Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Садыкова, Галина Кадымовна

• Садыкова, Галина Кадымовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Садыкова, Галина Кадымовна

ВВЕДЕНИЕ.5.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10.

1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила.10.

1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождением эволюция.18.

1.3. Генетическая организация и репликативный цикл ф лавивирусов.25.

1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН.34.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Компьютерный анализ последовательностей ДНК.40.

2.2. Выделение РНК.40.

2.3. Реакция обратной транскрипции.41.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.41.

2.5. Клонирование кДНК-фрагментов генома.41.

2.6. Приготовление компетентных клеток.42.

2.7. Трансформация плазмидной ДНК.42.

2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле.43.

2.9. Выделение фрагментов ДНК из агарозы.43.

2.10. Секвенирование ДНК.44.

2.11. Сайт-специфический мутагенез ДНК.44.

2.12. Транскрипция вирусной РНК in vitro.45.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Определение и анализ первичной структуры геномов 19-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005гг.46.

3.2. Клонирование полноразмерной кДНК-копии российского изолята вируса Западного Нила, относящегося к IV субтипу.67.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.69.

ВЫВОДЫ.74.

БЛАГОДАРНОСТИ.74.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России»

Актуальность проблемы.

Род Flavivirus семейства Flaviviridae состоит более, чем из 70 вирусов, большинство из которых является арбовирусами, т.е. вирусами, передающимися путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, включающий в себя млекопитающих, насекомых, птиц и рептилий. Многие из них могут вызывать тяжелые заболевания человека - желтую лихорадку, лихорадку Денге, клещевой энцефалит, японский энцефалит и др. Прототипным вирусом семейства считается вирус жёлтой лихорадки, который и дал название семейству и роду флавивирусов. (Термин "flavi" происходит от латинского слова "flavus" - жёлтый и связан с жёлтым цветом кожи у больных жёлтой лихорадкой.) В большинстве случаев передача инфекции осуществляется через укус переносчика - комара или клеща, что позволяет разделить флавивирусные инфекции на переносимые клещами и комарами, а также заболевания, для которых переносчик не установлен. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами Денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита и Западного Нила. Ежегодно Всемирная Организация Здравоохранения регистрирует более 50 миллионов случаев заболевания лихорадкой Денге, около 200 ООО случаев заболевания желтой лихорадкой и около 50 000 случаев заболевания японским энцефалитом. Смертность от заболеваний, вызванных этими наиболее патогенными представителями семейства флавивирусов, варьирует в пределах 5%-30% .

Дополнительным фактором значимости проблем, связанных с флавивирусными инфекциями, становится существенное расширение их ареала. Здесь ярким примером может служить вирус японского энцефалита, который во второй половине XX века широко распространился в Азии, Океании, а в конце 1990-х достиг австралийского континента. Другой хорошо известный пример связан с проникновением в 1999 году и последующим стремительным распространением вируса Западного Нила на американском континенте. Возможность переноса флавивирусов перелетными птицами, их способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, быстрая адаптация к природным условиям обеспечивает формирование новых природных очагов флавивирусных инфекционных заболеваний, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население. Отсутствие на сегодняшний день вирусоспецифических препаратов, эффективных методов лечения, а, нередко, и профилактики заболеваний, вызванных флавивирусными инфекциями, объясняет интерес работников науки и практического здравоохранения к данной проблеме.

Для России наиболее актуальными являются вирус клещевого энцефалита (несмотря на существование эффективной вакцины) и вирус Западного Нила. В нашей стране наиболее активные очаги лихорадки Западного Нила расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь, в дельте Волги, в силу географических и экологических особенностей сформированы чрезвычайно благоприятные условия для поддержания активной циркуляции ВЗН, и почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки.

Особую значимость вирус Западного Нила приобрел после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в

Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (-9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном 10%) уровне летальности. Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вируса Западного Нила, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры геномов различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства, являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Настоящая работа была выполнена в рамках комплексного изучения биологии вируса Западного Нила, циркулирующего на территории юга Русской равнины, которое проводится в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с 1999 года. В рамках этого исследования были, в частности, выполнены работы по генетической характеристике российских штаммов ВЗН, вызвавших эпидемии 19992000 гг., созданию новых чувствительных тест-систем для детекции возбудителя, а также работы по мониторингу циркуляции вируса, включающему в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической цепи.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлась характеристика и изучение генетических свойств популяции ВЗН, циркулирующей на эндемичной территории юга Астраханской области России. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Установить первичную структуру геномов 18-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. на территории Астраханской области.

2. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на данной территории в период с 2001 по 2005 гг.

3. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств ВЗН методами обратной генетики на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена нуклеотидная последовательность геномов (с 24 н.п. по 10834 н.п. включительно) 18-ти штаммов вируса ЗН, изолированных в 2001-2005 годах в Астраханской области из птиц, комаров и клещей.

2. Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

3. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV

Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Впервые определена первичная структура генома для 9 штаммов ВЗН, кодирующая все структурные и неструктурные белки, а также нетранслируемые области генома (частично). Для 9 штаммов ВЗН впервые определена первичная структура, кодирующая неструктурные белки вируса, а также 3' -нетранслируемую область (частично).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов выявил их высокую идентичность с астраханскими штаммами Ast99-986 и Ast99-901, вызвавшими эпидемические вспышки в 1999-2000 гг.

Проведен поиск функциональных детерминант вируса, отвечающих за его вирулентные свойства. В частности, показано, что у 6 из 18 штаммов в положении 154-156 а.к. оболочечного белка Е имеется потенциальный сайт гликозилирования NYS, который является одним из ключевых факторов нейроинвазивности вируса в мышах, а три штамма имеют смешанную NYS/NYP позицию. Кроме того, у всех исследуемых штаммов имеется аминокислота пролин в 249-й позиции геликазного домена неструктурного белка NS3, которая, как было показано в опытах in vivo, также отвечает за патогенные свойства вируса Западного Нила.

Данные о первичной структуре вирусов являются важными, как для многих фундаментальных исследований, связанных с происхождением, распространением и эволюцией вирусов, так и практических научных вопросов, связанных с эпидемиологией вирусных инфекций. Разработка мер по предотвращению эпидемиологических заболеваний включает в себя ряд вопросов, связанных с установлением источника и путей распространения вирусной инфекции, а также мониторингом появления новых, более опасных вариантов вируса.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Садыкова, Галина Кадымовна

ВЫВОДЫ.

1. В результате анализа первичной структуры генома 18 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. в Астраханской области РФ, установлена высокая идентичность их как между собой, так и со штаммами ВЗН Ast99-901 и Ast99-986, вызвавшими эпидемические вспышки в этом регионе в 1999-2000 гг.

2. В 6 из 18 штаммов, исследованных в данной работе, содержится потенциальный сайт N-гликозилирования в белке Е, отвечающий за нейроинвазивные свойства вируса. У 9 из 18 штаммов сайт потенциального гликозилирования отсутствует, а в 3 штаммах содержится частично, так как соответствующая позиция в геноме гетерогенна.

3. Все 18 штаммов, исследованных в данной работе, в геликазном домене неструктурного белка NS3 в положении 249 содержат аминокислоту пролин, которая отвечает за высокопатогенные свойства ВЗН in vivo.

4. Плазмида, полученная в данной работе и несущая полноразмерную кДНК копию генома вируса Западного Нила, может быть использована в экспериментальной системе обратной генетики для ВЗН.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит искреннюю благодарность всем своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: Е.И. Самохвалову за помощь в получении РНК и кДНК, C.B. Альховскому за данные советы и полезные дискуссии при обсуждении работы, а также всему коллективу лаборатории экологии вирусов за предоставленный материал для исследований. Автор благодарен своему научному руководителю, А.Г. Прилипову за помощь и ценные советы в работе, а также приносит отдельную благодарность директору Института вирусологии РАМН, академику РАМН Д.К.Львову за возможность проведения данных исследований и руководство в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Садыкова, Галина Кадымовна, 2010 год

1. Andreadis T.Y., Anderson J.F., Vossbrinck R. Mosquitoes surveillance for West Nile virus in Connecticut, 2000: isolation from Culex pipiens, Cx. Salinarius, and Culiseta melanura // Emerg. Infect. Dis. 2001. -N7. - pp.670-4.

2. Bakonyi Т., Hubalek Z., Rudolf I., Nowotny N. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, Central Europe // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - N2. - pp. 225-31.

3. Beasley D., Barrett A. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein // J Virol.- 2002,- Vol. 76. N24. - pp. 13097100.

4. Beasley D.W.C., Li Li, Suderman M.T., and Barrett A. Mouse neuroinvasive phenotype of West Nile virus strains varies depending upon virus genotype // Virology — 2002. Vol. 296. - pp. 17-23.

