Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за гнойными бактериальными менингитами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.02.02, доктор наук Миронов Константин Олегович

• Миронов Константин Олегович
• доктор наук
• 2018

Оглавление диссертации доктор наук Миронов Константин Олегович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1 Этиология, заболеваемость и социальная значимость ГБМ

1. 2 Эпидемиологическая характеристика ГБМ различной этиологии

1. 3 Эпидемиологический надзор за ГБМ

1. 4 Молекулярно-биологический мониторинг возбудителей ГБМ

1. 5 Метод мультилокусного секвенирования-типирования в

эпидемиологическом надзоре за возбудителями ГБМ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. 1 Материалы исследования

2. 2 Лабораторные методы исследования

2. 3 Программное обеспечение и Интернет-ресурсы

2. 4 Базы данных для генотипирования возбудителей и эпидемиологического

анализа

2. 5 Эпидемиологические методы

2. 6 Статистические методы

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДИК ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГБМ

3. 1 Определение капсульных антигенов

3. 2 Методики, основанные на секвенировании

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ

4. 1 Серогруппы N. meningitidis

4. 2 Серотипы S. pneumoniae

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

5. 1 Характеристика N. meningitidis

5. 2 Генотипирование S. pneumoniae

5. 3 Генотипирование H. influenzae

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА ГБМ

6. 1 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за

генерализованными формами менингококковой инфекции

6. 1. 1 N. meningitidis серогруппы А

6. 1. 2 N. meningitidis серогрупп B, С и W

6. 1. 3 Определение вариабельных фрагментов белков наружной мембраны

N. meningitidis и его эпидемиологическое значение

6. 2 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за

ГБМ, вызванными S. pneumoniae

6. 3 Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за

ГБМ, вызванными Hib

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1. Олигонуклеотиды для определения антигенов капсулы . 269 Приложение 2. Праймеры для проведения МЛСТ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БНМ - белок наружной мембраны

ГБМ - гнойный бактериальный менингит

ГФМИ - генерализованная форма менингококковой инфекции

МИ - менингококковая инфекция

МЛСТ - мультилокусное секвенирование-типирование

МЛЭЭ - мультилокусный энзимэлектрофорез (мультилокусный электрофорез ферментов)

ОСО - острый средний отит ПИ - пневмококковая инфекция ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РРВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ПЦР-ЭФ - полимеразная цепная реакция с электрофоретической детекцией результата амплификации п.о. - пары (нуклеотидных) оснований

BURST - based upon related sequence types, метод (для обработки данных МЛСТ), основанный на анализе родственных сиквенс-типов Hib - Haemophilus influenzae серотипа b

id - идентификационный номер записи об изоляте в базах данных МЛСТ

NmA - Neisseria meningitidis серогруппы А

NmB - Neisseria meningitidis серогруппы B

NmC - Neisseria meningitidis серогруппы C

NmW - Neisseria meningitidis серогруппы W

UPGMA - unweighted pair group method using arithmetic averages, невзвешенный парногрупповой метод, в котором используется арифметическое среднее

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за гнойными бактериальными менингитами»

Актуальность темы исследования

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) могут быть вызваны различными микроорганизмами, среди которых наибольшее этиологическое и эпидемиологическое значение имеют три возбудителя - Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Бактерии видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae также способны вызывать тяжелые септические состояния без выраженной клинической картины ГБМ, S. pneumoniae и H. influenzae являются возбудителями широкого спектра болезней, среди которых наибольшее клиническое и эпидемиологическое значение имеют пневмонии и другие инфекции респираторного тракта. Поскольку наиболее часто диагностируемым заболеванием, вызываемым N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae является ГБМ, учет случаев данного заболевания, проводимый в рамках эпидемиологического надзора за ГБМ, позволяет оценить вклад данных возбудителей в структуру общей заболеваемости.

Эпидемиологический надзор за ГБМ основан на этиологической расшифровке возбудителей, выделяемых при инвазивных (генерализованных) формах соответствующих инфекций, и учете случаев заболевания в определенных группах населения на наблюдаемой территории в заданный период времени. Идентификация возбудителя ГБМ является основой эпидемиологического надзора за ГБМ и определяет тактику планируемых противоэпидемических мероприятий [33, 105]. Наиболее эффективно идентификация возбудителей ГБМ может быть проведена с использованием основанных на ПЦР методик как отдельно, так и в сочетании с другими методами лабораторной диагностики [97, 107].

Поскольку не все представители видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae способны вызывать ГБМ, помимо методов лабораторной диагностики, направленных на идентификацию вида возбудителя, важная роль должна отводиться методам, позволяющим проводить антигенную и

генетическую характеристику штаммов, принадлежащих одному виду. Определение антигенных и генетических характеристик микроорганизмов позволяет выделить в популяции возбудителя отдельные штаммы и группы штаммов, обозначаемые также как клоны или клональные комплексы, ассоциированные с генерализованными формами инфекции (клинический уровень) и с эпидемическими подъемами заболеваемости в различных группах населения (эпидемиологический уровень). В связи с этим разработка научных и методических основ мониторинга свойств возбудителей ГБМ с применением современных методов внутривидовой характеристики, проводимой с использованием молекулярно-биологических методов, является актуальной эпидемиологической задачей. Данные, характеризующие внутривидовые свойства возбудителей, циркулирующих на наблюдаемой территории, необходимы для постановки эпидемиологического диагноза с целью повышения эффективности надзора за ГБМ, который, в свою очередь, является залогом успешной профилактики других форм инфекций, вызываемых N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время внутривидовая характеристика основных возбудителей ГБМ проводится в основном при помощи широко применяемых рутинных микробиологических и серологических методов. Различия микробиологических свойств отдельных возбудителей ГБМ, определяющих в том числе характер течения эпидемического процесса, диктует необходимость разработки отдельных методик для их внутривидовой характеристики. Поскольку все фенотипические проявления (микробиологические и антигенные свойства бактерий) определяются соответствующими генетическими локусами, идентификация генов или их фрагментов является основой для разработки молекулярно-биологических методик с целью характеристики штаммов возбудителей, выделенных от больных ГБМ. На сегодняшний день геномы основных возбудителей ГБМ секвенированы и в них идентифицированы участки, кодирующие факторы, определяющие антигенные свойства. На

