Молекулярно-генетические, антигенные и биологические свойства штаммов вируса гриппа птиц А, выделенных от водных и околоводных млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Гуляева Марина Александровна

• Гуляева Марина Александровна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Гуляева Марина Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Основные этапы в исследовании вируса гриппа

1.2 Общие сведения о вирусе гриппа птиц

1.2.1 Таксономическая принадлежность, классификация и номенклатура. 18 Природноочаговый характер вируса гриппа А

1.2.2 Строение вириона

1.2.3 Организация генома, изменчивость вируса

1.2.4 Дикие птицы как природный резервуар вируса гриппа птиц

1.2.5 Циркуляция вируса гриппа А среди млекопитающих

1.3 Вирус гриппа у водных млекопитающих 28 1.3.1 Грипп в популяциях морских млекопитающих

1.4 Вирус гриппа околоводных млекопитающих

1.5 Экологические особенности территории юга Западной Сибири и роль 46 данного региона в циркуляции вируса гриппа А

1.6 Экологические особенности Каспийского региона и роль данного 48 региона в циркуляции вируса гриппа А

1.7 Заключение по обзору литературы

: соьс Г1Я1 м 1ьм : 1 к с. п дои м п 1>1

2.1 Материалы и методы

2.2 Сбор и хранение биологических образцов

2.3 Выделение и размножение вирусов из биологического материала в 55 системе РКЭ

2.4 Создание коллекции штаммов вируса гриппа

2.4.1 Наработка пулов штаммов

2.4.2 Лиофилизация штаммов вируса гриппа

2.5 Изучение молекулярно-биологических и патогенных свойств штаммов 57 вируса гриппа А

2 5 1 Нирчс 5"

2.5.2 Экспериментальные животные

2.5.3 1УР1 тест

2.5.4 Схемы экспериментов на мышах

2.5.5 Вирусологические методы исследования

2.5.5.1 Изучение способности вируса к репродукции на РКЭ

2.5.5.2 Изучение способности вируса к репродукции на перевиваемой 61 культуре клеток

2.5.6 Молекулярно-биологические методы исследования

2.5.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 61 2 5 М 1 Вы. имен не Р11К М

2.5.6.1.2 Реакция обратной транскрипции

2.5.6.1.3 ПЦР-амплификация в режиме реального времени и детекция 62 продуктов амплификации

2.5.6.2 Секвенирование генома

2.5.6.3 Филогенетический и аминокислотный анализ

2.5.7 Серологические методы исследования 65 2.4.7.1 Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации

2.5.8 Гистологические методы исследования

2.5.8.1 Световая микроскопия

2.5.8.2 Иммуногистохимический анализ

2.5.9 Статистический анализ 67 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование вируса гриппа в популяции ондатр на территории 69 Чановской озерной системы. Новосибирская область

3.1.1 Выделение вируса гриппа птиц А от ондатры в системе РКЭ

3.1.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенного от 70 ондатры

3.1.2.1 Филогенетический анализ штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2)

3.1.2.2. Оценка способности штамма A/muskrat/R.ussia/63/2014 (H2N2) к

репродукции

3.1.2.3 Оценка патогенности штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) на 75 модельных животных

3.2 Исследование вируса гриппа в популяции Каспийских тюленей, о. 76 Малый Жемчужный, Каспийский регион

3.2.1 Выделение штамма вируса гриппа птиц от каспийских тюленей в 76 системе РКЭ

3.2.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенных от 77 каспийских тюленей в 2002 и 2012 гг.

3.2.2.1 Филогенетический анализ штаммов A/Caspian 78 seal Russia 1SS4 2<><>2(114\0) и \ Caspian seal Russia TI :<)i:dl4\0)

3.2.2.2 Аминокислотный анализ штаммов A/Caspian 82 seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/T l/2012(H4N6)

3.2.3 Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/1884/2002(114N6) 84 к репродукции in vitro, in vivo

3.2.4 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных 86 животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian

seal/Russia/1884/2002(H4N6)

3.2.4.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального

инфицирования мышей

3.2.4.2Изменения структуры почки в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/1884/2002(H4N6)

3.2.4.3 Изменения ткани печени в результате экспериментального 95 инфицирования мышей вирусом гриппа А штаммом A/Caspian

seal/Russia/1884/2002(H4N6)

3.2.4.4Изменения структур сердца в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/1884/2002(H4N6)

3.2.4.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/1884/2002(H4N6)

3.2.4.6Изменения структур головного мозга в результате

экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(114N6)

3.2.5 Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) к 104 репродукции in vitro и in vivo

3.2.6 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных

животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.2Изменения структур почки в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.3 Изменения структур печени в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.4Изменения структур сердца в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального

инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian

seal/Russia/T 1/2012(H4N6)

3.2.6.6Изменения структур головного мозга в результате

экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1 /2012(II4N6)

I ;\i .N<>41 щи i::

4 1 Выг.оды 133 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135 ПРИЛОЖЕНИЯ

Список использованных сокращений

ВГА - вирус гриппа А

ВГП - вирус гриппа птиц

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

РВ1 - полимеразный белок

РВ2 - полимеразный белок

РА - полимеразный белок

НА - гемагглютинин

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеин

М - матричный белок

MDCK (Madin-Darby canine kidney) - культура клеток почки собаки ТЦД - тканевая цитопатогенная доза ЭИД - эмбриональная инфицирующая доза NS - неструктурный белок

LPAI-вирус (low pathogenic avian influenza) - низкопатогенный вирус гриппа А

HP Al-вирус (highly pathogenic avian influenza) - высокопатогенный вирус гриппа А

ЛД - летальная доза

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

УФ - ультрафиолетовое излучение

IVPI (Intravenous pathogenicity index) - индекс патогенности при внутривенном введении

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические, антигенные и биологические свойства штаммов вируса гриппа птиц А, выделенных от водных и околоводных млекопитающих»

Введение

Вирус гриппа является одним из самых распространенных патогенов, поражающих широкий круг хозяев. Заболевание, называемое гриппом, вызывают представители семейства Orthomyxoviridae, к которому относятся вирусы гриппа родов А, В, С и D, а также Togovirus, Quaranjavirus и Isavirus. Из представленных вирусов только вирус гриппа А (ВГА), естественным резервуаром большинства субтипов которого являются дикие водоплавающие птицы, имеет широкий круг хозяев. ВГА инфицирует разнообразные виды позвоночных, включая птиц, свиней, лошадей и морских млекопитающих. Полагают, что причиной пандемий гриппа в человеческой популяции является проникновение нового субтипа вируса или некоторых его генов из естественного резервуара [45, 94, 114, 118]. Это, в свою очередь, ставит мировое сообщество перед угрозой новой пандемии, наносит серьезный экономический урон в сельском хозяйстве, создает проблемы в области охраны биологических ресурсов планеты. Подтверждением этому могут служить документированные случаи инфицирования человека, сельскохозяйственных и домашних животных вирусами гриппа H9N2, H7N7, H1N1, H5N1 -субтипов [69].

Дикие птицы отрядов Anseriformes и Charadriiformes, образуя естественный резервуар ВГА в природе, могут способствовать трансмиссии данного патогена другим хозяевам [148]. Основой эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц в природных условиях является обследование водных и околоводных биоценотических комплексов. Большой интерес представляют непроточные пресные или слабоминерализованные водоемы с обилием прибрежно-водной и кустарниковой растительности, где имеются оптимальные условия для укрытий, отдыха, кормежки и гнездования перелетных птиц указанных отрядов. В первую очередь представляют интерес и контролируются биоценозы, располагающиеся в непосредственной близости от сельских населенных пунктов. Интересным объектом животного мира для

исследования ВГП, у которого в последние десятилетия выявляются разнообразные вирусы гриппа, являются млекопитающие, которые так или иначе разделяют водный и сухопутный образ жизни. Представители экологической группы водных млекопитающих демонстрируют большую или меньшую связь с водными экосистемами и различную степень приспособленности к обитанию в водной среде. Их объединяет один важный фактор - контакт с дикими птицами на лежбищах или во время приема пищи из одного источника, например, рыба или криль, что может способствовать межвидовой передачи вирусов гриппа птиц [54].

Документально зафиксировано, что у морских млекопитающих активно циркулируют вирусы гриппа птиц различных субтипов, что указывает на важную роль этих животных в распространении и эволюции данного патогенна. При этом, роль млекопитающих, ведущих водный или околоводный образ жизни, в качестве хозяев или переносчиков потенциальных зоонозных патогенов, таких как ВГП, до конца не ясна и данный вопрос требует дальнейшего изучения. Проведенные филогенетические анализы вирусов гриппа, выделенных от морских млекопитающих и от диких птиц, указывают на близкое генетическое сходство, в результате чего можно предположить, что дикие птицы являются основным источником гриппозной инфекции у млекопитающих [54].

ВГП является большой проблемой во всем мире, прежде всего, в виду

того, что он способен постоянно эволюционировать и преодолевать

межвидовой барьер. Преодолевая межвидовой барьер от птиц к

млекопитающим, ВГ А не всегда может быстро адаптироваться и

распространяться среди особей нового вида хозяина, но, если это произойдет,

не исключено, что в будущем появятся новые пандемичные варианты,

способные вызывать эпидемию или даже пандемию в человеческой популяции

[114]. Таким образом, чрезвычайно важно проводить мониторинг данного

патогена не только в популяции диких птиц и среди людей, заболевших ОРВИ,

а также необходимо обследовать новые резервуары, в которые ВГП может

8

проникнуть и закрепиться. Полученные новые данные принесут не только фундаментальные знания, но и будут иметь важное прикладное значение. Детальное понимание механизмов, определяющих патогенность, межвидовую трансмиссию и вирусную адаптацию, является неотъемлемой частью необходимой для контроля над гриппом.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы, изучить молекулярно-генетические, антигенные и биологические свойства штаммов вируса гриппа А, выделенных от водных и околоводных млекопитающих Северного Каспия и Юга Западной Сибири, на примере каспийского тюленя и ондатры, обитающих в местах гнездования диких перелетных птиц.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести вирусологическое исследования проб биоматериала на наличие вируса гриппа, взятого от ондатры и каспийского тюленя.

2. Изучить молекулярно-биологические и генетические свойства полученных изолятов вируса гриппа А.

3. Определить вирулентность выделенных изолятов в развивающихся куриных эмбрионах, в культуре клеток и для лабораторных животных.

4. Выявить особенности патоморфологических изменений у лабораторных животных, вызванных инфицированием выделенными штаммами.

5. Изучить тропность и топологию выделенных штаммов вируса гриппа А, к органам и тканям лабораторных животных при экспериментальном инфицировании.

Научная новизна и практическая значимость

В ходе данной работы впервые выделен вирус гриппа с субтипом H2N2 от ондатры обыкновенной.

Впервые выделен вирус гриппа с субтипом H4N6 от каспийских тюленей в 2002 и 2012 гг.

Выделенные вирусы определены и депонированы в электронную международную базу данных GenBank; нуклеотидные последовательности всех 8 сегментов (НА, PA, РВ2, РВ1, NP, NA, М, NS) выделенных в настоящей работе штаммов A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6), A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6), A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) приведены в паспорте депонирования данных штаммов в «Музей вирусов гриппа и ОРЗ» в ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ (г. Санкт-Петербург) (приложение 1).

