Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Калинина, Ольга Викторовна

• Калинина, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калинина, Ольга Викторовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Современные представления о вирусе гепатита С и методах его детекции

1.1.1. Молекулярная биология вируса гепатита С

1.1.2. Методы выявления ВГС

1.2. Молекулярная эпидемиология гепатита С

1.2.1. Вариабельность вирусного генома. Генотипы ВГС

1.2.2. Генотипы и генетическая гетерогенность ВГС как эпидемиологические маркеры

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге»

Гепатит С является одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всем мире, включая Россию. Это связано с широким распространением инфекции и частыми ее неблагоприятными исходами с развитием хронического гепатита, цирроза печени, а в дальнейшем гепатокарциномы. При отсутствии эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС предотвращение распространения инфекции является основной задачей в борьбе с данным заболеванием.

Одной из особенностей вируса ГС является его высокая генетическая вариабельность, на основании которой была создана концепция генотипов. Современная классификация насчитывает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Simmonds Р, 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет решать задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозирования исходов заболевания и выработки тактики противовирусной терапии (Соринсон С.Н., 1998; Mondelli M.U. et al., 1999; ZeinN., 2000).

Известно, что генотипы 1, 2 и 3 наиболее распространены, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах (Simmonds P. et al., 1999). В Европе преобладает субтип 16, в США преимущественно распространен субтип la (Mahaney К. et al., 1994; Nousbaum J. et al., 1995; Zein N. et al., 1996). В Японии отмечена достаточно высокая циркуляция генотипов 1 (субтип 16) и 2 (Nousbaum J., 1998). Субтип За занимает, как правило, второе или третье место по частоте встречаемости в этих географических зонах (Lee С. et al., 1992; Simmonds P., 1999; Mondelli M. et al., 1999). Наряду с этим генотипы 4, 5 и 6 имеют более локальное распространение. Генотип 4 превалирует в Северной Африке и некоторых странах Среднего Востока, а генотип 5 был выявлен только в Южной Африке (Simmonds P. et al., 1993а; Bukh J. et al., 1995b). В состав генотипа 6 в настоящее время включены генотипы 7, 8, 9 и 11, 7 и с учетом этого, данный генотип широко распространен на территории всей Юго-Восточной Азии (Okamoto Н. et al., 1996; Tokita Н. et al., 1996; Simmonds P. et al., 1995, 1999). Во всем мире продолжают следить за циркуляцией вариантов вируса ГС в популяции, что позволяет выявлять смену доминирующих субтипов (Ross R. et al., 2000).

О распространенности различных генотипов и субтипов ВГС в отдельных регионах России до сих пор имеется небольшое количество публикаций. Во всех этих работах было отмечено доминирование субтипа 16 (Вязов С. и др., 1996; Львов Д. и др., 1996, 1997, Мукомолов С. и др., 1996; Viazov S. et al., 1997), которое сохраняется до настоящего времени согласно недавно опубликованным данным (Кузин С. и др., 1999, Shustov A. et al., 1999). В отношении распространения других субтипов вируса ГС в доступной литературе имеются ограниченные и весьма противоречивые сведения.

Разработано несколько методов быстрого определения генотипов ВГС. Стандартизованной является тест-система INNO-LiPA (Innogenetics, Belgium). Тем не менее, в мире получили широкое распространение методы, основанные на использовании ПЦР: либо с типоспецифическими праймерами (Okamoto Н. et al., 1992), либо с последующим проведением рестрикции полученных амплификатов (PCR-RFLP). Последний метод позволяет дифференцировать все шесть генотипов и основные субтипы генотипов 1, 2 и 3 в зависимости от количества используемых рестриктаз (Davidson F. et al.,1995).

В России для генотипирования изолятов ВГС в основном используют метод, предложенный Н. Okamoto (1992; 1996), который позволяет дифференцировать лишь пять субтипов ВГС: 1а, 16,2а, 26 и За.

Несмотря на то, что определение генотипов ВГС помогает в решении ряда задач эпидемиологии, знание о конкретном генотипе выделенного изолята ВГС не является абсолютным доказательством общности источника инфекции, конкретных путей распространения возбудителя, поскольку оно не несет информации о генетических взаимоотношениях между различными вариантами 8

ВГС. Такие данные можно получить лишь при изучении молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса. Дополнительно эти данные могут оказаться полезными при конструировании вакцин против ВГС.

Международный генетический банк EMBL (GeneBank) постоянно пополняется данными о новых нулеотидных последовательностях различных участков генома изолятов ВГС, выделенных в разных географических зонах. Доступность этой информации позволяет уточнять с помощью филогенетического анализа принадлежность каждого изолята к конкретному субтипу, охарактеризовывать новые субтипы ВГС.

В настоящее время имеется всего несколько публикаций, посвященных анализу нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГС (Васильев В. и др., 1994; Viazov S. et al., 1997; Тарасов К., 1998). При этом только в одной работе был проведен филогенетический анализ изолятов ВГС субтипа 16, который показал отсутствие какой-либо специальной кластеризации между российскими изолятами (Viazov S. et al., 1997).

Сравнение результатов генотипирования, выполненных на различных участках генома одного и того же изолята ВГС, до сих пор не выявило возможность генетической рекомбинации между геномами разных изолятов (Simmonds P. et al., 1999). В тоже время, в ряде исследований с помощью ПЦР с типоспецифическими праймерами было выявлено одновременное присутствие двух изолятов ВГС, принадлежащих к разным генотипам, в образцах сыворотки крови (Jarvis L. et al., 1994; Gournay J. et al., 1995; Sheng L. et al., 1995; Nishizono A. et al., 1997; Львов Д. и др., 1997; Тарасов К., 1998).