5. Bell J.A., Brewer C.M., Mickelson N. J. et. al. West Nile virus epizootology, Central Red river valley, North Dakota and Minnesota, 2002-2005 // Emerg. Infect. Dis. 2006. -Vol. 12.-N8.-pp. 1245-7.

6. Berthet F.X., Zeller H.G., Drouet M.T., Rauzier J„ Digoutte J.P., Deubel V., Extensive nucleotide change and deletions within the elnvelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses // J of Gen. Virology.- 1997.-Vol.78.- pp.2293-97.

7. Besselaar T. G. and Blackburn N. K. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies // Arch. Virol.-1988.-№99.-pp.75-88.

8. Bin H., Grossman Z., Pokamunski S., Malkinson M., Weiss L., Duvdevani P., Banet C., Weisman Y., Annis E., Gandaku D., Yahalom V., Hindyieh M., Shulman L., Mendelson E.

9. West Nile fever in Israel 1999-2000: from geese to humans // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001.-Dec. - №951. - pp. 127-42.

10. Blackwell, J. L., and M. A. Brinton. 1997. Translation elongation factor-1 alpha interacts with the 3 stem-loop region of West Nile virus genomic RNA // J. Virol. 71:64336444.

11. Bondre V.P., Jadi R.S., Mishra A.C., Yergolkar P.N. and Arankalle Y.A. West Nile virus isolates from India: evidence for a distinct genetic lineage // Journ. of Gen. Virol. 2007. -Vol. 88.-pp. 875-84.

12. Botha E.M., Markotter W., Wolfaardt M., Paweska J.T., Swanepoel R., Palacios G., Nel L.H. and Venter M. Genetic determinants of virulence in pathogenic lineage 2 West Nile virus strains. // Emerg. Infect. Dis. -2008. Vol. 14. - N2. - pp. 222-30.

13. Brault, A. C., Langevin, S. A., Bowen, R. A., Panella, N. A., Biggerstaff, B. J., Miller, B. R. & Nicholas, K. Differential virulence of West Nile strains for American crows. //Emerg Infect Dis.-2004.-Vol 10.- 2161-68.

14. Brinkworth R.I., Fairlie D.P., Leung D., Young P.R. Homology model of the dengue 2 virus NS3 protease : putative interactions with both substrate and NS2B cofactor // J. Gen.Virol. -1999.- Vol.80. P. 1167-77.

15. Brinton M.A. The molecular biology of West Nile virus: a new invader of the western hemisphere// Ann.Rev. Microbiol. 2002. - Vol.56. - P. 371- 402.

16. Brinton M.A. The molecular biology of West Nile virus: a new invader of the western hemisphere// Ann.Rev. Microbiol. 2002. - Vol.56. - P. 371- 402.

17. Campbell, M. S., and A. G. Pletnev. Infectious cDNA clones of Langat tick-borne flavivirus that differ from their parent in peripheral neurovirulence // Virology. 2000. - Vol. 269.-pp. 225-37.

18. Chambers T. J., Hahn C. S., Galler R. et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Ann. Rev. Microbiol. — 1990. — Vol. 44. — pp. 649—88.

19. Chambers J., Halevy M., Nestorowicz A., Rice Ch., Lustig S. West Nile virus envelope proteins: nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness //Journ. of Gen. Virology.-1998.-Vol.79.-pp.2375-2380.

20. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.- 1987. Vol.162.- N1.- pp. 156159.

21. Crabtree M.B., Kinney R.M., Miller B.R. Deglycosilation of the NS1 protein of dengue 2 virus, strain 16681: construction and characterization of mutant viruses // Arch. Virol. 2005. -Vol. 150.-pp. 771-86.

22. Dauphina C., Zientaraa S., Zellerb H., Murguec B. West Nile: worldwide current situation in animals and humans // Comparative Immunology, Microbiology and Infect. Dis. -2004. Vol. 27.- pp. 343-55.

23. Davis C.W., Nguyen H.Y., Hanna S.L. et al. West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGN-R for cellular attachment and infection // J Virol. 2006. - Vol.80 -pp. 1290-301.

24. Davisa C. T., Beasleya D.W., Guzmana H., Siirina M., Parsonsc R.E., Tesha R.B., Barrett A.D. Emergence of attenuated West Nile virus variants in Texas, 2003 // Virology — 2004. Vol. 330. - P. 342-50.

25. Eidson M., Komar N., Sorhage F., Nelson R., Talbot T., Mostoshari F. Crow deaths as a sentinel surveillance system for West Nile virus in the northeastern United States, 1999 // Emerg. Infect. Dis.-2001.-N7.- pp.615-620.