Научная новизна подтверждена патентами:

патент № RUS 2538168 25.03.2013 на изобретение РФ «Наборы олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В с их использованием» (приложение 2),

патент № RUS 2606030 24.12.2015 на изобретение РФ «Штамм вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 Н2Ы2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo» (приложение 3).

Штаммы вирусов гриппа, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы в диагностических целях в качестве антигенов и полученных на основе данных антигенов поликлональных сывороток.

Разработаны наборы олнгонуклеотндных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В методом гибридизации для использования в области молекулярной биологии, вирусологии и медицине (патент № RUS 2538168 25.03.2013 на изобретение РФ «Наборы олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В с их использованием»).

Создан антигенсодержащий препарат (патент № RUS 2606030 24.12.2015 на изобретение РФ «Штамм вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 Н2Ы2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo»).

Данные генетического анализа выделенных штаммов вируса гриппа, полученные в ходе исследования, могут быть использованы в изучении эволюции и экологии патогена.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Avian Influenza Surveillance in Central Asia (Russia, China). Russian-Chinese Workshop "Avian Flu and Public Concerns - 2014", 26 November 2014, Xining, China (oral presentation); 4th International Influenza Meeting, Westfälische Wilhelms-Universität in Münster, Germany. 21-23.09.2014; 8 Международная конференция «Морские млекопитающие голарктики», Санкт-Петербург, 22-27.09. 2014; 9th International Symposium on Avian Influenza. April 12-14, 2015 Athens, Georgia, USA; 3th International Symposium on Neglected Influenza Viruses, April 15-17, 2015. Athens, Georgia, USA, (oral presentation); II Всероссийская конференция с международным участием. Сер. "ActaNaturau" 2017. Т. 9. № S1. С. 50а; International conference "Trends in Influenza Research", Saint-Petersburg, September 18-20, 2017. P. 48 (oral presentation); XIX

Международной научной конференции с элементами научной школы молодых ученых. 2017. С. 597-601.

По материалам диссертации опубликовано 15 работ (включая сборники международных конференций и монографию), 6 из них - в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, получено 2 патента.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, заключение, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 43 рисунками. Список литературы содержит 159 источников, в том числе 129 работ иностранных авторов. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В популяциях морских и околоводных млекопитающих, обитающих в местах массового гнездования перелетных птиц Каспийского региона и юга Западной Сибири, установлена циркуляция вируса гриппа А.

2. По данным филогенетического анализа, штаммы A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2), A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6) относятся к Евразийской генетической линии вируса гриппа А.

3. Штаммы A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6), выделенные от каспийского тюленя, являются патогенными для лабораторных мышей линии BALB/c.

4. Характер структурных изменений легких и течение воспалительного процесса у экспериментально инфицированных мышей штаммами

A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6) вируса гриппа А различаются.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность за помощь в организации работы, обсуждении и апробации научных результатовсотрудникам отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеванийи сотрудникам лаборатории структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний ФГБНУ "ФИЦ ФТМ": Шестопалову A.M., Шаршову К.А., Соболеву И.А., Ковнер А.В., Мурашкиной Т.А., Чубаревой Е., Курской О.Г., Черданцевой JI.A., а также профессору Новосибирского государственного университета Шестопаловой JI.B.

1. Обзор литературы

1.1. Основные этапы в исследовании вируса гриппа

В настоящее время грипп является наиболее распространенной вирусной инфекцией в глобальном масштабе и регистрируется на всех континентах. Особенностью этой инфекции является невероятная быстрота распространения - большой город охватывается заболеванием за 1,5-2 недели, огромная страна - за 3-4 недели. Выявленные, в последнее время, новые свойства возбудителей гриппа - способность обмениваться генетической информацией с возбудителями гриппа животных и птиц, длительное время сохраняться в организме человека после выздоровления и даже, как полагают, быть одним из возможных факторов развития у человека медленных инфекций - усиливают значимость этой проблемы и необходимость дальнейшего изучения гриппа.

Следует отметить и историю происхождения названия этого заболевания. Есть мнение, что первое упоминание об «ифлюэнце» встречается в трактате «Канон врачебной науки», который являлся основным пособием для врачей Европы XII-XVII вв. и был написан Авиценной, жившим в X-XI вв. н.э. Именно Абу Али Ибн Сина, первым, выдвинул гипотезу о невидимых возбудителях «лихорадочных» (инфекционных) заболеваний, которые передаются по воздуху, по воде и т.д. Так, некоторые историки предполагают, что название данному заболеванию дал великий арабский ученый-философ (в переводе с арабского «энф аль анца» означает «нос козы»).

По мнению других ученых-историков, название «инфлюэнца» уходит

своими корнями в медицинские труды, появившиеся после пандемии 1732 -

1738 гг. и, возможно, происходит от того, что болезнь быстро передается,

источник ее как бы «воздействует, влияет» (to influence - влиять,

воздействовать) на других находящихся рядом людей и вызывает у них

заболевание. Продолжая данную тему, стоит отметить и о голландском слове

"griep", что соответствует английскому "flu". Это голландское слово

14

происходит от французского "gripper" и объединяет в себе огромное количество разнообразных респираторных заболеваний, образующимся более чем от 100 разнообразных вредоносных вирусов. Кроме этих названий в научной литературе до XIX столетия сохранялись еще и старые названия: catarrus epidemicus, cephalgia contagiosa, febris catarrhalis и др.

Материальную природу гриппа врачи долгое время понять не могли. В разных странах в Средние века по этому поводу существовали различные предположения. Например, в Италии причиной гриппа считали особое расположение луны и звезд. В Германии обратили внимание на то, что болезнь свирепствует в зимний период, и предположили, что во всем виноваты моченые яблоки и соленая рыба - основная «зимняя» пища. В XIX в. уже было выдвинуто предположение, что заболевание имеет бактериальную природу, что и было подтверждено в период эпидемии 1889 - 1892гг. немецким врачом Ричардом Пфайфером. Из мокроты больных он выделил чрезвычайно мелкую бактерию, которая по внешнему виду была похожа на палочку и, таким образом, получила название Haemophilus influenzae - палочка Пфайфера.

В конечном итоге, вирус гриппа человека был открыт в 1933 г. в Лондоне

в лаборатории доктора Эндельса. Пытаясь найти животное, которое было бы

чувствительно к гриппу человека, ученые заражали гриппом всевозможных

животных, от змей до грызунов. Однажды сотрудник этой лаборатории доктор

Вилли Смитт, который исследовал зараженных животных, взял в руки хорька,

и хорек на него чихнул. Оказалось, что хорьки, как и люди, также болеют

гриппом. Через два дня доктор Смитт заболел гриппом. Из его носоглотки был

взят смыв, профильтрован через ультрафильтрат и введен в дыхательные пути

здоровых хорьков. Произошло необычайное — хорьки заболели гриппом! У

них начали слезиться глаза, повысилась температура, а из носа появились

слизисто-гнойные выделения. Более того, оказалось, что грипп от одних

хорьков передается другим, находящимся по соседству — в хорьковой

колонии возникла эпидемия. В выделениях из носа и трахеи заболевших

животных вновь обнаружилось фильтруемое заразное начало, которое могло

15

быть перенесено на здоровых животных и, таким образом, сохранено в лаборатории неопределенныйдлительный период. Это был первый случай экспериментального заражения гриппом. В результате от него был выделен вирус, который получил название штамм — штамм Вилли Смитт. Последующие эксперименты заражения вирусом гриппа показали, что обычные белые мыши не менее восприимчивы к вирусу гриппа, чем хорьки. Мыши, которым вводили смывы от гриппозных больных, заболевали, как и хорьки, но гриппозная инфекция у них проявлялась в тяжелом, нередко смертельном воспалении легких. Именно таким образом А. А. Смородинцев с сотрудниками в Ленинграде и Л. А. Зильбер с сотрудниками в Москве в 1936 — 1937 гг. выделили и закрепили первые отечественные штаммы вирусов гриппа.

Вскоре после выделения вируса гриппа А при заболевании человека, стало ясно, что не все случаи связаны именно с этим вирусом. В 1940 году Фрэнсис и Магилл независимо друг от друга выделили от человека вирус, в антигенном отношении отличный от гриппа А. Этот вирус, схожий с вирусом гриппа А, был назван вирусом гриппа В. Позднее в 1947 году Тэйлор выделил из мягких тканей верхних дыхательных путей агент, оказавшийся гемагглютинирующим вирусом. Штамм «1233» вначале был принят за спорадически выделяемый вирус, имеющий небольшое значение, однако, позднее Фрэнсис с соавторами, выделили антигенно идентичный вирус при эпидемическом респираторном заболевании детей. Впоследствии его назвали вирусом гриппа С.

Предполагается, что история эпидемий гриппа насчитывает более 20

столетий. Впервые, гриппоподобное заболевание было описано Г иппократом

еще в 412 г. до н.э. Многократно эпидемии гриппа описывались и в средние

века, так с XII столетия произошло не менее 130 вирусных атак, большая часть

из которых была причиной эпидемий гриппа. Эпидемии гриппа возникали

довольно часто, но характер всемирного бедствия принимали три-четыре раза

в столетие. Такие крупные эпидемии получили название пандемий. В 1580

16

году была впервые официально зафиксирована пандемия гриппа, которая унесла множество жизней. Известны пандемии 1580, 1675, 1729, 1742-1743, 1780, 1831, 1857, 1874-1875 годов. На протяжении последующих столетий эпидемии гриппа продолжались довольно часто и фиксировались с разной периодичностью: от 2 до 13 лет [134]. Но самой страшной эпидемией гриппа считается эпидемия испанки, произошедшая в 1918 году (очаг заболевания был в Испании), причиной - вирус гриппа субтипа НШ1. По различным оценкам, испанка унесла от 25 до 40 миллионов человеческих жизней. От данной эпидемии серьезно пострадало 20-40% населения земного шара. Нетипичной особенностью испанки была способность поражать молодых людей (обычно от гриппа в первую очередь страдают маленькие дети и пожилые люди) [135].

На протяжении всего XX столетия вирус гриппа возвращался с завидной периодичностью, при этом каждый раз новый. В период 1957-1958 гг. причиной эпидемии стал "азиатский грипп" (Н2№), затем, в 1968-1969 его место занял «гонконгский грипп» (Н3№) и в 1977-1978 гг. была зафиксирована эпидемия, вызванная «русским гриппом»(НЗЫ2), который до сих пор является причиной очень серьезного заболевания, он постоянно видоизменяется и возвращается, чтобы причинить еще больше вреда.

