Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium avium subspecies hominissuis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Старкова, Дарья Андреевна

• Старкова, Дарья Андреевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Старкова, Дарья Андреевна

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 26

1.1 Классификация и номенклатура нетуберкулезных микобактерий 26

1.2 Экология М. avium 27

1.3 Вирулентность М. avium 29

1.4 Микобактериоз 30

1.4.1. Эпидемиология и клинические проявления 30

1.4.2 Микробиологическая диагностика микобактериоза 33

1.4.3 Лекарственная чувствительность М. avium 34

1.5 Характеристика генома М. avium 35

1.5.1 Структура генома 35

1.5.2 Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм 37

1.5.3 Механизмы генетического обмена 39

1.6 Геноидентификация М. avium 41

1.7 Генотипирование М. avium 42

1.7.1 VNTR- и MATR-типирование 44

1.7.21S1245- и IS 1311- RFLP-типирование 45

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 49

ГЛАВА 2. ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА М. avium 49

2.1 Генодентификация клинических изолятов микобактерий 49

2.1.1 Видовая идентификация 49

2.1.2 Определение подвида М. avium путем детекции инсерционных элементов ISPÖ0 и 1S901 50

2.2 Оценка аллельного полиморфизма штаммов М. avium subsp. hominissuis

с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR 51

2.2.1 Генотипирование штаммов МАН с использованием восьми локусов VNTR 51

2.2.2 Оценка дискриминирующей способности 8 локусов VNTR 54

2.2.3 Генотипирование штаммов МАН с использованием

15 локусов MATR 54

2.2.4 Оценка дискриминирующей способности 15 локусов MATR 57 ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СХЕМЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МАН

С УЧЕТОМ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛОКУСОВ VNTR И MATR 60

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИМОРФИЗМА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ М. avium subsp. hominissuis НА ОСНОВЕ ИНСЕРЦИОННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ IS1245 65

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 69

ВЫВОДЫ 76

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 77

ПЕРЕСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 77

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 78

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 79

ПРИЛОЖЕНИЯ 91

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium avium subspecies hominissuis»

Актуальность темы исследования

Микобактериоз — инфекционное заболевание животных и человека, возбудителями которого являются более 20 видов кислотоустойчивых медленно-и быстрорастущих убиквитарных нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ) [1, 4]. Несмотря на спорадический характер заболевания, в последнее десятилетие отмечен рост пораженности населения микобактериозом легких, что связывают, в основном, с распространенностью иммуносупрессивных состояний. У 20% больных СПИД, несмотря на профилактическое лечение, в течение года развивается диссеминированная форма инфекции с неблагоприятным прогнозом [4,16,41,55, 92].

Среди НТМБ наиболее часто встречаются медленнорастущие бактерии Mycobacterium avium complex (MAC), включающего M. avium и М. intracellular е. Эти микроорганизмы - типичные обитатели окружающей среды, способные выживать в почве, воде, аэрозолях, системах водоснабжения и в биопленках [30, 94], являются оппортунистическими патогенами диких и домашних животных (свиней и др.), птиц и человека [88].

Наиболее актуальным возбудителем микобактериоза человека является М. avium [1, 4].

Согласно современным представлениям, вид М. avium включает несколько подвидов, ассоциированных с определенным кругом хозяев, экологическими и географическими характеристиками штаммов, которые имеют специфические геномные паттерны. Так, М. avium subsp. hominissuis (МАИ) вызывает заболевания у людей (в т.ч., у ВИЧ-инфицированных) и свиней; М. avium subspp. avium (МАА), silvaticum (MAS) и paratuberculosis (MAP) поражают в основном птиц, диких и домашних животных [71, 88].

Степень разработанности темы исследования

Трудоемкость методов идентификации и генотипирования микобактерий отчасти объясняет относительно небольшое число зарубежных и отсутствие отечественных публикаций, посвященных оценке биоразнообразия М. avium.

Лишь недавно для видовой идентификации М. avium стали использовать методы, основанные на гибридизации ДНК (например, тест-система GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience).

Для изучения геномного полиморфизма М. avium за рубежом до настоящего времени используют различные инсерционные последовательности (Insertion Sequence, IS) - мобильные элементы, в частности IS1245 [54, 90]. Метод IS1245-RFLP-типирования позволяет проводить тонкую дифференциацию штаммов путем оценки количества и взаимного расположения фрагментов рестрикции в паттернах IS1245 [40, 45, 90, 91]. Недостатками данного метода являются длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК, сложность интерпретации результатов при оценке мультибендовых паттернов рестрикции существенно ограничивают применение данного метода в эпидемиологических исследованиях. В последнее десятилетие генотипирование М. avium осуществляют с использованием метода VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - типирования для оценки аллельного полиморфизма восьми локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TRIO, TR32) [84]. Учитывая относительно невысокую вариабельность большинства из них для типирования штаммов М. avium subsp. hominissuis, японские исследователи предложили 15-локусную схему, которая включала локусы MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12,13,14,15,16 [40].

Неполнота сведений о генетической структуре российской популяции М. avium subsp. hominissuis, отсутствие простых и чувствительных молекулярно-генетических методов и схем геноидентификации и типирования возбудителя ограничивают исследования в области эпидемиологии микобактериоза в нашей стране.

Цель исследования: генотипическая характеристика штаммов М. avium, выделенных от человека, с использованием комплекса молекулярных маркеров.

Задачи исследования:

1. Провести геноидентификацию клинических изолятов микобактерий с использованием молекулярно-генетических методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA- hsp65) и ПЦР-детекции инсерционных элементов IS900 и 901.

2. Изучить геномный полиморфизм изолятов М. avium, выделенных от различных групп больных микобактериозом (включая ВИЧ-инфицированных), с использованием комплекса методов анализа полиморфизма локусов VNTR, MATR и 18/245-КРЬР-типирования.

3. Установить распространенность и оценить генетическое родство штаммов М. avium различных генотипов. •

4. Оценить дискриминирующую способность полиморфных локусов VNTR и MATR.

5. Разработать схему генотипирования российских штаммов М. avium.

Научная новизна исследования

Впервые на основе анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 и инсерционных элементов IS901 и IS900 с использованием методов, основанных на ПЦР, проведена идентификация и определена принадлежность к подвиду hominissuis 90 чистых культур М. avium, выделенных от больных микобактериозом легких (в т.ч., ВИЧ-позитивных) на территории Северо-Запада России.

Получены новые знания о структуре популяции М. avium subspecies hominissuis на Северо-Западе России на основе исследования геномного полиморфизма штаммов возбудителя, выделенных от больных микобактериозом,

с помощью комплекса молекулярно-генетических методов (VNTR-, MATR-типирования и 18/24.5^БЪР-типирования).

Разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов М. avium subsp. hominissuis, основанная на идентификации возбудителя по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая проводить мониторинг одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России.

Впервые изучена информативность (дискриминирующая способность) 23 локусов VNTR и MATR для типирования российских штаммов М. avium subspecies hominissuis.

Установлено, что аллели У в локусе MATR-16 и 2' в локусе TRIO (MATR-9), имеющие делеции, являются маркерами российских изолятов М. avium subspecies hominissuis.

Впервые последовательности ДНК клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis депонированы в GenBank: а) последовательности локуса TRIO, содержащие два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (accession no. JQ935977.1) и внутреннюю делецию размером 15 п.н. в первом из двух повторов (accession no. JQ918769.1); б) последовательность локуса MATR-16, содержащая делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (accession no. KF479191).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Установлено, что российская популяция М. avium subspecies hominissuis, представленная в данной работе изолятами больных микобактериозом людей, неоднородна по маркерам геномного полиморфизма VNTR, MATR и IS1245, что позволяет оценить этиопатогенетическую роль штаммов различных генотипов в развитии микобактериоза на территории Российской Федерации.

Показано, что распространенность VNTR- и MATR-типов М. avium subspecies hominissuis неодинакова у штаммов возбудителя различного

географического происхождения, что вносит существенный вклад в характеристику глобальной популяции микроорганизма данного вида.

С учетом информативности маркеров геномного полиморфизма разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов М. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS/245-RFLP, позволяющая установить генетическое родство между штаммами при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований микобактериоза и мониторинга популяции возбудителя.

В лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера создана и поддерживается коллекция ДНК 90 клинических штаммов М. avium subspecies hominissuis. Создана компьютерная база данных, содержащая профили VNTR-, MATR- и IS7245^РЪР-типирования 90 клинических штаммов М. avium subspecies hominissuis.

Материалы исследования изданы в виде Информационно-методического письма «Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis - возбудителя микобактериоза человека» (утверждено директором ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера А.Б. Жебруном и директором ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии П.К. Яблонским 18 апреля 2014 г.) и используются в научно-исследовательской работе лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Акт о внедрении от 21 мая 2014 г.).