основании работ, посвященных характеристике особенностей рекомбинационных процессов для видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, выделены гены, являющиеся маркерами генетического (филогенетического) родства различных штаммов внутри вида. В связи с этим существует возможность для использования молекулярно-биологических методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые до сих пор применяются значительно реже микробиологических и серологических методов, но при этом имеют целый ряд преимуществ [97, 115, 188]. Главное преимущество основанных на ПЦР методик заключается в возможности изучения не только жизнеспособных микроорганизмов, что выражается в проведении их антигенной и генетической характеристики на основании детекции специфических фрагментов ДНК в образцах клинического материала, не прибегая к этапу высева возбудителей и изучения их микробиологическими методами [157]. Ввиду высокого процента как этиологически нерасшифрованных случаев ГБМ, так и не охарактеризованных возбудителей, которые все-таки были идентифицированы до вида, использование ПЦР существенно повышает результативность проводимых исследований, направленных как на идентификацию возбудителя ГБМ, так и на проведение внутривидовой характеристики возбудителя [55, 70, 97]. Этиологическая расшифровка случая ГБМ, проводимая с помощью основанных на ПЦР методик, является решенной задачей: на базе Центрального НИИ эпидемиологии разработаны и производятся соответствующие наборы реагентов [52, 97, 115, 127]. Идентификация вида возбудителя, являясь основой проводимого эпидемиологического надзора [33, 103], в то же время не позволяет в полной мере охарактеризовать эпидемическую обстановку. Это связано с тем, что инвазивные (генерализованные) формы инфекций, включая ГБМ, в подавляющем большинстве могут быть вызваны только определенными штаммами (клонами, клональными комплексами) бактерий видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, в связи с чем, последующая внутривидовая характеристика возбудителей является важной эпидемиологической задачей,

определяющей тактику профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Современная внутривидовая классификация N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae предполагает обозначение антигенных вариантов, определяемых, в первую очередь, на основании антигенных свойств полисахарида капсулы. Для N. meningitidis антигенная характеристика также включает и более подробную классификацию, предполагающую определение антигенных вариантов белков наружной мембраны (БНМ). Определение генетических свойств возбудителей, выполненное с помощью метода мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ), является одним из наиболее удобных и распространенных способов анализа клональной структуры популяций патогенных бактерий с целью идентификации штаммов, обладающих повышенными вирулентными свойствами, и мониторинга их циркуляции [96]. Результат МЛСТ - сиквенс-тип возбудителя ГБМ и его принадлежность к клональному комплексу - является важным параметром эпидемиологического надзора, который позволяет проспективно оценивать и прогнозировать эпидемиологическую ситуацию.

На сегодняшний день схемы МЛСТ разработаны для всех основных возбудителей ГБМ, и, в зависимости от особенностей эпидемического процесса, обусловленного тем или иным возбудителем, эти схемы могут быть применены для решения определенных эпидемиологических задач. МЛСТ направлено на характеристику популяции микроорганизма, выявление гипервирулентных (и/или ассоциированных с резистентностью к антибиотикам) сиквенс-типов и клональных комплексов. МЛСТ используется для описания генетических взаимоотношений штаммов и эволюционных процессов в бактериальной популяции с целью своевременной идентификации уже известных и новых (не изученных или импортированных с других территорий) микроорганизмов, анализа случаев групповой заболеваемости, а также для анализа эпидемиологического значения бессимптомного носительства штаммов различных клональных комплексов. Другими словами МЛСТ позволяет осуществить «эпидемиологическую маркировку» циркулирующих

возбудителей. Результаты МЛСТ в совокупности с эпидемиологическими характеристиками типированных штаммов (год, место, источник выделения) публикуются через Интернет в общедоступных базах данных, и могут быть использованы для объединения и сопоставления результатов, полученных в разных лабораториях и/или на сопредельных территориях [130, 184, 189]. В частности, МЛСТ успешно зарекомендовало себя в ряде работ по характеристике и анализу локальных вспышек, эпидемий и пандемий менингококковой инфекции (МИ), в которых были выявлены гипервирулентные клональные комплексы N. meningitidis и охарактеризованы клональные комплексы носительских штаммов, не ассоциированные с риском возникновения генерализованных форм менингококковой инфекции (ГФМИ) [140, 187, 188]. Также неоднократно был показан различный вклад в эпидемический процесс возбудителей видов S. pneumoniae и H. influenzae, имеющих одинаковые антигенные характеристики. Причем заболеваемость, обусловленная этими возбудителями, сильно зависит как от формы инфекции, так и от групп населения, вовлеченных в эпидемический процесс [5, 29, 31].

Неодинаковый характер эпидемического процесса, обусловленный штаммами одного вида с различными вирулентными свойствами, диктует необходимость разработки комплекса молекулярно-биологических методик внутривидовой характеристики для идентификации наиболее эпидемиологически значимых антигенных и генетических свойств возбудителей с целью проведения качественной эпидемиологической диагностики и повышения эффективности эпидемиологического надзора и контроля заболеваемости ГБМ.

Цель работы: Совершенствование эпидемиологического надзора за ГБМ с помощью разработанной системы молекулярно-биологического мониторинга возбудителей, циркулирующих на территории России.

Задачи исследования

1. Выявить антигенные и генетические особенности возбудителей ГБМ, вовлеченных в эпидемический процесс на территории России, и определить приоритетные направления использования комплекса молекулярно-биологических методов мониторинга в эпидемиологическом надзоре за ГБМ.

2. В соответствии с генетическими особенностями возбудителей разработать комплекс молекулярно-биологических методических подходов для внутривидовой характеристики антигенных и генетических свойств бактерий видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae.

3. Провести молекулярно-биологический мониторинг и анализ клональной структуры N. meningitidis серогруппы А в наблюдаемый межэпидемический период на территории Москвы, проанализировать наблюдаемые эволюционные изменения и связь с заболеваемостью ГФМИ.

4. Определить клональные комплексы N. meningitidis серогрупп B и C, циркулирующих на территории России, охарактеризовать особенности российских штаммов и эпидемиологическую значимость циркулирующих клональных комплексов.

5. Определить клональную принадлежность N. meningitidis серогруппы W, циркулирующих на территории России, и охарактеризовать их эпидемиологическое значение.

6. Дать антигенную и генетическую характеристику S. pneumoniae, циркулирующих на территории России, и обозначить направления молекулярно-биологического мониторинга S. pneumoniae, вызывающих ГБМ.

7. Определить эпидемиологическую значимость Hib, циркулирующих на территории России, и на основании их генетической характеристики определить клональную структуру российских Hib в сопоставлении с зарубежными.

Научная новизна

Впервые в отечественной эпидемиологической практике разработан и применен комплекс некультуральных молекулярно-биологических подходов для характеристики антигенных и генетических свойств основных возбудителей ГБМ с учетом их эпидемиологической значимости, что позволило получить новые сведения о циркулирующих возбудителях и их вкладе в эпидемический процесс.