Первая пандемия XXI века началась, как и прежде, неожиданно, хотя к

ней готовились все последнее десятилетие. Дело в том, что эксперты ВОЗ и

специалисты-гриппологи находились в ожидании пандемии, вызванной

высокопатогенным вирусом гриппа птиц А/Н5Ы1. Однако, новым

пандемическим вирусом неожиданно оказался вирус А/НШ1 свиного

происхождения, который первоначально вызвал вспышки заболеваемости в

Мексике и США в марте и апреле 2009 года [5, 43, 103, 110]. Патогенность

вируса гриппа, который был назван «свиным» гриппом, была не такая

серьёзная как у «Испанки» 1918 года; в большинстве случаев происходило

самоизлечение, но несмотря на это, некоторые пациенты были

госпитализированы с пневмонией, дыхательной недостаточностью или с

17

синдромом острой дыхательной недостаточности в течение первой волны заражения [119]. Вирус распространился по планете с такой быстротой, что 11 июня 2009 г. ВОЗ поднял уровень готовности к пандемии гриппа до фазы 6, официально объявив первую пандемию гриппа в XXI в. К тому времени насчитывалось 30000 подтвержденных случаев заболевания в 74 странах. Менее чем через месяц ВОЗ подтвердила уже более 77000 случаев заболевания. Меньше, чем за полтора года пандемия затронула 214 стран и территорий мира и стала причиной смерти по меньшей мере 18449 человек. С помощью методов молекулярно-генетического анализа было выяснено, что пандемический вирус гриппа A/H1N1 2009 - это результат генетической рекомбинации вирусов человека и животных, которая, возможно, имела место в организме свиньи, хотя свидетельств прямой передачи этого вируса от свиньи к человеку нет. Тем не менее весьма вероятно, что свинья явилась «смешивающим сосудом» для поколения новых вирусов гриппа А человека.

1.2. Общие сведения о вирусе гриппа птиц

1.2.1. Таксономическая принадлежность, классификация и номенклатура. Природноочаговый характер вируса гриппа А

Вирус гриппа принадлежит к семейству Orthomyxoviridae, включающему шесть родов - Influenza virus A, Influenza virus В, Influenza virus С, Togovirus, Quaranjavirus и Isavirus, отличающиеся по антигенным различиям в нуклеопротеидном (NP) и матриксном (М) белках [26, 72]. Наиболее патогенным является вирус гриппа А (ВГА). Он инфицирует разнообразные виды позвоночных, включая свиней, лошадей, морских млекопитающих и птиц, периодически вызывая пандемии в человеческой популяции [14, 16, 69, 148]. Вирусы гриппа А обычно классифицируются антигенными свойствами своих высоковариабельных основных поверхностных протеинов гемагглютинином и нейраминидазой. Эти два белка - основные цели во время защитной иммунной реакции организма. Таким образом, выделяют 18

субтипов - по гемагглютинину и 11 субтипов - по нейраминидазе [16,139,140].

Циркуляция 1-16 субтипов гемагглютинина и 1-9 субтипов нейраминидазы

поддерживается среди птиц водно-околоводного экологического комплекса, в

первую очередь, речь идет о семействе чайковых (Laridae), утиных (Anatidae)

и крачковых (Sternidae), а также подсемействе речных (Anatinae) и нырковых

(Aythyinae) уток. Данные виды птиц являются постоянным гигантским

резервуаром и источником распространения генетически измененного вируса

гриппа птиц, при этом некоторые субтипы встречаются чаще, чем другие [25,

81, 126]. Интересным фактом является то, что за последние 5 лет были

выделены два новых, ранее неизвестных, субтипа от летучих мышей - это

H17N10 и H18N11 [139, 140], что говорит о существовании новых не

изученных резервуаров вируса гриппа. Гемагглютинин ВГ опосредует

связывание вирусной частицы с клетками хозяина и доставку вирусного

генома в цитоплазму в то время, как нейраминидаза помогает при выходе

вирусной частицы путем отщепления сиаловой кислоты, связываясь с

клеточной мембраной. Помимо гемагглютинина и нейраминидазы, еще 3

белка образуют полимеразный комплекс (РВ1, РВ2, РА), сегменты РНК

связаны с нуклеопротеином (NP); матриксные белки (М1 и М2) входят в состав

протеиновой оболочки вирусной частицы; неструктурный белок (NS) и

ядерный экспортный белок (NEP) взаимодействуют с клеточными белками и

действуют, помогая репликации и выходу вирусной частицы избегая

иммунного ответа хозяина. Несколько дополнительных белков было

обнаружено в сегментах генов РВ1 и РА, которые могут образовываться в

результате сдвига рамки считывания, нарезки или вторичных старт ко донов.

К ним относятся РВ1- F2 и набор недавно обнаруженных форм РА [74, 98], как

предполагается, все они влияют на вирулентность инфекции и требуют

дальнейшего изучения.

1.2.2. Строение вириона

Вирионы ВГА представляют собой частицы плейоморфной, чаще

округлой формы, диаметром 80-120 нм (рис. 1). Вирион вируса гриппа состоит

19

из рибонуклеопротеидных фрагментов, заключенных в липопротеидную оболочку с выступающими пепломерами (шипами) двух видов: одни из них -стержнеобразные, образованы гемагглютинином, а другие - грибообразные, нейраминидазой [26, 85]. Шипы первого типа представлены тремя молекулами НА, каждая из которых состоит из двух субъединиц (НА1 и НА2), соединенных дисульфидными мостиками [151]. Гемагглютинин способствует прикреплениювируса к клеточным рецепторами участвует в инициации инфекционного процесса. Шипы второго типа представлены четырьмя молекулами NA [26]. Липидный компонент оболочки вируса имеет клеточное происхождениеи образован единым бислоем, состоящим из холестерина и фосфолипидов. В липидную оболочку вируса встроен интегральный мембранный белок М2, его тетрамер образует ионные каналы. Внутреннюю поверхность липидной оболочки выстилает матриксный белок Ml, который связан с рибонуклеопротеидными структурами [111, 157].

Рисунок 1 - Схема строения вириона вируса гриппа А. (http://www.ifpma.org/resources/influenza-vaccines/the-influenza-virus/the-influenza-virus.html).

1.2.3. Организация генома, изменчивость вируса

Геном вируса гриппа А, в зависимости от патогенности, содержит 11-12 генов, распределенных по восьми сегментам РНК отрицательной полярности. Наиболее существенный вклад в патогенность ВГА вносят белки НА, РВ1, PB1-F2, РВ2, NS1. Устойчивость вирусов к противовирусным препаратам

определяется двумя белками - NA и М2 (Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика, 2012).

Первые три сегмента РНК кодируют три самых больших гена - РВ2, РВ1 и РА. Продукты данных генов представляют собой белки полимеразного комплекса, причем первые два участвуют в синтезе мРНК, а третий - в синтезе вРНК [148]. Не так давно было обнаружено, что ген РВ1 кодирует еще два дополнительных белка - PB1-F2 и N40. Их экспрессия зависит от мутации в гене РВ1 Данные белки не являются обязательными компонентами всех ВГА. Считается, что наличие PB1-F2 способствует гибели клетки-хозяина, вызывая иммунопатологию и провоспалительный эффект [142]. PB1-F2 оказывает влияние на апоптоз инфицированных клеток и, возможно, играет роль в патогенности и летальности вируса для млекопитающих и птиц. Анализ аминокислотной последовательности белка PB1-F2 показал, что наряду со штаммами, имеющими полноценный PB1-F2, имеется ряд штаммов с неполным, усеченным вариантом белка. Клетки некоторых животных, инфицированные определенными штаммами вируса гриппа (например, выделенных от свиней), не экспрессируют этот белок [61].

Белок N40, взаимодействуя с полимеразным комплексом ВГА, способен ускорять репликацию вируса в клеточных культурах [152]. Также был обнаружен еще один белок - РА-Х, закодированный в гене РА. Экспрессия данного протеина способна быть причиной проявления более выраженных и тяжелых клинических признаков заболевания, при этом, его влияние на репликацию вируса в клетке хозяина не обнаружено [74].

Четвертый сегмент РНК кодирует интегральный мембранный

гликопротеид - гемагглютинин (НА), ответственный за прикрепление вируса

к клетке. Гемагглютинин является основным антигеном вируса, против

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гуляева Марина Александровна, 2019 год

MP - - -

3.2.3. Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) к репродукции in vitro, in vivo

При внутривенном заражении кур штаммами ВГП H4N6 субтипа по истечению 10 дней после заражения нами не наблюдалось проявление клинических признаков заболевания. На основании этого было сделано заключение, что выделенный нами штамм является низкопатогенными (IVPI=0).

При инфицировании данным штаммом мышей линии BALB/c не удалось определить МЛД50 и МЛДюо.

Определены 50% инфекционные титры вируса на перевиваемой культуре клеток MDCK (ТЦД50/см3), 50% инфекционные титры вируса на РКЭ (ЭИД50/см3), 50% инфекционные титры для мышей (МИД50/см3). Характеристики пулов исследованных в эксперименте штаммов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Значения вирусологических показателей пула штамма вируса гриппа Н4Ы6-субтипа.

Штамм lg ТЦДзо/см3 ^ЭИДзо/см3 lg МИДзо/см3 (мыши)

A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 8,59 ±0,21 7,03 ±0,34 3,30±0,34 (5 сутки) 2,30±0,34 (7 сутки)

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c исследуемым штаммом ВГП субтипа H4N6 признаки болезни в экспериментальной группе животных регистрировали со 2-х суток. Болезнь сопровождалась снижением активности, одышкой (с усилением брюшного дыхания), уменьшением массы тела, негативными изменениями качества шерсти. При этом титры вирусов в легких регистрировали на 3, 5 и 7 сутки; максимальный титр был отмечен на 5 сутки и был равен 4,08±0,20 ^ТЦД5о/см3 (Таблица 5). Таким образом, результаты, полученные в ходе исследования, показали, что A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6), выделенный от каспийского тюленя, способен

реплицироваться в легких мышей линии ВАЬВ/с при экспериментальном инфицировании без предварительной адаптации путем пассирования.

Таблица 5. Вирусологические показатели титра вируса гриппа А штамма A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) в легких мышей BALB/c_

Титры вируса 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки

^ТЦДзо/см3 2,75±0,08 4,08±0,20 2,55±0,13 -

Были оценены антигенные свойства исследуемого штамма. Для этого проведен анализ сывороток крови мышей в РТГА с вирусом, которым были инфицированы данные экспериментальные животные. Заражение мышей штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) привело к развитию выраженного гуморального ответа. Во всех 10 исследуемых сыворотках титры антител в РТГА были выше пороговых значений. Среднее геометрическое значение, выраженное в log2, определялось на уровне 7,62±0,26 (диапазон: 1:80-320) (Таблица 6). Таким образом, эксперименты на мышах показали, что штамм 2002 года обладал выраженной антигенностью. Перекрестная реакция со штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) показала, что оба вируса, выделенные от тюленей антигенно схожи.