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Предметом исследования явилась характеристика геномного полиморфизма М. avium - возбудителя микобактериоза человека. Анализ научной литературы, посвященной оценке молекулярных маркеров, используемых для дифференциации штаммов М. avium subsp. hominissuis, проведён на основе формально-логических методов исследования.

Работа выполнена в формате сравнительного открытого исследования с использованием микробиологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов.

Материал исследования

Изучены 120 чистых культур НТМБ, выделенных в период с 2008 г. по 2011 г. в в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ) от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Все 120 изолятов были идентифицированы как представители М. avium complex. Девяносто (из 120) штаммов, идентифицированные до вида М avium, получены от больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧ-инфицированных), 18 - выделены от пациентов с подозрением на туберкулез. Эпидемиологические связи между случаями заболевания не установлены.

Для контроля использовали ДНК эталонных и коллекционных штаммов, представленных СПбНИИФ: М. avium subsp. avium АТСС 35712, IWGMT49 и М avium subsp. paratuberculosis К10.

Культивирование микобактерий

Культивирование микобактерий осуществляли в лаборатории СПбНИИФ общепринятым методом на среде Левенштейна-Йенсена [Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"]; видимый рост культур медленнорастущих микобактерий наблюдали в течение 21 дня.

Идентификацию клинических изолятов микобактерий и дифференциацию бактерий Mycobacterium avium complex (MAC) от остальных видов НТМБ осуществляли с использованием биохимических тестов [1, 3, 4] (Таблица 1).

Таблица 1 - Культуральные и биохимические свойства MAC

Биологические свойства MAC

Скорость роста медленнорастущие

Пигментация колоний нефотохромогенные

Восстановление нитратов —

Деградация салицилового натрия —

Катал аза +

Восстановление теллурита калия +

Амидазная активность:

ацетамидаза —

уреаза —

никотинамидаза +

пиразинамидаза +

аллантаиназа —

Арилсульфатазная активность:

3-дневная —

14-дневная +

Гидролиз Твин 80 —

Выделение хромосомной ДНК из чистых культур М. avium Для выделения хромосомной ДНК из исследуемых культур М. avium и лабораторных штаммов АТСС35712 и IWGMT49, полную бактериологическую петлю материала вносили в микропробирки объемом 1,5 мл, содержащие 400 мкл буферного раствора 1хТЕ (10 мМ Tris, рН 8.0 и 1мМ EDTA). Бактериальная масса в пробирках обеззараживалась при 80 °С на водяной бане в течение 0,5 час. Далее проводили дезинтеграцию клеток. Для этого в каждую пробирку добавляли 50 мкл лизоцима (10 мг/мл); смесь инкубировали при 37 °С в течение 18-20 ч.

Пробирки встряхивали на вортексе - 30 с, добавляли 70 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл), инкубировали при 65 °С 30 мин, добавляли 100 мкл 5М NaCl и 100 мкл раствора CTABVNaCl (4,1 г NaCl, 80 мл дистиллированной воды, 10 г СТАВ), предварительно прогретого на водяной бане при 65 °С не менее 10 мин. Пробирки встряхивали на вортексе 30 с, инкубировали при 65 °С 40 мин. Продукты денатурации белков и полисахариды образовывали стойкий комплекс со СТАВ, а ДНК оставалась в растворе. В каждую пробирку добавляли смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1) в соотношении: 1 объем содержимого пробирки к 1 объему смеси. После центрифугирования при 13200 об/мин в течение 20 мин при 6 °С, содержимое пробирок расслаивалось. Прозрачную надосадочную жидкость, содержавшую ДНК, отбирали в новые пробирки и добавляли равный объем охлажденного до минус 18 °С изопропанола. Пробирки выдерживали при минус 18 °С 18-20 ч для осаждения ДНК в виде белых нитей.

Очистку ДНК проводили путем обработки 70% этанолом и центрифугированием при тех же условиях (см. выше). Осадок ДНК растворяли в 20 мкл 1хТЕ и хранили при 4 °С до года. Контроль выделения ДНК осуществляли путем электрофореза. Пробы ДНК (4 мкл) вносили в лунки 0,8% геля агарозы (0,8 г агарозы, 100 мл дистиллированной воды, 2,5 мкл 10% бромистого этидия). Электрофорез проводили в растворе lxTBE (89 мМ Tris, 89 мМ борной кислоты, 2,5 мМ EDTA) в течение 20 мин при постоянном напряжении 100 V. По окончании электрофореза гель помещали на трансиллюминатор. Присутствие ДНК в пробе оценивали визуально по наличию светящейся полосы в ультрафиолетовом излучении.

Полученную ДНК использовали для постановки ПЦР с целью детекции инсерционных элементов IS900 и IS901, MATR-VNTR-типировании, а также для IS1245-, ШЗЛ^РЬР-типирования.

VeKCsmemui триметил аммония бромид (Cetyltrimethylammonium bromide, СТАВ), Sigma, USA

Видовая геноидентификация микобактерий

Ускоренное определение видовой принадлежности изолятов микобактерий проводили с помощью молекулярно-генетических методов.

Метод FRA-hsp65 - анализ полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PCR-Restriction enzyme Analysis, VRA-hsp65) [12].

Амплификацию участка гена hsp65 . осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл. ИТ TP смесь включала: по 1 мкл прямого (ACCAACGATGGTGTGTCCAT) и обратного (CTTGTCGAACCGCATACCCT) праймеров (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), ЮхПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 - 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) - 0,2 мкл (1 ед.), стерильная дистиллированная вода - до 25 мкл. В смесь вносили по 1 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.

Условия проведения ПЦР для амплификации hsp65: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек - 58 °С, 30 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С. -

При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штаммов М. avium subsp. avium АТСС 35712 и М. avium paratuberculosis К10.

Участок гена hsp65, амплифицированный в ходе ПЦР, расщепляли с помощью эндонуклеаз ÄsfEII и НаеIII. В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 10 мкл смеси, содержавшей 3 мкл раствора рестриктазы ÄsiEII (GE Healthcare Life Sciences, США) и 7 мкл пробы ДНК. В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 15 мкл смеси, содержавшей 3 мкл раствора рестриктазы ÄstEII (GE Healthcare Life Sciences, США) и 12 мкл пробы ДНК. Пробирки инкубировали 3 часа при 37°С, охлаждали, погружая в ледяную крошку на 10 мин.

Фрагменты рестрикции разделяли методом электрофореза. Для разделения фрагментов рестрикции Äs/EII использовали 1,5% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва). Для разделения фрагментов рестрикции Нае III использовали 3% агарозный гель (агароза Metaphor (Cambrex Bio Science) и

обычная агароза в соотношении 2:1), окрашенный бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Размеры фрагментов рестрикции сравнивали с опубликованными [12].

Гибридизация с ДНК-зондами (MLPA - Multiplex Ligation dependent Probe Amplification - мультиплексная амплификация лигированных зондов) с использованием тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience (Германия) (Рисунок 1).

2C^mroi JE«etbutil

—---- i

» I.V.* ^ -----|

»•*?•»♦.»*>»•* f

...»..».«, M 1t

П

«»♦^ftWK»»-•«»»•к—».»:*«**,,

1?

SpiKAt**!»*

у vT

n^tm^itpMMfU

- ШмеШттЫяй'"

Mjt»»«l«rtum*J .

Я Fw fcrtf* (Mn шОМр Hrt«Wt«4umM 8г«МтЯатм «MtittMWTnM ИТК

Рисунок 1 - Профили продуктов гибридизации с ДНК-зондами тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/AS различных видов микобактерий

Определение подвида М. avium: детекция инсерционных элементов IS900 иIS901

Амплификацию инсерционных элементов IS901, IS900 осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Последовательности праймеров для ISP07 и ISPÖ0 приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Последовательности праймеров для амплификации инсерционных

элементов ISPÖ7 и IS900

Наименование праймера Последовательность праймера

IS900 F GGGTGTGGCGTTTTCCTTCG

IS900R TCCTGGGCGCTGAGTTCCTC

IS901 F GCAACGGTTGTTGCTTGAAA

IS901 R TGATACGGCCGGAATCGCGT

Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл. ПЦР смесь включала: по 1 мкл прямого и обратного праймеров (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), ЮхПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 -1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) -0,2 мкл (1 ед.), стерильная дистиллированная вода - до 25 мкл. В смесь вносили по 1 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.

Условия проведения ПНР для амплификации IS901: 5 мин — 95 °С, 35 циклов: 45 сек. - 95 °С, 45 сек - 63 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С.

Условия проведения ПЦР для амплификации IS900: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 45 сек. - 95 °С, 45 сек - 65 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С.

