Молекулярно-генетические подтипы серозной аденокарциномы яичника, их малоинвазивная диагностика и ассоциация с выживаемостью больных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Цандекова Мариэтта Рафаэловна

• Цандекова Мариэтта Рафаэловна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Цандекова Мариэтта Рафаэловна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рак яичника: современные подходы к диагностике, лечению и прогнозированию

1.2 Диагностика рака яичника

1.3 Современные подходы к лечению

1.4 Современные представления о факторах прогноза исхода заболевания

1.5 Молекулярно-генетическая характеристика серозной аденокарциномы яичника

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Дизайн исследования

2.2 Характеристика больных раком яичника

2.3 Методы исследования

2.4 Биоинформационный анализ данных

2.5 Лазерная микродиссекция с бесконтактным захватом

2.6 Определение показателя относительной копийности генов в опухолевых и нормальных клетках

2.7 Определение показателя относительной копийности генов во внеклеточной ДНК плазмы крови

2.8 Методы статистической обработки полученных данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Анализ данных проектов The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal

3.2 Показатель копийности генетических локусов в опухолевых клетках больных серозной аденокарциномой яичника

3.3 Сравнение показателей выживаемости больных с различными молекулярными подтипами серозной аденокарциномы

Глава 4. МАЛОИНВАЗИВНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА

СЕРОЗНОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКОВ

4.1 Показатель копийности генов во внеклеточной ДНК как диагностический маркер серозной аденокарциномы яичника

высокой и низкой степени злокачественности

4.2 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов СУР1Б1 и Е8Я1

4.3 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности на основании показателя копийности генов РТЕИ, БСЬ2 и БАХ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические подтипы серозной аденокарциномы яичника, их малоинвазивная диагностика и ассоциация с выживаемостью больных»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

В большинстве стран мира последние десятилетие наблюдается рост показателей заболеваемости раком яичника (РЯ) наряду с незначительным снижением смертности и выживаемости (Амлаев К.Р. и соавт., 2015; Цандекова М.Р., 2020). Данные Международного агентства по изучению рака (International Agency for Research on Cancer, IARC) свидетельствуют о том, что при имеющейся тенденции к 2030 году заболеваемость и смертность в России в абсолютных числах привысит показатель в 13 000 и 8 000 случаев соответственно (Оганесян М.Г., 2015). В настоящее время РЯ занимает третье место в структуре репродуктивных злокачественных опухолей и является пятой по частоте причиной женской смертности от онкологических заболеваний (Кислякова Ю.В., Максимова А.А., 2015; Khattak Y.J. et al., 2013).

Наиболее распространенным подтипом рака яичников является серозная аденокарцинома (American Cancer Society Global Cancer Facts&Figures, 3rd Edition), в современный стандарт лечения которой входит циторедуктивная операция и химиотерапия на основе платины (National Comprehensive Cancer Network Ovarian Cancer Guidelines V1, 2016). Позднее выявление и сложности лечения на этом этапе, связанные с повышенной устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапии у большинства больных на поздней стадии, обуславливают высокую актуальность проблемы ранней малоинвазивной диагностики рака яичника и подчеркивают острую необходимость скрининга альтернативных подходов к диагностике, молекулярному типированию (классификации) и лечению пациентов с серозной аденокарциномой.

По состоянию на апрель 2021 года не существует утвержденного скринингового теста для серозной аденокарциномы яичника, что может быть ключевым препятствием к выявлению этого заболевания на ранней стадии. В этом контексте, глубокое исследование молекулярных характеристик злокачественных опухолей яичника может повысить эффективность раннего выявления этого заболевания с помощью различных подходов, таких как идентификация

возможных предраковых поражений, а также биомаркеров сыворотки (например, циркулирующая внеклеточной ДНК (внДНК)).

В многочисленных отечественных и международных исследованиях установлено, что серозная аденокарцинома яичников является гетерогенным заболеванием на гистологическом и на молекулярном уровнях (Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С., 2020).

Традиционно считалось, что из хорошо дифференцированной серозной аденокарциномы низкой степени злокачественности возможно формирование более агрессивной формы рака яичников - серозной аденокарциномы высокой степени злокачественности (Kurman R.J., 2013). Достижения в молекулярной и клинико-патологической характеристиках опухолей показали, что серозная аденокарцинома низкой степени злокачественности вряд ли является предшественником серозной карциномы высокой степени злокачественности. Наиболее вероятно, что это два отдельных заболевания с различными изменениями в геноме и разным прогнозом. Если следовать этой современной парадигме, то серозную аденокарциному низкой степени злокачественности можно классифицировать как опухоль подтипа 1, которая характеризуется более благоприятным клиническим течением и обладает относительно стабильным генетическим профилем. По этой же концепции, серозную аденокарциному высокой степени злокачественности, имеющей более агрессивное клиническое течение, следует классифицировать как опухоль подтипа 2. Эта классификационная схема не только способствует более точной характеристике данного заболевания, но также дает представление о механизмах, лежащих в основе развития эпителиального рака яичников (Kurman R.J., Shih I.M., 2016).

Каскад молекулярно-генетических исследований позволил выявить дифференциальный характер генетической нестабильности для различных подтипов серозной аденокарциномы. Были обнаружены мутации в генах KRAS CTNNB1, CDKN2A, PIK3CA, PTEN, TP53, ARID1A, ERBB2, а также амплификации в этих генах (амплификации - увеличение копийности гена - вид генетического полиморфизма (Кутилин Д.С. и соавт., 2019)). Именно высокий уровень

молекулярно-генетической гетерогенности серозной аденокарциномы яичников препятствовует ее эффективной характеристике и оптимизации тактики лечения пациенток. И несмотря на то, что достигнуты существенные успехи в понимании некоторых молекулярно-генетических аспектов формирования и функционирования серозных аденокарцином яичников, их клиническое значение еще полностью не определено. Дальнейшие исследования в области молекулярной характеристики различных гистологических подтипов серозной аденокарциномы могут способствовать разработке более полной классификации этих опухолей, а также разработке новых диагностических и прогностических подходов.

Степень разработанности темы

К настоящему времени в ряде исследований уже установлена взаимосвязь показателей выживаемости больных серозной аденокарциномой яичников с определенными молекулярно-генетическими характеристиками. Однако, выборки пациентов не многочисленны, и поэтому каждое новое исследование в данной области обладает не оспоримой актуальностью. Не смотря на активное развитие подходов малоинвазивной диагностики в последнее десятилетие адекватных тестов для серозной аденокарциномы яичников так и не создано.

Цель исследования

Биоинформационный и экспериментальный скрининг маркеров для генотипирования серозной аденокарциномы яичника, для диференциальной малоинвазивной диагностики ее разных подтипов, а также выявление ассоциаций между молекулярным профилем разных подтипов серозной аденокарциномы яичника и общей выживаемостью больных.

Задачи исследования

1. Провести биоинформационный скрининг маркеров (показателя копийности генов) серозной аденокарциномы яичника с использованием баз данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal.

2. Использовать выявленный входе биоинформационного анализа перечень генов для валидации на образцах серозной аденокарциномы яичника, полученных путем лазерной микродиссекции с бесконтактным захватом.

3. Используя данные по копийности генов выделить различные молекулярно-генетические подтипы серозной аденокарциномы яичника.

4. Осуществить сравнительную оценку показателей общей выживаемости больных с различными молекулярно-генетическими подтипами серозной аденокарциномы яичника.

5. Провести оценку показателя копийности генов, валидированных на образцах клеток серозной аденокарциномы яичников, во внеклеточной ДНК больных.

6. Разработать способы малоинвазивной диагностики двух основных подтипов серозной аденокарциномы яичников - высокой и низкой степени злокачественности.

Научная новизна исследования

Впервые при помощи совмещения биоинформационого анализа и экспериментального исследования был получен перечень молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих генотипирование серозной аденокарциномы яичника и ее малоинвазивную диагностику. Также впервые изучено влияния абберантной копийности ряда генов на выживаемость пациентов с различными подтипами серозной аденокарциномы яичников.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные позволили разработать способы дифференциальной малоинвазивной диагностики серозной аденокарцинмы яичников высокой и низкой степени злокачественности. Результаты исследования подтвердили наличие молекулярно-генетической гетерогенности серозной аденокарциномы яичников и позволили сформировать перечень генов, показатель копийности которых обеспечивает разделение серозной аденокарциномы яичников высокой и низкой степени злокачественности на несколько молекулярных подтипов, отличающихся уровнем общей выживаемости больных.

Применение результатов исследования в клинической практике специалистов онкологического профиля позволит в будующем повысить эффективность диагностики данного заболевания.

Методология и методы исследования

Методология исследования включала биоинформационный анализ, позволивший сформировать первичный перечень молекулярных маркеров, анализ копийности генов в опухолевых и нормальных клетках, извлеченных при помощи лазерной микродисскции с бесконтактным захватом, а также анализ копийности генов во внеклеточной ДНК больных серозной аденокарциномой яичников и условно-здоровых доноров; оценку продолжительности жизни с помощью метода Каплана-Мейера и выбор минимального набора генов для малоинввазивной диагностики с помощью LASSO-пенализованной логистической регрессии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Серозная аденокарцинома яичника высокой степени злокачественности характеризуется изменением копийности генов TP53, BRCA2, MDM2, SOX2, ESR1, CYP1B1 и SULT1E1, а серозная аденокарцинома яичника низкой степени злокачественности - изменением копийности генов PIK3CA, PTEN, BAX, CASP3 и CASP8. Особенности изменения копийности этих генов позволяют выделить в каждой группе несколько молекулярных подтипов, отличающихся общей выживаемостью пациенток.

2. Показатели копийности генов PTEN, SULT1E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1B1 во внеклеточной ДНК плазмы крови положительно коррелируют с данными показателями в опухолевых клетках и могут быть использованы для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника низкой и высокой степени злокачественности.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности полученных результатов определяется адекватным количеством обследованных больных в выборке исследования, применением современных и адекватных методов исследования, длительными сроками наблюдения больных раком яичника, включенных в работу, а также использованием корректных методов статистического анализа данных. Сформулированные в диссертации выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа результатов исследования.

Апробация работы состоялась 29 апреля 2021 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России.

Основные результаты исследования доложены и обсуждены на конференции «Молекулярная онкология» (Москва, 2019) и конгрессе АБС02020 (США, 2020).

Результаты работы внедрены в практику работы ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер №1» Министерства здравоохранения Краснодарского края.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, получено 2 патента Российской Федерации.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно определена цель и сформулированы задачи исследования, изучены данные литературы, составлена программа исследования, выполнен сбор и обработка материалов, проведено их обобщение и осуществлен анализ результатов исследования. Диссертантом лично проведено обследование и лечение 300 пациенток с диагнозом серозная аденокарцинома яичника, данные которых включены в настоящее исследование.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 1 29 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, состоящего из 205 библиографических источников: 70 отечественных и 135 иностранных публикаций. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.

10

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рак яичника: современные подходы к диагностике, лечению и прогнозированию

В последние годы во всем мире наблюдается рост показателей заболеваемости раком яичника (РЯ) и незначительное снижение смертности (Амлаев К.Р. и соавт., 2015; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2010). По данным Международного агентства по изучению рака (International Agency for Research on Cancer, IARC), при текущей тенденции к 2030 году заболеваемость и смертность в Российской Федерации составят 13 898 и 8 624 случаев соответственно (Оганесян М.Г., 2015).

РЯ, занимая третье место в структуре репродуктивных злокачественных опухолей, является пятой по частоте причиной женской смертности вследствие злокачественных заболеваний (Кислякова Ю.В., Максимова А.А., 2015; Никогосян С.О. и соавт., 2009; 2010; Khattak Y.J. et al., 2013). На территории государств Европейского Союза РЯ занимает лидирующую позицию среди причин смерти от заболеваний онкологического характера у женщин: 5 место по числу новых случаев в структуре общей онкологической заболеваемости (уступает только опухолям молочной железы, кишечника, легких и тела матки) и 6 место по показателям смертности (Ferlay J. et al., 2012). Высокие показатели смертности женщин с таким диагнозом связаны с поздним выявлением заболевания (Никогосян С.О., Кузнецов В.В., 2013; Косенко М.С., Мамедова М.З., 2018).