Проведена характеристика эпидемически значимых штаммов возбудителей ГБМ (включая находящихся в нежизнеспособном состоянии) в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми для внутривидовой характеристики этих микроорганизмов. Результаты опубликованы в международных базах данных и доступны для проспективного микробиологического мониторинга.

Впервые проведена характеристика клональной структуры популяций основных возбудителей ГБМ, циркулирующих на территории России, и охарактеризовано эпидемиологическое значение представителей выявленных клональных комплексов, определяющее дальнейшие направление молекулярно-биологического мониторинга.

Впервые проанализирована связь заболеваемости ГБМ и генетических свойств возбудителей с целью определения эпидемической опасности циркулирующих в России клональных комплексов и характеристики интенсивности течения эпидемического процесса, ассоциированного с определенными клональными комплексами.

Впервые сформулированы принципы и направления молекулярно-биологического мониторинга основных возбудителей ГБМ в России с учетом их антигенных и генетических особенностей.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты молекулярно-биологического мониторинга использованы в эпидемиологической практике для ретроспективного и проспективного

мониторинга возбудителей ГБМ, циркулирующих на территории России, с целью оценки эпидемической опасности циркулирующих возбудителей видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae.

На основании полученных результатов показана возможность и целесообразность применения разработанных молекулярно-биологических методических подходов в практике эпидемиологического надзора за ГБМ. Полученные данные позволяют охарактеризовать антигенную и генетическую изменчивость возбудителей, вовлеченных в эпидемический процесс, выявлять наиболее опасные в эпидемическом отношении клональные комплексы, отслеживать их распространение в различных группах населения и следить за появлением на территории возбудителей с новыми или измененными свойствами.

Рекомендовано внедрение молекулярно-биологических методов в существующую схему микробиологического мониторинга возбудителей ГБМ для повышения эффективности эпидемиологического надзора за счет высокой дискриминирующей способности генотипирования и уменьшения доли не охарактеризованных штаммов.

Результаты молекулярно-биологического мониторинга штаммов N. meningitidis, выделенных в очагах ГФМИ, могут быть использованы для описания эпидемических связей между инфицированными лицами и оценке эпидемической опасности выявленных источников инфекции и определенных возбудителей.

В совокупности с уже внедренными в диагностическую практику методами этиологической расшифровки ГБМ, основанными на ПЦР, разработанный комплекс молекулярно-биологических методических подходов обеспечивает получение данных о видовых, антигенных и генетических свойствах возбудителей, содержащихся в клиническом материале, без использования микробиологических методов исследования, что сокращает время анализа для оперативного получения эпидемиологически значимой информации.

Внедрение результатов

Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-методических документов, аналитических обзоров и научных исследований, посвящённых мониторингу возбудителей и эпидемиологическому надзору за ГБМ. Результаты исследований были использованы при составлении следующих нормативных документов Роспотребнадзора:

1. Письмо №01/9620-0-32 от 29.06.2010 «О взаимодействии территориальных органов и учреждений Роспотребнадзора с Референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами».

2. Научно-практическая работа «Определение особенностей менингококкового носительства в очагах менингококковой инфекции», выполненная в соответствии с письмом №17-12/517 от 22.08.2007 Управления Роспотребнадзора по Москве. М., 2011. - 49 с.

3. Письмо №01/10303-12-32 от 12.09.2012 «О результатах мониторинга за заболеваемостью менингококковой инфекцией и бактериальными менингитами в Российской Федерации в 2011 г.».

4. Информационно-аналитический обзор «Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации 2012 год». М.: Российский референс-центр по мониторингу за бактериальными менингитами при ФБУН «Центральном НИИ эпидемиологии», 2013. - 54 с.

5. Приказ №798 Роспотребнадзора от 25.07.2014 «О совершенствовании эпидемиологического надзора и профилактики гнойных бактериальных менингитов в Российской Федерации».

6. Информационно-аналитический обзор «Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации 2013 год». М.: Российский референс-центр по мониторингу за бактериальными менингитами при ФБУН «Центральном НИИ эпидемиологии», 2014. - 31 с.

7. Методические рекомендации МР 4.2.0114-16 «Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии, 2016. - 57 с.

Апробированные при проведении исследования методические подходы и итоговые материалы работы используются в лекционном материале сертификационных курсов усовершенствования «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний», проводимых на базе ФБУН «Центрального НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, и сертификационных курсах усовершенствования по специальности «Бактериология», проводимых НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии.

Публикации

Результаты исследования были опубликованы в 101 научной работе, в том числе в 32 статьях, из которых 29 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 глава в практическом руководстве.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационного исследования послужили труды отечественных и зарубежных специалистов по эпидемиологии ГБМ. Проанализированы клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности ГБМ различной этиологии, которые легли в основу выработанных подходов для молекулярно-биологического мониторинга возбудителей с целью их использования в практике эпидемиологического надзора за ГБМ.

При разработке молекулярно-биологических методических подходов использован опыт исследователей, посвященный внедрению способов внутривидовой классификации возбудителей в практику эпидемиологического надзора за ГФМИ и инвазивными формами инфекций, вызываемых S. pneumoniae и H. influenzae. Для разработки способов определения капсульных антигенов возбудителей использован метод ПЦР-РРВ как наиболее

оптимальный, доступный и широко распространенный в практике клинических лабораторий. При создании подходов для генетической характеристики приоритет был отдан методам, основанным на секвенировании ДНК, поскольку только в этом случае результат исследования обладает абсолютной межлабораторной сопоставимостью и позволяет обозначить клональные комплексы в соответствии с уже имеющимися данными, тем самым обеспечивая информацию для ретроспективного и проспективного эпидемиологического анализа.

В работе применены общенаучные подходы и специальные методы научного познания классической эпидемиологии (описательные и аналитические эпидемиологические методы), а также статистические методы. Ретроспективный и проспективный эпидемиологический анализ проводился с использованием официальных данных о заболеваемости ГФМИ и доступных данных последних исследований о заболеваемости ГБМ неменингококковой этиологии. При проведении анализа использованы антигенные, генетические, микробиологические и эпидемиологические данные их международных баз данных, интегрирующих сведения об источниках и результатах генотипирования основных возбудителей ГБМ.

Положения, выносимые на защиту

1. Молекулярно-биологические подходы для антигенной и генетической характеристики возбудителей ГБМ обеспечивают накопление необходимых данных о свойствах возбудителей и являются инструментами, позволяющими усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за ГБМ.