При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штаммов М. avium subsp. avium АТСС 35712 и М. avium paratuberculosis К10.

Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США).

Молекулярно-генетические методы типирования клинических изолятов M. avium

1. VNTR- и MATR-типирование

Аллельный полиморфизм штаммов M. avium изучали методом VNTR-типирования по 8 вариабельным локусам TR: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TRIO, TR32 и методом MATR-VNTR-типирования по 15 вариабельным локусам MATR-: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Фланкирующие праймеры для ПЦР, представленные в работах V. Thibault et al. (2007) и T. Inagaki et al. (2009), синтезированы в ООО «Синтол», г. Москва (Таблица 3, 4).

Таблица 3 - Праймеры для амплификации 8 локусов VNTR [84]

Праймер Последовательность праймера

32F ccacagggtttttggtgaag

32R ggaaatccaacagcaaggac

292F cttgagcagctcgtaaagcgt

292R gctgtatgaggaagtctattcatgg

X3F aacgagaggaagaactaagccg

X3R ttacggagcaggaaggccagcggg

25F gtcaagggatcggcgagg

25R tggacttgagcacggtcat

3F catatctggcatggctccag

3R atcgtgttgaccccaaagaaat

7F gacaacgaaacctacctcgtc

7R gtgagctggcggcctaac

10F gacgagcagctgtccgag

10R gagagcgtggccatcgag

47F cgttgcgatttctgcgtagc

47R ggtgatggtcgtggtcatcc

Таблица 4 - Праймеры для амплификации 15 локусов MATR [40]

Наименование Последовательность

праймера праймера

MATR-1 F gaacgttgggccgaatgcga

MATR-1 R gtgtcggacccctcccgtaa

MATR-2 F ttgagcagctcgtaaagcgt

MATR-2 R cgcgctcaaggagatggttc

MATR-3 F ccaatcacaacggcaccatc

MATR-3 R tcctcgacaatcagcacact

MATR-4 F gacaatggcatgccgatcct

MATR-4 R cgctacggccttctccatct

MATR-5 F cttgcagcaggacgatcagg

MATR-5 R gtggtcgaagtcgctgttgg

MATR-6 F tcgcaggaaaccaacctcaa

MATR-6 R gcgtgatcgactcgaagacc

MATR-7 F ccgaggaagagacgaaaccc

MATR-7 R tcgtcacccacaacatgcag

MATR-8 F caggtccagggcatgtttcc

MATR-8 R tcccgataatccgttgcatgac

MATR-9 F ctgttggagcgcagccgttt

MATR-9 R acccagtcgtcgacggtgtt

MATR-11 F tggctgctgttcaattggatg

MATR-11 R tcgtcggtcaattgcacctt

MATR-12 F tgatggcgaccaccgacaagg

MATR-12 R tggatgcggccgaccaaca

MATR-13 F cctcgaaggtggcggacttg

MATR-13 R accaggatggtgcccaaacc

MATR-14 F tggtcgccgcacacctact

MATR-14 R gcccttactgggcaggtccttc

MATR-15 F ggaaggcagcaagggtcaac

MATR-15 R tcaggtccagcgacagcttc

MATR-16 F gtggtcagcacccggagagt

MATR-16 R accaccgactgctcgacctt

ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси для TR 292, ХЗ, 25, 47, 3, 7 и MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15 составил 25 мкл. ПЦР смесь включала: праймеры, по 1 мкл прямого и обратного (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл

(конечная концентрация 200 мкМ/л), 5хПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 — 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л) TaqF-полимераза (ИнтерЛабСервис, Москва) - 0,2 мкл (1 ед), стерильная дистиллированная вода - до 25 мкл. В смесь вносили по 1 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.

Общий объем реакционной смеси для TRIO, TR32 и MATR-11, MATR-12, MATR-16 составил 30 мкл. ПЦР смесь включала: праймеры, по 1 мкл прямого и обратного (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 4 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), ЮхПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 - 2 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) - 0,2 мкл (1 ед.), диметил сульфоксид (DMSO) - 3 мкл, стерильная дистиллированная вода - до 30 мкл. В смесь вносили по 1 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR47, MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,11,12,13,14,15,16: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек -62 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С.

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR 10, TR 32 и MATR-9: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек - 57 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин-72 °С.

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR292, TRX3, TR25, TR3, TR7: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек - 58 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин-72 °С.

При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штаммов М avium subsp. avium АТСС 35712.

Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Число тандемных повторов в локусах рассчитывали согласно таблицам 5 и 6 молекулярных масс ампликонов.

Таблица 5 - Размеры ампликонов 8 локусов УЫТЯ

Число повторов в локусе Ожидаемые размеры ПЦР-продукта локуса УЫТИ, п.н.

292 ХЗ 25 47 3 7 10 32

0 141 94 176 112 154 159 193 154

1 194 147 234 147 181 181 248 172

2 247 200 292 182 208 203 303 190

3 300 253 350 217 235 225 358 208

4 353 306 408 252 262 247 413 226

5 406 359 466 287 289 269 468 244

6 459 412 524 322 316 291 523 262

7 512 465 582 357 343 313 578 280

8 565 518 640 392 370 335 633 298

9 618 571 698 427 397 357 688 316

10 671 624 756 462 424 379 743 334

11 724 677 814 497 451 401 798 352

12 777 730 872 532 478 423 853 370

Размер повтора 53 53 58 35 27 22 55 18

Таблица 6 - Размеры ампликонов 15 локусов МАТЫ

Число повторов в локусе Ожидаемые размеры ПЦР-продукта локуса МАТ11, п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16

0 228 194 195 168 133 213 220 106 325 284 371 235 215 194 241

1 281 247 248 221 191 270 277 163 380 339 428 291 273 251 300

2 334 300 301 274 249 327 334 220 435 394 485 347 331 308 359

3 387 353 354 327 307 384 391 277 490 449 542 403 389 365 418

4 440 406 407 380 365 441 448 334 545 504 599 459 447 422 477

5 493 459 460 433 423 498 505 391 600 559 656 515 505 477 536

6 546 512 513 486 481 555 562 448 655 614 713 571 563 532 595

7 599 565 566 539 539 612 619 505 710 669 770 627 621 587 654

8 652 618 619 592 597 669 676 562 765 724 827 683 679 642 713

9 705 671 672 645 655 726 733 619 820 779 884 739 737 697 772

10 758 724 725 698 713 783 790 676 875 834 941 795 795 752 831

11 811 777 778 751 771 840 847 733 930 889 998 851 853 807 890

12 864 830 831 804 829 897 904 790 985 944 1055 907 911 862 949

13 917 883 884 857 887 954 961 847 1040 999 1112 963 969 917 1008

14 970 936 937 910 945 1011 1018 904 1095 1054 1169 1019 1027 972 1067

15 102 3 989 990 963 1003 1068 1075 961 1150 1109 1226 1075 1085 1027 1126

Размер повтора 53 53 53 53 58 57 57 57 55 55 57 56 58 57 59

MATR- и VNTR-профиль каждого штамма записывали в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах в следующем порядке: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TRIO, TR32 и MATR-1, MATR-2, MATR-3, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-7, MATR-8, MATR-9, MATR-11, MATR-12, MATR-13, MATR-14, MATR-15, MATR-16.

Степень родства между штаммами М. avium оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали в виде дендрограммы, построенной с учетом полиморфизма локусов MATR-VNTR на сайте URL: http://www.miru-vntrplus.org.

2. IS7245-RFLP-THnHpoBanHe

Генотипирование изолятов М. avium с помощью метода IS7245-RFLP проводили с использованием стандартного протокола J. van Embden et al. (1993).

Исходным материалом для выделения хромосомной ДНК служили клинические изоляты М. avium и лабораторный штамм IWGMT49, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена. Процедура выделения хромосомной ДНК описана в п. 2.3. Энзиматическое расщепление (рестрикцию) ДНК проводили с помощью эндонуклеазы Pvull (Thermo Scientific, Life Science Research). В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 20 мкл смеси, содержавшей 12 мкл раствора рестриктазы PvuW (GE Healthcare Life Sciences, США), приготовленного в соответствии с инструкцией производителя, и 8 мкл пробы ДНК. Пробирки инкубировали 3 часа при 37°С, охлаждали, погружая в ледяную крошку на 10 мин. К содержимому пробирок (продукты рестрикции ДНК) добавляли 2 мкл бромфенолового синего, перемешивали пипетированием и вносили по 20 мкл в лунки приготовленного заранее 0,83% геля (1,98 г агарозы, 240 мл раствора lxTBE, 25 мкл 10% бромистого этидия) в следующем порядке: в первую, среднюю и последнюю лунки геля вносили контроль (продукт рестрикции ДНК штамма М. avium IWGMT49), в остальные - рестрицированную ДНК культур исследуемых клинических штаммов М. avium. Электрофорез проводили в растворе lxTBE, 32 ч при постоянном напряжении 42V для разделения

фрагментов рестрикции, различающихся по молекулярной массе. По окончании гель помещали на трансиллюминатор. Множество светящихся полос - фрагментов рестрикции во всех дорожках геля свидетельствовало о хорошем качестве рестрикции проб ДНК.