Таблица 6. РТГА с сыворотками мышей, инфицированных штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

Вирус (антиген) Сыворотка, полученная из Титр антител в РТГА с

крови мышеи, зараженных A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) антигеном

A/Caspian A/2002(H4N6)-1 1:320

seal/Russia/1884/2 A/2002(H4N6)-2 1:80

002(H4N6) A/2002(H4N6)-3 1 160

A/2002(H4N6)-4 1 160

A/2002(H4N6)-5 1 320

A/2002(H4N6)-6 1 320

A/2002(H4N6)-7 1 320

A/2002(H4N6)-8 1 320

A/2002(H4N6)-9 1:80

A/2002(H4N6)-10 1:160

В группе пнтактных мышей вирусный титр не определялся или определялся на очень низком уровне (1/5)

3.2.4. Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

Наиболее выраженные морфологические изменения у инфицированных мышей наблюдались в легких. Но в других органах экспериментально зараженной группы животных, исследуемых методом световой микроскопии, таких как: почка, печень, селезенка, сердце также были обнаружены морфологические изменения в сравнении с контрольной группой мышей. 3.2.4.1. Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей

На третьи сутки инфекции в респираторном отделе легкого наблюдалась ярко выраженная сосудистая реакция. Крупные кровеносные сосуды выглядели запустевшими. Четко визуализировалось плазматическое пропитывание стенки кровеносных сосудов, периваскулярные отеки, отмечалась обширная инфильтрация лимфоцитарно-моноцитарного генеза в интерстицию. Регистрировалось разрастание соединительной ткани периваскулярно и периброхниально. Вмелких и средних бронхахнаблюдалась десквамация эпителия. В эпителиальной выстилке бронхов отмечалась дискомпозиция эпителиоцитов. В отдельных альвеолах скапливался жидкий экссудат с белками плазмы, в просветах часто встречались макрофагии геморрагии (Рисунок 6).

Таким образом, в сравнении с интактными животными (Рисунок 7), на третьи сутки после инфицирования развивались дистрофические изменения эпителиальной выстилки бронхиального дерева и легочных структур. Инфекционное заболевание, вызванное вирусом гриппа, распространялось, в нижние отделы респираторного тракта экспериментальных мышей.

Рисунок 6. Фрагмент легкого мыши на третьи сутки п. и. штаммом В Г A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином; по Маллори. Увеличение: х200, х400.

Рисунок 7. Фрагмент легкого интактной мыши Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200.

К пятым суткам в тканях респираторного отдела легкогопроисходят диффузные измененияусиливая воспалительный процесс: выявлялись большие скопления макрофаговв интерстиции и просветах альвеолярных мешков, наблюдалсягемолиз эритроцитов в крупных кровеносных сосудах.

Отчетливо были видны множественные очаги лейкоцитарной инфильтрации моноцитарно-лимфоцитарного генеза. Присутствовали точечные кровоизлияния в интерстиции, плазморрагии; отчетливо прослеживались участки ателиктаза легкого. В бронхах наблюдались значительные скопления детрита. Регистрировался стромальный отек органа.

Таким образом, на пятые сутки после инфицирования сохранялся воспалительный процесс в эпителиальной ткани легочного ацинуса и всего бронхиального дерева, который постепенно переходил в интерстициальную тканьлегкого с последующим развитием интерстициальной пневмонии. (Рисунок 8).

Рисунок 8. Фрагмент легкого экспериментальной мыши на пятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином; по Маллори. Увеличение: х200, х400.

На седьмые сутки визуально воспалительный процесс усугублялся. Крупные легочные сосуды выглядели запустевшими; в бронхах визуально увеличивалось количество клеточного детрита, выявлялись обширные скопления клеток крови. В ткани легкого отчетливо определялись крупные очаги лимфоцитарно-моноцитарного инфильтрата. В интерстициальной ткани, окружающей воздухоносные пути и альвеолы, обнаруживались отёки и сливные некрозы. Наблюдалась гиперплазия пневмоцитов второго типа. Плазматическое пропитывание отмечали не только в стенках кровеносных сосудов, но также и в интерстиции легочного ацинуса, отмечались множественные геморрагии (Рисунок 9).

Рисунок 9. Фрагмент легкого экспериментальной мыши на седьмые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400

На десятые сутки сохранялись признаки интерстициальной пневмонии, однако, зоны ателектаза визуально уменьшались, а просветы респираторной части легкого выглядели очищенными от детрита и клеток крови (Рисунок 10). Наблюдалось уменьшение альвеолоцитов в состоянии гиперплазии, в сравнении с более ранними сроками.

Таким образом, через десять суток после заражения состояние ткани легкого в исследуемой группе свидетельствует об интерстициальной пневмонии у животных, однако площадь поражения сокращалась по сравнению с предыдущим сроком и появлялись признаки репарации, что в свою очередь может свидетельствовать о процессе выздоровления.

Рисунок 10. Фрагмент легкого экспериментальной мыши на десятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400

В тканях легкого мышей наличие вирусного антигена детектировалось методом иммунногистохимического анализа (Рисунок 11). В динамике заболевания маркер определяли в клетках различного генеза, включая макрофаги, альвеолоциты и клетки эпителия бронхиол. Визуально определяемое количество клеток с положительной окраской было максимальным на 5 сутки после инфицирования. При этом, интересным является тот факт, что на 10 сутки, по-прежнему, антиген визуализировался в отдельных эпителиоцитах бронхиол.

* »

* ~

_ № И * • . 1л . г"- / '

Ч - г ,, • ■ *. « 1 *

- I ■ + ¿л * < , н ч * V ; *

* . * V.Л' : - ^ ■ * ■ * ■

♦ • V Ч 1 ' «Г

М

А

* ? ' '.у

- ' И .'Л'.

V

* I :>г

V ■"

- ■ с

4. . / » Л,

, -V- . V •

4я

В

', ф*

Ш ... '

Г I > "

V . *Г I <' • ' « ' ■ . <

! * \ч < "V*-Л,

! -г Г,»* 7 « •»>« л "V « 'л

• . ' > " V I

Г г

• ■ А £ Л ,

4 * Чые -- ■ * * 'к. - 4

* .......лл«?- * и

л5 ; -.¿г . " >5. А -'■■-V .V«л

С

* -Л". " . л-у-'4- .Л* * *

Б

-1*

Г

Г.' Лт 1

Я

Ж ш*

* в 4 ■ < - 1 .Г/

Ь " ■ь Гт, Ч| . ^ * Л' - . г ^ Л т..

* *" -и:- V ли * ны ч О" Л/ 1 . у-.

, Ь - ч т * ■ V. . " * , к-**? > - Л

о; V } ^ г" Л, » ' % * Т ■'#. И п 1 * » * 4 ■ * % 1 А

< - лР ■> > .

Рисунок 11. Экспрессия антигена вируса гриппа А легочными макрофагами, альвеолярными клетками и эпителиальными клетками бронхов мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6) 1884. А - третьи сутки п.и., В -пятые сутки п.и., С - седьмые сутки п.и., Б - десятые сутки п.и., Е - фрагмент

легкого интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение: х200, х400.

3.2.4.2. Изменения структуры почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

На 3-й сутки в корковом веществе почки наблюдались множественные очаги лейкоцитарной инфильтрации. Сосуды коркового и мозгового вещества исследуемого органа выглядели кровенаполненными, в сосудах мелкого калибра наблюдались сладжи эритроцитов. Просветы дистальных и проксимальных канальцев почки были заполнены хлопьевидным содержимым. Перикапсулярное пространство клубочков в корковом веществе выглядело уменьшенным. В интерстиции органа визуализировались геморрагии (Рисунок 12).

:-к _ mJS

™ \l "Ч -в .JB У ъ.

Л / i f л- — /Л т . | ст.

Г / ¿4 1 У _ р£и Ш* * * г * S*

Н; 7% т"

Рисунок 12. Фрагмент почки экспериментальной мыши на третьи сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200,1400.

На 5 сутки после инфицирования определялись очаги лейкоцитарной инфильтрации, преимущественно лимфоцитарно-моноцитарного генеза. В корковом и мозговом веществе почки наблюдалась дистрофия эпителиоцитов в канальцах почки, в собирательных трубочках изменения, в сравнении с контролем, не визуализировались (Рисунок 13). В мозговом веществе выявлялись точечные кровоизлияния.

Рисунок 13. Фрагмент почки экспериментальной мыши на пятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400.

Седьмые сутки характеризовались запустением кровеносных сосудов в органе. В корковом и мозговом веществе наблюдались точечные некрозы. Просветы собирательных трубочек были заполнены хлопьевидным содержимым. Интерстициальное пространство выглядело слегка отечным (Рисунок 14).

Рисунок 14. Фрагмент почки экспериментальной мыши на седьмые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). а - корковое вещество; b - мозговое вещество. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400, хЮОО.

К 10 суткам картина существенно не менялась. Прослеживались одиночные очаги некрозов в корковом веществе. Перикапсулярное пространство отдельных почечных клубочков визуально было сужено. (Рисунок 15).

Рисунок 15. Фрагмент почки экспериментальной мыши на деаятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200,1400.

Методом иммуногистохимического анализа было показано присутствие вирусного антигена в единичных клетках проксимальных и дистальных канальцев почки с третьих по седьмые сутки (Рисунок 16). При этом, на седьмые сутки наблюдалась тенденция к уменьшению инфицированных эпителиоцитов. На десятые сутки вирусный антиген не детектировался.

В

94

с

D

Рисунок 16. Экспрессия антигена вируса гриппа А эпителиоцитами почечных канальцев и собирательных трубочек мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ш)1884. А, В - третьи сутки п.и., С, Б - седьмые сутки п.и., Е -фрагмент почки интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение: х200, х400.

3.2.4.3. Изменения ткани печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

На третьи сутки после инфицирования в печени экспериментальной группы животных наблюдалась кровенаполненность кровеносных сосудов. Часть гепатоцитов центролабулярной зоны печеночных долек находились в состоянии капельной дистрофии (Рисунок 17).

Рисунок 17. Фрагмент печени экспериментальной мыши на третьи сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400.

К пятым суткам течения инфекции в ткани органа визуализировались точечные кровоизлияния и очаги лейкоцитарной инфильтрации. Наблюдались небольшие очаги некроза. В венозных синусах эритроциты располагались в виде монетных столбиков. Некоторые крупные кровеносные сосуды выглядели запустевшими, в то время как другие были кровенаполненными (Рисунок 18).

Рисунок 18. Фрагмент печени экспериментальной мыши на пятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400.

На 7 сутки визуализировались множественные гепатоциты в состоянии балонной дистрофии. Крупные кровеносные сосуды выглядели кровенополненными (Рисунок 19).

'» . и йГ* * г« ■ ■ " # \ "

V Я ■ г<

н-'^р, 1 Ч. ' Ъ"1. 1 .'■ л -Ь'."* : tsir * - • • 4 '

ц . 1 ' ч. - 4 ■_ ' < р

** >„ %" " ч ' / " -1 v; . *: ' ■ i .

..." * V . * 1г \ г ' *"т • * " Гь" •*■ t;, С4 ■ V , ■) f Я * 1

J ■ •' h Ъ 4 , '

Рисунок 19. Фрагмент печени экспериментальной мыши на седьмые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200.

К 10-м суткам после инфицирования наблюдается запустение крупных кровеносных сосудов, при этом венозные синусы быликровенаполнены, что может говорить о нарушении циркуляции крови и тромбообразовании в мелких сосудах кровоотводящей системы печени. Часть гепатоцитов находилась в состоянии дистрофии (Рисунок 20).

Рисунок 20. Фрагмент печени экспериментальной мыши на десятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400.

Вирусный антиген в клетках печени не детектировался методом иммунногистохимического анализа на протяжении всего периода исследования (Рисунок 21).

А

В

С

Рисунок 21. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6)1884. А - третьи сутки п.и., В - седьмые сутки п.и., С - фрагмент печени интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.4.4. Изменения структур сердца в резулыпате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

Начиная с пятых суток и на протяжении всего периода наблюдения в сердце экспериментальной группы животных, инфицированных вирусом A(H4N6)1884, наблюдались незначительные признаки воспаления. Периваскулярное пространство выглядело отечным. Определялись небольшие очаги лейкоцитарной инфильтрации (Рисунок 22).

