Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Титова, Виктория Андреевна

• Титова, Виктория Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Титова, Виктория Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ретровирусы как естественные векторы для переноса 12 экзогенных генов

1.1.1. Строение вириона ретровирусов

1.1.2. Жизненный цикл ретровирусов

1.1.3. Конструирование векторов на основе ретровирусов

1.2. Создание трансгенных животных путём трансформации половых клеток самцов

1.3. Использование молочной железы для синтеза 32 рекомбинантных белков

1.3.1. Получение соматических трансгенных животных с 33 помощью ретровирусных векторов

1.3.2. Производство рекомбинантных белков

1.3.2.1. Производство рекомбинантных белков фармакологического 34 назначения

1.3.2.2. Изменение состава и свойств молока

1.3.3. Животные-продуifенты рекомбинантных белков

1.4. Экспрессия трансгенных белков

1.4.1. Экспрессия продуктов трансгеное в молоко

1.4.2. Экспрессия продуктов трансгенов в кровь

1.5. Исследование способности ретровирусных векторов 48 переносить экзогенные конструкции в органы и ткани животных

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Реактивы и оборудование

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Оборудование

2.2. Используемые векторные системы

2.3. Анализ животных на наличие рекомбинантной вставки

2.3.1. Экстракция ДНК

2.3.2. Определение концентрации ДНК

2.3.3. Использование полимеразной цепной реакции для проведения 58 анализов на траисгенностъ

2.4. Анализ экспрессии трансгенных белков

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Оценка клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной 60 вставки

3.1.1. Разработка и оптимизация тест-систем

3.1.2. Оценка используемых клеток-упаковщиц на наличие 63 рекомбинантной вставки

3.2. Оптимизация метода выделения ДНК из слюны и 63 спермы

3.2.1. Оптимизация выделения ДНК из слюны

3.2.2. Оптимизация выделения ДНК из спермы

3.3, Исследование способности ретровирусных векторов для 66 локального переноса генов в молочную железу, кровь и семенники животных

3 3 J Исследование характера интеграции генной конструкции при введении ретровирусных векторов в молочную железу

3.3.2 Исследование характера интеграции при внутривенном введении клеток-упаковщиц, содержащих рекомбинантную ДНК

3.3.3. Оценка эффективности использования ретровирусных 73 векторов для переноса рекомбинантной генной конструкции в спермии in vivo

3.4. Исследование экспрессии трансгенного белка

3.4.1. Исследование динамики экспрессии рекомбинантного 75 эритропоэтина в молоко свиноматок

3.4.2. Исследование динамики экспрессии рекомбинантного 77 эритропоэтина в молоко крупного рогатого скота

3.5, Исследование распространения провируса в органах и go тканях при инъекции ретровирусных векторов в молочную железу

3.5.1. Исследование распространения провируса в органах и go тканях при инъекции ретровирусных векторов в молочную железу

3.5.2. Исследование распространения провируса в органах и 33 тканях животных при внутривенном введении ретровирусных векторов

3.5.3. Исследование распространения провируса в органах и 33 тканях при инъекции ретровирусных векторов в семенники

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве»

Актуальность темы.

Одним из приоритетных направлений развития науки и техники в области технологий живых систем является создание трансгенных форм животных и растений (Постановление Правительства РФ от 21 июля 1996 года, №2727/п-П8).

Последняя четверть века характеризуется быстрым прогрессом в применении техники генетической инженерии ко всё большей совокупности организмов от бактерий и дрожжей до млекопитающих. В 1985 г. впервые прозвучал доклад по проблеме создания сельскохозяйственных животных. Ранние работы были, в основном, сфокусированны на получении животных, несущих экзогены, отвечающие за рост и развитие, резистентность к заболеваниям, увеличение репродукции, изменение лактации, повышение эффективности переваривания кормов и улучшение иммунного ответа. В настоящее время, трансгенных животных используют в качестве моделей для исследования патогенеза различных наследственных и других заболеваний, для производства биологически активных белков для фармацевтической промышленности.

