortion. // Fertil Steril. - 2010. - Vol. 93. - № 4. - P. 1244-7. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.11.017. PMID: 19131057.

95. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor thirty-five years later // Science. -1987. - Vol. 237. - P. 1154-1162.

96. Li L., Donghong L., Shuguang W., Hongbo Z., Jing Z., Shengbin L. Polymorphisms in the vascular endothelial growth factor gene associated with recurrent spontaneous miscarriage // The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. - 2012. - Vol. 26. - №7. - P. 686-690. doi:10.3109/14767058.2012.746305

97. Li X., Shen L., Tan H. Polymorphisms and plasma level of transforming growth factor-Beta 1 and risk for preeclampsia: a systematic review. PLoS One 9. - 2014. - Vol. 9. - No. 5: e97230.

98. Lian I.A., Toft J.H., Olsen G.D., Langaas M., Bj0rge L., Eide I.P., B0rdahl P.E., Austgulen R. Matrix metalloproteinase 1 in pre-eclampsia and fetal growth restriction: reduced gene expression in decidual tissue and protein expression in extravillous trophoblasts // Placenta. - 2010. - Vol. 31. - P. 615-620.

99. Linsingen R., Bompeixe E.P., da Graca Bicalho M. A Case-Control Study in IL6 and TGFB1 Gene Polymorphisms and Recurrent Spontaneous Abortion in Southern Brazilian Patients // Am J of Reproductive Immunology. - 2005. - Vol. 53. - No. 2. - P. 94-9.

100. Liu J.L., Yakar S., LeRoith D. Conditional knockout of mouse insulin-like growth factor-1 gene using the Cre/loxP system // Proc Soc Exp Biol Med. -2000. - Vol. 223. -No. 4. - P. 344-51.

101. Livak K., Schmittgen T. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2-AACT Method // METHODS. - 2001. Vol. 25. - P. 402408.

102. Lockwood C.J., Basar M., Kayisli U.A, Guzeloglu-Kayisli O., Murk W., Wang J., De Paz N., Shapiro J.P., Masch R.J., Semerci N., Huang S.J., Schatz F. Interferon-y protects first-trimester decidual cells against aberrant matrix metalloproteinases 1, 3, and 9 expression in preeclampsia // Am J Pathol. -2014. - Vol. 184. - No. 9. - P. 2549-2559.

103. Lose F., Thompson P., Duffy D., Stewart G.A., Kedda M.A. A novel tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) polymorphism associated with asthma in Australian women // Thorax. -2005. - Vol. 60. - P. 623-628.

104. Luizon M.R., Sandrim V.C., Palei A.C., Lacchini R., Cavalli R.C., Duarte G., Tanus-Santos J.E. Epistasis among eNOS, MMP-9 and VEGF maternal genotypes in hypertensive disorders of pregnancy // Hypertens Res. - 2012. Vol. -35. - I. 9. - P. - 917921.

105. Maatta M., Soini Y., Liakka A., Autio-Harmainen H. Localization of MT1-MMP, TIMP-1, TIMP-2, and TIMP-3 messenger RNA in normal, hyperplastic, and neoplastic endometrium. Enhanced expression by endometrial adenocarcinomas is associated with low differentiation // Am J Clin Pathol. - 2000. - Vol. 114. - I. 3. - P. 402-411.

106. Macklon N.S., Geraedts J.P., Fauser B.C. Conception to ongoing pregnancy: the 'black box' of early pregnancy loss // Hum Reprod Update. - 2002. - № 4. - P. 333-43. doi: 10.1093/humupd/8.4.333. PMID: 12206468.

107. Magdoud K., Dendana M., Herbepin V., Hizem S., Ben Jazia K., Messaoudi S., Almawi W.Y., Touraine R., Mahjoub T. Identification of specific vascular endothelial growth factor susceptible and protective haplotypes associated with recurrent spontaneous miscarriages // Hum Reprod. - 2012. - Vol. 27. - № 5. - P. 1536-41. doi: 10.1093/humrep/des033. PMID: 22402207.

108. Magdoud K., Granados Herbepin V., Messaoudi S., Hizem S., Bouafia N., Almawi W.Y., Mahjoub T., Touraine R. Genetic variation in TGFB1 gene and risk of idiopathic recurrent pregnancy loss // Mol Hum Reprod. - 2013. - Vol. 19. - No. 7. - P. 438-43.

109. Marhemati F., Rezaei R., Mohseni Meybodi A., Taheripanah R., Mostafaei S., Amani D. Transforming growth factor beta 1 (TGFß1) polymorphisms and unexplained infertility: A genetic association study // Syst Biol Reprod Med. - 2020. - Vol. - 66. - № 4. - P. 267-280. doi: 10.1080/19396368.2020.1773575. - PMID: 32735465.