26. Eidson M., Kramer L., Stone W., Hagiwara Y., Schmit K. Dead bird surveillance as an early warning system for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.- 2001.-N7.- pp.631-635.

27. Estrada-Franco J.G., Navarro-Lopez R., Beasley D.W., Coffey L., Carrara A.S., Travassos da Rosa A., Clements T., Wang E., Ludwig G.V., Cortes A.C., Ramirez P.P.,

28. TeshR.B., Barrett A.D., Weaver S.C. West Nile virus in Mexico: evidence of widespread circulation since My 2002 // Emerg. Infect. Dis.-2003.-Vol.9.-№12.-pp. 1604-1607.

29. Grinev A., Daniel S., Stramer S., Rossmann S., Cagliotti S. and Rios M. Genetic variability of West Nile virus in US blood donors, 2002-2005 // Emerg. Infect. Dis. 2008. -Vol.14.-N3.-pp. 436-44.

30. Guo J.T., Hayashi J., Suger C. Wesr Nile virus inhibits the signal transduction pathways of alpha interferon // J Virol. 2005. - Vol. 79. - N3. - pp. 1345-50;

31. Halevy M, Akov Y, Ben-Nathan D, Kobiler D, Lachmi B, Lustig S. Loss of active neuroinvasiveness in attenuated strains of West Nile virus: pathogenicity in immunocompetent and SCID mice//Arch. Virol. 1994.-Vol.137. - pp. 355-70.

32. Hall R.A., Scherret J.H., Mackenzi J.S. Kunjin virus: an Australian variant of West Nile? // Ann. N Y Acad. Sci.-2001.-Dec.-№951.-pp. 153-60.

33. Hanna S.L., Pierson T.C., Sanchez M.D., Ahmed A.A., Murtadha M.M. and Doms R.W. N-linked glycosilation of West Nile virus envelope proteins influences particle assembly and infectivity // J Virol. 2005. - Vol. 79. - N21. - pp. 13262-74.

34. Hayes E.B., Komar N., Nasci R.S. et. al. Epidemiology and tansmission dynamics of West Nile virus disease // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol.11. -N8. - pp. 1167-73.

35. Ho J.-J., Huang L.F. , Weng C. J., et al. Denge virus type 2 antagonizes IFN-alpha but not IFN-gamma antiviral effect via down-regulating Tyk2-Stat signaling in the human dendritic cell // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - pp.8163-72.

36. Hurrelbrink, R. J., A. Nestorowicz, and P. C. McMinn. 1999. Characterization of infectious Murray Valley encephalitis virus derived from a stably cloned genome-length cDNA //J. Gen. Virol. 1999. - Vol.80, -pp. 3115-25.

37. Jia X.Y., Briese T., Jordan I., Rambaut A., Chi H.C., Mackenzie J.S., Hall R.A., Scherret J., Lipkin W.I. Genetic analisis of West Nile New York 1999 encephalitis virus // Lancet.-1999.-Vol. 354. pp.1971-2.

38. Kanai R., Kar K., Anthony K., Gould L.H., Ledizet M., Fikrig E., Marasco W.A., Koski R.A., Modis Y. Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes // J. Virol. 2006. - Vol. 80. - pp. 11000-8.

39. Kapoor, M., L. Zhang, P. M. Mohan, and R. Padrnanabhan. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). // Gene. -1995. Vol.162. - pp.175-80.

40. Khromykh A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: construction and applications// J. Virol.- 1997.- Vol. 71 (2). P. 1497-505.

41. Khromykh, A. A., and E. G. Westaway. Completion of Kunjin virus RNA sequence and recovery of an infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - pp. 4580-8.

42. Kinney R.M., Huang C., Whiteman M.C., Bowen R.A., Langevin S.A., Miller B.R., Brault A.C. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus // Journ. of Gen. Virol. 2006.- Vol. 87. - P. 3611-22.

43. Komar N., Langevin S., Hinten S., Nemeth N., Edwards E., Hettler D., Davis B., Bowen R., Bunning M. Experimental infection of North American birds with the Ney York 1999 strain of West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.- 2003. Vol.9. - N3.- pp. 311 -22.

44. Kyung Min Chung, M. Kathryn Liszewski, Grant Nybakken et al. West Nile virus nonstructural protein NS1 inhibits complement activation by binding the regulatory protein factor H // Proc Natl Acad Sei USA. 2006. Vol.103.- N50. - pp.19111-6.