Этиопатогенез опухолей яичников на сегодняшний день в значительной мере остается неизученным (Молчанов C.B., Коломиец Л.А., 2015; Castellarin M. et al., 2013). Полагают, что это мультифакторное заболевание (Жорданиа К.И. и соавт., 2014; Солопова А.Е. и соавт., 2016; Jones M.R. et al.,2017). Главным фактором риска считается наследственность, в первую очередь РЯ у родственниц первой линии родства (Ашрафян Л.А., 2012; Жорданиа К.И. и соавт., 2017; Ware Miller R. et al., 2011).

Первичная опухоль яичника может быть отнесена к одной из трех основных категорий в зависимости от происхождения: эпителиальная, герминогенная опухоли или опухоль стромы полового тяжа (Солопова А.Е. и соавт., 2016). Кроме того, яичники могут поражаться метастатически (Прокопюк А.В. и соавт., 2013). Эпителиальные опухоли яичников встречаются примерно в 85% случаев всех злокачественных опухолей яичников, среди них наиболее часто встречается серозная карцинома яичника (Черепанова Е.В. и соавт., 2011; Жорданиа К.И. и соавт., 2014).

Используют 2 основные классификации стадирования рака яичников: классификация злокачественных новообразований TNM и классификация Международной федерации акушеров и гинекологов пересмотра 2014 г. (FIGO) (Солопова А.Г. и соавт., 2017).

Согласно классификации FIGO, стадия I подразумевает, что опухоль ограничена яичниками, стадия II диагностируется при вовлечении стенок таза, при стадии III по классификации FIGO опухоль распространяется на брюшину и выходит за пределы малого таза в брюшную полость, при этом могут поражаться забрюшинные, паховые лимфатические узлы. Стадия IV РЯ характеризуется наличием отдаленных метастазов (Практические рекомендации, 2014; Солопова А.Г. и соавт., 2017).

Опухолевая диссеминация при раке яичников происходит с током внутрибрюшинной жидкости по брюшной полости (Ашрафян Л.А., 2012; Молчанов С.В., Коломиец Л.А., 2014); лимфогенным и гематогенным путем (Conic I. et al., 2011; Ahmed N. et al., 2014; Kossai M. et al., 2017). Встречается прямое прорастание опухоли яичников в тело матки, фаллопиевы трубы и контралатеральный яичник, в то же время вовлечение ректо-сигмовидного отдела кишки и мочевого пузыря встречается реже (Chui M.H. et al., 2014).

Важной особенностью РЯ является его диссеминация по брюшине, которая происходит путем эксфолиации опухолевых клеток с поверхности пораженной яичниковой ткани с током внутрибрюшинной жидкости по всей брюшной полости (Алябьева М.А., 2015).

Преобладающей локализацией метастазов РЯ являются Дугласово пространство, большой сальник и поддиафрагмальная область, что объясняется особенностями циркуляции перитонеальной жидкости (Молчанов С.В., Коломиец Л.А., 2015). При лимфогенной диссеминации метастазы чаще всего обнаруживаются в парааортальных и паракавальных лимфатических узлах, в которые лимфа оттекает в основном по лимфатическим сосудам, сопровождающим яичниковые артерию и вену (Kurman R.J. et al., 2016). В ряде случае поражаются наружные подвздошные, подчревные, запирательные и паховые лимфатические узлы (Леваков С.А. и соавт., 2014; Хайрутдинова М.Р., Эгамбердиева Л.Д., 2015).

Метастатическое поражение лимфатических узлов при I стадии распространения злокачественной опухоли по классификации FIGO встречается у 25% пациентов, при стадии II - у половины пациентов и при более поздних стадиях - в 74% всех случаев (Lengyel E., 2010). У пациентов с диссеминацией опухолевого процесса по брюшине в 30% случаев поражаются тазовые, парааортальные и паховые лимфоузлы (Son H. et al., 2011). Реже встречается гематогенное метастазирование, при котором чаще всего поражаются печень и легкие (Lengyel E., 2010; Kossai M. et al. 2017). Метастазы РЯ также могут обнаруживаться в селезенке, костях, головном мозге и др. (Xie X. et al., 2017; Janda M. et al., 2018).

1.2 Диагностика рака яичника

В клинической практике новообразования яичников часто обнаруживают случайно (Григорук О.Г. и соавт., 2012; Бехтерева С.А. и соавт., 2018; Ульянова А.В. и соавт., 2018). На начальных этапах заболевания РЯ протекает асимптоматически либо не имеет патогномоничных клинических симптомов, в связи с чем заболевание диагностируется уже на поздних стадиях (Солопова А.Е. и соавт., 2016; Хаджимба А.С., 2016; Tanaka Y.O. et al., 2016).

Диагностика новообразований яичников имеет мультидисциплинарный подход и основывается на данных осмотра, результатах применения различных методов визуализации и лабораторных анализов (Стецюк Е.Л., 2008; Терновой С.К. и соавт., 2009; Кузнецова Е.П., Серебренникова К.Г., 2010; Солопова А.Е., 2016). Важно отметить, что опухоли яичников встречаются очень часто и большинство из

них доброкачественны, значительно реже встречаются пограничные или злокачественные опухоли (Когай С.В., 2013).

Наиболее изучен при РЯ опухоль-ассоциированный антиген СА-125, определяемый в сыворотке крови (Paik E.S. et al., 2016; Liu W. et al., 2017). В постменопаузе СА-125 имеет высокую чувствительность и специфичность в диагностике заболевания (Григорук О.Г. и соавт., 2017; Liu W. et al., 2017; Shah J.S. et al., 2018). В то же время у женщин, находящихся в пременопаузе, этот антиген имеет высокую чувствительность, но низкую специфичность, что связывают с возможностью повышения СА-125 и при других патологических состояниях -воспалительных процессах в области малого таза, эндометриозе и других (Никогосян С.О. и соавт., 2011; 2014; Хайрутдинова М.Р., Эгамбердиева Л. Д., 2015; Paik E.S. et al., 2016).

В ряде рандомизированных исследований было продемонстрировано, что оценка концентрации другого онкомаркера - человеческого эпидидимального белка-4 (human epididymis protein 4, HEP4) позволяет проводить дифференциальную диагностику между доброкачественными и злокачественными образованиями яичников у женщин в пременопаузе (Сергеева Н.С., Маршутина Н.В., 2010; Bandiera E. et al., 2011).

Важнейшую роль в выявлении, описании и стадировании опухолевого процесса в яичниках играет диагностическая визуализация (Мартынов С.А. и соавт., 2014; Солопова А.Е., 2016; Son H. et al., 2011; Wang W. et al., 2015; Foti P.V. et al., 2016). Так, при подозрении на опухоль яичника применяется ультразвуковое исследование (УЗИ), важная роль которого определяется доступностью, хорошей переносимостью, неинвазивностью и низкой стоимостью метода (Люстик А.В., 2012; Мартынов С.А. и соавт., 2014). Сочетание В-режима и допплерометрического исследования в процессе проведения трансвагинального и/или трансабдоминального УЗИ дает возможность изучить морфологию выявленного объемного образования и оценить степень его васкуляризации (Кормош Н.Г. и соавт., 2009; Востров А.Н. и соавт., 2013; Bagwell D., Bast R.C., 2007).

К УЗИ-признакам РЯ относят утолщение капсулы опухоли (более 2-3 мм),

неровность наружного контура образования, наличие перегородок различной толщины, папиллярных разрастаний (Mitsumori A. et al., 2012; Tanaka Y.O. et al., 2016). В тех случаях, когда при исследовании невозможно четко выявить признаки доброкачественности или злокачественности образования, следует использовать цветное допплеровское картирование, для которого характерна чувствительность 84%, специфичность - 82% при РЯ (Iyer V.R., Lee S.I., 2010; Mitsumori A. et al., 2012).

При исследовании в этом режиме возможно определение наличия и локализации сосудов опухоли (Chilla B. et al., 2011; Wu Y. et al., 2015). Преимущественно центральное расположение зон высокой васкуляризации чаще ассоциируется со злокачественным процессом, тогда как периферический кровоток в опухоли чаще встречается при доброкачественном процессе (Гажонова В.Е. и соавт., 2013; Мартынов С.А. и соавт., 2014; Олатаева М.Т. и соавт., 2017).

По результатам мета-анализа Y. Wu et al. (2015), в рамках которого анализировались результаты 10 исследований, было показано, что высококонтрастный ультразвук обладает высокой диагностической точностью в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных опухолей яичника. Однако, по мнению вышеуказанных авторов, несмотря на то, что по морфологическим характеристикам и характеру васкуляризации опухоль может расцениваться как доброкачественная, необходимым является проведение дальнейших исследований в этом направлении с соблюдением принципов доказательной медицины.

На основе консенсуса, принятого Обществом Ультразвуковых радиологов (Society of Radiologists in Ultrasound), были сделаны следующие рекомендации относительно ведения пациенток с образованиями яичников: в случае если данные образования не выходят за пределы яичников у женщин репродуктивного возраста или диаметр кисты яичника менее или равен 1 см у женщин в постменопаузе, то скорее всего это доброкачественное образование (Levine D. et al., 2010).

Компьютерную томографию (КТ) с контрастом органов брюшной полости и полости малого таза следует применять для оценки распространения опухолевого

процесса и выявления рецидива злокачественных образований после химиотерапии, в то время как в первичной диагностике заболеваний яичников данный метод визуализации имеет ограниченное применение (Антошечкина М.А. и соавт., 2011). На КТ снимках лучше определяются образования, содержащие жировые включения и кальцификаты, например, зрелая тератома (Мартынов С.А. и соавт., 2014; Khattak Y.J. et al., 2013; Genc M. et al., 2015). Тем не менее, в тех случаях, когда при УЗ-исследовании невозможно четко определить признаки доброкачественности или злокачественности образования яичника, используется КТ, которая характеризуется чувствительностью на уровне 81% и специфичностью 87% (Iyer V.R., Lee S.I., 2010). КТ является методом выбора как для регионарного, так и для дистанционного стадирования опухоли, поскольку способна выявить степень вовлеченности в патологический процесс большого сальника, брюшины и лимфатических узлов, а также определить объем асцитической жидкости (Iyer V.R., Lee S.I., 2010; Klymenko Y. et al., 2018).

Кроме того, этот метод является ведущим при оценке эффективности терапии РЯ (Santoso J.T. et al., 2014). Исследование проводят до начала лечения и после проведения 6 циклов химиотерапии. В тех случаях, когда уровни онкомаркеров крови находятся в пределах нормы, то допустимо проведение повторной КТ после трех циклов химиотерапии (Lalwani N. et al., 2011).

В настоящее время для оценки эффективности противоопухолевого лечения у пациенток с риском рецидива РЯ все чаще применяется позитронная эмиссионная томография с 18F-фтордезоксиглюкозой (18Ф-ФДГ ПЭТ) (Чекалова М.А. и соавт., 2008; Prakash P. et al., 2010). Чувствительность и специфичность метода составляют соответственно 92% и 100% в диагностике рецидива РЯ (Queiroz M.A. et al., 2015). Особенно важна роль этого метода в тех случаях, когда при КТ никаких патологических очагов не наблюдается, а концентрация онкомаркеров в плазме крови превышает норму (Lalwani N. et al., 2011).

ПЭТ/КТ, как правило, не применяют при первичной оценке опухолевого процесса во избежание ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов (Когай С.В., 2013; Сафонова М.А., Диомидова В.Н., 2015). Считается,

что в некоторых доброкачественных опухолях, особенно тератомах и эндометриомах, может наблюдаться гиперфиксация 18Ф-ФДГ (Соломатина А.А. и соавт., 2008). В то же время в небольших, некротических и низкодифференцированных опухолевых массах 18Ф-ФДГ может практически не накапливаться (Ашрафян Л.А. и соавт., 2012; Son H. et al., 2011).