110. Mazzocca A., Fransvea E., Lavezzari G., Antonaci S., Giannelli G. Inhibition of transforming growth factor beta receptor I kinase blocks hepatocellular carcinoma growth through neo-angiogenesis regulation // Hepatology. -2009. - Vol. 50. -No 4. - P. 114051.

111. Mogami H., Keller P.W., Shi H., Word R.A. Effect of Thrombin on Human Amnion Mesenchymal Cells, Mouse Fetal Membranes, and Preterm Birth // The journal of biological chemistry. - 2014. - Vol. 289. - No. 19. - P. 13295-13307.

112. Moher D., Liberati A., Tetzlaff J., Altman D.G., The PRISMA Group. Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses: The PRISMA Statement // PLoS Med. - 2009. - Vol. 6. - № 7. - e1000097. doi:10.1371/journal.pmed1000097

113. Motsinger A.A., Lee S., Mellick G., Ritchie M.D. GPNN: Power studies and application sofa neural network method for detecting gene-gene interactions in studies of human disease // BMC Bioinformatics. - 2006. - Vol.7. - No. 39. - P. 1471-2105.

114. Müller A., Wagner J., Hodzic A., Maver A., Skrlec I., Heffer M., Zibar L., Peterlin B. Genetic variation in leptin and leptin receptor genes is a risk factor for idiopathic recurrent spontaneous abortion // Croat Med J. - 2016. - Vol. 57. - No. 6. - P. 566-571.

115. Myatt L., Cui X. Oxidative stress in the placenta // Histochemistry and Cell Biology. - 2004. - Vol. 122. - No. 4. - P. 369-382.

116. Naruse K., Lash G.E., Innes B.A., Otun H.A., Searle R.F., Robson S.C., Bulmer J.N. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2, MMP-9 and tissue inhibitors for MMPs (TIMPs) in uterine natural killer cells in early human pregnancy // Hum Reprod. - 2009. - Vol. 24. - No. 3. - P. 553-561.

117. Nikolova P.N., Ivanova M.I., Mihailova S.M., Myhailova A.P., Baltadjieva D.N., Simeonov P.L., Paskalev E.K., Naumova E.J. Cytokine gene polymorphism in kidney transplantation--impact of TGF-beta 1, TNF-alpha and IL-6 on graft outcome // Transpl Immunol. - 2008. - Vol. 18. - No. 4. - P. 344-348.

118. Nonaka T., Takakuwa K., Tanaka K. Analysis of the polymorphisms of genes coding biotransformation enzymes in recurrent miscarriage in the Japanese population // Send to J Obstet Gynaecol Res. - 2011. - Vol. 37. - No. 10. - P. 1352-1358.

119. Onogi A., Naruse K., Sado T., Tsunemi T., Shigetomi H., Noguchi T., Yamada Y., Akasaki M., Oi H., Kobayashi H. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy // Placenta. - 2011. - Vol. 32. - P. 665-670.

120. Palei A.C., Sandrim V.C., Amaral L.M., Machado J.S.R., Cavalli R.C., Lacchini R., Duarte G., Tanus-Santos J.E. Matrix metalloproteinase-9 polymorphisms affect plasma MMP-9 levels and antihypertensive therapy responsiveness in hypertensive disorders of pregnancy // The Pharmacogenomics Journal. - 2012. - Vol. 12. - P. 489498.

121. Palei A.C., Sandrim V.C., Duarte G., Cavalli R.C., Gerlach R.F., Tanus-Santos J.E. Matrix metalloproteinase MMP-9 genotypes and haplotypes in preeclampsia and gestational hypertension // Clin Chim Acta. - 2010. - Vol. -411. - I. 11-12. - P. 874-877.

122. Palmer S.S., Altan M., Denis D., Tos E.G., Gotteland J.P., Osteen K.G., Bruner-Tran K.L., Nataraja S.G. Bentamapimod (JNK Inhibitor AS602801) Induces Regression

of Endometriotic Lesions in Animal Models // Reprod Sci. - 2016. - Vol. 23. - No. 1. -P. 11-23.

123. Papazoglou D., Galazios G., Papatheodorou K., Liberis V., Papanas N., Maltezos E., Maroulis G.B. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and idiopathic recurrent pregnancy loss // Fertil. Steril. —2005. — Vol. 83, N 4. — P. 959-963.

124. Pereira R.D., De Long N.E., Wang R.C., Yazdi F.T., Holloway A.C., Raha S. Angiogenesis in the Placenta: The Role of Reactive Oxygen Species Signaling // BioMed Research International. - 2015. - Vol. 2015: 814543.