Таким образом, внедрение методов, позволяющих получать информацию о молекулярно-генетической характеристике циркулирующих вариантов вируса ГС, может открыть широкие перспективы развития молекулярной эпидемиологии ГС, а также глубже понять процесс формирования новых генетических разновидностей возбудителя. 9

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Цель: Охарактеризовать варианты ВГС, циркулирующие в Санкт

Петербурге, и установить особенности их распространения среди различных групп населения города с помощью молекулярно-генетических методов.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность использования праймеров из различных областей генома ВГС при выявлении РНК ВГС в образцах сыворотки крови методом обратно-транскриптазной и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

2. Провести генотипирование вариантов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге, с помощью анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков генома ВГС, амплифицированных в полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP).

3. Определить нуклеотидные последовательности фрагмента NS5B области генома изолятов ВГС различных генотипов методом лимитированного секвенирования.

4. Изучить особенности распространения и генетические взаимоотношения между изолятами ВГС различных субтипов ВГС, циркулирующих среди больных ГС и анти-ВГС-позитивных пациентов отделений гемодиализа, на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома.

5. Установить возможность смешанной инфекции, обусловленной различными вариантами возбудителя, а также генетической рекомбинации между изолятами, принадлежащими к разным субтипам ВГС.

6. Показать преимущества использования молекулярно-генетических методов при решении задач эпидемиологического надзора за вирусным гепатитом С.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на основе лимитированного секвенирования участков генома и анализа нуклеотидных последовательностей изолятов изучена генетическая

10 структура популяции ВГС на территории Санкт-Петербурга.

Получены новые данные о распространении субтипов 1а, 16, За среди различных категорий инфицированных лиц, включая пациентов из групп риска. Впервые в Санкт-Петербурге выявлены субтипы 2а, 2с и 4а.

У больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города, показано доминирование ВГС субтипа За. Впервые на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка NS5B области генома, установлено, что в Санкт-Петербурге сформировались варианты ВГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских вариантов данного субтипа. У анти-ВГС позитивных пациентов отделений гемодиализа показано преобладание вариантов ВГС субтипа 16 и установлены пути их распространения. В одном из отделений гемодиализа выявлен «внутрибольничный» вариант данного субтипа.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей получены убедительные доказательства смешанной инфекции, обусловленной разными вариантами возбудителя, и возможности генетической рекомбинации между изолятами ВГС различных генотипов.

Впервые в России выявлены изоляты ВГС субтипа 2к, который был зарегестрирован в качестве нового субтипа генотипа 2 в международном банке данных (2000 г.) и ранее выявлялся только в Молдавии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Результаты исследования свидетельствуют о необходимости внедрения молекулярно-генетических методов в эпидемиологический надзор за вирусным гепатитом С. В ходе исследования был апробирован модифицированный метод PCR-RFLP, который может быть рекомендован для слежения за циркуляцией субтипов/генотипов ВГС среди различных категорий населения. Внедрение метода лимитированного секвенирования позволит быстро проводить филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов

11

ВГС для выявления возможных источников инфекции и факторов передачи с целью предотвращения дальнейшего распространения возбудителя. Результаты работы включены в аналитический обзор «Вирусные гепатиты в Российской Федерации, вып.З», а также используются в учебном процессе в СПб НИИЭМ им. Пастера (1-й и 2-й учебные семинары для врачей-эпидемиологов «Эпидемиология вирусных гепатитов и эпидемиологический надзор за этими инфекциями в современный период», СПб, 1999, 2000). Полученные результаты используются в работе кафедр и клиник инфекционных болезней Военно-Медицинской Академии и Санкт-Петербургского Медицинского Университета им. Акад. И.П. Павлова.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В настоящее время в Санкт-Петербурге циркулирует 7 субтипов вируса ГС: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а. При этом субтип За доминирует у больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города. В то же время ВГС субтипа 16 продолжает оставаться наиболее распространенным у пациентов отделений хронического гемодиализа.

2. Наряду с разнообразными вариантами вируса ГС субтипа 16, встречающимися у больных ГС и родственными европейским и азиатским вариантам ВГС, в Санкт-Петербурге сформировались собственные варианты ВГС субтипа За, отличные от большинства европейских и азиатских вариантов данного субтипа. В отделениях хронического гемодиализа возможно формирование «внутригоспитального» варианта ВГС субтипа 16, отличающегося от вариантов этого субтипа, выявляемых у больных инфекционных стационаров.

3. При гепатите С существует смешанная инфекция, обусловленная несколькими субтипами вируса, а также возможна рекомбинация между геномами изолятов, принадлежащих к различным генотипам ВГС.

12

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Калинина, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

1. В Санкт-Петербурге выявлена циркуляция семи субтипов возбудителя: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а по данным метода лимитированного секвенирования NS5B и 5'UTR/core областей генома изолятов вируса ГС. При этом ВГС субтипа За (50%) являлся доминирующим у больных вирусным ГС, находившихся на лечении в инфекционных отделениях стационаров, а ВГС субтипа 16 (89%) превалировал у пациентов отделений хронического гемодиализа.

2. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома вируса ГС определены генетические взаимоотношения между изолятами вируса, распространенными в Санкт-Петербурге и в мире. Установлено, что в городе сформировались варианты вируса ГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских изолятов данного субтипа. В одном из трех отделений хронического гемодиализа сформировался «внутригоспитальный» вариант вируса ГС субтипа 16, которым оказались инфицированы 17 из 22 РНК ВГС позитивных пациентов.