Магнитно-резонансная томография применяется для определения опухолевого образования, характеристики его структуры и определения локальной инвазии опухоли, особенно у пациенток с отсутствием четких признаков доброкачественности/злокачественности образования (Рубцова Н.А. и соавт., 2016; Cui Y.F. et al., 2012; Foti P.V. et al., 2016). Метод обладает высокой разрешающей способностью и возможностью использования мягкотканного контраста (Abedi S.M. et al., 2016; Bakir B. et al., 2011; Cai S.Q. et al., 2013). Данные МРТ позволяют обнаружить жировой и геморрагический компоненты в составе образования (Сафонова М.А., Диомидова В.Н., 2015; Bollineni V.R. et al., 2015). Применение гадолиниевого контраста повышает вероятность обнаружения солидного компонента в составе первичной опухоли или метастатического очага (Carter J.S. et al., 2013; Santoso J.T. et al., 2014).

В диагностике образований яичников чувствительность магнитно-резонансной томографии составляет 76,0%, специфичность - 97,0% (Берген Т.А., Трофименко И.А., 2012). Перспективным представляется использование диффузионно-взвешенных изображений в диагностике опухолей яичника, однако мнения разных авторов на этот счет не однозначны (Iyer V.R., Lee S.I., 2010; Fan X. et al., 2015). Перспективным представляется использование диффузионно-взвешенных изображений (ДВИ) в диагностике образований яичника, однако мнения исследователей на этот счет не однозначны (Canese R. et al., 2016; Fehniger J. et al., 2016; Kim H.J. et al., 2016). При этом магнитно-резонансная томография не является необходимой для дифференциальной диагностики злокачественных опухолей яичников, поскольку не несет дополнительной информации по сравнению с другими методами визуализации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Цандекова Мариэтта Рафаэловна, 2021 год

ъ -

ф II ■

1 т * о- | е- > А' ■

У 1 а к-, ^ ■

А 4-, о- - <

1---- к.

а---! <Ь- А-

и— С Ь " &

о 6 12 18 24 30 Срок наблюдения, месяцы

36

-Группа 1-3

- Группа 1-2

__- Группа 1-1

Рисунок 3.10. Кривые Каплана-Мейера общей выживаемости больных серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности (кластер 1, п=96) отдельно по трем группам статистически значимо (р<0,05) различающимся по копийности генов 8иЬТ1Е1 и 80X2

Оценка выживаемости в кластере 2 (^С) пациенток в зависимости от подгруппы п2к-1=21, п2к-2=30, п2к-3=29 или п2к-4=24 выявила, что выживаемость в течение 12 месяцев в подгруппе 1 больных была на уровне 93,0%, в подгруппе 2 -90,1%, в подгруппе 3 - 57,8%, а в подгруппе 4 была на уровне 82,6%. При этом выживаемость в подгруппе 3 статистически значимо (р<0,05) отличалась от подгрупп 1, 2 и 4 в 1,6 раза, 1,6 раза и 1,4 раза соответственно (рисунок 3.11).

В дальнейшем наблюдалось постепенной снижение значения показателя кумулятивной выживаемости в этих подгруппах. Через 24 месяца значения этого показателя были 63,7, 75,3, 42,2 и 60,9% в подгруппах 1, 2, 3 и 4 соответственно.

При этом выживаемость в подгруппе 3 статистически значимо (Р--критерий Кокса составил 2,87, р=0,038) отличалась от этого показателя в подгруппе 2 в 1,8 раза (рисунок 3.11).

Рисунок 3.11. Кривые Каплана-Мейера общей выживаемости больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности (кластер 2, п=104) отдельно по 4 группам статистически значимо (р<0,05) различающимся по копийности генов РТЕЫ и БСЬ2

Трехгодичная выживаемость в этих подгруппах (1-4) была соответственно на уровне 35,9, 47,2, 24,3 и 39,7% (рисунок 3.11). При этом отмечено статистически значимое межгрупповое отличия в выживаемости больных РЯ между подгруппами 2 и 3, различие было в 1,9 раза (Р-критерий Кокса=1,62, р<0,02).

Таким образом, было установлено, что два основных подтипа серозной аденокарциномы яичника (высокой и низкой степени злокачественности)

существенно отличаются по такому показателю как общая выживаемость, что не противоречит литературных данным. Однако важно отметить, что каждый из этих подтипов обладает внутригрупповой молекулярно-генетической гетерогенностью, которая позволила выделить в каждом из них дополнительные подгруппы, также отличающиеся по выживаемости пациенток. Обобщенные данные представлены в таблице 3.6.

Таблица 3.6 - Общая выживаемость больных РЯ в зависимости от молекулярных типов и субтипов опухоли

Серозная аденокарцинома яичника

Низкой степени злокачественности Высокой степени злокачественности

12 мес. - 78,6% 24 мес. - 64,3% 36 мес. - 46,4% 12 мес. - 57,7% 24 мес. - 40,4% 36 мес. - 20,2%

Выживаемость в подгруппах, % Выживаемость в подгруппах,%

1 2 3 4 1 2 3

12 мес.-93,0 24 мес.-63,7 36 мес.-35,9 12 мес.-90,1 24 мес.-75,3 36 мес.-47,2 12 мес.-57,8 24 мес.-42,2 36 мес.-24,3 12 мес.-82,6 24 мес.-60,9 36 мес.-39,7 12 мес.-48,0 24 мес.-28,0 36 мес.-12,0 12 мес.-65,4 24 мес.-49,5 36 мес.-28,9 12 мес.-58,1 24 мес.-36,4 36 мес.-25,2

Как видно из представленных в таблице 3.6 данных, в кластере больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности наихудшими показателями выживаемости характеризовались пациенты 3 подгруппы (агрессивный подтип), а наилучшими показателями обладали подгруппы 1, 2 и 4 (благоприятный подтип). В кластере больных серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности наихудшими показателями выживаемости характеризовались пациенты 1 подгруппы (высоко агрессивный подтип), а наилучшими показателями обладали подгруппы 2 и 3 (не агрессивный подтип).

Следующим этапом, целесообразно оценить влияние копийности рассматриваемых генов на установленные показатели выживаемости.

В разделе 3.2 было показано, что 13 генетических локусов (BAX, BCL2, CASP-3, CASP-8, MDM2, TP53, PIK3CA, SOX2, BRCA2, PTEN, ESRI, CYP1-B1 и SULT1-E1) могут быть использованы для молекулярного типирования серозной

аденокарциномы яичников. С использование однофакторного регрессионного анализа Кокса было оценено влияние этих генов на выживаемость. На общую выживаемость влияла копийность только 4 генов - SOX2 (р=0,01), SULTIEI (р=0,03), В^2 (р=0,02) и PTEN (р=0,04).

В таблице 3.7 представлены результаты однофакторного регрессионного анализа Кокса.

Таблица 3.7 - Влияние уровня копийности генетических локусов на общую выживаемость больных (регрессионный анализ Кокса)

Ген в (в) ОШ Wald Р

80X2 3,85 (1,66) 7,1 4,47 0,01

8иЬТ1Е1 5,99 (2,56) 7,7 5,21 0,03

БСЬ2 -1,99 (0,99) 0,2 6,55 0,02

РГЕМ 3,15 (1,24) 3,9 6,41 0,04

МБМ2 4,88 (2,06) 10,1 3,82 0,05

ESR1 4,33 (2,01) 9,8 3,80 0,06

CYP1B1 2,45 (1,12) 2,1 3,01 0,07

ТР53 2,85 (1,42) 2,7 2,71 0,09

BRCA2 3,60 (2,57) 2,9 3,14 0,11

Р1К3СА 7,01 (4,99) 6,1 4,11 0,18

ВАХ 7,10 (3,40) 5,13 2,20 0,12

CASP3 8,25 (3,21) 6,78 4,01 0,21

CASP8 5,00 (4,10) 5,8 3,95 0,37

Регрессионный анализ показал наличие статистически значимого влияние аберрантной копийности генов SOX2 (|) и SULTI-EI Ц) в опухолевой ткани на риск летального исхода у больных раком серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности 1 подгруппы.

Ген SULTIEI кодирует фермент эстроген-сульфотрансферазу, которая катализирует сульфатную конъюгацию многих гормонов, нейромедиаторов, лекарств и ксенобиотических соединений. Эстроген-сульфотрансфераза передает сульфогруппу эстроген, что может регулировать уровни рецепторов эстрогена

(Bernier F. et al., 1994). Согласно теории эстроген-ассоциированного канцерогенеза, увеличение количества ядерных рецепторов ERa приводит к активации пролиферативных процессов в тканях-мишенях и развитию опухолей. Этот процесс блокируется увеличением активности фермента сульфотрансферазы, ассоциированным с повышенной копийностью гена SULT1-E1. Сульфотрансфераза участвует в инактивации эстрогенов путем их сульфатирования (Kot О.И., Водолажский Д.И., ^тилин Д.С. и соавт., 2016).

Ген SOX2 (SRY-box 2) кодирует транскрипционный фактор необходимый для поддержания самообновления или плюрипотентности недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. В клетках опухолей разных нозологий наблюдаются изменения копийности генетических локусов в области 3q26.3, где и локализуется ген SOX2. Sox2 контролирует морфогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. В нормальных условиях ген и белок Sox2 выполняют важные функции в поддержании определенной пропорции базальных клеток в эпителии и их самообновлении. Но гиперэкспрессия данного гена, ассоциированная с увеличением числа его копий, может приводить к обширной эпителиальной гиперплазии и к раку (Lu Y., Futtner C., Rock J.R. et al., 2Q1Q), также активации клеточной миграции (Hussenet T., Dali S, Exinger J., Monga B. et al., 2Q1Q). Гиперэкспрессия SOX2 обнаружена при злокачественных опухолях простаты (Kregel S., Kiriluk K.J., Rosen A.M. et al., 2Q13), толстой кишки (Tani Y., Akiyama Y., Fukamachi H. et al., 2007) и глиобластоме (Gangemi R.M.R, Griffero F., Marubbi D. et al., 2QQ8; Ikushima H. et al., 2QQ9).

Соответственно, у больных кластера 1 (hgSC) подгруппы 1 медиана копийности гена SULT1E1 была ниже этого показателя в двух других подгруппах, а медиана копийности гена SOX2 имела промежуточное значение среди двух других подгрупп, но при этом превышала этот показатель в нормальной ткани яичников более, чем в 5 раз. Очевидно, сочетание этих двух факторов и обеспечило клинические особенности течения заболевания в этой подгруппе пациенток.

Также результаты регрессионного анализа ^кса позволили обнаружить статистически значимое (р<0$2) влияние уровня копийности генетических

локусов BCL2 и PTEN в опухолевой ткани на риск развития летального исхода у больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности 1-4 подгруппы. Так, наихудшие показатели выживаемости наблюдались у больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности 3 подгруппы (подтипа). В этом подтипе наблюдалось сочетание одновременно наименьшей медианы копийности гена PTEN и наибольшей копийности гена BCL2.

Субстратами фосфатазы, кодируемой генетическим локусом PTEN, являются и белки, и фосфатидилинозитол-3-фосфаты. Данная фосфатаза катализирует отщепление Р04-группы фосфатидилинозитол-3-фосфатов, лишая их функции вторичных мессенджеров. PTEN является антионкобелком, негативным регулятором PBK/AKT/mTOR-сигнального (McCubrey J.A. et al., 2012). В нормальных клетках белок PTEN контролирует их пролиферацию клеток и внедрение в соседние ткани. В экспериментальной работе Zi-Jian Lan с соавторами показано, что уменьшение функциональных копий этого гена приводит к избытку андрогенов и дисфункции яичников у лабораторных мышей (Lan Zi-Jian, Krause M.S., Redding S.D. et al., 2017).

Белок PTEN также является одним из опухолевых супрессоров наиболее часто теряющих свою функциональную активность при раке у человека. По предварительным оценкам до 70% больных раком простаты потеряли копию гена PTEN (Chen Z., Trotman L.C., Shaffer D. et al., 2005). Ряд исследований выявили повышенную частоту потери копии гена PTEN в опухолях, что потенциально отражает увеличение пролиферации и плотности клеток в этих опухолях (Norris J.M., Simpson B.S., Parry M.A. et al., 2020).