2. Определение капсульных антигенов N. meningitidis и S. pneumoniae с помощью ПЦР-РРВ является быстрым и удобным способом характеристики нежизнеспособных возбудителей в исследуемом клиническом материале, увеличивающим накопление эпидемиологически значимой информации для планирования иммунопрофилактических мероприятий и контроля их эффективности.

3. В масштабах наблюдаемой территории подтверждено, что метод МЛСТ позволяет определять клональные комплексы основных возбудителей ГБМ, циркулирующих на различных территориях, выявлять генетические взаимосвязи возбудителей и определять их роль в эпидемическом процессе.

4. Генетическая характеристика, осуществляемая с помощью МЛСТ, является основным инструментом мониторинга эпидемически значимых возбудителей вида N. meningitidis и дополнительным инструментом характеристики возбудителей ГБМ неменингококковой этиологии.

5. Определены дальнейшие направления молекулярно-биологического мониторинга основных возбудителей ГБМ, вовлеченных в эпидемический процесс на территории России.

Степень достоверности и апробация результатов

Достаточный объем данных, полученных от больных ГФМИ и менингитами неменингококковой этиологии в течение этапов проведенного исследования, высокая информативность используемых молекулярно-биологических методов для получения результатов антигенной и генетической характеристики изучаемых штаммов. Использование секвенирования ДНК возбудителей как наиболее точного метода определения всех возможных генетических изменений в популяциях микроорганизмов. В результате использования разработанных методических подходов осуществлена возможность объединения и сопоставления полученных данных с результатами, опубликованными в международных базах данных, содержащих значительный объем информации о возбудителях, вовлеченный в эпидемический процесс на других территориях. В исследовании применены современные программные и информационные технологии для проведения генетического анализа и сопоставления полученных результатов с имеющимися данными других исследователей в рамках проведения ретроспективного и проспективного анализа эпидемиологически значимой информации. Сформулированные выводы

и практические рекомендации достаточно аргументированы и логически вытекают из результатов исследования.

При проведении работы материалы диссертационного исследования регулярно представлялись на российских и зарубежных конференциях: VIII, IX и X Всероссийских съездах научно-практического Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002, 2007, 2012), 13th, 16th и 18th International Pathogenic Neisseria Conference (Oslo, 2002; Rotterdam 2008; Wurzburg, 2012), Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002, 2004, 2007), I и II Российских конференциях «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва, 2004, 2008), 4th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Warsaw, 2005), XIV и XXIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2016), 9th Meeting of The European Monitoring Group on Meningococci (Rome, 2007), Всероссийской научной конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009), II, III, IV, V и VII Ежегодных Всероссийских конгрессах по инфекционным болезням (Москва, 2010, 2011, 2012, 2013, 2015), Всероссийских научно-практических конференциях c международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2010, 2014), III Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (Астрахань, 2012), 3-й Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы бактериальных и вирусных менингитов» (Москва, 2012), Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013), Научно-практической конференции «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2013), Межведомственных научно-практических конференциях «Инфекционные болезни - актуальные проблемы, методы борьбы и профилактика» (Москва, 2015, 2016), Международной научно-практической

конференции «Перспективы сотрудничества государств - членов Шанхайской организации сотрудничества в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сочи, 2015) и 115th General Meeting of the American Society for Microbiology (New Orleans, 2015).

Материалы диссертационного исследования были доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на заседании Ученого совета ФБУН «Центрального НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора 18 октября 2016 года.

Личный вклад автора

Автором были выполнены планирование этапов исследования, анализ данных литературы, выбор современных направлений молекулярно-биологического мониторинга возбудителей ГБМ, разработка и апробация соответствующих методик. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений некоторых этапов исследований, обработке всех полученных экспериментальных данных, их публикации в международных базах данных, анализе и обобщении полученных результатов.

Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментальной и теоретической реализации до обсуждения и публикации результатов и их внедрения в практику.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Миронов Константин Олегович, 2018 год

Источник:

Больной ГФМИ 20844 (65,8)

Здоровый носитель 6574 (20,8)

Нет данных 4248 (13,4)

Возраст

<5 лет 4429 (14)

>5 лет 12066 (24,1)

Нет данных 19600 (61,9)

Определение принадлежности N. meningitidis к клональным комплексам проведено в соответствии с номенклатурой, принятой в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/. На момент окончания настоящего исследования в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ было определено 54 клональных комплекса для бактерий рода Neisseria, из них для вида N. meningitidis был определен 51 клональный комплекс [144]. Для NmA при анализе результатов также была использована классификация, предложенная в [129].

При анализе эпидемиологических параметров ГФМИ использована информация о клональных комплексах N. meningitidis, доступная через основной Интернет-ресурс Neisseria.org [197], посвященный характеристике N. meningitidis и содержащий данные эпидемиологического надзора за МИ в странах Европы и Америки.

2. 4. 1. 2 Анализ результатов генотипирования S. pneumoniae

База данных http://pubmlst.org/spneumoniae/ содержит информацию о сиквенс-типах S. pneumoniae в совокупности с результатами фенотипической характеристики: определения серотипа и определения чувствительности к основным антибиотикам (охарактеризована большая часть изолятов). Некоторые параметры S. pneumoniae, информация о которых содержится в базе данных http://pubmlst.org/spneumoniae/, представлены в таблице.

База данных http://pubmlst.org/spneumoniae/ содержала информацию о 187 российских изолятах, охарактеризованных в других отечественных и зарубежных исследованиях. Некоторые характеристики изолятов S. pneumoniae, опубликованных в базе данных http://pubmlst.org/spneumoniae/ представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Характеристики S. pneumoniae, информация о которых содержится в базе

данных http://pubmlst.org/spneumoniae/

Параметры Количество изолятов (%)

Серотип:

19А 3751 (12,4)

19Б 2477 (8)

6В 2115 (7)

14 1980 (7)

23Б 2110 (7)

6А 1848 (6)

1 1401 (4,7)

3 1069 (3,5)

6С 732 (2,4)

Другой 11091 (37)

Бескапсульные изоляты или 1547 (5)

серотип не определен

Годы выделения:

2000-2015 22855 (76)

1980-1999 3361(11)

1960-1979 85 (0,3)

До 1959 52 (0,2)

Нет данных 3798 (12,5)

Параметры Количество изолятов (%)

Территория:

Россия 281 (1)

Европа 9787 (32,5)

Азия 8259 (27)

Африка 5921 (20)

Северная Америка 4329 (14,4)

Южная Америка 979 (3,2)

Другая или нет данных 565 (1,9)

Источник:

СМЖ или кровь 2300 (6)

Здоровый носитель 5321 (18)

Другой 1191 (4)

Нет данных 21712(72)

Возраст

<5 лет 11219 (37,2)

>5 лет 4958 (16,5)

Нет данных 13944 (46,3)

Классификация и обозначение клонов S. pneumoniae, ассоциированных с резистентностью, проведено согласно номенклатуре, предложенной Pneumococcal Molecular Epidemiology Network [185, 203].