3. В образцах сыворотки крови трех больных вирусным ГС анализ нуклеотидных последовательностей из NS5B и 5'UTR/core областей генома показал одновременное присутствие двух субтипов вируса (16 и 2к, соответственно), что свидетельствует как о смешанной инфекции, вызванной разными вариантами возбудителя, так и о вероятности рекомбинации между геномами вариантов ВГС, принадлежащих к разным генотипам.

4. Метод PCR-RFLP, основанный на использовании праймеров из 5'UTR области генома и трех рестриктаз (BstUl, BstNl и Sau3a), позволяет выявлять основные субтипы/генотипы вируса ГС, циркулирующие в России. Совпадение результатов при определении субтипов/генотипов с помощью

122 данного метода PCR-RFLP и лимитированного секвенирования составляет 95%/100%.

5. Использование праймеров из 5'UTR области генома обеспечивает наиболее эффективное выявление РНК ВГС в исследуемых образцах сыворотки крови методом ОТ-ПЦР по сравнению с праймерами из 5'UTR/core или NS5B областей.

6. Молекулярно-генетические методы исследования необходимы для получения достоверной информации о путях распространения вируса ГС и взаимосвязи между отдельными случаями заболевания.

123

1.3. Заключение

Таким образом, одной из особенностей вируса ГС является его высокая генетическая вариабельность. Современная классификация насчитывает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Simmonds Р, 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет контролировать циркуляцию различных вариантов вируса на конкретной территории, решать практические задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозировать исход заболеваний и вырабатывать тактику противовирусной терапии. Раработаны различные методы генотипирования ВГС. Наиболее простыми и доступными являются методы, основанные на постановке ОТ-ПЦР (ОТ-ПЦР с типоспецифическими праймерами, PCR-RFLP).

Информация о принадлежности выделенного изолята ВГС к конкретному генотипу не всегда является доказательством общности источника инфекции и путей распространения возбудителя. Изучение молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса и информация о генетических взаимоотношениях между различными вариантами ВГС позволяет более четко отвечать на поставленные эпидемиологические вопросы.

Неясными остаются вопросы о существовании смешанной инфекции, вызванной одновременно несколькими гено/субтипами вируса ГС, и о возможности генетической рекомбинации между геномами разных изолятов ВГС.

В связи с указанным, необходимо определение вариантов ВГС, циркулирующих среди населения, и их углубленное изучение с помощью молекулярно-генетических методов исследования.

47

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Образцы сыворотки крови

В работе изучено 716 образцов сыворотки крови, полученных от пациентов инфекционных отделений стационаров и отделений хронического гемодиализа Санкт-Петербурга. Определение антител к вирусу ГС проводили с использованием иммуноферментных тест-систем 3 поколения anti-HCV (НПФ "Аквапаст», С.Петербург), HCV Monolisa (Sanofi Diagnostic Pasteur, France) или UBI HCV EIA 4.0 (Organon Teknika, Netherlands) совместно с научным сотрудником В.А. Плотниковой (лаборатория вирусных гепатитов Санкт-Петеребургского НИИЭМ им. Пастера).

Образцы сыворотки крови, полученные от 294 пациентов инфекционных отделений стационаров с диагнозом вирусный ГС, были предоставлены д.м.н. К.В.Ждановым (Военно-Медицинская Академия), врачом-инфекционистом Т.А.Ветровым (Городская инфекционная больница N30 им. С.П.Боткина), к.м.н. Т.Г.Дмитриевой (Детская инфекционная больница N3). В анамнезе 130 больных имелись указания на внутривенное употребление наркотических средств. 65 больных обращалось за медицинской помощью в течение 6 месяцев, предшествовавших заболеванию, и могли быть инфицированы в медицинских учреждениях, включая 24 пациента детских отделений гемодиализа (14), нефрологии (4) и гематологии (6). Распределение обследованных пациентов по полу, возрасту и предполагаемым путям заражения ВГС представлено в таблице 1. Также изучен 61 образец сыворотки крови больных хроническим ГС, которые были предоставлены Медицинским факультетом Якутского Государственного Университета (к.м.н. М.Н.Алексеева). В коллекции из Якутии было 27 образцов сыворотки крови, полученных от мужчин, и 34 - от женщин, возраст пациентов варьировал от 16 до 65 лет. Помимо образцов сыворотки крови взрослых больных в коллекцию входило 3 образца сыворотки крови детей в возрасте от 8 до 14 лет.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калинина, Ольга Викторовна, 2000 год

1. Афанасьев А.Ю., Зубов С.В., Юданов Ю.Е., Кривопустова А.В. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии, 1995, т5, N3, приложение 1, с. 12.

2. Васильев В.Б., Вязов С.О., Котова Е.И., Носиков В.В. Определение последовательностей нуклеотидов российского варианта ВГС.// Мол. Биол., 1994, N1, с.33-37.

3. Вейр Б. Анализ генетических данных.// Москва, Мир, 1995, 399 с.

4. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор (2выпуск) под ред. Жебруна А.Б., С.-Петербург, 1999, с.167-193.

5. Кузин С.Н., Мажуль Л.А., Снегирев И.Б. и др. Генотипы вируса гепатита С у больных гемофилией.// Вопросы вирусологии, 1996, N 2, с.63-65.