125. Pereza N., Ostojic S., Volk M., Kapovic M., Peterlin B. Matrix metalloproteinases 1, 2, 3 and 9 functional single-nucleotide polymorphisms in idiopathic recurrent spontaneous abortion // Reproductive BioMedicine Online. - 2013- Vol. 24. - № 5. - P. 567-575. doi:10.1016/j.rbmo.2012.01.008

126. Pereza N., Plesa I., Peterlin A., Jan Z., Tul N., Kapovic M., Ostojic S., Peterlin B. Functional polymorphisms of matrix metalloproteinases 1 and 9 genes in women with spontaneouspreterm birth // Dis Markers. - 2014. - Vol. 2014: 171036.

127. Pilka R., Noskova V., Domanski H., Andersson C., Hansson S., Casslen B. Endometrial TIMP-4 mRNA is expressed in the stroma, while TIMP-4 protein accumulates in the epithelium and is released to the uterine fluid // Mol Hum Reprod. -2006. - Vol. 12. - I. 8. - P. 497-503.

128. Poniatowski L.A., Wojdasiewicz P., Gasik R., Szukiewicz D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications // Mediators Inflamm. - 2015. - Vol. 2015:137823.

129. Qorri M., Oei P., Dockery H., McGaughran J. A rare case of a de novo dup(19q) associated with a mild phenotype // Journal of medical genetics. - 2002 - Vol. 39. - № 10. - E61. https://doi.org/10.1136/jmg.39.10.e61

130. Rahimi Z., Abdan Z., Rahimi Z., Razazian N., Shiri H., Vaisi-Raygani A., Shakiba E., Vessal M., Moradi M.T. Functional Promoter Polymorphisms of MMP-2 C-735T and MMP-9 C-1562T and Their Synergism with MMP-7 A-181G in Multiple Sclerosis // Immunol Invest. - 2016. - Vol. 45. - No. 6. - P. 543-552.

131. Rao S., Lang, R.A. Formation and Regression of the Primary Vitreous and Hyaloid Vascular System // Encyclopedia of the Eye. - 2010. - P. 151-156. doi:10.1016/b978-0-12-374203-2.00259-1

132. Rethoré M.O., Debray P., Guesne M.C., Amédée-Manesme O., Iris L., Lejeune J. Sur un cas de trisomie 19 en mosaïque (A case of trisomy 19 mosaicism (author's transl)) // Ann Genet. - 1981. - Vol. 24. - № 1. - P. 34-6. PMID: 6971615

133. Reute J.S., Mathews D.H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis // BMC Bioinformatics. - 2010. - Vol. 11. - №129. https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-129

134. Rosenfeld R.G. Insulin-like growth factors and the basis of growth // New Eng. J. Med. - 2003. - Vol. 349. - P. 2184-2186.

135. Rudolph-Owen L.A., Hulboy D.L., Wilson C.L., Mudgett J., Matrisian L.M. Coordinate expression of matrix metalloproteinase family members in the uterus of normal, matrilysin-deficient, and stromelysin-1-deficient mice // Endocrinology. - 1997. - Vol. 138. - P. 4902-4911.

136. Sabatini L., Torricelli M., Scaccia V., Fineschi D., Pescaglini M., Gasparri L., Florio P., Petraglia F. Increased Plasma Concentrations of Antiprothrombin Antibodies in Women with Recurrent Spontaneous Abortions // Clinical Chemistry. - 2007. - Vol. 53. - No. 2. - P. 228-232.

137. Sajjadi M.S., Ghandil P., Shahbazian N., Saberi A. Association of vascular endothelial growth factor A polymorphisms and aberrant expression of connexin 43 and VEGFA with idiopathic recurrent spontaneous miscarriage // J Obstet Gynaecol Res. -2020. - Vol. 46. - №3. - P. 369-375. doi: 10.1111/jog.14192. - PMID: 32003128.

138. Samli H., Demir B.Ç., Ozgoz A., Atalay M.A., Uncu G. Vascular endothelial growth factor gene 1154 G/A, 2578 C/A, 460 C/T, 936 C/T polymorphisms and association with recurrent pregnancy losses // Genet Mol Res. - 2012. - Vol. 11. - № 4. P. - 4739-45. doi: 10.4238/2012. - PMID: 23315815.

139. Sbardella D., Fasciglione G. F., Gioia M., Ciaccio C., Tundo G. R., Marini S., Coletta M. Human matrix metalloproteinases: An ubiquitarian class of enzymes involved

in several pathological processes // Molecular Aspects of Medicine. - 2012. - Vol. 33. -P. 119-208.