Несмотря на то, что для создания трансгенных животных, в том числе и сельскохозяйственных, находит применение целый ряд методов (инъекция в пронуклеус, липосомы и спермии как векторы, пересадка ядер), эффективность их получения остаётся на довольно низком уровне. Кроме того, создание трансгенных сельскохозяйственных животных лимитируется высокими материальными и временными затратами.

В этой связи возникает необходимость в поиске и разработке альтернативных подходов, позволяющих эффективно получать генетически модифицированных особей. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Ретровирусные векторы самостоятельно проникают в клетки хозяина, эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку.

Огромным преимуществом ретровирусных векторов является возможность их использования для получения так называемых фенотипических трансгенных животных методами локального (органного) трансгенеза. В отличие от введения трансгена в эмбриональные линии, использование ретровирусных векторов для локального переноса экзогенных генов животным в постнатальный период позволяет синтезировать рекомбинантные продукты в отдельных органах уже через несколько месяцев или даже дней после начала эксперимента. Особенно актуальным это является для экспрессии рекомбинантных белков с молоком сельскохозяйственных животных (свиней и коров), так как по сравнению с методом микроинъекции затраты времени от начала экспериментов и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются в 10 раз.

За последние десятилетия был разработан целый ряд методов, позволяющих вводить интересующие последовательности ДНК в клетки индивидуумов: микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, использование трансформированных первичных половых и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровирусных, аденовирусных и аденоассосиированных векторов, трансформированных спермиев и липосом. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы делает возможным введение и интеграцию в геном фрагментов ДНК длиной до 800000 пар нуклеотидов. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного таргетинга (Савченкова И.П. и др., 1996), даёт возможность тестирования интеграции трансгенов в культуре клеток и в ряде случаев проводить оценку их экспрессии (Зиновьева Н.А. и др., 2001). Перенос экзогенных генов посредством ретровирусных векторных систем рассматривают как перспективный метод для использования в следующих направлениях:

1) для получения «фенотипических трансгенов», т.е. животных с трансформацией отдельных органов (Брем Г. и др., 1995);

2) для генной терапии болезней человека и животных (Uckert W., et. al., 1999; Porada С. et. al, 1998; Pitt В et. al, 1995);

3) для синтеза рекомбинантных белков с молоком или придания молоку новых свойств (Gutierrez-Adan A. et. al., 1997; Chan A.W.S. et. al., 1998).

Введение экзогенных генов в молочную железу взрослых особей позволяет получать рекомбинантные белки (интерфероны, эритропоэтин и др.) с молоком лактирующих самок. Причём, по сравнению с традиционным методом микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы затраты времени от начала эксперимента до получения первых результатов об уровне экспрессии сокращаются с 4-5 лет до 4-5 месяцев.

Однако каждый из этих методов имеет ряд недостатков, ограничивающих их использование (Chan A.W.S. et. al., 2000). Негативными факторами являются: недостаточная визуализация пронуклеусов у сельскохозяйственных животных, объединение генов в тандемы в результате гомологичной рекомбинации между молекулами ДНК, не сайт-специфическая интеграция, хромосомные абберации (Дыбан А.П., 1989). Получение трансгенных животных с помощью первичных половых клеток, эмбриональных стволовых клеток, трансформированных спермиев и липосом также связано с определёнными трудностями (Hooper et al.,1996; Kim J.H., 1997). Так, при использовании зародышевых клеток, полученные особи в большинстве случаев являются химерными. Кроме того, лишь часть животных будут передавать трансген по наследству потомству (Брем Г. и др., 1995). Использование трансформированных спермиев и липосом не получило широкого распространения вследствие низкой воспроизводимости эксперимента и высокого процента отрицательных результатов.

В этой связи, с целью разработки оптимальной технологии локального трансгенеза, основанной на использовании ретровирусных векторных систем, актуальным является оценка эффективности отдельных методик для доставки ДНК в отдельные органы сельскохозяйственных животных, в частности в молочную железу свиней и коров.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является исследование способности ретровирусных векторов переносить генетическую информацию в органы и ткани сельскохозяйственных животных с использованием молекулярно-генетических методов.