Далее осуществляли перенос фрагментов рестрикции ДНК на мембрану с последующей гибридизацией с зондом IS1245 (по Саузерну). Гель выдерживали в денатурирующем растворе (0,5М NaOH и 1,5М NaCl) при комнатной температуре 30 мин, затем помещали на мембрану Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences, США) размером 17,5x20 см, расположенную на подложке, и фиксировали в блоттере (Appligene, Франция). Перенос ДНК М. avium из геля на мембрану осуществляли в течение 1,5-2 ч при давлении 50-55 мм водяного столба, постоянно увлажняя гель раствором 2xSSC (0,ЗМ натрия хлорид и 0,03М натрия цитрат). По окончании переноса ДНК гель удаляли, мембрану однократно промывали тем же раствором и подсушивали при комнатной температуре на листе фильтровальной бумаги. ДНК фиксировали на мембране, облучая ультрафиолетом на трансиллюминаторе в течение 4 мин.

Зонд IS1245 (участок последовательности IS1245 размером 427 пн), меченный дигоксигенином (DIG), получали путем амплификации ДНК штамма М. avium IWGMT49 со специфическими праймерами Р1 (5-GCCGCCGAAACGATCTAC) и Р2 (5AGGTGGCGTCGAGGAAGAC) (Рисунок 2) [34].

57 1289

Transposase

TCGCOrGAGTCTClb 1 Probe

CAGAGCCACACGCGG

Рисунок 2 - Схематическое изображение 1313 п.н. инсерционного элемента \S1245. На схеме показаны: фланкирующие инвертированные повторы (Ш); праймеры Р1 и Р2, используемые для амплификации 427 п.н. зонда \S1245; начало и конец открытой рамки считывания, кодирующей транспозазу [34].

ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Конечный объем смеси составлял 50 мкл: 10х буфер для ПЦР - 10 мкл; MgC^ - 3 мкл (конечная конц. 1,5 мМ); lOxdNTP (DIG-labeling mix) - 5 мкл; Р37 - 2,5 мкл; Р38 - 2,5 мкл; Taq-полимераза (Силекс, Москва) - 0,3 мкл; ДНК - 0,5 мкл; стерильная дистиллированная вода до 50 мкл.

Суть реакции заключалась в увеличении количества копий IS1245 ДНК М. avium IWGMT49 при следующих условиях: 95 °С - 3 мин; 35 циклов: 94 °С - 1 мин, 65 °С -1 мин, 72 °С-1 мин; 72°С-10 мин.

Гибридизацию продукта ПЦР с фиксированными на мембране фрагментами рестрикции хромосомной ДНК МАН, содержащими участок элемента IS1245, осуществляли при 60°С, 12 ч в гибридизационной печи (GE Healthcare Life Sciences, США).

Продукты гибридизации на мембране визуализировали колориметрически с использованием конъюгата анти-DIG щелочной фосфатазы, нитротетразолия синего и бром-хлор-индолилфосфата. Полученные профили h (паттерны) гибридизации штаммов представляют собой наборы различающихся по количеству и молекулярной массе фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок нуклеотидной последовательности IS1245.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Старкова, Дарья Андреевна, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии MAC - Mycobacterium avium complex ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция п.н. - пара нуклеотидов

TR - англ., Tandem Repeats, тандемные повторы

VNTR - англ., Variable Number Tandem Repeats, вариабельное число тандемных повторов

MATR - Mycobacterium avium Tandem Repeats MAH-M. avium subsp. hominissuis MAP - M. avium subsp. paratuberculosis МАЛ - M. avium subsp. avium

RFLP - англ., Restriction Fragment Length Polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

IS - Insertion sequence, инсерционная последовательность

1. Литвинов, В.И. Нетуберкулёзные микобактерии / В.И. Литвинов, М.В. Макарова, М.А. Краснова // М.: МНПЦБТ. - 2008. - 256 с.

2. Макарова, М.В. Идентификация нетуберкулезных микобактерий / М.В. Макарова, М.А. Краснова // Российский медицинский журнал.- М. - 2009. - №1. — С.27-29.

3. Оттен, Т.Ф. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий // Спб: Метод. Рекоменд. -1994. - 20 с.

4. Оттен, Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев // Спб: Медицинская пресса. - 2005. - 224 с.

5. Старкова, Д.А. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis / Д. А. Старкова, Т.Ф. Оттен, И. В. Мокроусов, А. А. Вязовая, Б. И. Вишневский, О. В. Нарвская // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 9. - С. 1048-1054.

Starkova, D.A. Genotypic characteristics of Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains / D.A. Starkova, T.F. Otten, I.V. Mokrousov, B.I. Vishnevsky, O.V. Narvskaya // Russian Journal of Genetics. - 2013. - Vol. 49, №9. - P. 909-914.

6. Adekambi, T. Dissection of philogenetic relationships among 19 rapidly growing Mycobacterium species by 16S rRNA, hsp65, sodA, recA and rpoB gene sequencing / T. Adekambi, M. Drancourt // Int. J. Syst. Evol. Micribiol. - 2004. - Vol. 54. - P. 20952105.

7. Andersson, M.A. Bacteria, molds, and toxins in water-damaged building materials / M.A. Andersson, M. Nikulin, U. Koljalg, M.C. Andersson, F. Rainey, K. Reijula, E.L. Hintikka, M. Salkinoja-Salonen // Appl. Environ. Microbiol . - 1997. -Vol.63, №2.-P. 387-393.

8. Aravindhan, V. Identification and differentiation of Mycobacterium avium and M. intracellular by PCR- RFLP assay using the groES gene / V. Aravindhan, S. Sulochana, S. Narayanan, C.N. Paramasivam, P.R. Narayanan // Indian J. Med. Res. -2007. - №126. - P. 575-579.

9. Arruda, S. Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells / S. Arruda, G. Bomfim, R. Knights, T. Huima-Byron, L.W. Riley // Science. -1993. -Vol. 261. - P.1454-1457.

10. Bannantine, J. P. Genome scale comparison of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis with Mycobacterium avium subsp. avium reveals potential diagnostic sequences / J.P. Bannantine, E. Baechler, Q. Zhang, L.L. Li, V. Kapur // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P.1303-1310.

11. Bartos, M. Identification of members of Mycobacterium avium species by Accu-Probes, serotyping, and single ISPÖÖ, IS9Ö2, IS/245 and IS901-flanking region PCR with internal standards / M. Bartos, P. Hlozek, P. Svastova, L. Dvorska, T. Bull, L. Matlova, I. Parmova, I. Kuhn, J. Stubbs, M. Moravkova, J. Kintr, V. Beran, I. Melicharek, M. Ocepek, I. Pavlik // J. Microbiol. Methods. - 2006. - Vol.64. - P. 333345.

12. Beggs, M. L. Species identification of Mycobacterium avium complex isolates by a variety of molecular techniques / M. L. Beggs, R. Stevanova, K.D. Eisenach // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol.38. - P.508-512.

13. Cangelosi, G.A. The two-component regulatory system mtrAB is required for morphotypic multidrug resistance in Mycobacterium avium / G.A. Cangelosi, J.S. Do, R. Freeman, J.G. Bennett, M. Semret, M.A. Behr // J. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2006. - Vol. 50, №2. - p. 461-468.

14. Casali, N. Invasion activity of a Mycobacterium tuberculosis peptide presented by the Escherichia coli AIDA autotransporter / N. Casali, M. Konieczny, M.A. Schmidt, L.W. Riley // Infect. Immun. - 2002. - Vol.70. - P. 6846-6852.

15. Cayrou, C. Genotyping of Mycobacterium avium complex organisms using multispacer sequence typing / C. Cayrou, C. Turenne, A. M. Behr, M. Drancourt // Microbiology. - 2010. - Vol.156, №3. - P. 687-694.

16. CDC. Guidelines for the Control of Nontuberculous Mycobacteria in the Northern Territory // - 2002.

17. Chia-wei, Wu. Whole-Genome Plasticity among Mycobacterium avium subspecies: insights from comparative genomic hybridizations / Wu Chia-wei, J.

Glasner, M. Collins, S. Naser, A.M. Talaat // J. Bacteriol. - 2006. - Vol. 188, № 2. - P. 711-723.