140. Schumacher A., Brachwitz N., Sohr S., Engeland K., Langwisch S., Dolaptchieva M., Alexander T., Taran A., Malfertheiner S.F., Costa S., Zimmermann G., Nitschke C., Volk H., Alexander H., Gunzer M., Zenclussen A.C.. Human Chorionic Gonadotropin Attracts Regulatory T Cells into the Fetal-Maternal Interface during Early Human Pregnancy // Journal of Immunology. - 2009. - No. 182. - P. 5488-5497.

141. Shahbazi M.N., Wang, T., Tao, X., Weatherbee, B., Sun, L., Zhan, Y., Keller, L., Smith, G. D., Pellicer, A., Scott, R. T., Jr, Seli, E., & Zernicka-Goetz, M. Developmental potential of aneuploid human embryos cultured beyond implantation // Nature communications. - 2020. - Vol. 11. - № 1. - P. 3987. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17764-7

142. Singh K., Nair R.R., Khanna A. Functional SNP -1562C/T in the promoter region of MMP9 and recurrent early pregnancy loss // Reprod Biomed Online. - 2012. - Vol. -24. - I. 1. - P. 61-65.

143. Singh M., Orazulike N. C., Ashmore J., Konje J. C. Changes in maternal serum transforming growth factor beta-1 during pregnancy: a cross-sectional study // BioMed Research International. - 2013. - Vol. 2013: 318464.

144. Sokalska A., Cress A., Bruner-Tran K.L., Osteen K.G., Taylor H.S., Ortega I., Duleba A.J. Simvastatin decreases invasiveness of human endometrial stromal cells // Biol Reprod. - 2012. - Vol. 87. - No. 1:2. - P. 1-6.

145. Song G., Yan J., Zhang Q., Li G., Chen Z.J. Association of tissue inhibitor of metalloproteinase gene polymorphisms and unexplained recurrent spontaneous abortions in Han Chinese couples // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2014. - Vol. 181. - P. 8488.

146. Sri Manjari K., Nallari P., Balakrishna N., Vidyasagar A., Prabhakar B., Jyothy A., Venkateshwari A. Influence of matrix metalloproteinase-1 gene -1607 (1G/2G) (rs1799750) promoter polymorphism on circulating levels of MMP-1 in chronic pancreatitis // Biochem Genet. - 2013. - Vol. 51. - No. 7-8. - P. 644-654.

147. Steffensen K.D., Waldstrom M., Brandslund I., Jakobsen A. The relationship of VEGF polymorphisms with serum VEGF levels and progression-free survival in patients with epithelial ovarian cancer // Gynecol. Oncol. - 2010. - № 117. - P. 109-116. doi: 10.1016/j.ygyno.2009.11.011.

148. Su M-T., Lin S-H., Chen Y-C. Genetic association studies of angiogenesis- and vasoconstriction- related genes in women with recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis // Human Reproduction Update. - 2011. - Vol.17. - No. 6. - P. 803-812.

149. Sun Y., Chen M., Mao B., Cheng X., Zhang X., Xu C. Association between vascular endothelial growth factor polymorphism and recurrent pregnancy loss: A systematic review and meta-analysis // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2017. - Vol. 211. - P. 169-176.

150. Sundtoft I., Uldbjerg N., Steffensen R., Sommer S.,-Christiansen O.B. Polymorphisms in Genes Coding for Cytokines, Mannose-Binding Lectin, Collagen Metabolism and Thrombophilia in Women with Cervical Insufficiency // Gynecol Obstet Invest. - 2016. - Vol. 81. - P. 15-22.

151. Tartaglia N.R., Howell S., Sutherland A., Wilson R., Wilson L. A review oftrisomy X (47,XXX) // Orphanet J Rare Dis. - 2010. — Vol. 5. — P. 8. — doi:10.1186/1750-1172-5-8. — PMID 20459843

152. Thomas B.J., Kan-O K., Loveland K.L., Elias J.A., Bardin P.G. In the Shadow of Fibrosis: Innate Immune Suppression Mediated by Transforming Growth Factor-P // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2016. - Vol. 55. - No. 6. - P. 759-766.

153. Traina E., Daher S., Moron A.F., Sun S.Y., Franchim C.S., Mattar R. Polymorphisms in VEGF, progesterone receptor and IL-1 receptor genes in women with recurrent spontaneous abortion // J Reprod Immunol. - 2011. - Vol. 88. - №2 1. - P. 53-7. doi: 10.1016/j.jri.2010.07.006. - PMID: 20956022.

154. Turpeenniemi-Hujanen T., Feinberg R.F., Kauppila A., Puistola U. Extracellular matrix interactions in early human embryos: implications for normal implantation events // Fertil. Steril. -1995. - Vol. 64. - P. 132-138.