2. 4. 1. 3 Анализ результатов генотипирования H. influenzae

База данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/ содержит информацию о сиквенс-типах H. influenzae в совокупности с данными о чувствительности к антибиотикам и результатами характеристики методом МЛЭЭ (данные параметры указаны не для всех изолятов). База данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/ включает результаты МЛСТ H. influenzae всех

серотипов, а также данные о типировании бескапсульных штаммов. База данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/ содержит информацию о 615 изолятах Hib. Другие серотипы представлены изолятами серотипа a (48 изолятов), с (14 изолятов), d (21 изолят), e (45 изолята), f (55 изолятов); 1581 изолятов относятся к нетипируемым (бескапсульным) или данные об их серотипе отсутствуют. Некоторые эпидемиологические параметры изолятов Hib, информация о которых содержится в базе данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/, представлены в таблице.

На момент начала настоящего исследования база данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/ не содержала информацию о H. influenzae, циркулировавших на территории России. Некоторые характеристики изолятов Hib, опубликованных в базе данных http://pubmlst.org/hinfluenzae/ представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Характеристики изолятов Hib, информация о которых содержится в базе

данных http: //pubml st. org/hinfluenzae/

Параметры Количество изолятов (%)

Годы выделения:

2000-2015 428 (69,6)

1980-1999 146 (23,7)

До 1980 3 (0,5)

Нет данных 38 (6,2)

Параметры Количество изолятов (%)

Территория:

Россия 116 (18,9)

Европа 307 (49,9)

Азия 64 (10,4)

Африка 54 (8,8)

Северная Америка 54 (8,8)

Южная Америка 12 (1,9)

Другая или нет данных 8 (1,3)

Клинический материал, содержащий

возбудитель: 474 (77,1)

СМЖ или кровь 96 (15,6)

Другой 45 (7,3)

Нет данных

Источник:

Больной ГБМ или сепсисом, или пациент с 401 (65,2)

бактериемией

Другой диагноз 48 (7,8)

Здоровый носитель 41 (6,7)

Нет данных 125 (20,3)

Возраст

<5 лет 373 (60,6)

>5 лет 84 (13,7)

Нет данных 158 (25,7)

2. 4. 2 Антигенная характеристика белков наружной мембраны

N. meningitidis

Антигенная характеристика вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis проведена на основании секвенирования нуклеотидных

последовательностей, соответствующих вариабельным фрагментам УЯ1 и УЯ2 белка РогА и на основании секвенирования нуклеотидных последовательностей, соответствующих вариабельному фрагменту УЯ белка Бе1А. Анализ аллелей УЯ1 и УЯ2 (РогА) проводился с использованием базы данных http://pubmlst.org/neisseria/PorA/ [208], анализ аллелей УЯ (FetA) - с использованием базы данных http://pubmlst.org/neisseria/FetA/ [221]. База данных для фрагмента УЯ1 (РогА) содержала 258 аллелей, для фрагмента УЯ2 (РогА) -723 аллеля, для фрагмента УЯ (FetA) - 457 аллеля. Алгоритм определения аллелей вариабельных фрагментов БНМ принципиально не отличался от алгоритма, использованного при работе с базами данных МЛСТ: после обработки результатов секвенирования проводилось обозначение аллелей с помощью соответствующих программных ресурсов, доступных через соответствующие ресурсы http://pubmlst.org/neisseria/PorA/ и

http://pubmlst.org/neisseria/FetA/ [170, 221]. Присвоение номеров аллелей для впервые обнаруженных последовательностей осуществлялось в процессе работы кураторами соответствующих Интернет-ресурсов.

2. 5 Эпидемиологические методы

В работе использованы традиционные описательно-оценочные эпидемиологические методы: ретроспективный и оперативный анализ, а также аналитические методы. Для ретроспективного и оперативного (проспективного) эпидемиологического анализа использована информация о заболеваемости, которая включала данные официальной регистрации случаев ГФМИ и результаты оценки заболеваемости ГБМ неменингококковой этиологии в локальных исследованиях, выполненных преимущественно в ФБУН «Центральном НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, а также данные об антигенных и генетических свойствах циркулировавших ранее и циркулирующих на момент проведения исследования возбудителях. Основой для проведения эпидемиологического анализа являлась информация об источниках возбудителей и их внутривидовой характеристике (антигенных и генетических свойствах), аккумулированная с помощью специализированных баз данных, подробно описанных в разделе 2. 4.

Аналитические методы были использованы для выявления взаимосвязей и поиска ассоциаций между показателями заболеваемости ГБМ и циркулирующими возбудителями на основании их антигенных свойств и генетических характеристик (сиквенс-типов и клональных комплексов), которые были обозначены с помощью комплекса разработанных молекулярно-биологических методических подходов.

2. 6 Статистические методы

Статистические методы были использованы при разработке и апробации молекулярно-биологических методик, обработке и анализе данных. Часть статистических методов была реализована в специализированном программном обеспечении при работе с оборудованием для проведения молекулярно-биологических исследований (см. раздел 2. 2). Другая часть статистических методов была реализована через различные опции специализированного программного обеспечения для генетического анализа и классификации полученных результатов, выполненных на основании определенных нуклеотидных последовательностей и аллельных профилей (см. раздел 2. 3), а также через программные возможности использованных Интернет-ресурсов для анализа эпидемиологических данных (см. разделы 2. 4). Обработка и анализ данных выполнялись с использованием прикладных программ Microsoft Office (электронной таблицы Excel и базы данных Access). Для статистического анализа полученных результатов использованы программные возможности Excel и статистический пакет SPSS 11.0.1.

Для описания генетического разнообразия и характеристики применяемого способа проведения генотипирования был использован индекс разнообразия по Симпсону (численный индекс дискриминации) - вероятность того, что два разных микроорганизма из одной популяции имеют разные генотипы (сиквенс-типы), рассчитанный согласно [164].

На различных этапах работы для подбора адекватных статистических процедур, интерпретации полученных результатов и выбора способов их представления использовались методические подходы, описанные в монографии А.Е. Платонова «Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы» (ISBN: 5-7901-0022-8).