Для достижения указанной цели были сформулированы для решения следующие задачи:

• оценить используемые линии клеток-упаковщиц на наличие рекомби-нантной вставки методом ПЦР анализа;

• отработать метод выделения ДНК из слюны и спермы сельскохозяйствен-ных животных;

• изучить эффективность доставки ретровирусными векторами рекомбинантной ДНК в органы и ткани животных при введении клеток-упаковщиц в молочную железу и ушную вену;

• оценить эффективность ретровирусных векторов для доставки рекомбинантной генной конструкции в спермии бычков in vivo;

• проследить в динамике экспрессию рекомбинантного эритропоэтина в молоке опытных животных;

• изучить характер распространения ретровирусных векторов в органах и тканях опытных животных.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые была изучена эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза органов и тканей сельскохозяйственных животных, в частности свиней и коров. Была исследована обусловленная рекомбинантными провирусными последовательностями экспрессия рекомбинантных белков в молоке свиней и коров в динамике, выявлено влияние места, времени инъекции, а так же количества инъецированных клеток-упаковщиц на уровень экспрессии. Был выполнен анализ распространения и локализации рекомбинантных провирусов в органах и тканях животных при инъекции клеток-упаковщиц в молочную железу и кровь свиней и коров.

Практическая ценность работы.

• Разработана тест-система для выявления рекомбинантных провирусных последовательностей в органах, тканях и молоке опытных животных;

• Показана возможность обусловленного ретровирусными векторами синтеза в молоке коров и свиней рекомбинантных продуктов экспрессии, в частности эритропоэтина человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность доставки генной конструкции эритропоэтина в ткани молочной железы животных как при инъекции ретровирусных векторов в паренхиму молочной железы, так и при внутривенной инъекции.

• Синтез рекомбинантного эритропоэтина в клетках молочной железы животных имеет место как после введения генной конструкции непосредственно в ткани молочной железы, так и после внутривенной инъекции.

• Распространение рекомбинантной генной конструкции происходит не только в пределах места инъекции, но наблюдается и в других органах и тканях, где оно имеет мелкоочаговый характер.

Апробация работы.

Материалы диссертационный работы были представлены на научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2000; конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001; научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2001; научных отчетах ВИЖа 2000-2001; научной конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 10 таблиц, 8 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 130 источников, в т.ч. 103 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Титова, Виктория Андреевна

5.ВЫВОДЫ

1. Применение методики выделения ДНК с помощью перхлората натрия, позволяет получать высокоочищенную ДНК из спермы и слюны животных для последующего использования в постановке ПЦР-анализа.

2. Анализ ДНК, выделенной из молока опытных свиней и коров, показал наличие генной конструкции эритропоэтина у всех исследованных животных, что доказывает эффективность применения ретровирусных векторов для доставки рекомбинантной ДНК в органы-мишени.

3. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из спермы бычков с генной конструкцией эритропоэтина, выявил наличие провируса у всех трёх животных. Показана возможность сохранения генной конструкции в сперме в течение двух месяцев после инъекции, что демонстрирует возможность интеграции рекомбинантной генной конструкции в половые клетки самцов in vivo.

4. Уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке свиней при внутривенном введении клеток-упаковщиц достигал 70 нг/мл, а при введении в молочную железу - 450 нг/мл. В молоке коров эти данные составили 800 нг/мл.

5. Исследование динамики экспрессии эритропоэтина в молоке свиней и коров в ходе лактации выявили различия в концентрации рекомбинантного белка. Количество рекомбинантного эритропоэтина в молоке коров было максимально в первый месяц лактации, затем снижалось до 50 нг/мл ко второму месяцу и до 30 нг/мл к третьему месяцу лактации. После третьего месяца лактации, наличия эритропоэтина в молоке коров выявлено не было. У свиноматок экспрессия рекомбинантного белка наблюдалась на протяжении всего периода лактации.

103

6. Исследование внутренних органов опытных животных выявило, что распространение рекомбинантной генной конструкции происходит не только в пределах места инъекции, но наблюдается и в других, в основном, сильно пролиферирующих органах и тканях. Кроме тканей молочной железы наличие рекомбинантной ДНК было обнаружено в слюнной железе (3 из 10 проб), поджелудочной железе (2 из 10 проб), надпочечниках (1 из 10 проб), спинном мозге (1 из 10 проб). После внутривенной инъекции рекомбинантная генная конструкция была обнаружена в слюнной железе, щитовидной железе, селезенке, головном мозге и почках.