45. Kuno G., Chang G.-J.J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N. and Cropp S.B. Phylogeny of the genus Flavivirus // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - pp.73-83.

46. Lai, C. J., B. T. Zhao, H. Hori, and M. Bray. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus //PNAS. 1991. - Vol. 88. pp. 5139-43.

47. W., McNamara T., Gubler DJ. Origin of West Nile virus responsible for an outbreak of encephalitis in the Northeastern United States // Science.- 1999.-VoI.286.- pp.2333-7.

48. Lee E., Hall R.A., Lobigs M. Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis and West Nile viruses // J. Virol.-2004.-Vol. 78.- N15.-pp. 8271-80.

49. Lee J.W., Chu J.J., Ng M.L. Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin // J.Biol. Chem. -2006.-Vol.281.-N3. -pp. 1352-60.

50. Leung D., Schroder K., White H. et. AI. Activity of recombinant dengue 2 virus NS3 protease in the presence of a truncated NS2B co-factor, small peptide substrates, and inhibitors // J. Biol.Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 45762-71.

51. Lin C.W., Liu K.T., Huang H.D., Chen W.J. Protective immunity of E. coli-synthesized NS1 protein of Japanese encephalitis virus // Biotechnol Lett. 2008. - Vol.30.-N2. - pp.205-14.

52. Lin R.-J., Chang B.-L., Yu H.-P. et al. Blocking of IFN-induced Jak-Stat signaling by Japanese encephalitis virus NS5 through a protein tyrosine phosphatase-mediated mechanism // J. Virol. 2006: - Vol. 80. - pp.5908-18.

53. Lin Y. L., Chen L.K., Liao C.L. et al. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice // J. Virol. 1998. - Vol. 72.-pp. 191-200.

54. Lindenbach B.D., Rice C.M., Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function // J.Virol.- 1999. Vol.73. - N6.-pp.4611-21.

55. Mandl, C. W., M. Ecker, H. Holzmann, C. Kunz, and F. X. Heinz. Infectious cDNA clones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr // J. Gen. Virol. 1997. - Vol.78. - pp. 1049-57.

56. Marin , M.S., Zanotto P.M., Gritsun T. and Gould E.A. Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: differenr evolutionary rates in the genus Flavivirus // Virology. 1995. - Vol. 206. -pp. 1133-9.

57. Molaei G., Andreatis T.G., Amstrong P.M. et. al. Host feeding patterns of Culex mosquitoes and West Nile virus transmission, Northeastern United States // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12. -N3. - pp. 468-74.

58. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses // J. of General Virology.- 1997,-Vol.78.- pp.2711-22:

59. Moudy R.M., Meola MA, Morin LL, Ebel GD, Kramer LD (2007) A newly emergent genotype of West Nile virus is transmitted earlier and more efficiently by Culex mosquitoes // Am. J. Trop. Med. Hyg. Vol. 77.- pp. 365-70.

60. Moudy R.M., Zhang B., Shi P.Y., Kramer LD. West Nile virus envelope protein glycosylation is required for efficient viral transmission by Culex vectors // Virology. 2009. -Vol. 387.-Nl.-pp. 222-8.

61. Piersona T. C., Diamond M.S., Ahmeda A.A., Valentine L.E. , Davis C.W., Samuel M.A., Hanna S.L., Puffer B.A., Doms R.W. An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene // Virol. 2005. - Vol. 334. - P. 28-40.

62. Puig-Basagoiti F., Tilgner M., Bennet C.J. et al. A mouse cell-adapted NS4B mutation attenuates West Nile virus RNA synthesis // Virology. 2007. - Vol. 361. - pp. 229-241.

63. Samuel C. E. Host genetic variability and West Nile virus susceptibility // PNAS. -2002- Vol. 99.-N18. -pp. 11556-7.

64. Rice, С. M., A. Grakoui, R. Galler, and Т. J. Chambers. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation // New Biol. -1989.-Vol.1.- pp:285-96.

65. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. Structure of the flavivirus genome // В кн.: The Togaviridae and Flaviviridae / Под ред. M.J. Shlesinger.-New York.:Plenum.- 1986. pp.279.

66. Scholle F., Mason P.W. West Nile virus replication interferes with both poly (I:C)-induced interferon gene transcription and response to interferon treatment // Virology. — 2005. -Vol. 342.-pp. 77-87.