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДИК ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ КЛАССИФИКАЦИИ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГБМ

Важной составляющей молекулярно-биологического мониторинга возбудителей ГБМ является использование общепринятых регламентированных подходов для характеристики антигенных и генетических свойств возбудителей при характеристике параметров эпидемического процесса на субклеточном (молекулярно-генетическом) уровне [118, 119], поскольку только в этом случае обеспечивается накопление и объединение всех данных, необходимых для проспективной оценки эпидемической ситуации. С этой целью в рамках данного исследования были разработаны основанные на ПЦР методики для антигенной и генетической характеристики возбудителей ГБМ с использованием комплекса стандартных молекулярно-биологических методов, описанных в главе «Материалы и методы».

Разработанные в рамках данного исследования методики для молекулярно-биологического мониторинга возбудителей ГБМ можно разделить на две группы. Первая группа методик предполагает проведение ПЦР с детекцией результата амплификации специфических фрагментов генов, кодирующих биосинтез капсульного полисахарида, с целью определения капсульных антигенных вариантов N. meningitidis и S. pneumoniae, как основного элемента микробиологического мониторинга этих возбудителей. Вторая группа методик основана на использовании результатов секвенирования бактериальной ДНК для проведения генотипирования основных возбудителей ГБМ методом МЛСТ и антигенной характеристики вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis согласно существующим требованиям для обозначения представителей этого вида [157, 168, 190].

3. 1 Определение капсульных антигенов

Обязательным элементом характеристики бактерий видов N. meningitidis и S. pneumoniae является определение антигенных свойств основного фактора вирулентности этих микроорганизмов - капсульного полисахарида. Для этого могут быть использованы основанные на ПЦР методики, направленные на выявление специфических нуклеотидных последовательностей фрагментов генов, вовлеченных в биосинтез капсульного полисахарида [161, 183, 188, 198].

3. 1. 1 Серогруппирование N. meningitidis

Для определения серогрупповой принадлежности N. meningitidis разработана методика, основанная на ПЦР-РРВ (см. главу «Материалы и методы»). Методика основана на амплификации и детекции при помощи флуоресцентно меченых зондов серогрупп-специфических мишеней в геноме N. meningitidis [161, 188, 224]. Формат проведения ПЦР-РРВ позволяет детектировать несколько мишеней в одной реакционной смеси, поэтому в данной разработке, помимо основных эпидемиологически значимых капсульных антигенов серогрупп А, В и С, эта возможность была использована для детекции серогрупп-специфических мишеней для NmW, данные о циркуляции которых на территории России немногочисленны. Выбранные для этой цели олигонуклеотиды и соответствующие серогрупп-специфические мишени (фрагменты генов) представлены в таблице I приложения 1. До проведения данной работы существующие основанные на ПЦР методики не предполагали использования одной реакционной смеси с целью определения всех эпидемиологически значимых (для территории России) капсульных антигенов N. meningitidis и одновременной детекции положительного внутреннего контроля присутствия ДНК возбудителя.

Дизайн методики для определения серогрупп N. meningitidis методом ПЦР-РРВ выглядит следующим образом: реакционная смесь содержит смесь из 5 пар праймеров и 5 зондов для определения четырех серогрупп и амплификации

пятой мишени - положительного внутреннего контроля, в качестве которого выступает фрагмент ДНК, являющейся диагностической мишенью для определения вида N. meningitidis. Продукт амплификации, соответствующий NmA, детектируется по каналу детекции для флуорофора FAM, NmB - по каналу детекции для флуорофора R6G, NmC - по каналу детекции для флуорофора ROX, NmW - по каналу детекции для флуорофора Cy5. По пятому каналу детекции для флуорофора Cy5.5 детектируется продукт амплификации фрагмента гена ctrA, являющегося диагностической мишенью в наборе реагентов «АмплиСенс N. meningitidis / H. influenzae / S. pneumoniae - FL» (см. главу «Материалы и методы»), и присутствующего у всех N. meningitidis, имеющих капсулу [127, 161, 236]. Таким образом, с использованием предложенного подхода проводится определение четырех наиболее эпидемиологически значимых серогрупп N. meningitidis в одной реакции, и дополнительно подтверждается наличие (отсутствие) ДНК возбудителя в анализируемом образце. Использование в реакционной смеси положительного внутреннего контроля позволяет оценить вклад в эпидемический процесс представителей других (ни А, ни B и ни С) и редких (ни W) серогрупп N. meningitidis.

Аналитическая специфичность методики была проанализирована с использованием восьми штаммов N. meningitidis серогрупп А, B, С, E, W, X, Y и Z из коллекции Российского референс-центра по мониторингу за бактериальными менингитами (руководитель - д.м.н. И.С. Королева), а также некоторых штаммов других потенциальных возбудителей ГБМ (S. pneumoniae, Hib, Streptococcus agalactiae и Listeria monocytogenes); ложноотрицательных и ложноположительных результатов получено не было. Генетические и антигенные характеристики использованных референсных штаммов N. meningitidis опубликованы в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/, идентификационные номера штаммов - 20707-20714.

Аналитическая чувствительность для всех четырех серогрупп, оцененная с помощью разведений, приготовленных из ДНК соответствующих референсных

штаммов, составила 104 копий на 1 мл образца. Значения пороговых циклов для концентрации, соответствующей 104 копий на 1 мл образца, измеренные в десяти повторах, находились в диапазоне от 34 до 38,5. Заявленной чувствительности достаточно для определения серогрупп N. meningitis в клинических образцах СМЖ, полученной от больных ГБМ [107, 115]. Пример результатов определения серогрупп N. meningitis с помощью данной методики представлен на рисунке 3.

Клиническая апробация методики проведена в рамках микробиологического мониторинга N. meningitidis, вызвавших ГБМ на территории Москвы в 2007-2010 годах. В качестве метода сравнения, в первую очередь для оценки аналитической специфичности, использован набор реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С - EPh» (см. главу «Материалы и методы»). Проведенное исследование не выявило ложноположительных результатов, подтвердило стандартные преимущества метода ПЦР-РРВ и позволило определить большее количество серогрупп в исследованной выборке как за счет более высокой чувствительности, так и за счет возможности определения серогруппы W; присутствие дополнительной мишени - положительного внутреннего контроля присутствия ДНК N. meningitidis, снижает вероятность ошибок при постановке ПЦР. Результаты клинической апробации и эпидемиологический анализ выявленных серогрупп представлены в разделе 4. 1.

Рисунок 3. Определение серогрупп А, B, C и W N. meningitidis с помощью методики ПЦР-РРВ на приборе «RotorGeneQ» («Qiagen», Германия).

Кривые, пересекающие пороговую линию, соответствуют положительным пробам, содержащим ДНК серогрупп: А - детектируются по каналу Green (I), B - детектируются по каналу Yellow (II), C - детектируются по каналу Orange (III) и W - детектируются по каналу Red (IV); все пробы, содержащие ДНК N. meningitidis - детектируются по каналу Crimson (V).