С

Рисунок 22. Фрагмент сердца мыши. А - пятые сутки п.и. штаммом ВГА(Н4М)1884; В - седьмые сутки п.и. штаммом ВГ А(Н4Ш)1884; С -интактная мышь. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200.

При иммуиогистохимическом анализе тканей сердца вирусный антиген не выявлялсяни в эндотелии кровеносных сосудов, ни в кардиомиоцитахв течение всего периода наблюдений (Рисунок 23).

А

В

Рисунок 23. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в миокарде мышей, инфицированных вирусом гриппа A(H4N6)1884. А - третьи сутки п.и., В - седьмые сутки п.и.; С - фрагмент миокарда интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.4.5. Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

Селезенка является местом специфического иммунного ответа на

антигены, циркулирующие в крови. Обладая богатой сетью макрофагов и

антигенпредставляющих клеток в красной пульпе, она, также, выполняет

100

функции фильтра, удаляющего из крови попадающие туда чужеродные частицы и токсические вещества [64]. Уже, на третьи сутки п.и. в белой пульпе селезенки экспериментальной группы мышей отчетливо видны герминативные центры. На более поздних сроках наблюдается слияние фолликулов и формирование первичных узелков. В центральной части лимфоидных селезеночных узелков визуализируется увеличение количества лимфобластов и макрофагов. Происходит смещение в соотношении красной и белой пульпы в сторону последней. Полученные данные свидетельствует о развивающейся иммунной реакции (Рисунок 24).

С

Рисунок 24. Фрагмент селезенки мыши. А - третье сутки п.и. штаммом ВГ А(Н4К6)1884; В - пятые сутки п.и. штаммом ВГ А(Н4Ы6)1884; С - десятые

сутки; Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400, х200.

С помощью иммуногистохимического анализа на третьи сутки после инфицирования вирусные частицыдетектировались, преимущественно, в клетках, расположенных около селезеночных балок, а также в единичныхмакрофагах внутри фолликулов. Позднее, на 5 - 7 сутки, наблюдается усиление экспрессии антигена в лимфоцитах и макрофагах как в области балок, так и внутри фолликулов. На десятые сутки количество иммунопозитивных клеток визуально уменьшается (Рисунок 25).

I

*: -

А

В

Рисунок 25. Экспрессия антигена вируса гриппа А в клетках селезенки мышей,

инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6)1884. А - третьи сутки п.и., В-

102

седьмые сутки п.и., С - фрагмент селезенки интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.4.6. Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6)

Центральная нервная система защищена гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), который представляет собой физический, метаболический и транспортный барьер. Некоторые вирусы гриппа способны преодолевать ГЭБ, вызывая дисфункцию гематоэнцефалического барьера, включая повышенную проницаемость, плеоцитоз и энцефалопатию. В связи с этим, изменения нервной системы, возникающие при гриппе, являются результатом не только токсического воздействия, но и прямого размножения вируса в эндотелии стенок кровеносных сосудов мозга [4].

При оценке состояния структур головного мозга у экспериментальной группы мышей не было выявлено визуальных изменений в сравнении с контрольной группой животных. Иммуногистохимический анализ не детектировал вирусные частицы в клетках исследуемых структур головного мозга (Рисунок 26), что позволяет предположить, что данный штамм не способен преодолевать ГЭБ и вызывать патологические изменения структур головного мозга.

В юз

Рисунок 26. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в клетках фронтальной коры головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа A(H4N6)1884. А - пятые сутки п.и.; В- фрагмент фронтальной коры интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.5. Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) к репродукции in vitro и in vivo

При внутривенном заражении кур штаммами ВГП H4N6 субтипа по истечению 10 дней после заражения нами не наблюдалось проявление клинических признаков заболевания. На основании этого было сделано заключение, что выделенный нами штамм является низкопатогенными (IVPI=0).

При инфицировании данным штаммом мышей линии BALB/c не удалось определить ЛД5о и ЛДюо.

Определены 50% инфекционные титры вируса на перевиваемой культуре клеток MDCK (ТЦД50/см3), 50% инфекционные титры вируса на РКЭ (ЭИД50/см3), 50% инфекционные титры для мышей (МИД50/см3). Характеристики пулов исследованных в эксперименте штаммов представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Значения вирусологических показателей пула штамма вируса гриппа НШ6-субтипа.

Штамм lg ТЦДзо/см3 lg ЭИДзо/см3 lg МИДзо/см3

A/Caspian seal/Russia/T 1 /2012(H4N6) 7,05 ±0,12 8,43 ±0,29 3,30±0,34 (5 сутки) 2,90±0,34(7 сутки)

Мыши линии ВАЬВ/с были инфицированы исследуемым штаммом ВГП,

при этом, признаки болезни в экспериментальной группе животных

регистрировали со 2-х суток. Болезнь сопровождалась снижением активности,

104

одышкой, уменьшением массы тела, негативными изменениями качества шерсти. Титры вирусов в легких регистрировали на 3, 5 и 7 сутки; максимальный титр был определен на 5 сутки на уровне 4.40±0,47 lg ТЦД50/СМ3 (Таблица 8). Таким образом, результаты, полученные в ходе исследования, показали, что A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6), выделенный от каспийского тюленя, способен реплицироваться в легких мышей линии BALB/c при экспериментальном инфицировании без предварительной адаптации путем пассирования.

Таблица 8. Вирусологические показатели титра вируса гриппа А штамма A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) в легких мышей BALB/c

Титры вируса 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки

^ТЦДзо/см3 2,35±0,14 4,40±0,47 2,9±0,20 -

Для оценки антигенных свойства исследуемого штамма были проанализированы сыворотки крови мышей в РТГА с вирусом, которым были инфицированы данные экспериментальные животные. Инфицирование мышей штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) привело к развитию выраженного гуморального ответа, так во всех 10 исследуемых сыворотках титры антител в РТГА были выше пороговых значений. Среднее геометрическое значение, выраженное в log2, определялось на уровне 7,12±0,36 (диапазон: 1:40-640) (Таблица 9). Таким образом, эксперименты на мышах показали, что штамм A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) обладал выраженной антигенностью. Перекрестная реакция со штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) показала, что оба вируса антигенно близки.

Таблица 9. РТГА с сыворотками мышей, инфицированных штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1 /2012(H4N6)

Вирус (антиген) Сыворотка, полученная из крови мышей, зараженных A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) Титр в РТГА с антигеном

A/Caspian seal/Russia/T 1/2012 (H4N6) A/2012(H4N6)-1 1:40

A/2012(H4N6)-2 1:640

A/2012(H4N6)-3 1:80

A/2012(H4N6)-4 1:160

A/2012(H4N6)-5 1:320

A/2012(H4N6)-6 1:160

A/2012(H4N6)-7 1:160

A/2012(H4N6)-8 1:80

A/2012(H4N6)-9 1:80

A/2012(H4N6)-10 1:160

В группе интактных мышей вирусный титр не определялся или определялся на очень низком уровне (1/5).

3.2.6. Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian sea1/Russia/Tl/2012(H4N6)

Легкие являются основным органом-мишенью при гриппе А, в связи с пневмотропностью вируса [44], поэтому, пристальное внимание было уделено именно этому органу. Другие органы экспериментально зараженной группы мышей: почка, печень, селезенка, сердце и головной мозг, также были изучены описанным методом. Во всех исследуемых органах были обнаружены те или иные морфологические изменения в сравнении с контрольной группой мышей.

3.2.6.1. Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian sea1/Russia/Tl/2012(H4N6)

При инфицировании вирусом A(H4N6)T1 мышей линии BALB/c в тканях

легкого наблюдались морфологические изменения уже на 3-й сутки. Так,

была отмечена сосудистая реакция; визуализировались инфильтраты,

106

преимущественно лейкоцитарно-моноцитарного генеза в периваскулярное и перибронхиальное пространство. В бронхиолах определялась незначительная десквамация эпителия слизистой оболочки (Рисунок 28).

Рисунок 28. Фрагмент легкого мыши на третьи сутки п. и. штаммом В Г A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400.

На 5-е сутки течения инфекции количество инфильтрата визуально увеличивалось. Был отмечен сладж эритроцитов в мелких сосудах, который, в свою очередь, был причинойих окклюзии и повреждения сосудистой стенки с последующим кровоизлиянием в интерстицию. Вследствиегемолиза эритроцитов происходило накопление фибриновых масс. Отмечались эпителиоциты, находившиеся в состоянии сливных некрозов. В просветах воздухоносных путей и в интерстиции регистрировали большое количество макрофаговв активированном состоянии. В интерстициальной ткани, окружающей воздухоносные пути и альвеолы, были обнаружены отёки и сливные некрозы. Плазматическое пропитывание отмечали не только в стенках кровеносных сосудов, но также и в интерстиции. Периваскулярная строма и альвеолярные перегородки выглядели отёчными (Рисунок 29).

Рисунок 29. Фрагмент легкого мыши на пятые сутки п. и. штаммом В Г A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400.

Седьмые сутки после инфицирования характеризовались развитием воспалительного процесса (Рисунок 30). В крупных и средних бронхах со стороны просвета регистрировали клеточный детрит и небольшое количество эритроцитов. Эпителиальный слой частично отслаивался от базальной мембраны. Ткань вокруг мелких бронхов и бронхиол была уплотнена за счет инфильтратов. В отдельных альвеолах скапливался жидкий экссудат с белками плазмы. Кроме того, в них обнаруживалось небольшое количество эритроцитов и единичные лимфоциты. По-прежнему, наблюдался значительный периваскулярный отек. В ткани легкого наряду с процессами деструкции наблюдали картины, свидетельствующие о текущих репаративных процессах, что подтверждалось наличием коллагеновых волокон в периваскулярном и перибронхиальном пространствах.

Рисунок 30 Фрагмент легкого мыши на седьмые сутки п. и. штаммом ВГ А(Н4Ы6)Т1. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином; по Маллори. Увеличение: х200, х400.

На десятые сутки после заражения в ткани лёгких экспериментально инфицированныхмышей картина воспалительных изменений былаярко выражена (Рисунок 31). На некоторых участках происходило резкое снижение воздушности альвеолярной ткани. В респираторной ткани легкого регистрировали периваскулярные геморрагии. В просвете альвеол наблюдались альвеолярные макрофаги и лимфоциты. В альвеолярной ткани, наряду с процессами деструкции, наблюдали картины, свидетельствующие о начале репаративных процессов, что подтверждалось наличием фибробластов и коллагеновых волокон. Регистрировалось уменьшение отёчности подслизистой основы. Просветы бронхов и некоторые участки альвеолярной ткани были свободными от детрита.

Рисунок 31. Фрагмент легкого экспериментальной мыши на десятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, \400.

Таким образом, через десять суток после заражения состояние лёгочной ткани свидетельствует о развитии интерстициальной пневмонии с течением инфекции. Воспаление, начавшееся в эпителиальной стенке бронхиального дерева, постепенно переходило в более глубокие отделы респираторной ткани.