7.Обнаружено, что локализация генной конструкции в исследованных органах имеет мелкоочаговый характер. Процент участков, содержащих генную конструкцию составляет в среднем: в молочной железе - 50%, в слюнной железе - 30 %, в поджелудочной железе - 20 %, надпочечниках-20%, спинном мозге-20%.

104

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При получении соматических трансгенных животных с генной конструкцией эритропоэтина рекомендуем использовать в качестве продуцентов крупный рогатый скот из-за большего содержания рекомбинантного белка в молоке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Титова, Виктория Андреевна, 2001 год

1. Атабеков И.Г. Реализация генетической информации//М., Наука,1972.

2. Баранов В. Медицина на пороге революции//М. Наука и жизнь.-2000.-№9.-С. 8-11.

3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л.К. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология.- 1993,- № 6.- С. 3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М. РАСХН. 1995.326 с.

5. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. //М.: Агропромиздат.- 1990.-511с.

6. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Марзанов Н.С, Эрнст Л.К., Брем Г. Методические рекомендации по определению вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота методом ПЦР-ЦДРФ анализа // Дубровицы. 2001. - 15 с.

7. Голиков А.Н. Физиология сельскохозяйственных животных. //М.: Агропромиздат, 1991.

8. Дыбан А.П. Трансгенные млекопитающие в биологии развития. // Онтогенез. Т.20. №6. 1989:577-592.

9. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст Л. К., Марзанов Н.С., Бочкарёв В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве//Дубровицы. -1998.-47 с.

10. Ю.Зиновьева Н.А., Эрнст J1.K, Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве// ВИЖ.-2001.-128 с.

11. П.Медведев И.К., Нечипуренко J1.B. Пролиферация клеток молочной железы у жвачных животных на разных стадиях беременности и лактации.// Сельскохозяйственная биология.-1988.-№2.-С.32-34.

12. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы—эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих.// Молокулярная биология,-1989.-Т.23.-Вып.2.-С.8-12.

13. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.//М. Мир.1998. Т.2. 362 с.

14. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных.//ВНИТИБП. М.,-1998.-С.363-460.

15. Эрнст JI.K. Животноводство—XXI век//Инф. бюл. Новое в животноводстве.-1998.-№ 1 (01 ).С .6-7.

16. Эрнст JI.K., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных// М. Агропромиздат. -1989.- 302 с.

17. Alexander L.J., Hayes G., Bawden W., Stewart A.F., Mackinley A.G. Complete nucleotide sequence of bovine (3-lactoglobulin gene // Animal Biotechnology. 1993. - V. 4. - P. 1-10.

18. AH S., Clarke A.J. Characterisation of the gene encoding ovine (3-lactoglobulin: similarity to the genes for retinol-binding protein and other secretory proteins// J. Mol. Biol. 1988. - V. 199. - P. 415-426.

19. Anderson W. Human gene terapy: Scientific and etical consideration.// Recombinant DNA Tech. Bull.-1985.-v.8.-P.55-63.

20. Bachiller D., Schellander K., Peli J., Ruther U. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1991. - V. 30. - P. 194-200.

21. Bank A. Human somatic cell gene therapy// Bioassays.-1986.-V.18.-P. 999-1007.

22. Bawden W.S., Passey R.J., Mackinlay A.G. The genes encoding the major milk-specific proteins and their use in transgenic studies and protein engineering // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews.- 1994,- V. 12,- P. 89-137.

23. Brem Transgenic animals.-In Biotechnology.//N.-Y.:VCH Press.-1993.-P.745- 832.

24. Brem G., Besenfelder U., Hartl P. Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic mammals // Chimica Oggi.- 1993.- V. 11.- P. 2125.

25. Brem G., Hartl P., Besenfelder U., Wolf E., Zinovieva N., Pfaller R. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits // Gene.- 1994.- V. 149.-P. 351-355.

26. Brinster R.L. Macking transgenic mice: is it really that easy? // Science. -1989. -V. 245. P. 590-591.

27. Brinster R.L., Zimmermann J.W. Spermatogenesis following malt germ-cell transplantation Proc. Natl. Asad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 11298-11302.