155. Vidyadhari M., Sujatha M., Krupa P., Nallari P., Venkateshwari A. Association of genetic polymorphism of vascular endothelial growth factor in the etiology of recurrent pregnancy loss: a triad study // J Assist Reprod Genet. - 2019. - Vol. 36. - № 5. - P. 979988. doi: 10.1007/s10815-019-01431-y. - PMID: 30877601 - PMCID: PMC6541718.

156. Wang A., Leong D.J., He Z., Xu L., Liu L., Kim S.J., Hirsh D.M., Hardin J.A., Cobelli N.J., Sun H.B. Procyanidins Mitigate Osteoarthritis Pathogenesis by, at Least in Part, Suppressing Vascular Endothelial Growth Factor Signaling // Int J Mol Sci. - 2016. - Vol. 17. - No. 12: pii: E2065.

157. Wang Y., Zhao S. Vasculogenesis and angiogenesis of human placenta // Vascular Biology of the Placenta. -Morgan and Claypool Life Sciences, San Rafael, Calif, USA, -2010, - pp. 31-35.

158. Watson C.J., Webb N.J., Bottomley M.J., Brenchley P.E. Identification of polymorphisms within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production // Cytokine. -2000. - Vol. 12. - No. 8. - P. 1232-1235.

159. Wegner R.D., Entezami M., Knoll U., Horn D., Sohl S., Becker R. Prenatal diagnosis of fetal trisomy 6 mosaicism and phenotype of the affected newborn // Am J Med Genet A. - 2004. - Vol. - 124A. - № 1. - P. 85-8. doi: 10.1002/ajmg.a.20407. PMID: 14679592.

160. Xin L., Xu B, Ma L, Hou Q, Ye M, Meng S, Ding X, Ge W. Proteomics study reveals that the dysregulation of focal adhesion and ribosome contribute to earlypregnancy loss // Proteomics Clin Appl. - 2016. - Vol. 10. - No. 5. - P. 554-563.

161. Yalcintepe S.A., Silan F., Hacivelioglu S.O., Uludag A., Cosar E., Özdemir O. Fetal Vegf Genotype is More Important for Abortion Risk than Mother Genotype // Int J Mol Cell Med. - 2014. - Vol. 3. - No. 2. - P. 88-94.

162. Yang H., Liu J., Fan Y., Guo Q., Ge L., Yu N., Zheng X., Dou Y., Zheng S. Associations between various possible promoter polymorphisms of MMPs genes and endometriosisrisk: a meta-analysis // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2016. - Vol. 205. - P. 174-188.

163. Yang X., Sun Z., Ma R., Fan D., Moradian-Oldak J. Amelogenin "nanorods" formation during proteolysis by Mmp-20 // J Struct Biol. - 2011. - Vol. 176. - I. 2. - P. 220-228.

164. Ye H., He Y., Wang J., Song T., Lan Z., Zhao Y., Xi M. Effect of matrix metalloproteinase promoter polymorphisms on endometriosis and adenomyosis risk: evidence from a meta-analysis // J Genet. - 2016. - Vol. 95. - No. 3. - P. 611-619.

165. Young R.J., Möller A. Immunohistochemical Detection of Tumour Hypoxia // Histology Protocols. - 2009. - Vol. 611. - P. 151-159.

166. Yue J., Mulder K.M. Transforming growth factor-^ signal transduction in epithelial cells // Pharmacology and Therapeutics. 2001. - Vol. 91. - No. 1. - P. 1-34.

167. Zhang J., Cao Y.J., Zhao Y.G., Sang Q.X., Duan E.K. Expression of matrix metalloproteinase-26 and tissue inhibitor of metalloproteinase-4 in human normal cytotrophoblast cells and a choriocarcinoma cell line, JEG-3 // Mol Hum Reprod. - 2002. - Vol. 8. - I. 7. - P. 659-666.

168. Zhang X., Wang, Y., Zhao, N., Liu, P., & Huang, J. Variations in chromosomal aneuploidy rates in IVF blastocysts and early spontaneous abortion chorionic villi // Journal of assisted reproduction and genetics. - 2020. - Vol. 37. - № 3. - P. 527-537. https://doi.org/10.1007/s10815-019-01682-9

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 АНКЕТА

Дата забора материапа

ФИО пациента

Дата рождения Пол Тел:

Национальность

Место проживания

Место рождения

Соматический анамнез (при наличии заболевания, указать)

Сердечно-сосудистая система

Соединительной ткани (в т.ч. указывать наличие астенического типа телосложения, гиперрастяжнмости кожи: гнперподвижностн суставов, умение «шевелить ушами» и др.)