67. Shi P., Tilgner M., Lo M.K., Kent K., and Bernard K. Infectious cDNA clone of the epidemic West Nile virus from New York city // Journal of Virol.- 2002.-Vol. 76.-N12. -P.5847-56.

68. Sumiyoshi, H., С. H. Hoke, and D. W. Trent. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates // J. Virol. 1992. - Vol.66. -pp. 5425-31.

69. Tilgner M., Shi P.Y. Structure and function of the З'-terminal six nucleotides ofthe West Nile virus genome in viral replication // J. Virol.- 2004.- Vol. 78. N15. - pp. 815971.

70. Wilson J. R., de Sessions P. F., Leon M. A., Scholle F. West Nile virus nonstructural protein 1 inhibits TLR3 signal transduction // J. Virol. 2008. -Vol. 82. - N 17. - pp. 8262-71.

71. Yamshchikov V., Mishin V., Cominelli F. A new strategy in design of RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. И Virology. 2001. - Vol. 281. -pp. 272-80.

72. Yamshchikov V. F., Compans R.W. Regulation of the late events in the flavivirus protein processing and maturation // Virology. 1993. - Vol. 193. - N1. - pp. 3 8-51.

73. Yamshchikov V. F., Wengler G., Perelygin A. A. et al. An infectious clone of the West Nile flavivirus // Virology. 2001. - Vol. 281. - pp. 294-304.

74. Yang J.S., Ramanathan M.P., Muthumani K. Et al. Induction of inflammation by West Nile virus capsid through the caspase-9 apoptotic pathway // Emerg. Infect. Dis. — 2002 — Vol. 8.-P. 1379-1384.

75. Zanotto P.M. A., Gould E.A., Gao G.F., Harvey P.H. and Holmes E.C. Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies // PNAS. 1996. - Vol.93. - pp. 548-53.

76. Zhang В., Dong H., Stein D.A., Iversen P.L. and Shi P.-Y. West Nile virus genome cyclization and RNA replication require two pairs of long-distance interactions // Virology. -2008.-Vol. 373.-pp. 1-13.

77. Zhou Y., Ray D., Zhao Y. et al. Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase //J. Virol. — 2007. — Vol. 81. — pp. 3891—3903;

78. Булычев В.П., Данияров А., Гордеева З.Е. Выделение вируса Западного Нила от комаров Culex pipiens в Таджикистане //в кн.: Арбовирусы.Инст.виросологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР. М.-1981.- с.95-96.

79. Бутенко A.M.,Чумаков М.П., Беляева А.П. Серологическая идентификация астраханского вируса из клещей //В кн.: Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции / Под ред.М.П.Чумакова.-М.-1964.-С.7-9.

80. Виноград И.А., Белетская Г.В., Чумаченко С.С., Ардаматская Т.Б., РогочшТЕ.Г. Изоляция вируса Западного Нила в южной Украине // Вопр. вирус.-1982.-№5.-С.55-57.

81. Ю2.Войнов И.Н., Рытик П.Г., Григорьев А.И. Арбовирусные инфекции в Белоруссии / Вирусы и вирусные инфекции человека.-М.-1981.-С.86-87.

82. Львов Д.К., БутенкоА.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В.Ф., Лещинская Е.В., Лазаренко В.В., Петров В.Р., Триханов С.Т., Хуторецкая Н.В., Шишкина Е.О., Яшков

83. A.Б. Эпидемия менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом Западного Нила //Вопр.вирусол.-2000.-№1.- С.37-38.

84. Львов Д.К., БутенкоА.М., Вышемирский О.И., Гайдамович С.Я., Громашевский

85. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции.-М.:Медицина.-1986.-336 с.

86. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б.

87. Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов.-М.:Медицина.-1974.- С.184.

88. Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А., Григорьева Н.В. Лихорадка Западного Нила. // Приложение к Вестнику Волгоградского медицинского университета. Волгоград, 2004.

89. Сиденко Б.Ф., Думина А.Л., Грекова B.C. Циркуляция вируса Западного Нила среди птиц Украинского Причерноморья // в кн.: Экология вирусов, вып I.-M.-1973.-с. 164-169.

90. Федорова М.В., мат. конф. "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" 2006.

91. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко A.M., Мартьянова Л.И. Вирус Западного Нила в СССР // Эпидемиология вирусных инфекций.-1968.-Т.12.-С.365-373.

92. Чумаков М.П., Бутенко А.М., Башкирцев В.Н. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области // Этиология, эпидемиология и клиника крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила.-Астрахань.-1969.-С.36-38.