При канцерогенезе могут происходить мутации или потери определенного количества копий гена PTEN, которые инактивируют или снижают его ферментативную активность, что в итоге приводит к увеличению пролиферации клеток. Повышенная инактивация гена PTEN наблюдается при глиобластоме, раке эндометрия и раке простаты; а пониженная экспрессия обнаруживается в опухолях легких и молочных желез (Chen Z., Trotman L.C., Shaffer D. et al., 2005).

Ген BCL2 (B-cell lymphoma 2) кодирует регуляторный белок из семейства Bcl-2, который ингибирует клеточную гибель (апоптоз), изменяя проницаемость митохондриальной мембраны и предотвращая выход цитохрома C из митохондрий, что оказывает ингибирующее действие каспазы (Кутилин Д.С., Гусарева М.А., Кошелева Н.Г. и соавт., 2020). Рак можно рассматривать как нарушение баланса между пролиферацией и гибелью клеток. Чрезмерная экспрессия антиапоптотических генов и недостаточная экспрессия проапоптотических генов могут привести к отсутствию гибели клеток, характерной для рака. Наглядным примером служат лимфомы. Сверхэкспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 в лимфоцитах сама по себе не вызывает рак, но одновременная сверхэкспрессия Bcl-2 и протоонкогена myc может вызывать агрессивные В-клеточные злокачественные новообразования (Otake Y., Soundararajan S., Sengupta T.K. et al., 2007). Гиперэкспрессия BCL2, ассоциированная с его повышенной копийностью часто встречается и при других видах рака, например, при раке легкого и раке яичников (Kaiser U., Schilli M., Haag U. et al., 1996).

Соответственно, больные раком яичника с одновременно наиболее сниженной копийностью гена PTEN и повышенной копийностью гена BCL2 в опухолевой ткани потенциально должны обладать наименьшим показателем выживаемости. Это и наблюдается при сравнении 3 подтипа и 1, 2 и 4 подтипов серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности.

Таким образом, проведенное исследование позволило не только выделить на молекулярно-генетическом уровне подтипы серозной аденокарциномы яичников низкой и высокой степени злокачественности, но и выявить особенности их клинического течения. Полученные результаты открывают большие перспективы для персонифицированного подхода к лечению этих опухолей. Однако, для полной реализации этого подхода необходим переход от использования биоматериала, полученного уже на этапе операции к малоинвазивной диагностике. Для этого проведены дополнительные исследования, результатам которых посвящена следующая глава.

75

Глава 4

МАЛОИНВАЗИВНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА СЕРОЗНОЙ

АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКОВ

4.1 Показатель копийности генов во внеклеточной ДНК как диагностический маркер серозной аденокарциномы яичника высокой и низкой степени злокачественности

В главе 3 была показана внутригрупповая молекулярная и клиническая гетерогенность для серозной аденокарциномы яичника высокой и низкой степени злокачественности. В настоящеее время для этих опухолей не существует одобренного скринингового теста, что препятствует их ранней диагностике (Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С., 2020; Bell R., Petticrew M., Luengo S., Sheldon T.A. 1998).

На современном этапе развития молекулярной онкологии разработка высокоэффективных и малоинвазивных подходов ранней диагностики невозможна без скрининг молекулярно-генетических маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. В качестве таких маркеров большим потенциалом обладает показатель вариации числа копий генов (Copy Number Variation (CNV)) - особая форма полиморфизма, представляющая собой изменение копийности генетического локуса, приводящее к изменению его экспрессии (Кутилин Д.С. и соавт., 2019).

К внеклеточной ДНК (внДНК) относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу; ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК (Кутилин Д.С. и соавт., 2017).

Проведенный в главе 3 анализ позволил сформировать список генетических локусов, пoказатeль копийности которых обладает большим потенциалом для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников.

На внДНК, выделенной из плазмы 50 пациенток с серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности и 50 пациенток с серозной аденокарциномой яичников низкой степени злокачественности, а также 30 условно

здоровых доноров, проведена валидация потенциальных маркеров, представленных в таблице 4.1.

Таблица 4.1 - Потенциальные маркеры для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников

Кластер 1 (hgSC) Кластер 2 (^р

CNV повышено CNV понижено CNV повышено CNV понижено

МБМ2 ТР53 Р1К3СЛ БЛХ

80X2 БЯСЛ2 РТЕЫ СЛ8Р3

Е8Я1 БСЬ2 СЛ8Р8

СУР1Б1

$>иЬТ1Е1

В ходе валидации обнаружено статистически значимое (р<0,005) увеличение числа копий генов БиЬТ1Е1, СУР1Б1 и ЕБЯ1 в 2,8, 3,0 раза и в 5 раз соответственно во внеклеточной ДНК плазмы крови у 80,0, 75,0 и 85,0% соответственно обследованных больных серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности относительно внеклеточной ДНК плазмы крови условно

здоровых доноров (рисунок 4.1).

Рисунок 4.1. Показатель относительного количества копий генететических локусов во внДНК

пациенток с серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности. * - статистически значимые изменения относительно количества копий генетических локусов во внДНК плазмы крови условно здоровых доноров (р<0,005)

У 15% обследованных пациенток во внДНК наблюдалось снижение копийности ТР53 и БЯСЛ2 в 2,2 раза (р<0,05) и 2,1 раза (р<0,05) соответственно,

еще у 30% больных наблюдалось повышение копийности генов MDM2 и SOX2 в 2,0 раза (р<0,05) и 2,0 раза (р<0,05) соответственно относительно условно здоровых доноров.

Применение алгоритма «СИНА» («сетевой интеграции нескольких ассоциаций») позволило выявить наличие и силу взаимодействий между генетическими локусами TP-53, MDM2, SOX2, CYP1-B1, ESR1, BRCA2 и SULT1E1, а также генами, ассоциированными с ними в общих сигнальных путях (рисунок 4.2, таблица 4.2). Для локусов, перечисленных выше, наиболее сильное взаимодействие (вычислено по следующим критериям: со-экспрессия (Gene Expression Omnibus), общие белковые домены (BioGRID, IntAct и MIPS), регуляция общими транскрипционными факторами (JASPAR), со-локализация) наблюдалось с

локусами RPL-11, TFF-1, CUL-9, SFN, CUL7 и RAD-51.

ФШШШ

щтшш

(ф

общие белковые доыены прслскаинные взаныолеПовия совместная экспрессия общие сигнальные п>ли

СО-ЛОШ11Ш1Н1

Рисунок 4.2. Визуальная модель сети функциональных взаимосвязей между генами, регулирующими метаболизм и рецепцию эстрогенов, а также репарацию ДНК,

пролиферацию и апоптоз

Таблица 4.2 - Сила взаимосвязей между генами, рассчитанная с помощью алгоритма «сетевой интеграции нескольких ассоциаций»

Ген 1 Ген 2 W-value Тип взаимодействия

ЯРШ МБМ2 0,70558820 предсказанные взаимодействия

Тт Е8Я1 0,63245550 генетические взаимодействия

РЛК1 Е8Я1 0,59970117 предсказанные взаимодействия

ЯЛБ51 БЯСЛ2 0,57735026 предсказанные взаимодействия

СШ9 ТР53 0,54499210 физические взаимодействия

ШШ0Х ТР53 0,51897030 предсказанные взаимодействия

ССЫ01 МБМ2 0,48089832 предсказанные взаимодействия

Р8МБ1 Е8Я1 0,39220178 предсказанные взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,35735673 предсказанные взаимодействия

БЛХХ МБМ2 0,34891528 предсказанные взаимодействия

ТР53 0,30858160 предсказанные взаимодействия

СШ7 ТР53 0,30382136 физические взаимодействия

ЯРЬ5 МБМ2 0,29350963 предсказанные взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,27131596 физические взаимодействия

0БШ ТР53 0,27131596 физические взаимодействия

ЫРЛ83 ТР53 0,27131596 физические взаимодействия

БЛХХ ТР53 0,23516133 предсказанные взаимодействия

ССЫ01 МБМ2 0,22151214 общие сигнальные пути

ЯЛБ51 БЯСЛ2 0,21969065 общие сигнальные пути

Е8Я1 СУР1Б1 0,19609936 общие сигнальные пути

Т1МР4 Е8Я1 0,19609936 общие сигнальные пути

Ж^Р2 Е8Я1 0,19609936 общие сигнальные пути

8ЕЯРШБ9 Е8Я1 0,19609936 общие сигнальные пути

ССЫ01 ТР53 0,16988112 предсказанные взаимодействия

МВМ4 МБМ2 0,15952477 физические взаимодействия

Е8Я1 МБМ2 0,13227198 предсказанные взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,10426662 физические взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,10153924 предсказанные взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,09228970 физические взаимодействия

СШ9 ТР53 0,09228970 физические взаимодействия

ЯЛБ51 БЯСЛ2 0,09015864 физические взаимодействия

ТР53 МБМ2 0,06781394 совместная локолизация

БЛХХ ТР53 0,05460464 совместная локолизация

ТР53 $>иЬТ1Е1 0,05290603 физические взаимодействия

Тогда можно предположить, что изменение числа копий генов ESR1, CYP1-B1 и SULT1-E1, помимо экспрессии соответствующих генов, может отразиться и на экспрессии генов TFF-1, PAK-1, PSMD-1, CYP1-B1, TIMP-4, 07SP-2, SERPIN-B9, MDM2 (для ESR1), ESR1 (для CYP1-B1), TP53 (для SULT1-E1) (рисунок 4.2, таблица 4.2).

Гиперэстрогения (эндогенная или экзогенная) играет важную роль в патогенезе целого ряда гинекологических злокачественных опухолей, в том числе и серозных аденокарцином яичника высокой степени злокачественности (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Моисеенко Т.И. и соавт., 2016). Эстрогены образуются из андрогенов под действием НАДФН-зависимого фермента ароматазы, кодируемого геном CYP19 (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Никитин И.С. и соавт., 2016). В главе 3 было установлено, что число копий гена CYP19 в опухолевых клетках яичника статистически значимо не отличается от этого показателя в нормальных клетках. Это может свидетельствовать о том, что особые изменения в процессе образования эстрогенов в опухолевых клетках по сравнению с нормальными у больных серозной аденокарциномой яичников отсутствуют.

Стероидные женские половые гормоны осуществляют свое действие через соответствующие рецепторы, имеющиеся в разных тканях. В настоящее время известно два вида эстрогеновых рецепторов - а и ß, функции которых интенсивно изучаются (Burke W.M., Orr J., Leitao M. et al., 2014). Так, в работах A. Bardin et al. и О.И. Кита с соавторами показано, что сверхэкспрессия генетического локуса ESR1 наблюдается при онкотрансформации (Bardin A., Boulle N., Lazennec G., Vignon F., 2004), в то время как ESR2 регулирует митотическую активность и защищает от аномальной пролиферации, индуцированной активацией эстрогеновых рецепторов а (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Никитин И.С. и соавт., 2016).

По данным О.И. Кита с соавторами (2015) ключевым фактором в канцерогенезе ряда опухолей может быть метаболическая активация эстрадиола. Локусы CYP1-A1/-B1 кодируют ферменты из семейства цитохромов Р450,

катализирующие гидроксилирование эстрадиола в положениях С2 и С4 соответственно. 4-ОН-эстрогены (метаболиты CYP1B1) играют важную роль в злокачественной трансформации. При этом во многих гинекологических опухолях значительно увеличена транскрипционная активность генетических локусов, регулирующих гидроксилирование эстрадиола (СУР1-Л1/-Б1) и уровень ядерных рецепторов эстрогенов (ЕБЯ1, БиЬТ1-Е1 - ген сульфотрансферазы) (Кит О.И., и соавт., 2016; патент РФ №2750472, 2021).