Мочевыделительная система

Пищеварительная система

Эндокринная система

Ожирение

Другие

Вирусные инфекции в период беременности

Гинекологический анамнез

Настоящая беременность (указать номер)

Срок беременности Количество плодов

Вес Рост см Давление

Осложнения беременности (указать при наличии)

Гинекологические заболевания (указать при наличии)

Кол-во родов в анамнезе из них закончились:

живорождением ыертворождениеы

(антенатальная смерт-тъ или интранатальная смерт-ть)

НуЗБМ шздтершугь

Ранняя неонагальная гибель

Срок Причина

Анамнез новорожденного

Врожденные пороки развития

ВУИ

Соматическая патология

Наследственные заболевания

Кол-во абортов в анамнезе Из них:

медицинский аборт

спонтанный аборт Причина

замершая беременность Причина

Условные обозначения для кодировки проб Ьиоыатернала:

1 - женщины с первой оерем-ю

2 - женщины повторно береы-е: во не рожавшие

3-женщины повторно берем-е= но 1-ая беременность закончилась родами_

МА-медищшский аборт НБ -неразвивающаяся беременность

С А - самопроизвольный аборт

Э- эмбрион Ф - хорнон П - эндометрий К - кровь матера

Сведения о родственниках (нужное подчеркнуть)

Материнская линия Отцовская линия

Сердечно-сосудистые заболевания

мать бабушка дед ДР родственники* отец бабушка дед ДР родственники*

¡аболевания эндокринной системы

мать бабушка дед ДР родственники* отец баоушка дед ДР- родственники*

Заболевания репродуктивной системы

мать бабушка дед ДР родственники* отец бабушка дед ДР родственники*

Заболевания соединительной ткани (в т.ч. указывать наличие астенического типа телосложения, гнперрастяжиыосги кожи: гиперподвижности суставов, умение «шевелить ушами» и др.)

мать бабушка дед ДР родственники* отец баоушка дед ДР- родственники*

Заболевания мочевыделнтельной системы

мать бабушка дед ДР родственники* отец бабушка дед ДР родственники*

указать степень родства

ИНФОРМИРОВАННОЕ СОГЛАСИЕ

Я информировав/а, что Научно-псследовательскпп институт биологии Южного федерального университета совместно с Ростовским медицинским университетом проводит обследование населения. Основная задача комплексного обследования - отобрать геномные п постгеномньте маркеры, характеризующие генетическую предрасположенность к нарушению репродуктивных функшш п разработать новую технологию, позволяквдую оценить основные этапы развили и состояние фетоплацентарного комплекса.

Для этого мне предложили сдать образцы биологического материала для дальнейшего биохимического п генетического анализа, а также ответить на ряд вопросов обо мне и моих родственниках. Вся полученная информация будет храниться конфиденциально. Но при желании я могу получить бесплатно результаты обследования. Результаты исследования могут войти в общую медгжо-генетпческую документацию, но мое имя (и имя моих родственников) использоваться не будет. Я понимаю, что участие в данном обследовашш добровольное.

Я прочитал/а этот документ и даю свое согласие на участие в обследовании.

Дата_Подпись_Ф.И.О._

Т ел ефон_

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Подготовка к проведение реакции ОТ

1. Пробирки с Реакционной смгсыс, праймерамн и водой разморозить при комнатной температуре. Пробирку с ММ1Л'-Р1Т и ингибитором РНКаа поместить в лед.

2. Взять необходимое количество пробирок из расчета N+1, где К- количество исследуемых образцов Маркировать пробирки в соответствии с протоколом исследования.

3. В пробирках смецгатъ по 1 гасл праймера, н 1-2 мк[ тотальной РНК. Добавить НгО до обьема 13 икл для выбранного объема реакционной смеси 15 мял.

Примечание. Выбор праймера зависит о~ задач исследования. Праймер Олиго((1Т)15 комплементарен поли(А)-коицу зрелых м-РПК. Он используется для обратной транскрипции при создании библиотек ж ДНК или для лучшего изучения 3'-конца исследуемой РНК. Праймер Ка1к)оп-б более универсален и пригоден для исследования РНК по всей длине. Последовательность К.апс!ит-5 неспецифичсски связывается с РНК, позволяя ьараоатывать большое количество коротких перекрывающихся х-ДНК Использование этого праймера увеличивает количество продукта реакции ОГ, но необходимо учитывать, что увеличение концентрации самого праймера относительно РНК может привести к неимущественному синтезу коротких продуктов, а уменьшение наоборот способствовать синтезу более длинных к-ДНК. Лучше всего использовать в качестве праймера для ОТ специфичный автисенс праймер. например обратный, используемый для ПЦР или специальный, разработанный для реакции ОТ. При использовании антисенс праймера необходимо проводить термическую денатурацию РНК н отжиг праймеров при температуре 65- ^ 70°С в течение 5 мин. Затем немедленно охладите пробирки во льду. Температура денатурация зависит от ОС-состава и количества вторичных структур исходной матрицы. Если в реакции используются вырожденные гексапраймеры, то перед основной инкубацией рекомендуется ироьести 10-минутную инкубацию при 25°С.