Наличие вирусного антигена и его топологию детектировали методом иммуногистохимического анализа. В динамике заболевания маркер определяли, преимущественно в альвеолоцитахвторого порядка и эпителии бронхиол. Количество клеток с позитивной окраской было максимальным на 5 сутки (Рисунок 32). При этом, интересен тот факт, что даже на 10 сутки визуализировались инфицированные альвеолоциты и эпителиоциты (Рисунок 32d).

А В

1 4 ■ яь -ш м " 9ШШ 7 _ *в '

а" * • ' V ^ ■ J ЧГ * 4 № . V

• ■ " Ь, г ' * ® * Ъь Ш *

■ 'I ч * -*%* ■ ' 1 * V •лл

* 1-'» л Л а -Ь - «Ль л

1 , Н а 7\ , " А» " * * ' "

' * »¡А 3 | а « - ■

* • ' ' Ь "" ж Ф Ф

ф . Ж ' " - * ^ -ш 4» 1 - - - А.V л. • ^ ^

' ■ ¿г^бну^ » ^^г1 ■ - /у л I 4 ■И *

М. - , Ч ' ' ь V ■* 4 ¡У*

Эй' щр л ч ; > ДЙГ * 'Г 4 **

, — , > ' ж " "*%

1 ^ я ^ ? г 1. Л ¡г ,, | % „Г 1 д ч

У" г . ° '. ¡ъ УД- 4

Р * * ' •Ц

- г 4 Чч. * . ...

' ■ ,- -т рт ц* J

■! 1 ■ ^ ^

* •■»„_ %

■ , - А ■" ■ :

Рисунок 32. Экспрессия антигена вируса гриппа А альвеолярными клетками и эпителиальными клетками бронхиол мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6)Т1. А - третьи сутки п.и., В - пятые сутки п.и., С- седьмые сутки п.и., Б - десятые сутки п.и., Е - фрагмент легкого интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличениех400.

3.2.6.2. Изменения структур почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6)

При исследовании почек мышей, инфицированных ВГ A(H4N6)T1, на пятые сутки после инфицирования отмечалосьвизуальное уменьшение подкапсулярного пространства почечного клубочка. Были отмечены небольшие очаги лейкоцитарной инфильтрации. Прослеживалось нарушение гемодинамики, приведшее к неравномерному кровенаполнению сосудов, так некоторые сосуды выглядят опустошенными, в то время как другие были кровенаполнены. В результате нарушения целостности стенки у некоторых сосудов, наблюдались кровоизлияния в интерстицию (Рисунок 33).

Рисунок 33. Фрагмент почки экспериментальной мыши на десятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: хЮО, х400

К седьмым суткам процесс прогрессировал, наблюдалось развитие балонной дистрофии в эпителиоцитах почечных канальцев коркового вещества органа. В мозговом веществе регистрировались интерстициальные отеки (Рисунок 34).

Рисунок 34. Фрагмент почки экспериментальной мыши на седьмые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400, хЮОО.

На 10 сутки сохранялись интерстициальные отеки, но количество хлопьевидного содержимого в собирательных трубочках визуально уменьшилось (Рисунок 35).

Рисунок 35. Фрагмент почки экспериментальной мыши на десятые сутки п. и. штаммом ВГ A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6). Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400.

Присутствие антигена выявлялось путем проведения иммуногистохимического анализа с детекцией нуклеопротеина, при этом было показано наличие АГ в единичных эпителиальных клетках проксимальных и дистальных канальцев почки. На седьмые сутки инфицированные клетки визуально не определялись (Рисунок 36).

А

В

Рисунок 36. Экспрессия антигена вируса гриппа А эпителиоцитами почечных канальцев мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6)Т1. А- третьи сутки п.и., В- седьмые сутки п.и., С - фрагмент почки интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х200, х400.

3.2.6.3. Изменения структур печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6)

В ткани печени мышей, инфицированных вирусом гриппа A(H4N6)T1 центральные вены и вены портальных трактов были неравномерно кровенаполнены: от умеренного до полнокровного состояний, такженаблюдалось неравномерное кровенаполнение синусоидных капилляров, варьирующее от слабого до интенсивного (Рисунок 37). Во всех кровеносных сосудах, в том числе в капиллярах отмечается агрегация эритроцитов. К пятым суткам выявлены небольшие очаги лейкоцитарной инфильтрации. Бал очно-радиальное строение долек немного нарушено. В центролабулярной зоне печеночной дольки превалировали гепатоциты с выраженной балонной дистрофией (Рисунок 37Ь). На десятые сутки количество гепатоцитов в состоянии дистрофии визуально увеличивается (Рисунок 37d). Крупные кровеносные сосуды выглядят запустевшими, в то время как синусоидные капилляры кровенаполнены, причиной чего может являться формирование тромбов.

с в

Рисунок 37. Фрагмент печени экспериментальной мыши п. и. штаммом В Г А(Н4Ы6)Т 1: А - третьи сутки, В - пятые сутки, С - седьмые сутки, Б - десятые сутки. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200, х400.

Вирусный антиген в клетках печени при проведении иммуногистохимического исследования не детектировался (Рисунок 38).

А

В

Рисунок 38. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа A(H4N6)T1. А - третьи сутки п.и., В - седьмые сутки п.и., С - фрагмент печени интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.6.4. Изменения структур сердца врезультате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6)

При инфицировании вирусом A(H4N6)T1 в миокарде у мышей наблюдались небольшие очаги лейкоцитарной инфильтрации, преимущественно лимфоцитарно-моноцитарного генеза, локализованные периваскулярно. При визуальной оценке органа какие-либо значимые изменения не детектировались по сравнению с контрольной группой животных (Рисунок 39).

А

В

Рисунок 39. Фрагмент сердца мыши. А - 5-е сутки п.и. штаммом ВГА(Н4Ы6)Т1; В - интактная мышь. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х200.

При иммуногистохимическом анализе вирусный антиген детектировался в эндотелии одиночных кровеносных сосудов мелкого и среднего калибра (Рисунок 40).

А В

Рисунок 40. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в миокарде мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4М6)Т 1. А - третьи сутки п.и., В - седьмые сутки п.и. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.6.5. Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6)

Третьи сутки после инфицирования A(H4N6)T1 характеризуются развитием иммунного ответа организма на введенный антиген; в белой пульпе селезенки экспериментальной группы мышей визуализируются центры пролиферации лимфобластов. На более поздних сроках наблюдается слияние фолликулов и формирование первичных узелков. В центральной части лимфоидных селезеночных узелков отчетливо прослеживается увеличение количества лимфобластов и макрофагов. Визуально плотность белой пульпы

увеличивается. Полученные данные свидетельствует о развивающейся иммунной реакции (Рисунок 41)

Рисунок 41. Фрагмент селезенки мыши. А - 3-е сутки п.и. штаммом ВГ А(Н4Ш)1884; В - 5-е сутки п.и. штаммом ВГ А(Н4Ы6)Т1; С - 10-е сутки; Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: х400, х200.

На третьи сутки после инфицирования исследуемым штаммом вируса гриппа вирусные частицы визуализировались, преимущественно, в отдельных клетках, расположенных вблизи селезеночных балок, а также в единичных макрофагах внутри фолликулов. К седьмым суткам картина меняется, и экспрессия антигена детектируется в лимфоцитах и макрофагах как в области

балок, так и внутри фолликулов (Рисунок 42Ь). На десятые сутки количество иммунопозитивных клеток визуально уменьшается.

А

В

Рисунок 42. Экспрессия антигена вируса гриппа А в клетках селезенки мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4Ы6)Т1, А - третьи сутки п.и., В-седьмые сутки п.и., С - фрагмент селезенки интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

3.2.6.6. Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6)

Исследование фронтальной коры головного мозга мышей, инфицированных штаммом A(H4N6)T1 показало, что структуры визуально не нарушены и не имеют различий с таковыми у интактной группы животных.

Данный факт может указывать на то, что вирус не способен проникать через гемато-энцефалический барьер. Это предположение подтверждается иммунногистохимическим анализом, в результате проведения которого не было обнаружено вирусного антигена в структурах мозга (Рисунок43).

А В

Рисунок 43. Отсутствие экспрессии антигена вируса гриппа А в клетках фронтальной коры головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А(Н4К6)Т1. А - пятые сутки п.и., В - фрагмент фронтальной коры интактной мыши. Иммуногистохимический анализ. Увеличение х400.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вирус гриппа птиц отличается широким спектром хозяев, это является причиной того, что в процесс развития эпизоотий и эпидемий вовлекаются дикие и сельскохозяйственные животные, а также человек. Кроме того, генофонд ВГА является неоднородным, объединяющим различные варианты вируса гриппа, отличающиеся, в частности, по параметру патогенности [69, 148]. Между различными вариантами ВГП возможны рекомбинационные процессы, что может сопровождаться появлением новых реассортантов, которые будут обладать оригинальными биологическими свойствами [56, 59, 65, 122, 144]. Наконец, серьезным аспектом инфекционного потенциала вируса гриппа А является его способность преодолевать межвидовой барьер, за счет чего происходит расширение круга хозяев у отдельных субтипов вируса [69, 147]. Преодолевая межвидовой барьер от птиц к млекопитающим, ВГА не всегда может быстро адаптироваться и распространяться среди особей нового вида хозяина. Однако, если это происходит, возникает новый штамм, способный вызывать эпизоотию в популяциях как диких, так и домашних животных, эпидемию или, даже, пандемию в человеческой популяции [114].

В последние десятилетия птицы привлекают все больше внимания как возможные источники возбудителей многих заболеваний человека и сельскохозяйственных животных. Массовые серологические обследования птиц, осуществленные в мировом масштабе, установили их связь с десятками патогенов вирусной и бактериальной этиологии. В конце 20 века птицы стали привлекать внимание вирусологов как возможные участники глобальной циркуляции вируса гриппа. Эпидемиологическое значение птиц обусловлено также их межконтинентальными перелетами, создающими уникальные возможности для быстрого распространения зоонозов [13]. Именно дикие птицы водного и околоводного комплексов являются основным природным резервуаром вируса гриппа А, а заражение домашних птиц, диких и сельскохозяйственных животных происходит в процессе межпопуляционных

взаимодействий с дикими лимнофильными особями [15]. Поэтому ключевое звено в системе мониторинга циркуляции вируса гриппа занимают исследования мест концентрации лимнофильных птиц в природе [10]. Роль морских и околоводных млекопитающих в экологии вируса гриппа и в качестве переносчиков потенциально зоонозных патогенов до конца не ясна и требует более пристального внимания [54].

Каспийский тюлень и ондатра, несмотря на колоссальные различия между этими двумя видами, обладают некоторыми сходными очень важными, с точки зрения экологии вирусов, характеристиками. Рассматриваемые виды разделяют ареал обитания с дикими водоплавающими птицами, в той или иной мере их образ жизни связан с водоемами. Оба вида являются промысловыми, что подразумевает достаточно тесный контакт с людьми и, потенциально, создает опасность заноса нового ВГ в человеческую популяцию. В литературе существуют данные о ранее выделенных вирусах гриппа у исследуемых видов животных, при этом имеющейся информации крайне мало, чтобы сделать какие-либо выводы о роли каспийского тюленя и ондатры в циркуляции вируса гриппа в данных популяциях.