6. Зубкин М.Л., Селиванов Н.А., Стаханова В.М. и др. Распространенность и особенности инфицирования вирусами гепатитов В и С в условиях лечения гемодиализом.// Вопросы вирусологии, 2000, N1, с. 10-13.

7. Зубов С.В., Соринсон С.Н., Жданов Ю.Е., Афанасьев А.Ю. Серологический профиль в разные фазы гепатита С.// В кн. Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. СПб, 1995, с.86.

8. Киселев О.И., Яковлев А.А., Виноградова Е.Н. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С в Санкт-Петербурге и их клиническая характеристика.// В сб.: Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции, СПб, «ССЗ», 1997, т. 1, с.53-61.

9. Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. // Вопросы вирусологии, 1999, N2, с.79-82.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия.// «Высшая школа», Москва, 1973, 342 с.129

11. Львов Д.К., Миширо С., Селиванов Н.А. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России.// Вопросы вирусологии, 1995, N6, с.251-253.

12. Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Миширо С. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ.// Вопросы вирусологии, 1997, N4, с.157-161.

13. Мукомолов С.Л., Валькова И.В., Чайка Н.А. Вирусные гепатиты.// СПб., 1992, 97с.

14. Мукомолов С.Л., Колобов А.А., Плотникова В.А. и др. Использование метода серотипирования для определения генотипов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге.// Тезисы междун. Фальк симпозиума N92, СПб, 1996, с.266.

15. Мукомолов С.Л., Яковлев А.А., Колобов А.А., Плотникова В.А. и др. Диагностическое значение определения антител класса IgM к ядерному белку вируса гепатита С.// В кн. Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции, СПб, 1997, т. 1, с.61-70.

16. Самохвалов Е.И., Кузин С.Н., Вязов С.О., Львов Д.К. «Итальянский» генотип 2с вируса гепатита С на территории России.// Тезисы докл. Шей науч-практ.конф. с межд. уч., М., 1999, с.201.

17. Созина И.А. Разработка и использование метода определения генотип-специфических антител к вирусу гепатита С.// Автореф. канд. мед. наук., Санкт-Петербург, 1998,20с.

18. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике.// Теза, СПб, 1996, с. 204-234.

19. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. 2-ое издание. Теза, СПб, 1998, с.210-244.

20. Тарасов К.В. Генодиагностика и генотипирование вируса гепатита С.// Автореф. канд. мед. наук., Санкт-Петербург, 1998, 18с.130

21. Шахгильдян И.В., Кузин С.Н., Вязов С.О. и др. Эпидемиология гепатита С в России и других странах СНГ. Роль естественных путей передачи вируса гепатита С.// Новые направления в гепатологии: Тезисы межд. Фальк сипмозиума N92, С-Петербург, 1996, с.441.

22. Andonov A. and Chaudhary R.K. Subtyping of hepatitis С virus isolates by a line probe assay using hybridization.// J.Clin.Microbiol., 1995, 33, n.l: p.254-256.

23. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., and Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions.// J.Virol., 1993, 67, n.7: p.3835-3844.

24. Ben-Ari Z., Pappo O., Zemel R., Мог E., and Tur-Kaspa R. Association of lamivndine resistance in recurrent hepatitis В after liver transplantation with advanced hepatic fibrosis.// Transplantation, 1999, 68, n.2: p.232-236.

25. Berenguer M. and Wright T.L. Is the hepatocyte a Trojan horse for hepatitis С virus? comment.// Gut, 1998, 42, n.4: p.456-458.

26. Berg Т., Hopf U., Stark K., Baumgarten R., Lobeck H., and Schreier E. Distribution of hepatitis С virus genotypes in German patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and virological parameters.// J.Hepatol., 1997, 26, n.3: p.484-491.

27. Bernier L., Willems В., Delage G., and Murphy D.G. Identification of numerous hepatitis С virus genotypes in Montreal, Canada.// J.Clin.Microbiol., 1996, 34, n.ll: p.2815-2818.

28. Biasin M., Fiordalisi G., Zanella I., Cavicchini A., Marchelle G., and Infantolino D. A DNA hybridization method for typing hepatitis С vims genotype 2c.// J.Virol.Methods, 1997, 65, n.2: p.307-315.

29. Blight K., Trowbridge R., Rowland R., and Gowans E. Detection of hepatitis С virus RNA by in situ hybridization.// Liver, 1992, 12, n.4 Pt 2: p.286-289.

30. Blumberg B. S., Alter H.J., and Visnich S. Landmark article Feb 15, 1965: A "new" antigen in leukemia sera. By Baruch S. Blumberg, Harvey J. Alter, and Sam Visnich.// JAMA, 1984, 252, n.2: p.252-257.

31. Bresters D., Reesink H.W., Cuypers H.T., Jansen P.L., Mauser-Bunschoten E.P., van der Poel CL, and Lelie P.N. Sensitivity of an anti-HCV core peptide ELISA.// J.Med.Virol., 1992b, 37, n.3: p.187-191.132

32. Biikh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Biology and genetic heterogeneity of hepatitis С virus.// Clin.Exp.Rheumatol., 1995a, 13 Suppl 13:S3-7, p.S3-S7.

33. Bukh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus: quasispecies and genotypes.// Semin.Liver Dis., 1995b, 15, n.l: p.41-63.

34. Bukh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Genetic heterogeneity of the hepatitis С virus.//Princess.Takamatsu.Symp., 1995c, 25:75-91, p.75-91.

35. Bukh J., Purcell R.H., and Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis С virus genotypes.// Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.A., 1994, 91, n.17: p.8239-8243.