28. Bruce C., Whitelaw A. Truncated beta-lactoglobulin transgenes are expressed in the kidney // Gene. 1996. - V. 178. - P. 157-159.

29. Caffm J.P., Poutrel В., Rainard P. Physiological and pathological factors influencing bovine □-lactalbumin and D-lactoglobulin concentrations in milk // J. Dairy Sci. 1985. - V. 68. - P. 1087-1094.

30. Campbell S.M., Rosen J.M., Hennighausen L., Strech J.u., Sippel A.E. Comparison of the whey acidic protein genes of the rat and mouse // Nucl. Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 8685-8697.

31. Chan A.W.S. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning.-V. l.-N. l.-P. 25-46.

32. Chan A.W.S., Homan E.J., Ballou L.U., Burns J.C., Bremel R.D. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 14028-14033

33. Chan A.W., Kukolj G., Skalka A.M., Bremel R.D. Timing of DNA integration, transgenic mosaicism and pronuclear microinjection // Mol. Reprod. Dev.- 1999,- V. 52,- N. 4.- P. 406-413.

34. Chandan R.C., Parry R.M., Shahany K.M. Lysozime, lipase and ribonuclease in milk of various species // J. Dairy Sci.- 1968.- V. 51.- P. 606-607.

35. Clark A., Simons J., Wilmut I. et al. Pharmaceutical from transgenic livestock//Trends. Biotechnol.-1987.-V.5.-P.20-24.

36. Clarke R.A, Sokol D., Rigby N., Ward K., Murray J.D., Mackinlay A.G. Mammary gland specific expression of bovine aS 1 -casein derived transgenes in mice//Transgenics. 1994. -V. 1. - P. 313-319.

37. Conneely O.M., Headon D.R. Lactoferrin, lactoperoxidase and lysozyme: nature's protective proteins // In: Biotechnology in the Feed Industry, Proceedings of Alltech's Ninth Annual Symposium (ed.: Lyons T.P.).- 1993.- P. 123-131.

38. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes // Biol. Reprod.- 1999.- V. 61,- N. 5.- P. 1331-1339.

39. Ebner K.E., Schambacher F.L. Lactation (Eds.: Larson B.L., Smith V.R.), Academic Press. NY. - 1974. - V. 2. - P. 77-113.

40. Ekhterae D., Crumbleholme Т., Karson E. et al. Retroviral vector-mediated transfer of the bacterial neomycin resistance gene into fetal and adult sheep and human hematopoietic progenitors in vitro// Blood.-1990.-V.75.-P.365-369.

41. Ferry N., Heard JM. Liver-directed transfer vectors// Hum Gene Ther.-1998.-V.9.-N.14.-P. 1975-81.

42. Fox P.F. Chemistry of milk protein // In: Developments in dairy chemistry (Ed.: Fox P.F.), Applied Sci. Pub, NY.-1982,- P. 189-223.

43. Fox P.F. Heat-induced coagulation of milk // In: Developments in Dairy Chemistry (ed.: Fox P.F.), Applied Sci. Pub., NY.- 1982,- P. 189-223.

44. Gannon F., Powel R., Barry T. et al. Transgenic farm animals// J. Biotech.-1990.-V.16-P. 155-170.

45. Ghazizadeh S, Harrington R, Taichman L. In vivo transduction of mouse epidermis with recombinant retroviral vectors: implications for cutaneous gene therapy// Gene. Ther. -1999,- №6 (7).P. 1267-75.

46. Ghivizzani S., Lechman E., Tio C. et al. Direct retrovirus mediated gene transfere to the sinovium of the rabbit knee: implications for artritis gene therapy// Gene Ther.-1997.-V.4.-P.977-982.

47. Giangiacomo R., Nigro F., Messina G., Cattaneo T.M.P. Lysozyme: jast an additive or a technological aid as well? // Food Additives and Contaminants, 1992, V. 9, P. 427-433.

48. Goodman R.E., Shanbacher F.L. Bovine lactoferrin mRNA: sequence, analysis and expression in the mammary gland // Bichem. Biophys. Res. Comm. -1991,-V. 180. P. 75-84.