18. Chimara, E. Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns / E. Chimara, L. Ferrazoli, S. Y. M. Ueky, C.M. Martins, A.M. Durham, R.D. Arbeit, C. S. Leäo // BMC Microbiology. -2008. - Vol. 8, №48 doi: 10.1186/1471-2180-8-48.

19. Choudhuri, B.S. Overexpression and functional characterization of an ABC (ATP-binding cassette) transporter encoded by the genes drrA and drrB of Mycobacterium tuberculosis / B.S. Choudhuri, S. Bhakta, R. Barik, J. Basu, M. Kundu, P. Chakrabarti // Biochem. J. - 2002. - Vol.367. - P.279-285.

20. Collins, D.M. Use of four DNA insertion sequences to characterize strains of the Mycobacterium avium complex isolated from animals / D.M. Collins, S. Cavaignac, G.W. de Lisle // Mol. Cell. Probes. -1997. - Vol. 11. - P.373-380.

21. Covert, T. Occurrence of nontuberculous mycobacteria in environmental samples / T. Covert, M. Rodgers, A. Reyes, G. Stelma // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. -Vol. 65, №6. - P. 2492- 2496. \

22. Danelishvili, L. Identification of Mycobacterium avium pathogenicity island important for macrophage and amoeba infection / L. Danelishvili, M. Wu, B. Stang, M. Harriff, S. Cirillo, J. Cirillo, R. Bildfell, B. Arbogast, L.E. Bermudez // Proc. Natl. Acad. Sei. - 2007. - Vol. 104, №26. - P. 11038-11043.

23. Devallois, A. Computer-assisted analysis of Mycobacterium avium fingerprints using insertion elements IS1245 and IS 1311 in a Caribbean setting / A. Devallois, N. Rastogi // Res. Microbiol. - 1997. - Vol.148. - P. 703-713.

24. Dvorska, L. A standardized restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for typing Mycobacterium avium isolates links IS901 with virulence for birds / L. Dvorska, T. J. Bull, M. Bartos, L. Matlova, P. Svastova,. R.T. Weston, J. Kintr, I. Parmova, D. Van Soolingen, I. Pavlik // J. Microbiol. Methods. - 2003. - Vol. 55. - P. 11-27.

25. Eckstein, T. M. A Genetic Mechanism for Deletion of the ser2 Gene Cluster and Formation of Rough Morphological Variants of Mycobacterium avium / T.M. Eckstein, J.M. Inamine, M.L. Lambert, J.T. Belisle // J. of Bacteriology. - 2000. - Vol. 182, - № 21. - P. 6177-6182.

26. Ellingson, J.L. Evaluation of the accuracy and reproducibility of a practical PCR panel assay for rapid detection and differentiation of Mycobacterium avium subspecies / J.L. Ellingson, J.R. Stabel, W.R. Bishai, R. Frothingham, J.M. Miller // Mol. Cell. Probes. - 2000. - Vol. 14. - P.153-161.

27. Euze'by, J.P. List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature [http ://www.bacterio .cict.fr]

28. Falkinham III, J.O. Nontuberculous mycobacteria in the environment // Clin. Chest Med. - 2002. - Vol. 23. - P. 529- 551.

29. Falkinham III, J.O. Collection and characteristics of mycobacteria in aerosols / J.O. Ill Falkinham, K.L. George, M.A. Ford, B.C. Parker // Biological contaminants in indoor environments, American Society for Testing and Materials. -1990. - P. 71-81.

30. Falkinham III, J.O. Factors influencing numbers of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellular and other mycobacteria in drinking water distribution systems / J.O. Ill Falkinham, C.D. Norton, M.W. Le Chevallier // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, №3. - P.1225-1231.

31. Field, S. Mycobacterium avium complex pulmonary diseases in patients without HIV infection / S. Field, D. Fisher, R. Cowie // Chest. - 2004. - Vol. 126. - P. 566-581.

32. George, K.L. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Growth and survival in natural waters / K.L. George, B.C. Parker, H. Gruft, J.O. Ill Falkinham // Am. Rev. Respir. Dis. - 1980. - Vol.122. - P. 89-94.

33. Goslee, S. Water as a source of potentially pathogenic mycobacteria / S. Goslee, E. Wolinsky // Am. Rev. Respir. Dis. - 1976. - Vol.113. - P. 287- 292.

34. Guerrero, C. A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS1245, is a specific target for analysis of strain relatedness / C. Guerrero, C. Bernasconi, D. Burki, T. Bodmer, A. Telenti // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33, № 2. - P. 304-307.

35. Hunter, P. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity / P. Hunter, M. Gaston // J. Clin. Microbiol. -1988. - Vol. 26, № 11. - P. 2465-2466.

36. Horan, K.L. Isolation of the Genome Sequence Strain Mycobacterium Avium 104 from Multiple Patients over a 17-Year Period / K.L. Horan, R. Freeman, K. Weigel, M. Semret, S. Pfaller, T.C. Covert, D. van Soolingen, S.C. Leäo, M.A. Behr, G.A. Cangelosi // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, №3. - P. 783-789.

37. Ichikawa, K. Characterization of Mycobacterium avium clinical isolates in Japan using subspecies-specific insertion sequences, and identification of a new insertion sequence, ISMav6 / K. Ichikawa, T. Yagi, M. Moriyama, T. Inagaki, T. Nakagawa, K. Uchiya, T. Nikai, K. Ogawa // J. Med. Microbiol. - 2009. - № 58. - P. 945-950.

38. Ichiyama, S. The isolation of Mycobacterium avium complex from soil, water, and dusts / S. Ichiyama, K. Shimokata, M. Tsukamura // Microbiol. Immunol. - 1988. — Vol.32, №7.-P.733-739.

39. Iivanainen, E. Mycobacteria in drinking water networks: occurrence in water and -loose deposits, formation of biofilms / E. Iivanainen, M.L. Katila, P.J. Martikanen // Abstracts of the European Society of Mycobacteriology, Lucerne, Switzerland^ - 1999.

40. Inagaki, T. Comparison of a Variable-Number Tandem-Repeat (VNTR) method for typing Mycobacterium avium with Mycobacterial Interspersed Repetitive-Unit— VNTR and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism Typing / T. Inagaki, K. Nishimori, T. Yagi, K. Ichikawa, M. Moriyama, T. Nakagawa, T. Shibayama, K. Uchiya, T. Nikai, K. Ogawa // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, № 7. - P. 21562164.

41. Iseman, M. Medical management of pulmonary disease caused by Mycobacterium avium complex // Clin. Chest Med. - 2003. - Vol. 23. - P.633-641.

42. Iwamoto, T. Intra-subspecies sequence variability of the MACPPE12 gene in Mycobacterium avium subsp. hominissuis / T. Iwamoto, K. Arikawa, C. Nakajima, N. Nakanishi, Y. Nishiuchi, S. Yoshida, A. Tamaru, Y. Tamura, Y. Hoshino, H. Yoo, Y. K. Park, H. Saito, Y. Suzuki // Genetics and Evolution. - 2014. - Vol.21. - P. 479-483.

43. Iwamoto, T. Genetic diversity of Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains isolated from humans, pigs, and human living environment / T. Iwamoto, C. Nakajima, Y. Nishiuchi, T. Kato, S. Yoshida, N. Nakanishi, A. Tamara, Y. Tamura, Y. Suzuki, M. Nasu // Infect. Genet. Evol. - 2012. - Vol. 12, №4. - P. 846-852.

44. Jha, S. Virulence-related Mycobacterium avium subsp. hominissuis MAV_2928 gene is associated with vacuole remodeling in macrophages / S.S. Jha, L. Danelishvili, D. Wagner, J. Maser, Y.J. Li, I. Moric, S. Vogt, Y. Yamazaki, B. Lai, L.E. Bermudez // BMC Microbiol. - 2010. - Apr 1. - doi: 10:100.

45. Johansen, T.B. New probes used for IS1245 and IS 1311 restriction fragment length polymorphism of Mycobacterium avium subsp. avium and Mycobacterium avium subsp. hominissuis isolates of human and animal origin in Norway / T.B. Johansen, I. Olsen, M.R. Jensen, U.R. Dahle, G. Holstad, B. Dj0nne // BMC Microbiology. - 2007. -Vol.7, №14. - doi:10.1186/1471-2180-7-14.

46. Johansen, T.B. Distribution of IS 1311 and IS1245 in Mycobacterium avium subspecies / T.B. Johansen, B. Djonne, M.R. Jensen, I. Olsen // J. Clin. Microbiol: — 2005. - Vol. 43, № 5. - P. 2500-2502.

47. Keller, A. P. Evidence of the presence of IS/245 and IS 1311 or closely related insertion elements in nontuberculous mycobacteria outside of the Mycobacterium avium complex / A.P. Keller, M.L. Beggs, B. Amthor, F. Bruns, P. Meissner, W.H. Haas // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P.1869-1872.