36. Burjel L., Daglio M., Ghioni G., Manzin A., Pereira M., Ribeiro L., Solforosi L., Taborda M., and Thomas C. Characterization of hepatitis С virus genotypes in an hemodialysis unit in Paysandu, Uruguay.// Rev.Argent.Microbiol., 1998, 30, n.4: p.190-194.

37. Cha T. A., Beall E., Irvine В., Kolberg J., Chien D., Kuo G., and Urdea M.S. At least five related, but distinct, hepatitis С viral genotypes exist.// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1992, 89, n.15: p.7144-7148.

38. Chan S. W., McOmish F., Holmes E.C., Dow В., Peutherer J.F., Follett E., Yap P.L., and Simmonds P. Analysis of a new hepatitis С virus type and its phylogenetic relationship to existing variants.// J.Gen.Virol., 1992, 73, n.Pt 5: p.1131-1141.

39. Chang M. Chronic hepatitis virus infection in children.// J.Gastroenterol. Hepatol., 1998, 13,n.5: p.541-548.

40. Choo Q. L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W., and Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.// Science, 1989, 244, n.4902: p.359-362.

41. Choo Q. L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby R., and Barr P.J. Genetic organization and diversity of the hepatitis С virus.//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1991, 88, n.6: p.2451-2455.133

42. Colombo M. The role of hepatitis С virus in hepatocellular carcinoma.// Recent.Results.Cancer Res., 1998,154:337-44, p.337-344.

43. Damen M., Cuypers H.T., Zaaijer H.L., Reesink H. W., Schaasberg W.P., Gerlich W.H., Niesters H.G., and Lelie P.N. International collaborative study on the second EUROHEP HCV-RNA reference panel.// J.Virol.Methods, 1996, 58, n.l-2: p.175-185.

44. De F. R. Molecular virology of the hepatitis С virus.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:47-53, p.47-53.

45. De F. R. and Steinkuhler C. Structure and function of the hepatitis С virus NS3-NS4A serine proteinase.// Curr.Top.Microbiol.Immunol.2000.;242.: 149.-69., 242:149-69, p.149-169.

46. Di G. A., D'Antonio D., Parrati G., Iacone A., Di G.R., Salemme L., and Pizzigallo E. Comparative analysis of two systems for HCV genotyping.// New Microbiol, 1998, 21, n.2: p.203-208.

47. Diago M., Zapater R., Tuset C., Carbonell P., Gonzalez C, Cors R., and Casas E. Intrafamily transmission of hepatitis С virus: sexual and non-sexual contacts see comments.//J.Hepatol., 1996, 25, n.2: p. 125-128.

48. Ding J., Akira Т., Noriko Y., Mikihiro Т., and Takayasu D. Study of hepatitis С virus genotype in Guizhou area of southwestern China.// Chin.Med.J.(Engl), 1998, 111, n.2: p.128-131.

49. Esteban R. Epidemiology of hepatitis С virus infection.// J.Hepatol., 1993, 17 Suppl 3:S67-71, p.S67-S71.

50. Eugene R. and Medina M.and Rizwana S. New perspectives in the diagnosis of hepatitis C. 19(sl)(Seminars in Liver Disease), 3-15,1999.

51. Farci P., Alter H.J., Govindarajan S., Wong D.C., Engle R., Lesniewski R.R., Mushahwar I.K., Desai S.M., Miller R.H., and Ogata N. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С virus.// Science, 1992, 258, n.5079: p.135-140.

52. Farci P., Orgiana G., and Purcell R.H. Immunity elicited by hepatitis С virus.// Clin.Exp.Rheumatol., 1995, 13 Suppl 13.S9-12, p.S9-12.

53. Farci P. and Purcell R.H. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes and quasispecies In Process Citation.// Semin.Liver Dis.2000.;20.(l.):103.-26., 20, n.l: p.103-126.

54. Feinstone S. M., Kapikian A.Z., and Purceli R.H. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness.// Science, 1973,182, n.116: p.1026-1028.135

55. Fournillier J. A., Cahour A., Escriou N., Girad M., and Wychowski C. Processing of the El glycoprotein of hepatitis С virus expressed in mammalian cells.// J.Gen.Virol., 1996, 77, n.Pt 5: p.1055-1064.

56. Fried M. W„ Shindo ML, Fong T.L., Fox P.C., Hoofnagle J.H., and Di B.A. Absence of hepatitis С viral RNA from saliva and semen of patients with chronic hepatitis С see comments.// Gastroenterology, 1992, 102, n.4 Pt 1: p.1306-1308.

57. Galan F., Perez-Gracia M.T., Lozano A., Benavides В., Fernandez-Ruiz E., and Rodriguez-Iglesias M.A. A 3-year follow-up of HCV-RNA viraemia in haemodialysis patients.//Nephrol.Dial.Transplant, 1998, 13, n.5: p.1211-1214.

58. Garson J. A., Ring C., Tuke P., and Tedder R.S. Enhanced detection by PCR of hepatitis С virus RNA letter.// Lancet, 1990, 336, n.8719: p.878-879

59. Gerken G., Knolle P., Jakobs S., and Meyer zum Buschenfelde KH. Quantification and genotyping of serum HCV-RNA in patients with chronic hepatitis С undergoing interferon treatment.// Arch.Virol., 1997, 142, n.3: p.459-464.

60. Gournay J., Marcellin P., Martinot-Peignoux M., Degott C., Gabriel F., Courtois F., Branger M., Wild A.M., Erlinger S., and Benhamou J.P. Hepatitis С vims genotypes in French blood donors.// J.Med. Virol., 1995, 45, n.4: p.399-404.

61. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., and Rice C.M. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products.// J.Virol., 1993, 67, n.3: p.1385-1395.136

62. Gretch D. R. Diagnostic tests for hepatitis CM Hepatology, 1997, 26, n.3, Suppll: p.43S-47S.

63. Haydon G. H., Jarvis L.M., Blair C.S., Simmonds P., Harrison D.J., Simpson K.J., and Hayes P.C. Clinical significance of intrahepatic hepatitis С virus levels in patients with chronic HCV infection see comments.// Gut, 1998, 42, n.4: p.570-575.

64. Healey C. J., Smith D.B., Walker J.L., Holmes E.C., Fleming K.A., Chapman R.W., and Simmonds P. Acute hepatitis С infection after sexual exposure.// Gut, 1995, 36, n.l: p.148-150.

65. Heinz F. X. Comparative molecular biology of flaviviruses and hepatitis С virus.//Arch.Virol.Suppl., 1992, 4:163-71, p.163-171.

66. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., and Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virus genome by in vitro processing analysis.// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1991, 88, n.13: p.5547-5551.

67. Hohne M., Schreier E., and Roggendorf M. Sequence variability in the env-coding region of hepatitis С virus isolated from patients infected during a single source outbreak.// Arch.Virol., 1994,137, n.1-2: p.25-34.

68. Ни K. Q., Yu C.H., and Vierling J.M. Direct detection of circulating hepatitis С virus RNA using probes from the 5' untranslated region.// J.Clin.Invest., 1992, 89, n.6: p.2040-2045.

69. Jarvis L. M., Watson H.G., McOmish F., Peutherer J.F., Ludlam C.A., and Simmonds P. Frequent reinfection and reactivation of hepatitis С vims genotypes in multitransfused hemophiliacs.// J.Infect.Dis., 1994, 170, n.4: p.1018-1022.

70. Jiang W., Gu S., and Hu Y. Genotyping of HCV isolates from different populations in Shanghai by using second generation line probe assay.// Chung.Hua.Kan.Tsang.Ping.Tsa.Chih., 1999, 7, n.l: p.29-30.

71. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K., Yamaguchi K., Kobayashi Y., Konishi M., Yokoi M., Ishida S., Suzuki S., and Kohara M. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study.// J.Gen.Virol., 1994, 75, n.Pt 7: p.1755-1760.

72. Kaneko S., Murakami S., Unoura M., and Kobayashi K. Quantitation of hepatitis С virus RNA by competitive polymerase chain reaction.// J.Med.Virol, 1992, 37, n.4: p.278-282.

73. Kao J. H., Lin H.H., Chen P.J., Lai M.Y., Wang Т.Н., Mizokami M., and Chen D.S. Serotyping of hepatitis С virus in chronic type С hepatitis in Taiwan: correlation with genotypes.// J.Gastroenterol., 1996, 31, n.2: p.224-227.

74. Karachristos A., Linardopoulos S., Ergazaki M., and Spandidos D.A. Detection and analysis of hepatitis С virus by a combined RT-PCR method: variation in the 5' non-coding region of the viral genome.// J.Med.Microbiol., 1995, 42, n.5: p.367-371.

75. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S., Nakazawa Т., Mori S., Hijikata M., and Shimotohno K. Distribution of plural HCV types in Japan.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991, 181, n.l: p.279-285.

76. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S., Nakazawa Т., Sekiya H., Hijikata M., and Shimotohno K. Characterization of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis С virus.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 189, n.l: p.119-127.

77. Khan R. U., Tong C.Y., Bloom S„ Gilmore I.T., Toh C.H., Bolton-Maggs P.H., Beeching N.J., and Hart C.A. Evaluation of two simplified methods for genotyping hepatitis С virus.// J.Med.Virol., 1997, 52, n.l: p.35-41.

78. Kolykhalov A. A., Feinstone S.M., and Rice C.M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis С vims genome RNA.// J.Virol., 1996, 70, n.6: p.3363-3371.

79. Lee С. M., Govindarajan S., and Lai M.M. Molecular cloning and sequence analysis of an isolate of hepatitis С virus from Southern California, U.S.A.// J.Formos.Med.Assoc., 1992, 91, n.2: p.174-179.

80. Lin C., Lindenbach B.D., Pragai B.M., McCourt D.W., and Rice C.M. Processing in the hepatitis С virus E2-NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different С termini.// J.Virol., 1994a, 68, n.8: p.5063-5073.140

81. Lin С., Pragai B.M., Grakoui A., Xu J., and Rice C.M. Hepatitis С virus NS3 serine proteinase: trans-cleavage requirements and processing kinetics.// J.Virol., 1994b, 68, n.12: p.8147-8157.

82. Mahaney K., Tedeschi V., Maertens G., Di B.A., Vergalla J., Hoofnagle J.H., and Sallie R. Genotypic analysis of hepatitis С virus in American patients see comments.//Hepatology, 1994, 20, n.6: p. 1405-1411.

83. Marino N., Di P.M., Moschitta P., Balocchini E., Chionne P., Spada E., Rapicetta M., Stroffolini Т., and Mazzotta F. Intrafamily spread of hepatitis С virus infection.//New Microbiol., 1994, 17, n.2: p. 147-150.

84. Matsuura Y., Harada Т., Makimura M., Sato M., Aizaki H., Suzuki Т., and Miyamura T. Characterization of HCV structural proteins expressed in various animal cells.// Intervirology, 1994, 37, n.2: p. 114-118.