49. Gossler A., Doetschman Т., Korn R, et al. Transgenosis by means of blastocyst-dereived embryonic stem.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-Y.83.-P.9065-9069.

50. Green M.L., Marshall R.J. The acceleration by cationic materials of the coagulation of casein micelles by rennet// J. Dairy Res., 1977, V. 44, P. 521-531

51. Gruenbaum Y., Revel E., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens // J. Cell Biochem.-1991.-Suppl.15.-P.194.

52. Gutierrez-Adan A., Maga E.A., Made H., Shoemaker C.F., Medrano J.F., Anderson G.B., Murray J.D. Alterations of the physical characteristics of milk from transgenic mice producing bovine kappa-casein // J. Dairy Sci.-1996.- V. 79.-P. 791-799.

53. Gutierrez-Adan A., Pindado B. The use of transgenic techniques in farm animals: outlook on altering milk composition // A.E.T.E. on the WEB.-1997.-P.5-7.

54. Haskell R., Bowen R. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev.-1995.-№(3)-P.386-390.

55. Hitchin E., Stevenson E.M., Clark A.J., McClenaghan M., Leaver J. Bovine beta-casein expressed in transgenic mouse milk is phosphorylated and incorporated into micelles // Protein Expr. Purif. 1996. - V. 7. - № 3. - P. 247252.

56. Hooper M. Manipulation of the mouse genome by homologouse recombination//-1996.-V.27-P. 13-15.

57. Hughey V.L., Johnson E.A. Antimicrobial activity of lysozyme againist bacteria involved in food spoilage and food borne disease // Appl. Environ. Mikrobiol.- 1987.- V. 53.-P. 2165-2170.

58. Huguet E., Esponda P. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa // Mol. Reprod. Dev.- 1998.- V. 51.- P. 42-52.

59. Jaenish R. Infection of mouse blastocysts with SV 40-specific DNA sequences in the adult animals // Cold Spring Harbor Symp. 1974. - V. 39. - P. 375-380.

60. Jaenish R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. -P. 1260.

61. Jaenish R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71. - P. 1250-1254.

62. Jaenish R.Transgenic animals//Science.-1988.-V.240.-P. 1468-1474.

63. Janne J., Alhonen L., Hyttintn J.M., Peura Т., Tolvanen Т., Korhonen V.P. Transgenic bioreactors // Biotechnol. Annu. Rev. 1998. - V. 4. - P. 55-74.

64. Jolivet G., Devinoy E., Fontain M.L., Houdebine L.M. Structure of the gene encoding rabbit alpha SI-casein // Gene. 1992. - V. 113. - P. 257-262.

65. Jolles P., Jolles J. What's new in lysozyme research // Mol. Cell. Biochem. 1984. - V. 63. - P. 165-189.

66. Kah-Whye Peng. Strategies for targeting therapeutic gene delivery // Molecular Medicine Today.-1999.-V.5.-P.448-453.

67. Key M.A., Rothenberg S., Landen C.N., Bellinger D.A. et al. In vivo gene therapy of hemofilia В:sustained partial correction in factor IX-deficient dogs//Science.- 1993,-V. 262. -P. 117-119.

68. Kim J.H., Jung-Ha H.S., Lee H.T., Chung K.S. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig// Mol. Reprod. Dev.- 1997.-V46.-P. 1-12.

69. Koczan G., Hobom G., Seyfert H.-M. Genomic organisation of the bovine aSl-casein gene//Nucl. Acids Res.- 1991.-V. 19,-P. 5591-5596.

70. Kotani H, Newton PB III, Zhang S, Chaing et al. Impruved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy// Hum Gene Ther.-1994.-V 5.-P. 19-28.

71. Krausslich H. Neue Techniken in der Tierzucht und ihre Anwendungsmoglicheiten// Zuchtungskunde.-1985.-V6.- P.381-393.

72. Krausslich H., Brem G. Tierzucht und Allgemeine Landwirtschaftslehre fur Tiemediziner.//Enke.-1997.-P.596.

73. Kuizinga A., vanHaeringen N.J., Kijlstra A. Inhibition of hydroxyl radical formation by human tears // Ophthalmol. Vis. Sci.-1987,- V. 28.- P. 305313

74. Lavitrano M., Camaioni A., Frati V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. Sperm Cells as vectors for introduction foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice//Cells.- 1989.-V. 57.-P. 717-723.