Одной из особенностей территории юга Западной Сибири является наличие большого количества рек и озер, и, как следствие, данные участки являются гнездовыми ареалами многих видов диких перелетных птиц, которые экологически связанны с водоемами. Самое крупное озеро данного региона - озеро Чаны - известно скоплением наибольшего числа птиц во время миграционных остановок [28].

Каспийское море, также, находится на пути миграции многих видов птиц, и рассматривается как важный коридор для евразийского пространства. Большинство мигрирующих птиц азиатского сибирского региона осенью сосредоточены в северной части акватории Каспийского моря, а затем перелетают на запад и юг. Птицы используют Каспийское море как для зимовок, так и для гнездования [8], что приводит к неизбежному контакту с

эндемичными млекопитающими и может способствовать межвидовой передачи различных патогенов, в том числе и вируса гриппа птиц.

Согласно литературным данным, ранее вирус гриппа в популяции ондатр был выделен только один раз и был отнесен к H4N6 субтипу [21]. За весь период, с 2013 по 2015 гг. нами было исследовано 227 особей Ondatra zibethicus (в 2013-2014 гг. были собраны назальные мазки от 32 особей, в 2015 г. были исследованы органы животных (легкое и печень), а также, назальные мазки от 195 особей). В результате, в 2014 году от одного образца был выделен ВГ, относящийся к H2N2 субтипу. Это событие может иметь важное значение, так как именно вирус гриппа данного субтипа стал причиной пандемии в 1957 году. Этот пандемичный вирус стал следствием реассортации ВГП H2N2 субтипа от дикой птицы и вируса H1N1, циркулировавшего в популяции людей. Несмотря на то, что точное его происхождение неизвестно, ученые предполагают, что проникновение пандемичного H2N2, так называемого Азиатского гриппа, в популяцию людей произошло посредством млекопитающего, которое сыграло роль промежуточного хозяина [78].

Вирусы гриппа H2N2 субтипа, наряду с сезонными субтипами, могут

вызывать определенное беспокойство со стороны здравоохранения. Широко

известен тот факт, что, на данный момент, в популяции людей циркулируют

вирусы гриппа субтипов H1N1 и H3N2. С 1968 года вирусы гриппа H2N2

субтипа не обнаружены у людей; поэтому большинство лиц моложе 50 лет не

имеют гуморального иммунитета к Н2-антигену исуществует определенный

риск новой пандемии [100]. Хотя в настоящее время в человеческой

популяции не встречаются вирусы гриппа H2N2, данный субтип часто

выделяется от диких и домашних птиц [93]. Проведенный филогенетический

анализ показал, что выделенный нами от ондатры штамм

A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2), наиболее гомологичен с вирусами

Евроазиатской клады, ранее выделенными от диких птиц. Аминокислотный

анализ не выявил наличие замен, таких как Е627К или D701N (основных

маркеров патогенности в РВ2, отвечающих за репликацию вируса в клетках

124

млекопитающих и смену хозяина) и показал, что в данных позициях присутствуют аминокислоты, характерные для птичьих вирусов [127]. При этом, были обнаружены некоторые замены, косвенно свидетельствующие о возможном патогенном потенциале данного штамма для грызунов. Так, например, мы обнаружили 89У, 309Б, 339К, 4770, 495У и 676Т в РВ2, что, согласно литературе, свидетельствует о потенциальном повышении полимеразной активности на мышиной модели [89]. Однако, эксперименты, проведенные на мышах линии ВАЬВ/с не подтвердили патогенного потенциала А/шшкга1;/Ки881а/63/2014 (Н2Ы2), выделенного от ондатры. С одной стороны, тот факт, что экспериментальная модель не была восприимчива к этому вирусу, позволяет предположить, что патогенность ВГП может быть связана с определенной комбинацией факторов и полигенностью характеристик патогенности, которая может отличаться, в зависимости от субтипа ВГ. С другой стороны, попадание вируса в организм ондатры может носить случайный характер, ввиду особенности поведенческих реакций. Ранее в исследованиях было показано, что водная среда, в которой обитают водоплавающие птицы и другие животные, может служить источником заражения для ее обитателей. Экспериментальные исследования, проведенные профессором Делогу показали, что важную роль в распространении вируса гриппа может играть не только классическое носительство вируса птицами, где они являются резервуаром ВГ, но и сорбция этого патогена на перьях [51]. Ондатра постоянно следит за чистотой своего мехового покрова, вычесывая его и смазывая жировыми выделениями, которые продуцируются особыми железами, а также, в ноздрях ондатры располагаются особые мышечные клапаны, которые после погружения смыкаются, предотвращая попадание воды в легкие. Таким образом, вирусные патогены могут быть занесены в ротовую полость или носовые ходы животного из окружающей среды, а в дальнейшем могут выделиться из назальных или ротоглоточных мазков, взятых у животных.

Исследования, проведенные в популяции ондатр, на данном этапе не свидетельствуют о возможности данного вида быть вовлеченным в передачу новых вирусов гриппа из популяции диких птиц млекопитающим. Однако, не исключают такой возможности в будущем, и определенный риск существует при менее благоприятных, для той или иной особи, условиях, что требует проведения регулярного мониторинга в популяции околоводных млекопитающих, разделяющих ареал обитания с основными носителями ВГП.

Интересным объектом исследования являются такие представители водных млекопитающих как тюлени. Начиная с 1979 года задокументировано несколько крупных эпизоотий, вызванных вирусом гриппа, у этого вида животных [54]. В популяции каспийских тюленей (Phoca caspica), эндемичного животного, обитающего на побережье Каспийского моря, мониторинг вируса гриппапроводился и ранее. Так, в предыдущих исследованиях, проводимых в период с 1993 по 2000 гг., у тюленей брали образцы крови. При изучении образцов сыворотки, взятой от каспийских тюленей, Оиши с соавторами показал наличие антител к вирусу гриппа птиц субтипа H3N2, циркулировавшего среди людей в 1979 - 1981 гг., и предположил факт заноса вируса в популяцию каспийских тюленей напрямую от человека [106]. Данный факт еще раз указывает на тесный контакт этого вида животных с человеком. Исследования последних лет показали, что особенностью тюленей является способность быть инфицированными как человеческими штаммами, так и вирусом гриппа птиц. Это обусловлено наличием обоих типов SAa2,6Gal и SAa2,3Gal рецепторов в тканях, в том числе, респираторного тракта этих животных. Морские млекопитающие, по мнению некоторых авторов, как и свиньи, могут служить неким сосудом, в котором происходит смешение вирусов гриппа птиц и человеческих штаммов [30, 118]. Вышеуказанные данные подчеркивают существующую опасность появления реассортантных штаммов вируса гриппа, потенциально опасных для других млекопитающих, в том числе - людей.

При изучении штаммов, выделенных от каспийских тюленей, проведенный филогенетический анализ выявил, что все гены двух штаммов вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6), относятся к евразийской линии ВГП и генетически схожи с вирусами, выделенными ранее от птиц на территории Швеции, Египта, Израиля, Голландии, Кореи и Монголии. Учитывая тот факт, что штаммы, которые были выделены во время проводимого нами мониторинга, относятся к птичьим, можно предполагать о возможности инфицирования тюленей напрямую от птиц.

Впервые вирус гриппа Н4 субтипа был выделен от утки на территории Чехословакии в 1956 году. С тех пор, низкопатогенные ВГ Н4 субтипа широко циркулируют в популяциях диких и домашних птиц в странах Азии, Европы и Северной Америки [40, 52, 76, 90, 137, 153, 156]. В ряде проведенных за последние годы исследований было показано, что вирусы гриппа данного субтипа могут реплицироваться в организме мышей без предварительной адаптации и, более того, способны передаваться от одной особи к другой при прямом контакте [76, 90]. Поразительно, что некоторые штаммы Н4 могут вызывать тяжелые респираторные заболевания у мышей, что в конечном итоге приводит к смерти [40]. Помимо птиц, вирусы Н4 были выделены от млекопитающих, включая тюленей и свиней [67, 70, 77]. Эти результаты могут явно указывать на имеющуюся потенциальную угрозу, представляемую вирусами Н4 для общественного здравоохранения. Филогенетический анализ, проведенный нами в исследовании, подтверждает данные, представленные в литературных источниках. Согласно дендрограмме НА субтипов Н4 из базы данных GISAID, в предыдущие годы неоднократно происходили случаи выделения от млекопитающих (свиньи, тюлени, ондатры) штаммов вируса гриппа, близкородственных штаммам вируса гриппа птиц. В частности, в Северной Америке от свиньи был выделен штамм А/swine/Missouri/АО 1727926/2015 субтипа H4N6, который филогенетически

был также близок к штаммам вируса гриппа птиц северо-американской клады.

127

В 2011 году в Китае (Guangdong) от свиньи был изолирован штамм вируса гриппа, содержащий Н4, филогенетически схожий с Н4 штаммов ВГП, выделенных от птиц в Корее и Китае, что еще раз подтверждает возможность инфицирования некоторых видов млекопитающих напрямую от птиц.

Ранее были описаны случаи выделения ВГП субтипа Н4 от морских/водных и околоводных млекопитающих. В 1982 году был выделен от тюленя и описан штамм H4N5 субтипа, в США (штат Массачусетс), а в 2000 году в Российской Федерации (Бурятия) от ондатры был выделен штамм субтипа H4N6. Таким образом, изоляция ВГ Н4 субтипа от тюленей не является уникальной и встречалась ранее. Кроме того, показаны случаи выделения от млекопитающих (свиньи, кошки, ондатры) штаммов вируса гриппа, содержащих NA субтипа N6. При этом, вирусы, изолированные от свиней на территории Северной Америки (A/swine/Ontario/01911-1/99 и А/swine/Missouri/АО 1727926/2915 субтипа H4N6) по структуре гена NA филогенетически близки к ВГП. Таким образом, создается опасность появления новых реассортантных штаммов, представляющих потенциальную угрозу для млекопитающих, в том числе, для человека.Так, например, инфицирование вирусом гриппа H7N7 субтипа, выделенного от тюленей во время эпизоотии на побережье Новой Англии,доказал наличие патогенного потенциала для людей, вызывая конъюнктивит у исследователей, контактировавших с больными животными [146]. В эксперименте на животных, тот же самый вирус H7N7 субтипа реплицировался в легких и носоглотке у саймири после внутритрахейного введения, и вызывал симптомы схожие с таковыми при человеческой гриппозной инфекции. Вирус гриппа данного субтипа был извлечен из селезенки, печени, мышц и легких обезьян, умерших от пневмонии, таким образом указывая на способность системного распространения инфекции у приматов [99].

Как известно, ВГ в популяции млекопитающих передается

респираторным путем, поэтому первым органом-мишенью при встрече с

патогеном оказываются легкие. Входными воротами для вируса гриппа

128

являются клетки мерцательного эпителия верхних дыхательных путей - носа, трахеи, бронхов. Размножение вируса в эпителиоцитах приводит к их разрушению. После выхода из клеток некоторые вирусы проникают в кровь, с током которой разносятся по всему организму (стадия виремии). Циркулируя в крови, вирус гриппа поражает кровеносные сосуды - это основной механизм ответственный за поражение внутренних органов при гриппе [4].