85. Miyakawa Y., Okamoto H., and Mayumi M. Classifying hepatitis С vims genotypes.//Mol.Med.Today, 1995, 1, n.l: p.20-25.

86. Mizokami ML, Gojobori Т., Ohba K., Ikeo K., Ge X.M., Ohno Т., Orito E., and Lau J.Y. Hepatitis С vims types 7, 8 and 9 should be classified as type 6 subtypes.//J.Hepatol., 1996, 24, n.5: p.622-624.

87. Mizushima H., Hijikata M., Tanji Y., Kimura K., and Shimotohno K. Analysis of N-terminal processing of hepatitis С vims nonstructural protein 2.// J.Virol., 1994, 68, n.4: p.2731-2734.

88. Mondelli M. U. and Silini E. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:65-70, p.65 -70.

89. Mori S., Kato N., Yagyu A., Tanaka Т., Ikeda Y., Petchclai В., Chiewsilp P., Kurimura Т., and Shimotohno K. A new type of hepatitis С virus in patients in Thailand.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 183, n.l: p.334-342.

90. Morikawa Т., Nakata K., Hamasaki K., Tsuruta S., Kato Y., Nakao K, Ohtsubo Т., and Eguchi K. Prevalence and characterization of hepatitis С virus in hemodialysis patients see comments.// Intern.Med., 1999, 38, n.8: p.626-631.

91. Muller H. M., Pfaff E., Goeser Т., Kallinowski В., Solbach C., and Theilmann L. Peripheral blood leukocytes serve as a possible extrahepatic site for hepatitis С virus replication.// J.Gen. Virol., 1993, 74, n.Pt 4: p.669-676.142

92. Murphy D. G., Willems В., Vincelette J., Bernier L., Cote J., and Delage G. Biological and clinicopathological features associated with hepatitis С virus type 5 infections.//J.Hepatol., 1996, 24, n.l: p.109-113.

93. Nakao Т., Enomoto N., Takada N., Takada A., and Date T. Typing of hepatitis С virus genomes by restriction fragment length polymorphism.// J.Gen.Virol., 1991, 72, n.Pt 9: p.2105-2112.

94. Naoumov N. V. Hepatitis С virus infection in Eastern Europe.// J.Hepatol., 1999,31 Suppl 1:84-7, p.84-87.

95. Nishizono A., Terao H., Shutoh R., Nasu M., Mifune K., Wun B.J., Montas В., and Fernandez F.S. Genotyping of hepatitis С virus in the Dominican Republic.// Am.J.Trop.Med.Hyg., 1997, 57, n.6: p.719-722.

96. Norder H., Bergstrom A., Uhnoo I., Alden J., Weiss L., Czajkowski J., and Magnius L. Confirmation of nosocomial transmission of hepatitis С virus by phylogenetic analysis of the NS5-B region.// J.Clin.Microbiol., 1998, 36, n.10: p.3066-3069.

97. Nousbaum J. B. Genomic subtypes of hepatitis С virus: epidemiology, diagnosis and clinical consequences.// Bull.Soc.Pathol.Exot., 1998, 91, n.l: p.29-33.

98. Nousbaum J. В., Pol S., Nalpas В., Landais P., Berthelot P., and Brechot C. Hepatitis С virus type lb (II) infection in France and Italy. Collaborative Study Group see comments.//Ann.Intern.Med., 1995,122, n.3: p.161-168.

99. Okamoto H. and Mishiro S. Genetic heterogeneity of hepatitis С vims.// Intervirology, 1994, 37, n.2: p.68-76.

100. Park Y. S., Lee K.O., Oh M.J., and Chai Y.G. Distribution of genotypes in the 5' untranslated region of hepatitis С vims in Korea.// J.Med.Microbiol., 1998, 47, n.7: p.643-647.

101. Pawlotsky J. M., Germanidis G., Neumann A.U., Pellerin M., Frainais P.O., and Dhumeaux D. Interferon resistance of hepatitis С virus genotype lb: relationship to nonstmctural 5A gene quasispecies mutations.// J.Virol., 1998, 72, n.4: p.2795-2805.

102. Pereira B. J. Hepatitis С virus infection in dialysis: a continuing problem.// Artif.Organs, 1999, 23, n.l: p.51-60.

103. Perrin S. and Gilliland G. Site-specific mutagenesis using asymmetric polymerase chain reaction and a single mutant primer.// Nucleic.Acids.Res., 1990, 18, n.24: p.7433-7438.

104. Poch О., Sauvaget L, Delarue M., and Tordo N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements.// EMBO J., 1989, 8, п. 12: p.3867-3874.

105. Power J. P., Lawlor E., Davidson F., Holmes E.C., Yap P.L., and Simmonds P. Molecular epidemiology of an outbreak of infection with hepatitis С virus in recipients of anti-D immunoglobulin see comments.// Lancet, 1995, 345, n.8959: p.1211-1213.

106. Ross R. S., Viazov S., Renzing-Kohler K., and Roggendorf M. Changes in the epidemiology of hepatitis С infection in Germany: shift in the predominance of hepatitis С subtypes.// J.Med.Virol.2000.Feb.;60.(2.):122.-5., 60, n.2: p.122-125.

107. Samokhvalov EI, Hijikata M, Gylka RI, Lvov DK, Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis С virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype 27/ Virus Genes, 2000, 20, n.2: p.183-187.