4. Добавить остальные компоненты, необходимые для проведения реакции обратной транскрипции иэ расчета:

:,5.\ Реакционная смесь...................10 мкл

ММЬУ-ЯТ..................................... I пкл

Ингибитор РНКаз—..................I мкл

Смесь перемешать и центрифугировать краткосрочным центрифугированием для осаждения жидкое™ с крышек и стенок пробирок

В одной пробирке следует приготовить отрицательный контроль реакции обратной транскрипции и убедится в. том, что исходная РНК не содержит примесей ДНК. Для этого в контрольную пробирку не добавляют \1MLV-RT.

Проведение реакции ОТ

5. Поставьте пробирки в амплификатор или термостат и инкубируйте при

температуре 37-45°С от 15 минут до 1 часа. Примечание: Длительность реакции зависит от длины фрагментов, получаемых в реакции обратной транскрипции. Температура реакции зависит от СгС-состава исходной матрицы.

7. Нагрейте пробирки до 92°С для инактивации ММЬУ-ЯТ, инкубируйте 3-5 мин.

8. Полученую к-ДНК можно сразу использовать в реакции ПЦР в количестве 1-10 мкл или храиить при -20°С, атак же при -70°С более длительное время.

Примечаниег 2,5Х Реакционная смесь полностью совместима с Тач-ДНК-полимер азой и может быть использована для совмещенной реакции ОТ-ПЦР.

э

Н

и о

й и

В

и

Ul

г. Москва, ул. Тимирязевская, д.42, к. 352 Тел/факс: [phone] Тел.: [phone] e-mail: syntol@iab ac.ru www.syntol.ru

ПАМЯТКА ПО ПРИМЕНЕНИЮ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ НАБОРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ПЦР «ЭИР-ЭКСПРЕСС» С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ЭЛЕКРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ПРОДУКТОВ

ПРИНЦИП МЕТОДА

Система «БИР-экспресс» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека.

Анализу подвергается геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитор цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь».

С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации - с ^умя парами аллель-специфичных праймеров. Результаты анализа позволяют дать три типа заключений гетерозиса: гомозигрта ПО 8ПЛ8ЛИI

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ

1. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл) в соответствии с количеством анализируемых проб с учетом положительных (при наличии) и отрицательных контролен. Для каждой пробы готовятся 2 пробирки: аллель 1 и аллель 2.

2. За 20-30 минут до приготовления рабочей амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР из морозильника, разморозить содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавитепя тщательно перемешать. Перемешивание разбавителя происходит при переворачивании пробирки (пузырём воздуха). Перемешивание реакционной смеси проводят вортексированием.

3. Из компонентов комплекта приготовить рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси,

0,2 мкл Тац-лолимеразы (вносится в последнюю очередь, перед внесением смесь рекомендуется перемешать)

Готовятся 2 рабочие смеси: с реакционной смесью аллель 1 и с реакционной смесью аллель 2. При приготовлении рабочей амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами (фильтрами). Такие же наконечники необходимо использовать и для внесения в пробирки препарата ДНК.

4. После добавления Taq-пoлимepaзы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пилотированием.

5. Добавить по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации

6. Добавить во все пробирки по 1 калле (около 25 мкл) минерального масла.

7. Внести по 5 мкп образца из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 1 и в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 2 под слой масла. В качестве отрицательного контрольного образца вносится разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси.

8. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин при комнатной температуре на микроцентрифуге-вортексе.

9. Перенести пробирки в прогретый до температуры +944; (установившаяся температура в режиме Пауза) программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующей программе: _____________

Стандартная программа амппифшации Программа амплификации для наборов кат. № 01350, 01351 и 01297

Т,С время циклов Т,С° время цшлов

94° Pause 94" Pause

93° 1 МИН 1 94° 1 МИН 1

93° 10 сек 94" 10 сек

64° 10 сек 35 68« 30 сек 35

72° 20 сек 72° 20 сек

72" 1 МИН 1 72" 1 мин 1

10° Storage 10° Storage

Для яиплификаторов тила «Терцик» следует выбрать алгоритм регулирования «точный», объем реакционной смеси 40 мкл.

ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Разделение продуктоо амплификации проводится в 3% агармном геле, приготовленной на ТАЕ буфере, методом горизонтального электрофореза, Для визуализации результатов электрофореза а качестве красителя вносится 1% раствор бромистого этидия из расчета 5 мкл на 50 мл расплавленного геля.

Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных логос под УФ излучением с длиной волны 310 нм.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

При интерпретации результатов важно помнить о невозможности появления в данных анализах слабоположительных гроб. Все полосы на электрофорезе должны быть четкими и примерно одинаковой интенсивности (допускаются небольшие различия в яркости как между тестами на норму и мутацию, так и от пробы к гробе).

Реакционная смесь Аллель 1 Реакционная смесь Аллель 2 Интерпретация результата

- гомозигота по аллели 1

+ + гетерозигота

- + гомозигота по аллели 2

Полное руководство го применению диагностически* наборов для выявления полиморфизмов в геноме человека методом ПЦР «SNP-ЭКСПРЕСС» находится на сайте www.lytech.ru в разделе «Методическая информация». По всем вопросам обращайтесь в офис компании ООО НПФ «Литяк»: телефон [phone], e-mail: ¡[e-mail]

NP-454-100 CFX-96

Набор реагентов для определения полиморфизма С2578А гена VEGFA (vascular endothelial growth factor А) (rs699947)

Подготовка к проведению реакции

Реактивы для амплификации ДНК поставляются в виде компонентов (2.5х реакционная смесь, 2.5 х разбавитель и Taq-полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеме непосредственно перед проведением исследования. 1. Рассчитать необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4 (три положительных контрольных и

один отрицательный контрольный образец).

№ Наименование Объем на реакцию, мкл

1 2.5х Реакционная смесь 10

2 2.5 х Разбавитель 10

3 Taq ДНК-полимераза, 5 ЕУмкл 0,5

2. Разморозить компоненты, перемешать и центрифугировать.

3. Приготовить смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанном в таблице, перемешать и центрифугировать.

4. Маркировать ПЦР пробирки в соответствии с протоколом исследования.

5. Внести в ПЦР пробирки по 20 мкл смеси компонентов.

6. В каждую ПЦР пробирку внести по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, плотно закрыть крышку.

7. Кратковременно центрифугировать.

8. Поместить пробирки в прибор в соответствии с протоколом исследования.

Создание протокола исследования

1. Открыть программу Bio-Rad.

2. Выбрать File—»New—»Protocol.

3. Задагь ирограмму амплификации со следующими параметрами:

г-> 2 95.0 С for 0:15

3 63.0 С for 0:40

+ Plate Read

4 GOTO 2 .40 more times

END

3. Задать рабочий объем реакции 25 мкл.

4. Нажать File—»Save As, дать имя файлу SNP-protocol и сохранить файл с расширением -.prcl.

Проведение реакции ГГЦР-РВ

1. Включить прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

2. Запустить программу Bio-Kad.

3. Выбрать File—»New—»Run.

4. Во вкладке Protocol выбрать (Select Existing) сохраненный ранее протокол SNP-protocol.prcl.

5. Перейти во вкладку Plate. Создать новую плашку (Create New)

6. Внести сведения об образцах и красителях. Для этого в окне Workshop выбрать Plate, затем в поле Selected Plate Setup выбрать опцию Create New. Выбрать флуорофоры (Select Fluorophores): FAM, HEX. Выделить на плашке рабочую область (в зависимости от количества образцов), выбрать тип образцов (Sample Туре) и поставить галочки в полях около флуорофоров:

7. Сохранить плашку.

8. Перейти во вкладку Start Run. Закрыть крышку прибора (если она закрыта) нажатием клавиши Close l.id.

9. Начать работу прибора нажатием клавиши Start Run.

10. Дать название файлу, сохранить.

1 I. Зафиксировать в рабочем журнале название файла.

Анализ результатов исследования

Открыть обрабатываемый файл в программе Bio-Rad. Для этого выбрать File—»Open—»Data File, выбрать нужный файл с расширением .perd и нажать клавишу Огкрыть. Возможно два варианта проведения анализа.

1. Анализ по пороговому циклу. Выбрать вкладку Quantification. Выбрать канал FA.M. Выделить положительные контроли и поднять пороговую линию примерно на 30% от сигнала гетерозиготы, как показано на рисунке, повторить те же действия для канала HEX.

□

S

U

О

*

н =

В

ft 'M

■

и

Allele 1 (FAM) аллель С Генотип С/С

Heterozygote (FAM+HEX) аллель C+ аллель А Генотип С/А

Allele 2 (HEX) аллель А Генотип А/А