Для оценки патогенного потенциала вирусов, выделенных от каспийских

тюленей, была выбрана модель мышей линии BALB/c [138]. Мыши были

экспериментально заражены обоими вирусами, A(H4N6)T1 и A(H4N6)1884.

Результаты ПЦР в режиме реального времени показали способность данных

вирусов реплицироваться в легких мышей без предварительной адаптации. На

пятые сутки в обеих группах инфицированных животных был зафиксирован

падеж особей. Проведенные морфологические исследования тканей органов,

взятых от мышей экспериментальных групп, позволили предположить, что,

вероятно, летальный исход был связан с серьезным поражением ткани легких

у животных этих двух групп. Методом световой микроскопии на 3 сутки в

легких определяли воспалительный процесс на всех уровнях организации

органа, который с течением времени усугублялся и принимал

генерализованный характер. При этом характер изменений структуры тканей

и течение процесса в двух группах отличались друг от друга. При

инфицировании A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) инфекция развивалась

стремительно и уже на 3-й сутки были зафиксированы периваскулярные

отеки, отмечалась обширная инфильтрация лимфоцитарно-моноцитарного

генеза в интерстицию и разрастание соединительной ткани периваскулярно и

периброхниально. В мелких и средних бронхах наблюдалась десквамация

эпителия. С течением времени, картина визуально усугублялась. В ткани

легкого отчетливо определялись множественные крупные очаги

лимфоцитарно-моноцитарного инфильтрата. В интерстициальной ткани,

окружающей воздухоносные пути и альвеолы, обнаруживались отёки и

сливные некрозы. При этом, на 10 сутки, зоны ателектаза визуально

129

уменьшались, а просветы респираторной части легкого выглядели очищенными от детрита и клеток крови. Таким образом, через десять суток после заражения A(H4N6)1884 состояние лёгочных тканей в исследуемой группе свидетельствовало о развитии интерстициальной пневмонии, но на десятые сутки наблюдали меньшую площадь поражения лёгких и признаки репарации, что в свою очередь могло предполагать процесс выздоровления. При экспериментальном инфицировании штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) в тканях легкого, при схожей морфологической картине в тканях органа, наблюдалась меньшая интенсивность течения воспалительных процессов на третьи сутки п.и., чем при заражении другим штаммом. Наиболее масштабные морфологические изменения были зафиксированы на 5 - 7 сутки, а к десятым суткам, как в предыдущем случае, мы наблюдали репаративные процессы, которые могли свидетельствовать о выздоровлении животных, но при этом, степень поражения органа визуально оценивалась выше, чем при инфицированиии вирусом, выделенным ранее.

Патологические изменения в тканях воздухоносных путей, вызываемые

разными субтипами вируса гриппа у людей и животных, зависят от

вирулентности конкретного штамма и реакции организма хозяина. Все вирусы

гриппа, способные вызывать инфекцию у млекопитающих, инфицируют

эпителий верхних дыхательных путей и бронхиол, однако,

высоковирулентные штаммы (2009H1N1, H5N1), как правило, также,

способны заражать пневмоциты и альвеолярные макрофаги. Локализация и

распространение воспаления зависит от того, клетки каких тканей

респираторного тракта способны поражать те или иные штаммы вируса

гриппа. Так, низковирулентные штаммы (сезонные H3N2 и H1N1) вызывают,

в первую очередь, воспаление, застойные явления и некроз эпителиальных

клеток в крупных воздухоносных путях (трахея, бронхи и бронхиолы). Тогда

как, высоковирулентные штаммы (2009H1N1, H5N1), наряду с

перечисленными патологическими изменениями, способны поражать более

обширные участки респираторного тракта и вызывать воспалительные

130

процессы в альвеолах. В некоторых случаях, это приводит к серьезным повреждениям стенок данных структур [63, 159].

Иммуногистологические методы подтвердили наличие вирусного антигена в клетках легкого различного генеза. В динамике заболевания маркер определяли в альвеолоцитах и эпителиоцитах бронхов различного калибра. Визуально определяемое количество клеток с положительной окраской было максимальным на 5 сутки после инфицирования. В фибробластах и эндотелии сосудов наличие вируса не определялось. В случае с исследуемыми штаммами, мы наблюдали небольшое количество антиген положительных клеток, но при этом их локализация варьировала от стенки альвеол до эпителия бронхов. Интерес вызывает тот факт, что при отсутствии адаптации вирусов к организму мышей, даже при незначительном количестве вируса в легких, мы наблюдали достаточно большие патологические изменения в тканях органа, приведшие к серьезному течению болезниу животных в обеих группах. В обоих случаях, даже на десятые сутки, антиген визуализировался в клетках органа, но количество антиген положительных клеток в легких мышей, инфицированных A(H4N6)18846buio визуально меньше, чем при инфицировании A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6).

Ранее, в исследованиях других авторов было показано, что вирус гриппа,

также обнаруживается в моче, крови и спинномозговой жидкости [4], поэтому,

допускают, что, наряду с первичной легочной локализацией, ВГП может

размножаться в различных органах, имеющих эпителий и эндотелий, в том

числе в мягких мозговых оболочках. Совместно с локальным воспалительным

процессом происходит общая интоксикация организма, занимающая ведущее

значение в патогенезе инфекции. В ходе нашего исследования были

проанализированы особенности влияния обоих вирусов на нереспираторные

органы (головной мозг, печень, почку, селезенку, сердце) экспериментальных

мышей линии BALB/c в сравнении с друг с другом. В почке и селезенке с

помощью иммуногистохимических методов была выявлена вирусная

продукция в обеих экспериментальных группах, при этом максимальное

131

количество иммунноиозитивных клеток визуализировалось 3 сутки. При инфицировании обоими вирусами локализация вирусного антигена отмечалась в отдельных эпителиоцитах канальцев почки, а также в лимфоцитах и макрофагах селезенки, как в области балок, так и внутри фолликулов.

Селезенка, являясь одним из органов иммунногенеза, ответственна за продукцию антител на антигены, циркулирующие в крови. Инфицирование мышей штаммами A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) привело к развитию выраженного гуморального ответа, так к 21 суткам во всех пробах сыворотки крови, отобранных от инфицированных мышей, в РТГА с соответствующими вирусами определялись антитела к введенным штаммам. Определяемые титры были выше пороговых значений. Таким образом, эксперименты на мышах показали, что оба штамма обладают выраженной иммуногенностью.

При наработке выделенных вирусов в системе РКЭ и на культуре клетокбыли отмечены различия. Оба вируса с большей эффективностью нарабатывались в системе РКЭ. Но, при этом, клеточный титр A(H4N6)1884 был на порядок больше, чем при инфицировании A(H4N6)T1.

В результате проведенного аминокислотного анализа были обнаружены аминокислотные замены в белках Ml и NS1 у обоих вирусов, выделенных от каспийских тюленей. Как отмечено в литературе ранее, данные замены могут способствовать увеличению вирулентных свойств вирусов и, как следствие, вызывать повышенную летальность среди зараженных животных, а также воздействовать на механизм иммунной защиты хозяина, снижая восприимчивость клеток к действию интерферонов [53, 75]. Проведенное исследование показало способность A(H4N6)T1 и A(H4N6)1884 вызывать заболевание с летальным исходом у экспериментальных мышей без предварительной адаптации, что только косвенно может быть связано с указанными аминокислотными заменами.

Как известно, вирус гриппа птиц способен образовывать новую генетическую линию в резервуаре млекопитающих, чему свидетельствует человеческая пандемия 1918 года (H1N1), евразийский классический грипп у свиней (H1N1), вирус гриппа у лошадей (H3N8) и, возможно, у летучих мышей (H17N10, H18N11) [140]. Таким образом, учитывая данный факт и результаты проведенного исследования можно предположить, что большого внимания требует дальнейшее изучение новых недооцененных резервуаров, а также способность вирусов гриппа преодолевать межвидовой барьер, появляться, а главное, закрепляться в новых хозяевах.

4.1 Выводы

1. Выделен вирус гриппа птиц А субтипа H2N2 от ондатры, обитающей на юге Западной Сибири. Показано его филогенетическое родство с вирусами гриппа, циркулировавшими среди диких птиц в Евразии.

2. Показано, что штамм A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2), не вызывает инфекцию при экспериментальном инфицировании мышей линии BALB/c: отсутствовали клинические признаки заболевания, не детектировалась молекулярно-биологическими методами репликация вируса в легких у мышей.

3. Впервые было выделено два новых штамма вируса гриппа птиц H4N6 субтипа от каспийских тюленей. Показана высокая филогенетическая близость A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) вирусам, выделенным от птиц циркулирующим на территории Евразии.

4. Выявлена активная вирусная репликация штаммов A/Caspian seal/Russia/T 1/2012 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) в легких мышей с 3 по 7 сутки, включительно, с наибольшим титром вируса на 5 сутки эксперимента.

5. Показана экспрессия нуклеопротеина (NP) штаммов A/Caspian seal/Russia/T 1/2012 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) методом

иммуногистохимии в эпителиальных клетках легких и почки, а также, в тканевых макрофагах селезенки.

6. При инфицировании A/Caspian seal/Russia/Tl/2012 (H4N6) и A/Caspian seal/Russia/1884/2002 (H4N6) наибольшие морфологические изменения были зафиксированы в легких животных обеих групп. Степень выраженности воспалительного процесса у мышей, зараженных A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6), в отличие от мышей, зараженных A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6), преобладала на ранних сроках заболевания. Среди наблюдаемых полиорганных морфологических изменений, наиболее выражен отечно-деструктивный синдром.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Автандилов, Г.Г. Основы количественной патологической анатомии: Учебное пособие. - М.: Медицина, 2002. -240 с.

2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев // М.: Медгиз. - 1962. -179 с.

3. Бурдин, A.M. Морские млекопитающие России: справочник-определитель / Бурдин А. М., Филатова О. А., Хойт Э.// Киров: Волго-Вятское книжное издательство. - 2009. - 210 е.: ил.

4. Бурцева, Е.И. В.М. Жданов и его единомышленники: из истории организации изучения вирусов гриппа человека / Е.И Бурцева, В.Т. Иванова, A.JI. Беляев, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. Издательство: Издательство "Медицина" (Москва). - 2013. - № 1. - 80-89 с. ISSN: 0507-4088 е ISSN: 2411-2097.

5. ВОЗ, 2009 (а). М. Чен. Мир в начале пандемии гриппа 2009 года. http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/hlnl_pandemic_pha se6_20090611/ru/

6. ВОЗ, 2009 (в). Часто задаваемые вопросы о гриппе A (H1N1) http://www.who.int/csr/disease/swineflu/faq/ru

7. Гаджиев, В. Д. Флора и растительность Кызылагачского заповедника и её биоразнообразие / В.Д. Гаджиев, Э. Ф. Юсифов // Баку: Национальная Академия Наук Азербайджана. Институт Ботаники. - 2003. - 183 с.

8. Даниленко, Е. А. Миграции птиц в Каспийском регионе. Электронный атлас Каспийского моря / Е.А. Даниленко, М.С. Солдатов // Русское Географическое Общество, Географический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва. - 2015, www.geogr.msu.ru/casp.

9. Ерохов, С. Н. Белокрылая крачка / С. Н. Ерохов // Птицы СССР. Чайковые / С. Н. Ерохов. - М.: Наука. - 1988. - 85-97 с.