108. Santolini E., Migliaccio G., and La M.N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С vims core protein.// J.Virol., 1994, 68, n.6: p.3631-3641.146

109. Selby M. J., Glazer E., Masiarz F., and Houghton M. Complex processing and protein:protein interactions in the E2:NS2 region of HCV.// Virology, 1994, 204, n.l: p.114-122.

110. Seme K., Poljak ML, Zuzec-Resek S., Debeljak M., Dove P., and Koren S. Molecular evidence for nosocomial spread of two different hepatitis С virus strains in one hemodialysis unit.// Nephron, 1997, 77, n.3: p.273-278.

111. Shah H. A., Jafri W., Malik I., Prescott L., and Simmonds P. Hepatitis С virus (HCV) genotypes and chronic liver disease in Pakistan.// J.Gastroenterol.Hepatol., 1997,12, n.ll: p.758-761.

112. Sheng L., Willems M., Peerlinck K., Vermylen J., and Yap S.H. Hepatitis С virus genotypes in Belgian hemophiliacs.//J.Med.Virol., 1995, 45, n.2: p.211-214.

113. Shih С. M., Lo S.J., Miyamura Т., Chen S.Y., and Lee Y.H. Suppression of hepatitis В virus expression and replication by hepatitis С virus core protein in HuH-7 cells.// J.Virol., 1993, 67, n.10: p.5823-5832.

114. Shustov A., Mishin V., Kisselev N., Ossipove L. et al. The prevalence, subtype distribution and molecular variability of hepatitis С virus (HCV) in the territory of Western Siberia. Xlth Intern. Congress of Virology, 1999, Sydney, Australia, p.279.

115. Silini E., Bono F., Cividini A., Cerino A., Maccabruni A., Tinelli C., Bruno S., Bellobuono A., and Mondelli M. Molecular epidemiology of hepatitis С virus infection among intravenous drug users.// J.Hepatol., 1995b, 22, n.6: p.691-695.

116. Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis С virus.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:54-60, p.54-60.

117. Smith D. B. and Simmonds P. Review: molecular epidemiology of hepatitis С virus.//J.Gastroenterol.Hepatol., 1997,12,n.7: p. 522-527.

118. Stuyver L., Rossau R., Wyseur A., Duhamel M., Vanderborght В., Van H.H., and Maertens G. Typing of hepatitis С virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay.// J.Gen.Virol., 1993, 74, n.Pt 6: p.1093-1102.

119. Takada N., Takase S., Takada A., and Date T. HCV genotypes in different countries letter.// Lancet, 1992, 339, n.8796: p.808.

120. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K, and Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis С virus genome.// J.Virol., 1996, 70, n.5: p.3307-3312.148

121. Tanji Y., Hijikata M., Hirowatari Y., and Shimotohno K. Hepatitis С virus polyprotein processing: kinetics and mutagenic analysis of serine proteinase-dependent cleavage.// J.Virol., 1994a, 68, n.12: p.8418-8422.

122. Tanji Y., Hijikata M., Hirowatari Y., and Shimotohno K. Identification of the domain required for trans-cleavage activity of hepatitis С viral serine proteinase.// Gene, 1994b, 145, n.2: p.215-219.

123. Tanji Y., Kaneko Т., Satoh S., and Shimotohno K. Phosphorylation of hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS5A.// J.Virol., 1995, 69, n.7: p.3980-3986.

124. Terada S., Kawanishi K., and Katayama K. Minimal hepatitis С infectivity in semen letter.// Ann.Intern.Med., 1992, 117, n.2: p. 171-172.

125. Tomei L., Failla C., Santolini E., De F.R., and La M.N. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С vims polyprotein.// J.Virol., 1993, 67, n.7: p.4017-4026.

126. Trepo C. and Pradat P. Hepatitis С vims infection in Western Europe.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:80-3, p.80-83.

127. Viazov S., Widell A., and Nordenfelt E. Mixed infection with two types of hepatitis С vims is probably a rare event.// Infection 2000.Jan.-Feb.;28.(l.):21.-5., 28, n.l: p.21-25.150

128. Watson J. P., Brind A.M., Chapman C.E., Bates C.L., Gould F.K., Johnson S.J., Burt A.D., Ferguson J., Simmonds P., and Bassendine M.F. Hepatitis С virus: epidemiology and genotypes in the north east of England.// Gut, 1996, 38, n.2: p.269-276.

129. Weiner A. J., Christopherson C., Hall J.E., Bonino F., Saracco G., Bmnetto M.R., Crawford K., Marion C.D., Crawford K.A., and Venkatakrishna S. Sequence variation in hepatitis С viral isolates.// J.Hepatol., 1991, 13 Suppl 4:S614, p.S6-14.

130. Widell A., Zhang Y.Y., Andersson-Gare В., and Hammarstrom L. At least three hepatitis С virus strains implicated in Swedish and Danish patients with intravenous immunoglobulin-associated hepatitis CM Transfusion, 1997, 37, n.3: p.313-320.

131. Zein N. N. Clinical significance of hepatitis С vims genotypes.// Clin.Microbiol.Rev.2000.Apr.;13.(2.):223.-35., 13, n.2: p.223-235.

132. Zeuzem S., Scheuermann E.H., Waschk D., Lee J.H., Blaser C., Franke A., and Roth W.K. Phylogenetic analysis of hepatitis С virus isolates from hemodialysis patients.// Kidney Int., 1996a, 49, n.3: p.896-902.

133. Zeuzem S., Teuber G., Lee J.H., Ruster В., and Roth W.K. Risk factors for the transmission of hepatitis CM J.Hepatol., 1996b, 24, n.2 Suppl: p.3-10.