75. Lee C.S., Kim K., Yu D.Y., Lee K.K. An efficient expression of human growth hormone (hGH) in the milk of transgenic mice using rat beta-casein/hGH fusion genes // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. - V. 56. - P. 211-222.

76. Lee K., Atice S., Rosen J., Differential regulation of rat (-casein-chloramphenicol acetyltransferase fusion gene expression in transgenic mice // Molecular Cell Biology. 1989. - V.9. - P.560-565.

77. Lee K.F., DeMayo F.J.,Atiee S.H. et al. Tissue-specific expression of the rat (a-casein gene in transgenic mice)// Nucl. Acid. Res.- 1988.-VI6.-P. 10271041.

78. Limon A., Briones J., Puig T. et al. High-titre retroviral vectors containing the enchanced green fluorescent protein gene for efficient expression in hematopoietic cells // Blood.- 1997.-V.90.-P.3316-3321.

79. Maga E.A., Anderson G.B., Huang M.C., Murray J.D. Expression of human lysozyme mRNA in the mammary gland of transgenic mice // Transgenic Res.- 1994,- V. 3,-P. 36-42.

80. Maga E.A., Anderson G.B., Murray J.D. The effect of mammary gland expression of human lysozyme on the properties of milk from transgenic mice // J. Dairy Sci.- 1995.- V. 78.- P. 2645-2652.

81. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk // Biotechnology.- 1995.- V. 13.-P. 1452-1457.

82. Marziali A.S., Ng-Kwan-Hang K.F. Effect of milk composition and genetic polymorphism on coagulating properties of milk // J. Dairy Sci.- 1986.- V. 69.-P. 1793-1798.

83. Masson P.L., Heremans J.F. Lactoferrin in milk from different species // Сотр. Biochem. Physiol.- 1971,- V. 39В,- P. 143-147.

84. Moreadith R., Radford N. Gene targeting in embrionic stem cells: the new physiology and metabolism// J. Med.-1997.-V75 (3)-P.208-216.

85. Nagano M., Brinster R.L. Spermatogonial transplantation and reconstitution of donor cell spermatogenesis in recipient mice // APMIS.- 1998.-V. 106,-N. l.-P. 47-57.

86. Ninomiya Т., Harabayashi M., Sagara J., Yuki A. Functions of milk protein gene 5' flanking regions oh human growth hormone gene // Mol. Reprod. Dev.-1994.-V. 37.-P. 276-283.

87. Perry A.C., Wakayama Т., Kishikawa H., Kasai Т., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection //Science. 1999.-V. 284.-P. 1180-1183.

88. Pervaiz S., Brew K. Homology of b-lactoglobulin, serum retinol-binding protein and protein HC // Science. 1985. - V. 228. - P. 335-337.

89. Phillips D.C. The 3-dimensional structure of an enzyme molecule // Sci. Anim.- 1966,- V. 215.-P. 78-90.

90. Pitt В., Schwarz M., Pilewski J. et al. Retrovirus-mediated gene transfer in lungs of living fetal sheep// Gene Ther.-1995.-V.2-P.344-354.

91. Platenburg G.J., Kootwijk E.P.A., Kooiman P.M., Woloshuk S.L., Nuijens J.H., Krimpenfort P.J.A., Pieper F.R., de Boer H.A., Strijker R. Expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice // Transgenic Res., 1994, V. 3, P. 99-108.

92. Porada C., Tran N., Eglitis M. et al. In utero gene therapy: transfer and long-term expression of the bacterial neo(r) gene in sheep after direct injection of retroviral vectors into preimmune fetuses// Hum Gene Ther.-1998.-V.9-P. 15711585.

93. Qasba P.K., Safaya S.K. Similarity of the nucleotide sequences of rat a-lactalbumin and chicken lysozyme gene // Nature. 1984. - V. 308. - P. 377-380.