3. 1. 2 Серотипирование S. рneumoniae

Для определения серогрупп и серотипов S. pneumoniae в рамках данного исследования было разработано две методики, основанные на амплификации и детекции серотип-специфических мишеней в бактериальном геноме. Первая методика (ПЦР-ЭФ) основана на использовании праймеров, созданных на основании подхода, предложенного R. Pai et al. [198], и широко апробированных в различных зарубежных исследованиях. Цель создания собственной методики заключалась в оптимизации проведения ПЦР для увеличения количества одновременно определяемых мишеней и в адаптации существующих подходов для определения серологических вариантов S. pneumoniae, вовлеченных в эпидемический процесс на территории России. Вторая методика (ПЦР-РРВ) является оригинальной разработкой, направленной на широкое внедрение оптимального лабораторного алгоритма определения серологических вариантов S. pneumoniae в лабораторную практику; принципиальные отличия методик заключаются в способе детекции продуктов амплификации и спектре определяемых серотипов.

3. 1. 2. 1 ПЦР-ЭФ методика для определения серотипов

На первом этапе работы была проведена адаптация методик, основанных на ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации серотип-специфических локусов генома S. pneumoniae с праймерами, рекомендованными агентством министерства здравоохранения США «Центры по контролю и профилактике заболеваний» (Centers for Disease Control and Prevention) [200]. С этой целью было отобрано 24 пары праймеров, которые были распределены по четырем реакционным смесям (№ 1-4), состав реакционных смесей представлен в таблице II приложения 1. Последовательности праймеров и аналитическая специфичность методик, в которых они были апробированы, опубликованы в [139, 146, 198, 202].

Методика амплификации с праймерами, представленными в в таблице II приложения 1, и условия проведения электрофореза описаны в главе «Материалы и методы».

При выборе праймеров для детекции серотип-специфических ДНК-мишеней и распределении их по реакционным смесям использовались следующие соображения. Во-первых, методика должна обеспечить возможность детекции всех серотипов, входящих в 10- и 13-валентные конъюгированные вакцины. Во-вторых, длины амплифицируемых фрагментов для разных серотипов должны отличаться друг от друга на достаточное количество нуклеотидов, позволяющее их дифференцировать (разделять) методом электрофореза в агарозном геле. И, в-третьих, предпочтение отдавалось серотипам S. pneumoniae, выявляемым преимущественно, по литературным данным, от больных инвазивными формами ПИ.

Методика была испытана на коллекции штаммов S. pneumoniae, собранных в рамках исследований серии «ПеГАС» [28], в качестве метода сравнения использован набор «Pneumotest-Latex» (Statens Serum Institut, Дания). В исследуемой выборке было найдено 18 серотипов S. pneumoniae: 2, 3, 4, 6A, 6B, 7FA, 8, 9NL, 9VA, 11AD, 14, 15AF, 15BC, 18ABCF, 19F, 22FA, 23B, 23F, дискордантных или ложноотрицательных результатов получено не было. Некоторые лабораторные детали апробации методики и один из вариантов оптимального проведения анализа описаны в [80]. Примеры результатов определения серотипов с помощью методики представлены на рисунке 4.

Рисунок 4. Определение серотипов S. pneumoniae с помощью ПЦР-ЭФ методики.

«М» - маркер молекулярных масс, 1-8 - образцы, «К-» - отрицательный контроль. При постановке с реакционной смесью №1 (I) детектируется положительный сигнал для образцов 2 - серотип 18ABCF (573 п. о.), 4 - серотип 6ВА (250 п.о.) и 8 - серотип 19F (304 п.о.). При постановке с реакционной смесью №2 (II) детектируется положительный сигнал для образцов 1 и 5 - серотип 9VA (816 п.о.). При постановке с реакционной смесью №3 (III) детектируется положительный для образцов 1 - серотип 9NL (516 п.о.), 6 - серотип 3 (371 п.о.) и 7 - серотип 4 (430 п.о.). При постановке с реакционной смесью №4 (IV) детектируется положительный сигнал для образцов 1 - серотип 15BC (496 п.о.) и 3 - серотип 15 AF (434 п.о.). Стрелкой показан продукт амплификации фрагмента гена cpsA (160 п.о.).

3. 1. 2. 2 ПЦР-РРВ методика для определения серотипов

В основе ПЦР-ЭФ методики с праймерами, рекомендованными [200], лежит использование апробированных ранее методик [139, 146, 198, 202] с известной аналитической специфичностью, для соответствующих серотип-специфических мишеней в геноме S. pneumoniae, что является ключевым преимуществом данного подхода. В то же время использование метода ПЦР-ЭФ имеет ряд недостатков, среди которых можно отметить возможные сложности при визуальной интерпретации результатов электрофореза, неодинаковую чувствительность для серотип-специфических мишеней, обусловленную необходимостью амплификации мишеней разной длины, а также стандартные сложности, связанные с лабораторным использованием метода ПЦР-ЭФ [24]. Существенным ограничением использования ПЦР-ЭФ методик [139, 146, 198, 202] и протоколов исследований, рекомендованных [200], в лабораторной практике является материал для исследования: данные подходы предполагают исследование ДНК, выделенной из штаммов, а не из клинического материала, содержащего ДНК S. pneumoniae. С целью избежать сложностей, связанных с лабораторным применением методики ПЦР-ЭФ, а также с учетом необходимости определения серотипов S. pneumoniae в клиническом материале нами была разработана оригинальная методика, основанная на ПЦР-РРВ. При разработке методики также принималось во внимание удобство постановки ПЦР: каждая ПЦР-смесь содержала максимальное количество серотип-специфических мишеней (которое было ограничено только количеством каналов флуоресцентной детекции прибора), а также положительный внутренний контроль присутствия ДНК S. pneumoniae. Первые две ПЦР-смеси содержали серотип-специфические мишени для детекции наиболее часто распространенных серотипов S. pneumoniae, ассоциированных с ГБМ.