Поэтому отличия в показателе копийности описанных выше генетических локусов во внеклеточной ДНК больных серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности относительно условно-здоровых доноров хорошо вписываются в теорию эстроген-ассоциированного канцерогенеза (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Моисеенко Т.И. и соавт., 2016), согласно которой сверхэкспрессия СУР1-Б1 (и соответственно активность фермента) в сочетании с повышенным числом ядерных рецепторов ERa (из-за аберрантной копийности и экспрессии гена ЕБЯ1) приводит к метаболической активации эстрадиола (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Никитин И.С. и соавт., 2016) и усилению пролиферации в тканях-мишенях. Этот процесс может быт ингибирован увеличением активности фермента сульфотрансферазы (ассоциированно с повышением транскрипции гена БиЬТ1-Е1), участвующей в инактивации эстрогенов путем их сульфатирования (Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Никитин И.С. и соавт., 2016). Но следует учитывать, что обнаруженное в ходе данного исследования увеличение копийности гена БиЬТ1-Е1 не позволяет однозначно говорить о биологическом значении данного явления - об изменении транскрипционной активности соответствующего гена или фермента. Тем не менее показатель копийности БиЬТ1-Е1 можно рассматривать как молекулярно-генетический маркер серозной аденокарциномы яичника высокой степени злокачественности.

Также обнаружено статистически значимое (р<0,05) увеличение копийности генетических локусов РТЕЫ и БСЬ2 в 1,9 и 4,1 раза соответственно во внеклеточной ДНК плазмы крови у больных серозной аденокарциномой яичников

низкой степени злокачественности относительно внеклеточной ДНК плазмы крови условно-здоровых доноров. При этом наблюдалось статистически значимое (р<0,05) снижение числа копий генов BAX и CASP-3 в 3,3 и 2,5 раза во внеклеточной ДНК плазмы крови у 75,0 и 80,0% соответственно обследованных больных серозной аденокарциномой яичников низкой степени злокачественности относительно внеклеточной ДНК плазмы крови условно здоровых доноров

(рисунок 4.3).

Рисунок 4.3. Уровень относительного количества копий генов во внДНК плазмы крови

больных серозной аденокарциномой яичников низкой степени злокачественности. * - статистически значимые отличия относительно количества копий генов во внДНК плазмы крови условно здоровых доноров (р<0,05)

Отметим, что приблизительно у 20% больных копийность PIK3CA во внеклеточной ДНК была увеличена в 1,85 раза (р<0,05) относительно условно здоровых доноров.

Применение алгоритма «СИНА» («сетевой интеграции нескольких ассоциаций») была оценена сила взаимодействия между генами PIK3CA, PTEN, BCL2, BAX, CASP-3 и CASP-8, а также генетическими локусами, связанными с ними в общих сигнальных путях (рисунок 4.4, таблица 4.3). Для локусов PTEN, PIK3CA, BCL2, BAX, CASP-3 и CASP-8 самая сильная взаимосвязь выявлена с генами SEPT-7, ITLN-1, FADD, MCL-1, FAS, VDAC1 и GAS-2 (определено по критериям, описанным выше, в том числе - соэкспрессия, общность белковых доменов, общая транскрипционная регуляция, со-локализация). Соответственно изменение числа

копий генов PTEN, BCL2, BAX и CASP3 может отразиться и на транскрипционной активности и других генов, например, PIK3CA, CASP3, BAX, CASP3, BAX, CASP3, BAX (для BCL2), SEPT7, PIK3R3, MCL1, FAS, BCL2, VDAC1, CASP8, CASP9 и BIK (для BAX), PIK3CA, BAX, BCL2, FADD, LPAR3, GAS2, CASP8, MCL1 и CASP9 (для CASP3) и PIK3CA, MCL1, MAST2, DLG1 и CASP8 (для PTEN) (рисунок 4.4, таблица 4.3).

Как уже упоминалось в главе 3, генетический локус PTEN кодирует фосфатазу, катализирующую отщепление фосфатной группы в положении 3D-инозитольного кольца фосфатидилинозитол-3-фосфатов и, тем самым, лишающую их функции вторичных медиаторов в клеточных сигнальных путях. К тому же PTEN является антионкогеном и блокирует передачу сигнала по PI3K/AKT/mTOR-сигнальному пути (McCubrey J.A., Steelman L.S., Chappell W.H. et al., 2012).

Рисунок 4.4. Сеть функциональных взаимосвязей между генами, регулирующими пролиферацию и апоптоз у больных серозной аденокарциномой яичников низкой степени злокачественности (Обозначения соответствуют, указанным на рисунке 4.2)

Таблица 4.3 - Уровень межгенного взаимодействия, вычисленный с помощью алгоритма «СИНА»

Ген 1 Ген 2 W-value Тип взаимодействия

¥ЛББ СЛ8Р8 0,76537 Предсказанные взаимодействия

МЛШ РТЕЫ 0,70711 Физические взаимодействия

¥Л$ СЛ8Р8 0,70711 Физические взаимодействия

¥Л$ ¥ЛББ 0,70711 Физические взаимодействия

БЬ01 РТЕЫ 0,70711 Физические взаимодействия

СЕВРВ СЛ8Р8 0,70711 Предсказанные взаимодействия

ВМ¥ МСЬ1 0,69382 Предсказанные взаимодействия

ВСЬ2 ВЛХ 0,66162 Предсказанные взаимодействия

ВСЬ2 ВЛХ 0,60940 Предсказанные взаимодействия

$>ЕРТ7 ВЛХ 0,55051 Генетические взаимодействия

МСЬ1 В1К 0,48803 Предсказанные взаимодействия

УВЛС1 ВЛХ 0,47752 Физические взаимодействия

¡ТЬЫ1 ВСЬ2 0,47567 Генетические взаимодействия

ЯЛБ9Л ВСЬ2 0,42265 Физические взаимодействия

СЕВРВ СЛ8Р8 0,41421 Предсказанные взаимодействия

В1К ВСЬ2 0,40728 Предсказанные взаимодействия

ВСЬ2 ВЛХ 0,38708 Физические взаимодействия

ТМВ1М6 ВСЬ2 0,38708 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь1 В1К 0,38022 Предсказанные взаимодействия

УВЛС1 ВСЬ2Ь1 0,36094 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь11 ВСЬ2 0,35920 Предсказанные взаимодействия

ЬРЛЯ3 СЛ8Р3 0,35463 Общие сигнальные пути

ОЛ82 СЛ8Р3 0,35463 Общие сигнальные пути

В1К ВСЬ2 0,33189 Физические взаимодействия

ЯЛБ9Л ВСЬ2Ь1 0,31003 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь1 СЛ8Р8 0,29864 Генетические взаимодействия

СЛ8Р9 СЛ8Р8 0,29864 Генетические взаимодействия

ВМ¥ ВСЬ2 0,26503 Предсказанные взаимодействия

УВЛС1 ВСЬ2 0,24931 Физические взаимодействия

МСЬ1 ВЛХ 0,24828 Предсказанные взаимодействия

ВМ¥ ВСЬ2Ь1 0,24742 Предсказанные взаимодействия

СЛ8Р8 ВСЬ2 0,19966 Генетические взаимодействия

ВСЬ2Ь11 ВЛХ 0,19269 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь10 ВАХ 0,14744 Физические взаимодействия

МСЬ1 ВСЬ2Ь11 0,14634 Предсказанные взаимодействия

ВСЬ2Ь1 ВСЬ2 0,14369 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 ВАХ 0,12486 Физические взаимодействия

ГАББ СА8Р8 0,11236 Физические взаимодействия

ЕА8 ГАББ 0,10352 Физические взаимодействия

МСЬ1 ВАХ 0,10310 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 МСЬ1 0,09844 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 ВАХ 0,09844 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь11 СА8Р3 0,09656 Общие сигнальные пути

ЕА8 СА8Р8 0,09493 Физические взаимодействия

МСЬ1 ВСЬ2 0,09108 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь1 МСЬ1 0,09108 Общие белковые домены

ВСЬ2 ВАХ 0,09108 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь1 ВАХ 0,09108 Общие белковые домены

ТМВ1М6 ВСЬ2 0,09024 Физические взаимодействия

МСЬ1 ВСЬ2 0,08973 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь10 ВСЬ2 0,08697 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 ВСЬ2Ь1 0,08697 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 ВСЬ2 0,08027 Физические взаимодействия

СА8Р8 СА8Р3 0,07905 Общие белковые домены

МСЬ1 ВАХ 0,07630 Физические взаимодействия

В1К ВАХ 0,07350 Общие белковые домены

МСЬ1 В1К 0,07350 Общие белковые домены

МСЬ1 В1К 0,07212 Физические взаимодействия

ВСЬ2Ь1 ВАХ 0,06950 Физические взаимодействия

СА8Р9 СА8Р3 0,06901 Общие белковые домены

ЕА8 СА8Р8 0,06610 Общие сигнальные пути

В1К ВСЬ2 0,06493 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь1 В1К 0,06493 Общие белковые домены

ВСЬ2Ь10 ВСЬ2 0,06321 Физические взаимодействия

Р1К3СА РТЕЫ 0,06178 Общие сигнальные пути

СА8Р9 СА8Р3 0,05994 Физические взаимодействия

ВМ¥ МСЬ1 0,05874 Физические взаимодействия

МСЬ1 В1К 0,05727 Физические взаимодействия

TMBIM6 BCL2 0,05359 Физические взаимодействия

CASP9 CASP8 0,05351 Общие белковые домены

CASP8 CASP3 0,05274 Физические взаимодействия

BCL2 BAX 0,04800 Физические взаимодействия

BCL2L1 BIK 0,04653 Физические взаимодействия

BAX CASP3 0,04629 Общие сигнальные пути

BMF MCL1 0,04543 Физические взаимодействия

BCL2 CASP3 0,04440 Общие сигнальные пути

DLG1 PIK3CA 0,03921 Общие сигнальные пути

BCL2L1 PIK3CA 0,03903 Общие сигнальные пути

BMF BCL2L1 0,03790 Физические взаимодействия

BCL2 кодирует регуляторный белок из семейства Bcl, которые ингибируют клеточную гибель (апоптоз) двумя путями - изменяя проницаемость митохондриальной мембраны (это предотвращает выход цитохрома C из митохондрий и ингибирует каспазы) и связываясь с APAF1 (фактор, ассоциированный с апоптозом) (Кутилин Д.С., Гусарева М.А., Кошелева Н.Г. и соавт., 2020). Чрезмерная экспрессия антиапоптотических генов и недостаточная экспрессия проапоптотических генов могут привести к отсутствию гибели клеток, характерной для рака. Гиперэкспрессия BCL2, ассоциированная с его повышенной копийностью, встречается и при многих видах рака (Kaiser U., Schilli M., Haag U. et al., 1996).

Ген BAX (Bcl-2-associated X protein) кодирует белок, который взаимодействует с митохондриальным потенциал-зависимым анионным каналом и увеличивает его открытие, что приводит к потере мембранного потенциала и высвобождению цитохрома C. Кроме того активированный BAX и Bak образуют олигомерные поры в наружной мембране митохондрий, что приводит к активации каспаз и реализации программы апоптоза (McArthur K. et al., 2018).

Ген CASP-3 кодирует протеолитический фермент, одну из эффекторных каспаз человека, взаимодействующую с каспазой-8 и каспазой-9. Пошаговая инициация каспазного каскада выполняет ведущую роль в клеточном апоптозе. Каспаза-3 активируется в апоптотической клетке как внешним, так и внутренним

(митохондриальным) путями (Ghavami S., Hashemi M., Ande S.R. et al., 2009). Отличительной чертой про-каспазы 3 является необходимость постоянной регуляция, потому что иначе активность каспазы приводит к тотальной гибели всех клеток (как здоровых, так и патологических). Внешняя активация каспазы-3 далее инициирует каспазный каскад, характерный для сигнального пути апоптоза, в котором данный белок играет доминирующую роль (Boatright K.M., Salvesen G.S., 2003).