48. Krzywinska, E. Naturally occurring horizontal gene transfer and homologous recombination in Mycobacterium / E. Krzywinska, J. Krzywinski, J.S. Schorey // Microbiology. - 2004. - №150. - P. 1707-1712.

49. Kunze, Z.M. IS901, a new member of a widespread class of atypical insertion sequences, is associated with pathogenicity in Mycobacterium avium / Z.M. Kunze, S. Wall, R. Appelberg, M.T. Silva, F. Portaeis, J.J. Mcfadden // Mol. Microbiol. - 1991. -Vol.5.-P. 2265-2272.

50. Levy-Frebault, V.V. Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium and for description of new slowly growing Mycobacterium species / V.V. Levy-Frebault, F. Portaels // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1992. - Vol. 42. - P. 315-323.

51. Li, Y.J. Identification of virulence determinants of Mycobacterium avium that impact on the ability to resist host killing mechanisms / Y.J. Li, L. Danelishvili, D. Wagner, M. Petrofsky, L.E. Bermudez // J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol. 59, №1. - P. 8-16.

52. Mackenzie, N. Genomic comparison of PE and PPE genes in the Mycobacterium avium complex / N. Mackenzie, D.C. Alexander, C.Y. Turenne, M.A. Behr, J.M. De Buck // J. Clin. Microbiol. - 2009. - №47. - P. 1002-1011.

53. Mahillon, J. Insertion Sequences / J. Mahillon, M. Chandler // Microbiol. And mol. Boil. Reviews . -1998. - Vol. 62, № 3. - P. 725-774.

54. Mani, A.K. Pulmonary Mycobacterium avium - intracellular complex infection in the immunocompetent host / A.K. Mani, G. Kane // Pulmonary disease board review manual. - 2003. - Vol. 11, Part 1.

55. Martin-Casabona, N. Non-tuberculous mycobacteria: patterns of isolation. A multicountry retrospective syrvey / N. Martin-Casabona, A. Bahrmand, J. Bennedsen, V.O. Thomsen, M.M. Curcio, Fauville-Dufaux, K. Feldman, M. Havelkova, M.L. Katila, K. Köksalan, M.F. Pereira , F. Rodrigues, G.E. Pfyffer, F. Portaeis, J. Rossellö Urgell, S. Rüsch-Gerdes // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2004. - Vol.8. - P.1186t1193.

56. McGarvey, J. Phenotypic and genomic analyses of the Mycobacterium avium complex reveal differences in gastrointestinal invasion and genomic composition / J. McGarvey, L. Bermudes // Infect. Immun. - 2001. - Vol.69. - P. 7242-7249.

57. McNabb, A. Assessment of Partial Sequencing of the 65-Kilodalton heat shock protein gene (hsp65) for routine identification of Mycobacterium species isolated from clinical sources / A. McNabb, D. Eisler, K. Adie, M. Amos, M. Rodrigues, G. Stephens, W.A. Black, J. Isaac-Renton // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42, №7. - P. 30003011.

58. Mijs, W. Molecular evidence to support a proposal to reserve the designation Mycobacterium avium subsp. avium for bird-type isolates and M. avium subsp. hominissuis for the human/porcine type of M. avium / W. Mijs, P. de Haas, R. Rossau, T. Van Der Laan, L. Rigouts, F. Portaeis, D. van Soolingen // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2002. - №52. - P. 1505-18.

59. Moulin, G.C. Concentration of Mycobacterium avium by hospital hot water systems / G.C. Moulin, K.D. Stottmeier, P.A. Pelletier, A.Y. Tsang, J. Hedley-Whyte // JAMA. - 1988. - Vol. 260, №11.- P.1599-1601.

60. No vi, C. Molecular typing of Mycobacterium avium isolates by sequence of the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer and comparison with the IS1245-based fingerprinting / C. Novi, L. Rindi, N. Lari, C. Garzeiii // J. Med. Microbiol. - 2000. -Vol.49. - P. 1091-1095.

61. O'Brien, D. Nontuberculous mycobacterium disease in Northen Australia: a case series and review of the literature / D. O'Brien, B. Currie, V. Krause // Clin. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 31 - P. 958-968.

62. Ochman, H. Lateral and oblique gene transfer. // Curr. Opin. Genet. - 2001. -Vol. 11, №6. - P. 616-619.

63. Pavlik, I. Relationship between IS901 in Mycobacterium avium complex strains isolated from birds, animals, humans, and the environment and virulence for poultry / I. Pavlik, P. Svastova, J. Bartl, L. Dvorska, I. Rychlik // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2000. - Vol.7. - P. 212-217.

64. Pate, M. MIRU-VNTR typing of Mycobacterium avium in animals and humans: heterogeneity of Mycobacterium avium subsp. hominissuis versus homogeneity of Mycobacterium avium subsp. avium strains / M. Pate, D. Kusar, M. Zolnir-Dovc, M. Ocepec // Res. Vet. Sei. - 2011. - Vol. 91, № 3. - P. 376-381.

65. Pedrosa, J. Characterization of the virulence of Mycobacterium avium complex (MAC) isolates in mice / J. Pedrosa, M. Florido, Z.M. Kunze, A.G. Castro, F. Portaels, J. McFadden, M.T. Silva, R. Appelberg // Clin. Exp. Immunol. - 1994. - Vol. 98. - P. 210-216.

66. Pestal-Caron, M. Characterization of IS1245 for Strain Typing of Mycobacterium avium / M. Pestal-Caron, R.D. Arbeit // J. Clin. Microbiol. -1998. -Vol.36, №7. - P. 1859-1863.

67. Philalay, J.S. Genes required for intrinsic multidrug resistance in Mycobacterium avium / J.S. Philalay, C.O. Palermo, A.K. Hauge, T.R. Rustad, G.A. Cangelosi // J. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2004. - Vol. 48, №9. - P. 3412-3418.

68. Rabello, M.C. First Description of Natural and Experimental Conjugation between Mycobacteria Mediated by a Linear Plasmid / M.C. Rabello, C.K. Matsumoto, L.G. Almeida, M.C. Menendez, R.S. Oliveira, R.M. Silva, M J. Garcia, S.C. Leäo // PLoS One. - 2012. - Vol.7, №1. - e29884.

69. Rabello, M.C. Natural Occurrence of Horizontal Transfer of Mycobacterium avium - Specific Insertion Sequence IS1245 to Mycobacterium kansasii / M.C. Rabello, R.S. Oliveira, R.M. Silva, S.C. Leäo // Journal of Clinical Microbiology. -2010. - Vol.48, №46. - P. 2257-2259.

70. Radomski, N. Determination of Genotypic Diversity of Mycobacterium avium Subspecies from Human and Animal Origins by Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem-Repeat and IS 1311 Restriction Fragment Length Polymorphism typing / N. Radomski, V.C. Thibault, C. Karoui, C. Krystel, T. Cochard, C. Gutie'rrez, P. Supply, F. Biet, M.L. Boschiroli // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, №4. - P. 1026-1034.

71. Rindi, L. Genetic diversity and phylogeny of Mycobacterium avium Infection / L. Rindi, C. Garzeiii // Genetics and Evolution. - 2013. - Vol. 12, №4. - P. 846-852.

72. Ritacco, V. Use of IS901 and IS1245 in RFLP typing of Mycobacterium avium complex: relatedness among serovar reference strains, human and animal isolates / V. Ritacco, K. Kremer, T. van der Laan, J.E. Pijnenburg, P.E. de Haas, D. Van Soolingen // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - 1998. -Vol. 2. - P. 242-251.

73. Rocco, J.M. Mycobacterium avium and modulation of the host macrophage immune mechanisms / J.M. Rocco, V.R. Irani I I Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2011. -Vol. 15, №4. - P. 447-452.

74. Rodgers, M.R. Colonisation of point of use water filters by silver resistant non-tuberculous mycobacteria / M.R. Rodgers, B.J. Blackstone, A.L. Reyes, T.C. Covert // J. Clin. Pathol. -1999. - Vol. 52. - P. 629- 632.

75. Rossi, M. M. avium complex infection in the swiss HIV cohort study: declining incidence, improved prognosis and discontinuation of maintenance therapy / M. Rossi, M. Flepp, A. Telenti, V. Schiffer, N. Egloff, H. Bucher, P. Vernazza, E. Bernasconi, R.

Weber, M. Rickenbach, H. Furrer // SWISS MED WKLY. - 2001. - Vol 131. - P. 471478.

76. Semret, M. Extensive Genomic Polymorphism within Mycobacterium avium / M. Semret, G. Zhai, S. Mostowy, C. Cleto, D. Alexander, G. Cangelosi, D. Cousins, D.M. Collins, D. van Soolingen, M.A. Behr // J. of Bacteriology. - 2004. - Vol. 186, №18. - P. 6332-6334.