94. Rodriguez A., Castro F.O., Aguilar A., Ramos В., Del Baco D.G., Lleonart R., De la Fuente L. Expression of active human erythropoietin in themammary gland of lactating transgenic mice and rabbits // Biol. Res. 1995. - V. 28. -P. 141-153.

95. Rokkones E., Fromm S.H., Kareem B.N., Klungland H., Olstad O.K., Hogset A., Iversen J., Bjoro K., Gautvik K.M. Human parathyroid hormone as a secretory peptide in milk of transgenic mice // J. Cell Biochem. 1995. - V. 59. - P. 168-176.

96. Rottmann O.J., Stratowa Ch., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific expression of hepatitis В surface antigen in mice following liposome-mediated gene transfer into blastocytes // Zbl. Vet. Med. A. 1985. - V. 32. - P. 676-682.

97. Salmons B, Gunzberg WHTargeting of retroviral vectors for gene therapy// Hum Gene Ther.-1993.-V4.-P.129-141.

98. Sato M., Jwase R., Kasai K., Tada N., Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative to sperm-mediated gene transter // Animal Biotechnology. 1994.-V. 5.-P. 19-31.

99. Schaar J. Effect of k-kasein geneticvariants and lactation number on the renneting properties of individual milks II J. Dairy Res.- 1984.- V. 51.- P. 97-106.

100. Schranner S. Untersuchungen zum maschinellen Milchentzug beim Kaninchen als Grundlage zur Bestimmung von Laktationsleistungen und Milchenthaltstoffen // Diss. Vet. Med.-Muenchen.- 1993.- P.95

101. Solaiman F, Zink MA, Xu G, Grunkemeyer J et al. Modular retroviral vectors for transgenic and therapeutic use.// Mol Reprod Dev.- 2000.- V56 (2Suppl).-P. 309-15.

102. Sperandio S., Lulli V., Bacci M.L., Fomi M., Maione В., Spadafora C., Lavitrano M. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species // Animal Biotechnology. 1996. - V. 7. - P. 59-77.

103. Stewart C.L., Vanek M., Wagner E.F. Expression of foreign genes from retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimeras // EMBO. 1985. - V. 4. - P. 3701-3709.

104. Stice S.L., Strelchenko N.S., Keefer C.L., Mathew L. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer // Biol. Reprod. 1996. -V. 54. - P. 100-110.

105. Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L., Hubert C., Houdebine L.M. Complete sequence of the rabbit whey acidic protein gene // Nucl. Asids Res. -1990.-V. 18.-P. 3641.

106. Toman D. Production of human type I collagene in transgenic mouse milk // 3rd International Symposium 'Exploiting transgenic technology for commercial development'. 1995. - San Diego, USA.

107. Tran N., Porada C., Zhao Y. et al. In utero transfer and expression of exogenous genes in sheep.// Exp. Hematol. -2000.-V.28.-P. 17-30.

108. UckertW.,WaltherW. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy. // Pharmac.Ther.-V.63.-P.323-347.

109. Van Brunt J. Molecular farming: transgenic animals as bioreactors// Biotechnology.-1988 ,-V.6-№ 10-P. 1149-115 5.

110. Vilotte J.L., Soulier S. Isolation and characterisation of the mouse a-Lactalbumin-encoding gene: interspecies comparison, tissue- and stage-specific expression // Gene. 1992. - V. 119. - P. 287-292.

111. Vilotte J.L., Soulier S., Mercier J.C., Gaye P., Hue-Delahaie D., Furet J.-P. Complete nucleotide sequences of bovine a-lactalbumin gene: comparison with its rat counterpart // Biochemie. 1987. - V. 69. - P. 609-620.

112. Vilotte J.L., Soulier S., Stinnakre M.G., Massoud M., Mercier J.C. Efficient tissue-specific expression of bovine D-lactalbumin in transgenic mice // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 186. - P. 43-48.118

113. Wang G., Williamson R., Muller G. et al. Ultrasaund-guided gene transfer to hepatocytes in utero// Fetal Diagn. Ther.-1998.-V.13-P. 197-205.

114. Waugh D.F. Formation and structure of casein micelles // In: Milk proteins chemistry and molecular biologe (ed.: McKenzie H.A.).- Acad. Press.-NY.-1971.-P. 3-85.