Соответственно, сниженная копийность про-апоптозных генов (BAX, CASP3) и повышенная копийность анти-апоптозного гена BCL2, обеспечивают аномально высокую (по сравнению с нормальными клетками) пролиферативную активность клеток серозной аденокарциномы низкой степени злокачественности, при этом противоположный эффект оказывает повышенная копийность гена анти-онко-белка PTEN, что в совокупности обеспечивает лучшую выживаемость пациентов данной группы.

Таким образом, в плазме крови больных серозной аденокарциномой яичников обнаружен профиль копийности генов CYP1B1, ESR1, SULT1E1, PTEN, BCL2, BAX и CASP3 дифференциальный для двух групп пациентов - с серозной аденокарциномой высокой и низкой степени злокачественности (таблица 4.4).

Таблица 4.4 - Профиль копийности генов в плазме крови больных серозной аденокарциномой яичников

Ген hgSC (n=50) lgSC (n=50)

CYP1B1 í N

ESR1 í N

SULT1E1 í N

PTEN N í

BCL2 N í

BAX N 1

CASP3 N 1

Примечание. N - не отличается от группы условно здоровых доноров (п=30); ] -статистически значимо выше (р<0,05), чем в группе условно здоровых доноров (п=30); [ -статистически значимо ниже (р<0,05), чем в группе условно здоровых доноров (п=30)

Основываясь на полученных результатах (таблица 4.4), далее формирование диагностической панели генов маркеров hgSC и lgSC производили на основе 49-ти пар генов, копийность которых значимо и стабильно отличалась между больными раком и условно-здоровыми донорами.

Вначале для определения диагностической значимости выбранных пар был проведен анализ их способности классифицировать доноров на группу больных раком или контрольную группу при помощи ROC-кривых. Полученные ROC-кривые со значением площади под кривой (AUC) не менее 0,7, представлены на рисунке 4.5.

Для пары генетических локусов ESR1/BCL2 значение AUC было равно 0,80, для PTEN/BCL2 - 0,76; BAX/CASP3 - 0,76; BAX/BCL2 - 0,70; PTEN/BAX - 0,72; CYP1B1/ESR1 - 0,73 (рисунок 4.5).

Как видно из представленных на рисунке 4.5 данных, ни одна из пар маркеров не позволяла полностью разделить группы доноров. Поэтому была предложена панель генов, при помощи которой достигалась максимальная точность классификации.

Для получения надежной диагностической панели генов применили математический подход, основанный на LASSO-пенализованной логистической регрессии и оптимизированный при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных (рисунок 4.6).

Регрессионные модели формировали из 14-ти пар генов с наиболее высоким значением AUC. Выбранные модели позволили правильно классифицировать образцы с точностью среднего значению AUC=0,93 (95% CI 0,9305-0,9320).

i-1-1-г

0.2 0.4 0.6 0.8 False positive rate AUC: 0.73

Рисунок 4.5. ROC-кривые классификации групп больных серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности и условно здоровых доноров (сплошная линия) или больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности и условно здоровых доноров (прерывистая линия) на основании показателя копийности генетических локусов. Представлены только ROC-кривые со значением AUC>0.70

Б В

Рисунок 4.6. LASSO-пенализованная модель для логистической регрессии уровня относительной копийности генетических локусов во внДНК плазмы крови. (A) Распределение регрессионных коэффициентов в bootstrap наборах данных; (Б) Важность переменных в bootstrap-моделях; (В) ROC-кривые для классификации образцов при помощи оптимизированной модели (непрерывная линия) и неоптимизированной модели (прерывистая линия)

Высокая важность перемеренных (рисунок 4.6Б) указывает на устойчивость классификатора к изменению состава выборки и на успешность методов отбора пар генов на предшествовавших этапах. На основании Ьоо1в1хар-моделей получена финальная панель генов:

РТЕЫ^иЬТ1Е1;

ESR1/BCL2;

РТЕЫ/ В^2;

ВАХ/В^2;

ESR1/BAX;

РТЕЫ/ВАХ.;

CYP1B1/ESR1.

Такое сочетание генов обеспечивает диагностическую чувствительность на уровне 95%, а специфичность на уровне 90% (ЛИС 0.98) при разделении доноров на группу онкологических больных и здоровых (рисунок 4.6). Однако, информативность такой панели гораздо шире, чем выявление серозной аденокарциномы яичника. Из вошедших в панель генов пары РТЕЫ/В^2,

BAX/BCL2, PTEN/BAX и PTEN/BCL2 связаны с опухолями низкой степени злокачественности, а CYP1B1/ESR1 - с опухолями высокой степени злокачественности. При этом важно отметить, что применение панели, состоящей из PTEN, SULT1E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1B1 позволяет выявлять больных серозной аденокарциномой яичника двух групп: низкой и высокой степени злокачественности (AUC=0.96).

4.2 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов CYP1B1 и ESR1

Как уже упоминалось в главе 1 и предыдущем разделе (4.1), серозная аденокарцинома яичников диагностируется, как правило, на поздней стадии и потому является ведущей причиной гибели пациенток от гинекологических злокачественных опухолей в современном мире (Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С., 2020). При этом подобные опухоли крайне гетерогенны на молекулярном и гистологическом уровнях организации (Blagden S.P., 2015), что является основой для их деления на серозную аденокарциному высокой и низкой степени злокачественности (Kurman R.J., 2013). Каждый из этих подтипов характеризуется особым клиническим течением (Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С., 2020) и отсутствием одобренного скринингового теста. Это препятствует их ранней диагностике (Bell R., Petticrew M., Luengo S., Sheldon T.A., 1998) и является актуальной проблемой, на решение которой направленно данное исследование.

Для эффективной и одновременно малоинвазивной ранней диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности, на основании проведенных нами исследований, хорошим потенциалом обладают молекулярно-генетические маркеры внеклеточной ДНК плазмы крови. Так проведенный нами анализ базы данных TCGA позволил выделить ряд таких генов-маркеров - CYP1-B1 и ESR1 (регулирующих метаболизм эстрогена), показатель числа копий которых возможно использовать для малоинвазивной диагностики.

Подробное описание биологических функций данных генетических локусах представлено в предыдуших разделах диссертации.

Нами был проведен анализ патентных источников, который показал, что известны следующее изобретения, наиболее близкие нашему:

1. «Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей» (патент ЯИ №2556129 С2 от 10.07.2015). Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей яичников, поджелудочной железы и других злокачественных опухолей с использованием антител против CD70. Моноклональное антитело (SG-21.1C1 или SG-21.5D12) специфически связывается с денатурированным CD70 человека, экспрессируемым в образце клеток или тканей человека. В качестве биоматериала используется образец клеток или тканей человека фиксированный формалином и погруженный в парафин. Способ предусматривает: 1) получение образца ткани яичника или другого органа (легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, толстой кишки); его фиксацию и денатурацию; 2) добавление антитела CD70 и обнаружение связывания антитела с фиксированным образцом; 3) оценку экспрессия CD70 - наличие экспрессии указывает на вероятность наличия у пациента злокачественной опухоли.

2. «Способ ранней диагностики неопластической трансформации эндометриоидных кист яичников» (патент RU 2730952 С1 от 26.08.2020). Изобретение предназначено для диагностики риска неопластической трансформации эндометриоза яичников. При наличии повышенного уровня онкомаркера СА125 у пациенток берут операционный материал, который, после стандартной гистологической проводки, используют для иммуногистохимического исследования с антителом к WT1, а интерпретацию результатов иммуногистохимического исследования с указанным антителом осуществляют с учетом локализации позитивных клеток в эпителии эндометриоидных кистозных образований яичника путем подсчета количества окрашенных эпителиальных клеток и интенсивности окрашивания, выражая полученные количественные

результаты в процентах. Изобретение обеспечивает возможность достоверной диагностики серозной дифференцировки эпителия эндометриоидных кистозных образований яичников, характерной для начала неопластической трансформации.

Однако, описанные выше способы принципиально отличаются от нашего подхода. При этом они имеют значительно меньшую точностью, чувствительность и специфичность, а также более сложны для клинической реализации и не являются малоинвазивными.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов CYP1B1 и ESR1».

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности.

Технический результат достигается тем, что проводят определение копийности генетических локусов СУР1В1 и ESR1 относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя ЕУА-Огееп и высокоспецифичных синтетических олигонуклеотидов используя в качестве матрицы внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (гС№) по формуле rCN =2-ДС(1), где С(1:) - медиана сигналов флюоресценции, ДСф =С(ген мишень) -С^референсный ген), и сравнивают полученные значения rCN с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rCN сгр1в1>(6,9±0,23)*10-3 и гС^8ю>(10Л±0Д0)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности, а при значениях гС^гр1В1<(3,5±0,31)*10-3 и гС^ю< (2,0±0,09)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников.

Способ реализуется следующим образом:

1) Образцы крови объемом 10 мл смешиваю с 3 мл 10 мМ фосфатного буфера

(рН 7.5, 0.15 М №С1 и 50 мМ ЭДТА) и разделяют на плазму/фракцию клеток центрифугированием в течение 15 минут при 400g и 15°С.

2) Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и ПЦР-РВ с высокоспецифичными синтетическими олигонуклеотидами для локусов CYP1B1, ESR1 и ОАРОИ.

3) Анализируют первичные данные ПЦР-РВ и вычисляют относительную копийность (гСК) по формуле, описанной выше.

4) Сравнивают полученные значения гСК с прогностическими показателями копийности, и при значениях гС^Р1В1>(6,9±0,23)*10-3 и гСКе8ю>(10,1±0,10)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности (чувствительность 98%, специфичность 90%), а при значениях гСКсу?1Б1<(3,5±0,31)*10-3 и гСКевю<(2,0±0,09)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников (чувствительность 98%, специфичность 90%).

Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов CYP1B1, ESR1 и ОАРОИ. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (представлены в Главе 2) осуществлялся с использованием референсных последовательностей КСБ1 ОепБапк.

Предлагаемым способом было осуществлено обследование 50 пациенток, у которых была диагностирована серозная аденокарцинома яичников высокой степени злокачественности, и 30 условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний). Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся следующие примеры.

1. Группу из 30 условно-здоровых доноров в возрасте от 25 до 63 лет обследовали заявляемым способом на копийность генов CYP1B1 и ESR1 относительно ОАРОИ. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288) и с разрешения этического комитета ФГБУ «НМИЦ

онкологии» Минздрава России. У всех условно-здоровых доноров-добровольцев взяли кровь при помощи вакутейнера с антикоагулянтом. Из полученной после центрифугирования плазмы выделили внДНК, и провели анализ заявленным способом.

Значения гСсгР1В1 находились в интервале от 3,19 *10-3 до 3,81*10-3 (у 27 доноров) и гСебю в интервале от 1,91 *10-3 до 2,09 *10-3 (у 27 доноров), что соответствует показателям гС характерным для отсутствия злокачественных опухолей яичников. У 3 доноров (в возрасте старше 60 лет) полученный результат был неопределенным (промежуточный интервал): гССуР1В1 в интервале от 3,91 *10-3 до 4,21*10-3, гС^ю в интервале от 2,55*10-3 до 2,79*10-3. Было проведено инструментальное и лабораторное обследование всех доноров (УЗИ органов брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза, компьютерная томографию с контрастом органов брюшной полости и полости малого таза, МРТ, определение опухоль-ассоциированного антиген СА-125).

2. Группу из 50 человек, первично обратившихся по поводу заболевания раком яичников (с гистологически подтвержденной серозной аденокарциномой яичника), обследовали заявляемым способом на копийность генов СГР1В1 и ESR1 относительно GAPDH. Медиана возраста исследуемых составила 58,0±6,3 лет, на момент выполнения исследования 48 пациентов имели верифицированный диагноз серозной аденокарциномой яичника III стадии (от Т3ШМ0 до Т3ШМ1), и 2 пациентки диагноз серозной аденокарциномой яичника на стадиях Т4№М1 и Т4ШМ2. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).

Для 49 пациенток значения гССуР1В1 находились в интервале от 6,67 *10-3 до 7,13*10-3 и гС^ю в интервале от 10,0*10-3 до 10,2*10-3, что соответствует показателям гС характерным для серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности. У 1 пациентки (в возрасте старше 64 лет) полученный результат был неопределенным (промежуточный интервал):

г^Р1В1 = 6,01 *10-3, гСевЮ =5,15*10-3.