77. Shinnick, T.M. Mycobacterial taxonomy / T.M. Shinnick, R.C. Good // Europ. J. clin. Mycrobiol. -1994. - Vol. 13, №11. - P. 884-901.

78. Sreevatsan, S. Restricted structural; gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination / S. Sreevatsan, X. Pan, K.E. Stockbauer, N.D. Connell, B.N. Kreiswirth, T.S. Whittam, J.M. Musser // Proc. Natl: Acad. Sei. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 9869 - 9874.

79. Möbius, P. Comparative macrorestriction and RFLP analysis of Mycobacterium avium subsp. avium and Mycobacterium avium subsp. hominissuis isolates from man, pig, and cattle / P. Möbius, P. Lentzsch, I. Moser, L. Naumannc, G. Martina H. Köhler // Vet. Microbiol. - 2006. - № 117. - P. 284-291.

80. Stine, T.M. A pseudoepidemic due to atypical mycobacteria in a hospital water supply / T.M. Stine, A.A. Harris, S. Levin, N. Rivera, R.L. Kaplan // JAMA. - 1987. -Vol. 258, №6.-P. 809-811.

81. Supply, P. Variable human minisatellite-like regions in the mycobacterium tuberculosis genome. / P. Supply, E. Mazars, S. Lesjean, V. Vincent, B. Gicquel, C. Locht // Mol. Microbiol. - 2000. - Vol.36, №3. - P. 762-71.

82. Taylor, R.H. Chlorine, chloramine, chlorine dioxide, and ozone susceptibility of Mycobacterium avium / R.H. Taylor, J.O. III Falkinham, C.D. Norton, M.W. LeChevalier // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P.1702- 1705.

83. Telenti, A. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis / A. Telenti, F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E.C. Bottger, T. Bodmer // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31. -P.175-178.

84. Thibault, V.C. New Variable-Number Tandem-Repeat Markers for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism Typing / V. C. Thibault, M. Grayon, M. Boschiroli, C. Hubbans, P. Overduin, K. Stevenson, M.C. Gutierrez, P. Supply, F. Biet // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol. 45, №8. - P. 2404-2410.

85. Timpe, A. The relationship of «atypical» acid-fast bacteria to human deseas / A. Timpe, E.N. Runyon // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - №44. - P. 202-209.

86. Tirkkonen, T. Comparison of Variable-Number Tandem-Repeat Markers typing and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism fingerprinting of Mycobacterium avium subsp. hominissuis from human and porcine origins / T. Tirkkonen, J. Pakarinen, E. Rintala, T. Ali-Vehmas, H. Marttila, O. Peltoniemi, J. Makinen // J. Acta Veterinaria Scandinavica. - 2010. - Vol. 52, № 1. - P. 21-27.

87. Tortoli, E. Clinical manifestations of nontuberculous mycobacteria infections // Clin. Microbiol. Infect. - 2009. - Vol. 15, №10. - P. 906-910.

88. Turenne, C.Y. Mycobacterium avium in the postgenomic era / C.Y. Turenne, R. Wallace, M.A. Behr // Clin. Microb. reviews. - 2007. - Vol.20, № 2. - P. 205-229.

89. Van Embden, J. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis iby DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology / J. Van Embden, M. Cave, J. Crawford, J. Dale , K. Eisenach , B. Gicquel // J. Clin. Microbiol. - 1993. -№.31. - P. 406-409.

90. Van Soolingen, D. IS/245 restriction fragment length polymorphism typing of Mycobacterium avium isolates: proposal for standardization / D. Van Soolingen, J. Bauer, V. Ritacco, S.C. Leao, I. Pavlik, V.Vincent, N. Rastogi, A. Gori, T. Bodmer, C. Garzelli, M.J. Garcia // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P. 3051-3054.

91. Van Soolingen, D. RFLP analysis of mycobacteria. / D. Van Soolingen, P. de Haas, P. Hermans, J. Van Embden // National Institute of Public Health and Environmental Protection, Netherlands: Bilthoven. - 1992. - 63 p.

92. Wallace, R. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria / R. Wallace, J. Glassroth, D. Griffith // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -1997.-Vol. 156.-P.1-25.

93. Whittington, R. Polymorphisms in IS 1311, an insertion sequence common to Mycobacterium avium and M. avium subsp. paratuberculosis, can be used to distinguish between and within these species / R. Whittington, I. Marsh, E. Choy, D. Cousins // Mol. Cell. Probes. -1998. - Vol. 12. - P. 349-358.

94. Yamazaki, Y. Mycobacterium avium Genes Associated with the Ability To Form a Biofilm / Y. Yamazaki, L. Danelishvili, M. Wu, M. MacNab, L.E. Bermudez // Applied And Environmental Microbiology. - 2006. - Vol.72, №1. - P. 819-825.

Приложение А

Таблица - Характеристика штаммов М. avium subsp. hominissuis

Штамм* Вид Материал ВИЧ статус пациента

577 М. avium hominissuis ПВБ -

784 М. avium hominissuis мокрота -

827 М. avium hominissuis мокрота -

1595 M. avium hominissuis мокрота -

2098 M. avium hominissuis мокрота -

2118 M. avium hominissuis мокрота -

2997 M. avium hominissuis участок легкого -

3094 M. avium hominissuis участок легкого -

3759 M. avium hominissuis мокрота -

3980 M. avium hominissuis мокрота -

4025 M. avium hominissuis ПВБ -

4098 M. avium hominissuis участок легкого -

4197 M. avium hominissuis мокрота -

4936 M. avium hominissuis мокрота -

5122 M. avium hominissuis мокрота -

5400 M. avium hominissuis мокрота -

5607 M. avium hominissuis ПВБ -

5643 M. avium hominissuis участок легкого -

5822 M. avium hominissuis мокрота -

6063 M. avium hominissuis участок легкого -

6337 M. avium hominissuis мокрота -

6749 M. avium hominissuis мокрота -

6935 M. avium hominissuis ПВБ -

7048 M. avium hominissuis участок легкого -

7376 M. avium hominissuis мокрота -

7508 M. avium hominissuis моча -

7703 M. avium hominissuis мокрота -

7813 M. avium hominissuis ПВБ -

7860 M. avium hominissuis участок легкого -

7886 M. avium hominissuis ПВБ -

8673 M. avium hominissuis мокрота -

9040 M. avium hominissuis мокрота -

15052 M. avium hominissuis мокрота -

15813 M. avium hominissuis мокрота -

18242 M. avium hominissuis ПВБ -

19910 M. avium hominissuis мокрота -

27050 M. avium hominissuis мокрота -

28587 M. avium hominissuis мокрота -

29021 M. avium hominissuis мокрота -

Штамм* Вид Материал ВИЧ статус пациента

32425 М. avium hominissuis мокрота -

35834 М. avium hominissuis мокрота -

39809 М. avium hominissuis мокрота -

42106 M. avium hominissuis мокрота -

46802 M. avium hominissuis мокрота -

48009 M. avium hominissuis мокрота -

48641 M. avium hominissuis мокрота -

50925 M. avium hominissuis мокрота -

51465 M. avium hominissuis мокрота -

54132 M. avium hominissuis мокрота -

54367 M. avium hominissuis мокрота -

59209 M. avium hominissuis мокрота -

61075 M. avium hominissuis мокрота -

61238 M. avium hominissuis мокрота -

62027 M. avium hominissuis мокрота -

64091 M. avium hominissuis мокрота -

64400 M. avium hominissuis мокрота -

74408 M. avium hominissuis кровь СПИД

78273 M. avium hominissuis кровь СПИД

1148 M. avium hominissuis мокрота -

12676 M. avium hominissuis мокрота +

135-1180 M. avium hominissuis мокрота +

1462 M. avium hominissuis ПВБ +

14655 M. avium hominissuis ПВБ +

1492 M. avium hominissuis мокрота +

18718 M. avium hominissuis кровь +

19002 M. avium hominissuis мокрота +

20561 M. avium hominissuis ПВБ +

2058 M. avium hominissuis мокрота +

21605 M. avium hominissuis мокрота +

23110 M. avium hominissuis ПВБ +

2387 M. avium hominissuis участок каверны -

29249 M. avium hominissuis мокрота -

3219ch M. avium hominissuis мокрота -

3219vo M. avium hominissuis кровь СПИД

385-192 M. avium hominissuis ПВБ +

42584 M. avium hominissuis мокрота +

43074 M. avium hominissuis кровь СПИД

51571 M. avium hominissuis кровь СПИД

51737 M. avium hominissuis мокрота +

Штамм* Вид Материал ВИЧ статус пациента

53093 М. avium hominissuis мокрота +

53709 М. avium hominissuis кровь СПИД

5583 М. avium hominissuis ПВБ +

58358 M. avium hominissuis мокрота +

59954 M. avium hominissuis ПВБ +

69610 M. avium hominissuis мокрота +

7139 M. avium hominissuis мокрота +

740-1103 M. avium hominissuis мокрота -

7761 M. avium hominissuis мокрота -

7979 M. avium hominissuis мокрота -

9238 M. avium hominissuis мокрота -

* штаммы 3219сИ и 3219уо выделены от разных пациентов.