Данный способ является экономически оправданным для диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Его возможно осуществлять в условиях стандартной лаборатории ПЦР.

4.3 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности на основании показателя копийности генов РТЕМ, ВСЬ2 и ВАХ

Данные представленные в предыдущих главах и разделе 4.1. показывают, что в качестве маркеров для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности допустимо использование показателя относительной копийности генов РТЕЫ, В^2 и ВАХ.

Анализ патентных источников показал, что известны следующее изобретения, наиболее близкие нашему:

1. «Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей» (патент RU №2556129 С2 от 10.07.2015).

2. «Способ ранней диагностики неопластической трансформации эндометриоидных кист яичников» (патент RU №2730952 С1 от 26.08.2020).

Эти способы принципиально отличаются от нашего (подробное описание представлено в разделе 4.1), обладают меньшей точностью, чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами. При этом данные способы более сложны для клинической реализации и не являются малоинвазивными.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности на основании показателя копийности генов РТЕЫ, В^2 и ВАХ».

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового и точного способа для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности.

Технический результат достигается тем, что проводят определение копийности генетических локусов РТЕЫ, ВСЬ2 и ВАХ относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим красителем ЕУА^гееп и высокспецифичными синтетическими олигонуклеотидами на матрице внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (гСК) по формуле гС^2-ДС(1), где С(1:) - медиана сигналов флюоресценции, ДСф =С(ген мишень) - Сг(референснъш ген), и сравнивают полученные значения rCN с прогностическими показателями копийности, и при гСНРТЕЫ>(4,9±0,13)*10-3, гС^сЕ2>(10,1±0,10)*10-3 и гС^ах<(0,5±0,01)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников низкой степени злокачественности, а при значениях гС^теы<(4,9±0,13)*10-3, гС^а,2< (10,1±0,10)*10-3 и гСНвах>(0,5±0,01)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников.

Способ реализуется следующим образом:

1) Образцы крови (как описано в разделе 4.2.) разделяют на плазменную и клеточную фракцию путем центрифугирования в течение 15 минут при 400g и 15С.

2) Из полученной плазмы выделяют внеклеточную ДНК методом фенол-хлороформной экстракции.

3) Проводят ПЦР в режиме реального времени с высокоспецифичными синтетическими нуклеотидами для локусов РТЕЫ, ВСЬ2, ВАХ и GAPDH.

4) Анализируют первичные данные ПЦР и вычисляют относительную копийность (гСК) по формуле представленной в разделе 4.2.

5) Сравнивают полученные значения rCN с прогностическими показателями копийности, и при значениях гС№теы>(4,9±0,13)*10-3, гС№ср2>(10,1±0,10)*10-3 и гСНвах<(0,5±0,01)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников низкой степени злокачественности, а при значениях гС^теы<(4,9±0,13)*10-3, гС^сЬ2<(10,1±0,10)*10-3 и гС^ах>(0,5±0,01)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников (чувствительность 95%, специфичность 91%).

Данным способом было осуществлено обследование 50 пациенток, у которых была диагностирована серозная аденокарцинома яичников низкой степени злокачественности, и 30 условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний). Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся следующие примеры.

1. Группу из 30 условно-здоровых доноров в возрасте от 25 до 63 лет обследовали заявляемым способом на копийность генов РТЕЫ, ВСЬ2, ВАХ относительно ОАРОИ. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288) и с разрешения этического комитета ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. У всех условно здоровых доноров-добровольцев взяли кровь при помощи вакутейнера с антикоагулянтом. Из полученной после центрифугирования плазмы выделили внДНК и провели анализ заявленным способом.

Значения гСРТЕЫ находились в интервале от 2,59*10-3 до 3,41 *10-3 (у 28 доноров), гСВСи в интервале от 4,40*10-3 до 7,11*10-3 (у 29 доноров) и гСвах в интервале от 0,97*10-3 до 1,68*10-3 (у 30 доноров), что соответствует показателям гС, характерным для отсутствия злокачественных опухолей яичников. У 2 доноров (в возрасте старше 61 года) полученный результат был признан неопределенным (пограничные значения): гС РТЕЫ в интервале от 4,76*10-3 до 4,77*10-3, гСВСь2 у 1 из 2 доноров равен 9,97*10-3. Было проведено инструментальное и лабораторное обследование всех доноров (УЗИ органов брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза, компьютерная томографию с контрастом органов брюшной полости и полости малого таза, МРТ, определение опухоль-ассоциированного антиген СА-125).

2. Группу из 50 человек, первично обратившихся по поводу заболевания раком яичников (с гистологически подтвержденной серозной аденокарциномой яичника), обследовали заявляемым способом на копийность генов РТЕЫ, ВСЬ2, ВАХ относительно ОАРОИ. Медиана возраста исследуемых составила

57,0±5,4 лет, на момент выполнения исследования 47 пациентов имели верифицированный диагноз серозной аденокарциномой яичника III стадии (от Т3ШМ0 до Т3ШМ1) и 3 пациентки - диагноз серозной аденокарциномой яичника на стадиях Т2ШМ0 и Т2К0М0. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).

Для 48 пациенток значения гСРТЕЫ находились в интервале от 5,47*10-3 до 6,71 *10-3, гСВСи в интервале от 10,01 до 14,62 и гСВАХв интервале от 0,21 *10-3 до 0,49*10-3, что соответствует показателям гС характерным для серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности. У 2 пациенток (в возрасте старше 65 лет) полученный результат был неопределенным (пограничные значения): гСртеы (5,02 и 5,00 )*10-3, гСвсь2 (10,01 и 10,00)*10-3 и гСвах (0,52 и 0,57)*10-3.

Этот способ является экономически оправданным для диагностики серозной аденокарциномы яичников низкой степени злокачественности, обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С 70-х годов XX века проводится интенсивный поиск маркеров рака яичника для диагностики и прогнозирования клинического течения заболевания (Earp M. et al., 2016; Paik E.S. et al., 2016; Meng X. et al., 2017). Серозная аденокарцинома является наиболее распространенным подтипом злокачественных опухолей яичников (Цандекова и соавт., 2020), для которого пока не разработано адекватного скринингового теста, и поэтому существуют определенные сложности в выявлении данного заболевания на ранней стадии. Повышение эффективности раннего выявления опухолей яичника возможно при углубленном изучении их молекулярных характеристик и применении различных подходов, таких как идентификация возможных предраковых поражений с помощью биомаркеров сыворотки/плазмы крови (например, циркулирующей внеклеточной ДНК).

Несмотря на разработку и внедрение в клиническую практику новых принципов терапии РЯ в последние годы, общая выживаемость данной категории больных существенно не повысилась. В связи с этим в настоящее время активно проводятся многочисленные исследования, направленные на поиск новых высокоэффективных диагностических маркеров (Santoiemma P.P. et al., 2016; Guo X. et al., 2017; Liu W. et al., 2017; Pavlov M.J. et al., 2017).

Эти исследования в последние 5 лет позволили раскрыть в качестве таких маркеров потенциал показателя числа копий генов (Copy Number Variation (CNV)). CNV представляет собой особый тип генетического полиморфизма, заключающийся в увеличении/уменьшении количества копий определенного генетического локуса, что в итоге приводит к изменению экспрессии данного локуса и изменению концентрации его продукта (белка, не кодирующей РНК) в клетке (Кутилин Д.С и соавт., 2019).

Для формирования перечня потенциальных молекулярных маркеров для типирования и диагностики серозной аденокарциномы мы обратились к данным проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA), доступным на портале Genomic Data Commons. Эта база содержит молекулярно-генетические данные более 14531 больных 38-ю видами онкологических заболеваний, в том числе 3401 пациента с

диагнозом рак яичников. С помощью алгоритма GISTIC2 было проанализировано изменение копийности 20795 генов, из которых было выбрано 34 генетических локуса (ВАХ, ВСЬ2, ТР-53, МОМ2, САБР-9, САБР-3, САБР-7, САБР-8, РЯКС1, БОХ2, ОСТ4, Р1К3, РТЕЫ, С-МУС, БОХ18, АКТ1, ЫОТСИ1, ВЯСА1/2, ЕХО1, БСЖ1А, КЯАБ, ЕОЕЯ, ВЯАГ, СУР1-А1, -А2, СУР1-В1, СУР-19А, ЕЖ1/2, ОРЕЯ, БТБ, БиЬТ-1А, БПЬТ-1Е1) наиболее часто изменяющих показатель копийности при серозной аденокарциноме яичников.

Далее выявленный перечень генов был валидирован на выборке из 200 пациентов метом ПЦР в реальном времени. Молекулярно-генетическое исследование СКУ генов, ответственных за регуляцию таких биологических процессов как апоптоз, клеточная дифференцировка и пролиферация, репарация ДНК, рецепция и метаболизм эстрогенов в нормальных и опухолевых клетках яичников позволило выявить перечень наиболее характерных маркеров серозной аденокарциномы яичника - показатель копийности генов Р1К3СА, ВСЬ2, ВАХ, САБР-3 и САБР-8. На основании отличий по уровню СКУ было выделено 2 молекулярно-генетических подтипа серозной аденокарциномы, соответствующих двум гистологическим подтипам - высокой (МОМ2, БОХ2, ЕБЯ1, СУР1В1, БШТ1Е1, ТР53, ВЯСА2) и низкой (Р1К3СА, РТЕЫ, ВСЬ2, ВАХ,, САБР3, САБР8) степени злокачественности. Эти подтипы обладали значительной внутренней молекулярной гетерогенностью, также позволившей разделить каждый из них на несколько подгрупп - для серозной аденокарциномы высокой степени злокачественности - 3 подгруппы, а для серозной аденокарциномы низкой степени злокачественности - 4 подгруппы. Молекулярно-генетические различия между гистологическими подтипами серозной аденокарциномы яичников, вероятно, лежат в основе их различного клинического течения.

С помощью метода Каплана-Мейера была оценена общая выживаемость больных серозной аденокарциномой с учетом молекулярно-генетического подтипа рака яичника. Было установлено, что два основных подтипа серозной аденокарциномы яичника (высокой и низкой степени злокачественности) существенно отличаются по такому показателю как общая выживаемость, что не

противоречит литературных данным. Однако, важно отметить, что каждый из этих подтипов обладает внутригрупповой молекулярно-генетической гетерогенностью, которая позволила выделить в каждом из них дополнительные подгруппы, также отличающиеся по выживаемости пациенток. Так, в кластере больных серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности наихудшими показателями выживаемости характеризовались пациенты 3 подгруппы (агрессивный подтип), а наилучшими показателями обладали подгруппы 1, 2 и 4 (благоприятный подтип). В кластере больных серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности наихудшими показателями выживаемости характеризовались пациенты 1 подгруппы (высоко агрессивный подтип), а наилучшими показателями обладали подгруппы 2 и 3 (не агрессивный подтип).

С использование однофакторного регрессионного анализа Кокса было оценено влияние копийности генов на выживаемость. На общую выживаемость влияла копийность только 4 генов - БОХ2 (р=0,01), БПЬТ1Е1 (р=0,03), ВСЬ2 (р=0,02) и РТЕЫ (р=0,04).

Таким образом, проведенное исследование позволило не только выделить на молекулярно-генетическом уровне подтипы серозной аденокарциномы яичников низкой и высокой степени злокачественности, но и выявить особенности их клинического течения. Полученные результаты открывают большие перспективы для персонифицированного подхода к лечению этих опухолей. Однако, для полной реализации этого подхода необходим переход от использования биоматериала полученного на этапе операции к малоинвазивной диагностике.

Создание эффективных малоинвазивных методов ранней диагностики злокачественных опухолей яичников невозможно без скрининга молекулярно-генетических маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. Внеклеточная ДНК происходит из внутриклеточной (ядерной, митохондриальой) ДНК различных клеток (подвергшихся апоптозу/некрозу), из вирусной и бактериальной ДНК.