ПВБ - промывные воды бронхов.

(+) - ВИЧ-позитивный; (-) - ВИЧ-негативный.

Таблица - Молекулярно-генетическая характеристика штаммов

М. avium subsp. hominissuis

Штамм* Размеры фрагментов рестрикции Инсерционный элемент

BstEII Haelll IS 901 IS 900

577 210/235 105/130 — —

784 210/235 105/130 — —

827 210/235 105/130 — —

1595 210/235 105/130 — —

2098 210/235 105/130 — —

2118 210/235 105/130 — —

2997 210/235 60/105/130 — —

3094 210/235 105/130 — —

3759 210/235 105/130 — —

3980 210/235 105/130 — —

4025 210/235 105/130 — —

4098 210/235 105/130 — —

4197 210/235 105/130 — —

4936 210/235 105/130 — —

5122 210/235 105/130 — —

5400 210/235 105/130 — —

5607 210/235 105/130 — —

5643 210/235 105/130 — —

5822 210/235 60/105/130 — —

'6063 210/235 105/130 — —

6337 210/235 105/130 — —

6749 210/235 105/130 — —

6935 210/235 105/130 — —

7048 210/235 105/130 — —

7376 210/235 105/130 — —

7508 210/235 105/130 — —

7703 210/235 105/130 — —

7813 210/235 105/130 — —

7860 210/235 105/130 — —

7886 210/235 105/130 — —

8673 210/235 105/130 — —

9040 210/235 60/105/130 — —

15052 210/235 105/130 — —

15813 210/235 105/130 — —

18242 210/235 105/130 — —

19910 210/235 105/130 — —

Штамм* Размеры фрагментов рестрикции Инсерционный элемент

В51ЕН НаеШ К 901 1Б 900

27050 210/235 105/130 — —

28587 210/235 105/130 — —

29021 210/235 105/130 — —

32425 210/235 105/130 — —

35834 210/235 105/130 — —

39809 210/235 105/130 — —

42106 210/235 105/130 — —

46802 210/235 105/130 — —

48009 210/235 60/105/130 — —

48641 210/235 105/130 — —

50925 210/235 105/130 — —

51465 210/235 105/130 — —

54132 210/235 105/130 — —

54367 210/235 105/130 — —

59209 210/235 105/130 — —

61075 210/235 105/130 — —

61238 210/235 105/130 — —

62027 210/235 105/130 — —

64091 210/235 105/130 — —

64400 210/235 105/130 — —

74408 210/235 105/130 — —

78273 210/235 105/130 — —

1148 210/235 105/130 — —

12676 210/235 105/130 — —

135-1180 210/235 105/130 — —

1462 210/235 105/130 — —

14655 210/235 105/130 — —

1492 210/235 105/130 — —

18718 210/235 105/130 — —

19002 210/235 105/130 — —

20561 210/235 105/130 — —

2058 210/235 105/130 — —

21605 210/235 105/130 — —

23110 210/235 105/130 — —

2387 210/235 105/130 — —

29249 210/235 105/130 — —

3219сЬ 210/235 105/130 — —

3219уо 210/235 105/130 — —

385-192 210/235 60/105/130 — —

Штамм* Размеры фрагментов рестрикции Инсерционный элемент

В51ЕП НаеШ К 901 1Б 900

42584 210/235 105/130 — _

43074 210/235 105/130 — —

51571 210/235 105/130 — —

51737 210/235 60/105/130 — —

53093 210/235 60/105/130 — —

53709 210/235 105/130 — —

5583 210/235 105/130 — —

58358 210/235 105/130 — —

59954 210/235 105/130 — —

69610 210/235 105/130 — —

7139 210/235 105/130 — —

740-1103 210/235 105/130 — —

7761 210/235 105/130 — —

7979 210/235 105/130 — —

9238 210/235 105/130 — —

* штаммы 3219сЬ и 3219уо выделены от разных пациентов. (-) - отсутствие продукта ПЦР.

Приложение В Таблица - Профили генотипирования штаммов

М. атит. виЬзр. котШББШЗ

Штамм* УИТЫ-МАТЯ -профиль* Профиль

577 22221128222231342532443' 1Р

784 22221128222231342532443' 1Р

827 22221128222231342532443* 1Р

1595 05431128205323442232223 1Р

2098 05331128205233522232223 1Р

2118 22431118222121411432222 1Р

2997 23221128223231342533243' Мау 3

3094 23221128223231342532443* МауЗ

3759 22221128222231342532443* 1Р

3980 24221128224131342532243* 1Р

4025 02211128202231342332443* 1Р

4098 24221128224131342532443* 1Р

4197 22221128222231342532443' 1Р

4936 22321128322131342532443' 1Р

5122 22221128222231342532443* 1Р

5400 22221128222231342532443* 1Р

5607 2533112*8425231322*432222 1Р

5643 22221128222231342532443* 1Р

5822 22221128222231342532443' 1Р

6063 2533112*8425231322*432222 1Р

6337 2533112*8425231322*432222 1Р

6749 24221128224231342232443* Мау 4

6935 22221128222221342532443* 1Р

7048 22221128222231342532443' 1Р

7376 22221128222231342532443' 1Р

7508 22221128222231342532443' 1Р

7703 24221128224131342532443* 1Р

7813 22221128222231342532443* 1Р

7860 2533112'8425231322'432222 1Р

7886 22221128222231342532443' 1Р

8673 22221128222231342532443' 1Р

9040 33331158333231325432223 1Р

15052 22221128222231342532443' 1Р

15813 22221128222231342532443* 1Р

18242 05321128105211622232222 1Р

19910 22221128222231342532443* 1Р

Штамм* УШИ-МАТЯ -профиль** Профиль

27050 22221128222231342532443' 1Р

28587 05431128205323442232223 1Р

29021 23221128223231342532443' МауЗ

32425 22221128222231342532443' 1Р

35834 22221128222231342532443' 1Р

39809 22221128222221342432443' 1Р

42106 22221128222231342532443' 1Р

46802 22221128222231342532443' 1Р

48009 01331128201222222232223 1Р

48641 22221128222231342532433' 1Р

50925 22221128222231342532443' 1Р

51465 2533112'8425231322*432222 1Р

54132 22221128222231342532243' 1Р

54367 22221128222231342532443' 1Р

59209 24221128224131342532443' 1Р

61075 24221128224131342432443' 1Р

61238 05321128105211522232223' 1Р

62027 03331128303230345432222 1Р

64091 24221128224131342532443' 1Р

64400 22221128222231342532443' 1Р

74408 24221128224133342532443' 1Р

78273 05331128205231522242123 1Р

1148 22221128222231342532443' 1Р

12676 22221128222231342532443' 1Р

135-1180 05431128305323442232223 1Р

1462 25221128225131342532443' 1Р

14655 12221129212231442532443' 1Р

1492 34321128334333322432422 1Р

18718 22221128222231342532443' 1Р

19002 21321128221231342532443' 1Р

20561 05321128205211522232223' 1Р

2058 22221128222231342532443' 1Р

21605 22221128222231342532443' 1Р

23110 22221128222213342432443' 1Р

2387 22221128222231342532443' 1Р

29249 24221128224131342532443' 1Р

3219сЬ 2533112*8425231322'432222 1Р

3219уо 22221128222231342532443' 1Р

385-192 22221128222231342332443' 1Р

Продолжение таблицы

Штамм* VNTR-MATR -профиль* Профиль IS/245-RFLP

42584 22221128222221342432443' IP

43074 22221128322231242232443' IP

51571 24221128224133332532443' IP

51737 24221128224131342532443' Mav 1

53093 24221128224131342532443' Mav 1

53709 25221128225131342532443* IP

5583 22221128222231342532443' Mav 2

58358 22221128222131342532443' IP

59954 22221128222231342532443' Mav 2

69610 22221128222231342532443' IP

7139 2533112*8425231322*432222 IP

740-1103 05331128105211522232223* IP

7761 22221128222231342532443* IP

7979 24221128224231342232443* Mav 4

9238 05321128105233542332223* IP

* штаммы 3219ch и 3219vo выделены от разных пациентов.

** VNTR-MATR профиль (14 локусов): TR292, TRX3, TR25, TR47, TRIO, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16.

IP - индивидуальный профиль рестрикции (Individual Profile).