На внДНК, выделенной из плазмы крови 100 больных серозной аденокарциномой яичников высокой/низкой степени злокачественности и

30 условно здоровых доноров, проведена валидация потенциальных молекулярно-генетических маркеров, выявленных на предыдущем этапе

Во время валидации данных было обнаружено статистически значимое (р<0,005) увеличение копийности генетических локусов SULT1-E1, CYP1-B1 и ESR1 во внеклеточной ДНК плазмы крови у больных серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности статистически значимое (р<0,05) увеличение копийности генетических локусов PTEN и BCL2 и снижение копийности генетических локусов BAX и CASP-3 во внеклеточной ДНК плазмы крови у больных серозной аденокарциномой яичников низкой степени злокачественности относительно внеклеточной ДНК плазмы крови условно здоровых доноров.

Используя LASSO-пенализованную логистическую регрессию и оптимизаци при помощи множественных перевыборочных (bootstrap) наборов данных была создана надежная диагностическая модель, позволяющая правильно классифицировать образцы на больных раком и здоровых с точностью среднего значению AUC=0.93. По результатам построения bootstrap-моделей был сформирован состав финальной регрессионной модели:

PTEN/SULT1E1;

ESR1/BCL2;

PTEN/ BCL2;

BAX/BCL2;

ESR1/BAX;

PTEN/BAX; CYP1B1/ESR1.

Такое сочетание генетических локусов позволило достигнуть чувствительности в 95% и специфичности в 90% (AUC 0.98) при классификации доноров на группу онкологических больных и группу здоровых. Однако, информативность такой панели гораздо шире, чем выявление серозной аденокарциномы яичника. Из вошедших в панель генов пары PTEN/BCL2, BAX/BCL2, PTEN/BAX и PTEN/BCL2 связаны с опухолями низкой степени

злокачественности, а СУР1В1/ЕБЯ1 - с опухолями высокой степени злокачественности. При этом важно отметить, что применение панели, состоящей из РТЕЫ,, БШТ1Е1, ЕБЯ1, ВАХ, ВС£2 и СУР1В1 позволяет выявлять больных серозной аденокарциномой яичника двух групп: низкой и высокой степени злокачественности.

104

ВЫВОДЫ

1. Биоинформационный анализ выявил 34 генетических локуса (ВАХ, ВСЬ2, ТР-53, МБМ2, САБР-9, САБР-3, САБР-7, САБР-8, РЯКС1, БОХ2, ОСТ4, Р1К3, РТЕЫ, СМУС, БОХ18, АКТ1, ЫОТСИ1, ВЯСА1/2, ЕХО1, БСЫЫ1А, КЯАБ, ЕОЕЯ, ВЯАЕ, СУР1-А1, -А2, -В1, СУР-19А, ЕБЯ1/2, ОРЕЯ, БТБ, БШТ-1А, БШТ1-Е1), показатель копийности которых можно использовать в качестве маркеров серозной аденокарциномы яичников.

2. Серозная аденокарцинома яичника высокой степени злокачественности характеризуется статистически значимым (р<0,005) повышением копийности генов МОМ2, БОХ2, ЕБЯ1, СУР1-В1 и БШТ1-Е1 в 3,4, 5,3, 4,2, 4,0 и 2,9 раза соответственно, и снижением копийности генов ТР-53 и ВЯСА2 в 2,0 и 2,5 раза соответственно, а серозная аденокарцинома яичника низкой степени злокачественности - статистически значимым (р<0,005) повышением копийности Р1К3СА, РТЕЫ и ВСЬ2 в 2,5, 2,5 и 4,7 раза соответственно и понижением копийности генов ВАХ, САБР-3 и САБР-8 в 2,5, 2,0 и 2,0 раза соответственно в опухолевых клетках яичника относительно нормальных.

3. Серозную аденокарциному яичника высокой степени злокачественности можно разделить на 3 молекулярных подтипа, отличающихся уровнем копийности генов БиЬТ1-Е1 и БОХ2, а также общей выживаемостью больных. Серозную аденокарциному яичника низкой степени злокачественности можно разделить на 4 молекулярных подтипа отличающихся уровнем копийности генов РТЕЫ и ВСЬ2 и общей выживаемостью больных.

4. Одновременное определение показателей копийности генов РТЕЫ, БШТ1-Е1, ЕБЯ1, ВАХ, ВСЬ2 и СУР1-В1 во внеклеточной ДНК плазмы крови (положительно коррелируют с данными показателями в опухолевых клетках), позволяет выявлять больных серозной аденокарциномой яичника двух групп: низкой и высокой степени злокачественности.

5. Разработан способ малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника низкой степени злокачественности с чувствительностью 95% и специфичность 91%, основанный на определении

показателя копийности генов РТЕЫ, ВАХ и ВСЬ2 во внеклеточной ДНК плазмы крови.

6. Разработан способ малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника высокой степени злокачественности с чувствительностью 98% и специфичность 90%, основанный на определении показателя копийности генов СУР1-В1 и Е8Я1 во внеклеточной ДНК плазмы крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для эффективной малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичника низкой и высокой степени злокачественности целесообразно проводить определение показателя копийности генов PTEN, SULT1E1, ESR1, BAX, BCL2 и CYP1B1 во внеклеточной ДНК плазмы крови.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РЯ - рак яичника

УЗИ - ультразвуковое исследование

18Ф-ФДГ ПЭТ - позитронная эмиссионная томография

HEP4 - человеческий эпидидимальный (human epididymis protein)

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

внДНК - внеклеточная ДНК

AUC - площадь под ROC-кривой (area under ROC curve) TCGA - The Cancer Genome Atlas CNV - Copy Number Variation FMD - Functional module detection

LgSC (нзСА) - Серозная аденокарцинома низкой степени злокачественности (low-grade serous cancer)

hgSC (всСА) - Серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности (high-grade serous cancer)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

RT-qPCR - количественной ПЦР в режиме реального времени

rC - относительная копийность генов

FC - кратность отличия (fold change)

СТИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алябьева, М.А. Опыт комплексного лечения диссеминированной дисгерминомы яичника / М.А. Алябьева // Российский журнал детской гематологии и онкологии. - 2015. - Т. 2, № 3. - С. 71-75.

2. Амлаев, К.Р. Доступность качественной онкологической помощи в условиях города / К.Р. Амлаев, М.Г. Гейвандова, Е.Ю. Хорошилова // Социология города. - 2015. - № 3. - С.47-52.

3. Антошечкина, М.А. Анализ эффективности неинвазивных визуальных технологий в диагностике ранних стадий рака яичников / М.А. Антошечкина, Е.Б. Савинова, С.О. Чуркина // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2011. - № 4. - С. 94-97.

4. Ашрафян, Л.А. Возможности позитронно-эмиссионной томографии в диагностике первичного и рецидивного рака яичников / Л.А. Ашрафян, И.П. Асланиди, О.В. Мухортова [и др.] // Опухоли женской репродуктивной системы. -2012. - № 1. - С. 75-83.

5. Ашрафян, Л.А. Спорадический рак яичников: вероятная модель патогенеза / Л.А. Ашрафян // Журнал акушерства и женских болезней. - 2012. -№61 (4). - С.3-11.

6. Берген, Т.А. Методика МР-диффузии и ее применение в исследовании опухолей малого таза у женщин / Т.А. Берген, И.А. Трофименко // Бюллетень сибирской медицины. - 2012. - Т. 11, № 1. - С. 10-12.

7. Бехтерева, С.А. Первично-множественный рак яичников / С.А. Бехтерева, А.С. Доможирова, И.А. Аксенова, С.В. Пшиченко // Исследования и практика в медицине. - 2018. - Т.5, № 1. - С. 20.

8. Болдогоева, И.М. Возможности диагностики продолженного роста и рецидивов рака яичников / И.М. Болдогоева // Уральский медицинский журнал. -2009. - № 3. - С. 78-84.

9. Востров, А.Н. История и современные тенденции применения ультразвукового исследования при раке яичников / А.Н. Востров, С.О. Степанов, И.А. Корнеева // Лучевая диагностика и терапия. - 2013. - № 3 (4). - С. 22-28.

10. Гажонова, В.Е. Ранняя ультразвуковая диагностика рака яичников с помощью соноэластографии (результаты 5-летнего опыта работы) / В.Е. Гажонова, А.Е. Халмухамедова, Н.Н. Виноградова [и др.] // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2013. - № 1. - С.79-86.

11. Григорук, О.Г. Молекулярно-генетические исследования при диагностике рака легкого и рака яичников с использованием цитологического материала / О.Г. Григорук, Е.Э. Пупкова, Л.М. Базулина, А.Ф. Лазарев // Российский онкологический журнал. - 2017. - Т. 22, № 4. - С. 214-218.

12. Григорук, О.Г. Цитологическая и иммуноцитохимическая диагностика злокачественных опухолей яичника / О.Г. Григорук, В.Н. Богатырев, А.Ф. Лазарев // Эффективная фармакотерапия. - 2012. - № 37-2. - С. 42-49.

13. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2008 г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2010. - № 21 (2, прил. 1). - 87 с.

14. Димитриади, Т.А. Дифференциальная экспрессия микроРНК и их генов-мишеней при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях разной степени тяжести / Т.А. Димитриади, Д.В. Бурцев, Е.А. Дженкова, Д.С. Кутилин // Успехи молекулярной онкологии. - 2020. - Т.7(2). - С.30-44.

15. Жорданиа, К.И. Два пути развития серозного рака яичников / К.И. Жорданиа, А.Г. Паяниди, Е.В. Калиничева // Онкогинекология. - 2014. - № 3. -С.42-48.

16. Жорданиа, К.И. Рак яичников: Эпидемиология, морфология и гистогенез / К.И. Жорданиа, Е.В. Калиничева, А.А. Моисеев // Онкогинекология. -2017. - № 3 (23). - С. 26-32.

17. Кислякова, Ю.В. Организация онкологической помощи населению (на примере Саратовской области): проблемы и пути совершенствования / Ю.В. Кислякова, А.А. Максимова // Бюллетень медицинских интернет-конференций. -2015. - Т. 5, № 12. - С. 1719.

18. Кит, О.И. Изменение экспрессии эстроген-регуляторных генов при малигнизации тканей тела матки / О.И. Кит, Д.И. Водолажский, Д.С. Кутилин, Т.И.

Моисеенко [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2016. - №2 2 (157).

- С. 84-90.

19. Кит, О.И. Транскриптомная активность эстроген-регуляторных генов при малигнизации тканей тела матки / О.И. Кит, Д.И. Водолажский, Д.С. Кутилин, И.С. Никитин [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2016. - № 115. - С. 294304.

20. Когай, Н.В. Возможности сонографии, позитронно-эмиссионной томографии и серологического метода исследования в диагностике рецидивов рака яичников: специальность 14.01.13 «Лучевая диагностика, лучевая терапия»: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Когай Надежда Вячеславовна; ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России. - Москва, 2013. - 25 с.

21. Колесников, Е.Н. Зависимость общей и без рецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода / Е.Н. Колесников, А.Ю. Максимов, О.И. Кит, Д.С. Кутилин // Вопросы онкологии.

- 2019. - 65(5). - С. 691-700.

22. Кормош, Н.Г. Стандарты и нерешенные вопросы в лечении раннего рака яичников / Н.Г. Кормош, К.П. Лактионов, Н.С. Кержковская // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2009. - № 3-4. - С. 101-107.

23. Косенко, М.С. Рак яичников. История с продолжением / М.С. Косенко, М.З. Мамедова // Символ науки. - 2018. - № 4. - С.104-109.

24. Кузнецова, Е.П. Современные методы диагностики опухолевых образований и доброкачественных опухолей яичника / Е.П. Кузнецова, К.Г. Серебренникова // Фундаментальные исследования. - 2010. - № 11. - С. 78-83.

25. Кутилин, Д.С. Аберрантная транскрипционная активность генов как фактор радиорезистентности клеток линии ht-29 / Д.С. Кутилин, Гусарева М.А., Кошелева Н.Г. [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2020. - № 3.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29831