На основании анализа серотип-специфических генетических локусов были выбраны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченые зонды для определения 16 серотипов S. pneumoniae, представленные в таблице III приложения 1 . Для детекции некоторых серотип-специфических мишеней были

использованы праймеры, опубликованные в предыдущих исследованиях; необходимость перевыбора праймеров связана с изменением способа детекции продукта амплификации - проведением ПЦР-РРВ. Некоторая часть праймеров для методики ПЦР-РРВ была разработана ранее в исследованиях [139, 198, 202] и не была изменена в данной методике. При выборе альтернативных праймеров для амплификации всех серотип-специфических мишеней использованы локусы бактериального генома, включающие сайты отжига соответствующих праймеров, рекомендованных [200]. При проведении ПЦР-РРВ в формате «мультипрайм» олигонуклеотиды для детекции серотип-специфических мишеней были распределены по четырем реакционным смесям: реакции № 1-4. В каждой реакционной смеси содержалось пять пар праймеров и пять зондов для определения четырех серотипов S. pneumoniae и детекции фрагмента гена cpsA, присутствующего у всех капсульных S. pneumoniae (см. таблицу III приложения 1 ). Постановка ПЦР-РРВ и интерпретация результатов описаны в главе «Материалы и методы». Продукты амплификации серотип-специфических мишеней детектируются по четырем каналам флуоресценции для флуорофоров FAM, R6G, ROX и Cy5 в соответствии с серотип-специфичными зондами, представленных в таблице III приложения 1 ; детекция продукта амплификации фрагмента гена cpsA проводится по каналу для флуорофора Cy5.5.

Для определения аналитической специфичности проведено тестирование 108 коллекционных штаммов S. pneumoniae (см. главу «Материалы и методы»), охарактеризованных также c помощью ПЦР-ЭФ методики в [80]. Ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР-РРВ для 14 исследованных серотипов выявлено не было. Возможность и специфичность определения методикой серотипа 2 подтвердить не удалось ввиду отсутствия контрольных штаммов. Клиническая апробация методики проведена в рамках микробиологического мониторинга S. pneumoniae, вызвавших ГБМ на территории Москвы. В качестве метода сравнения использована ПЦР-ЭФ методика для определения серотипов S. pneumoniae с праймерами, рекомендованными [200] (см. раздел 3. 1. 2. 1). Результаты клинической

апробации и эпидемиологический анализ выявленных серотипов представлены в разделе 4. 2.

Одним из вариантов модификации разработанной методики ПЦР-РРВ является вариант анализа с использованием оборудования для проведения ПЦР-РРВ с шестью каналами флуоресцентной детекции, которое позволяет применить разработанные серотип-специфические праймеры и зонды оптимальным образом. На первом этапе анализа используется две реакции в формате «мультипрайм», содержащие праймеры и зонды для выявления наиболее частых или актуальных для решения той или иной задачи серотип-специфических мишеней. Например, первая реакция может содержать праймеры и зонды для серотипов 3, 6ВА, 19Б, 4 и 18, и вторая реакция - праймеры и зонды для серотипов 1, 23Б, 11АО и 14. В данной модификации пять серотип-специфических зондов метятся флуорофорами БАМ, ЯбО, ЯОХ, Су5 и Су5.5, а зонд для детекции фрагмента гена ервА - флуорофором А1еха350. В случае если в обеих реакциях серотип не определяется и детектируется сигнал, соответствующий амплификации фрагмента гена ервА, может быть проведено дополнительное исследование с целью обнаружения других серотип-специфических мишеней методом ПЦР-ЭФ или ПЦР-РРВ с использованием соответствующих олигонуклеотидов, не включенных в эти реакции [89]. Результаты определения серотипов с помощью описанной модификации методики ПЦР-РРВ представлены на рисунке 5.

Рисунок 5. Определение серотипов S. pneumoniae с помощью модификации методики ПЦР-РРВ на приборе «RotorGeneQ» («Qiagen», Германия) с шестью каналами флуоресцентной детекции.

Пунктирные кривые (так же отмечены знаком «*») соответствуют реакции для определения серотипов 3, 6BA, 19F, 4 и 18, сплошные - реакции для определения серотипов 1, 9NL, 23F, 11AD, и 14. Кривые, пересекающие пороговую линию, соответствуют пробам, содержащим ДНК серотипов: 3 и 1 -детектируются по каналу Green (I), 6BA (в данной постановке не выявлен) и 9NL - детектируются по каналу Yellow (II), 19F и 23F - детектируются по каналу Orange (III) и 4 и 11AD - детектируются по каналу Red (IV); 18 и 14 -детектируются по каналу Orange (III), 4 и 11AD - детектируются по каналу

Crimson (V), все пробы, содержащие ДНК инкапсулированных S. pneumoniae -детектируются по каналу Blue (VI).

3. 1. 2. 3 Методика для дифференциации серотипов 6А и 6B

Предложенная [198, 200] ПЦР-ЭФ методика, основанная на использовании праймеров 6A/6B/6C-f и -r, предполагает амплификацию фрагмента гена wciP, общего для серотипов 6A и 6B. Амплифицируемый фрагмент гена wciP длиной 250 п.о. обладает высокой степенью гомологии для серотипов, и содержит около шести замен, позволяющих отличать нуклеотидные последовательности, соответствующие серотипам 6А и 6B. В работе [199] предложена методика для определения двух несинонимичных нуклеотидных замен с целью дифференциации серотипов 6А и 6B. Методика предполагает применение технологии пиросеквенирования [79, 199, 207].

Для определения нуклеотидных замен с помощью пиросеквенирования предложена методика, в которой используется биотинилированный праймер 6A/6B/6C-f и праймеры 6A/6B/6C-f (для ПЦР-ЭФ методики) или 6AB-RS (для ПЦР-РРВ методики). Проведение пиросеквенирования осуществляется после проведения реакции амплификации с праймерами для серотипа 6 (см. таблицы II и III приложения 1). Для секвенирования использовался праймер с последовательностью AgTgCAAACTTTgCAAAA (0,3 мкМ); порядок подачи нуклеотидов в реакцию пиросеквенирующего синтеза следующий: CTGACTATCATGAGACAGTTC. Для проведения реакции пиросеквенирования используются реагенты и оборудование фирмы «Qiagen» (Германия), все действия проводилось по методике, описанной в [79]; интерпретация результатов проводилась согласно [199]. Предлагаемая методика позволяет проводить дифференциацию серотипов после постановки ПЦР-РРВ (см. раздел 3. 1. 2. 2) с использованием имеющегося оборудования без дополнительного этапа ПЦР по ранее предложенной методике [199]. Пример дифференциации серотипов 6A и 6B с использованием пиросеквенирования представлен на рисунке 6.

серотип 6А

В2: ТААО TTATCATGAGAJ CCA GiTTTTT CT ATATATAAATA AT CT

500 400 300 200 100

С: Т: 100% 0% О 1> i% 99%

............ ............ ..........................

i i

.....................................1.................

_—1— К

E S С TGA СТА TCA TGAGACAGTTC

5 10 15 20

серотип 6B

500 400 300 200

100 □

С : 1% Т: 99% А: С: 100% 1%

1

1 i

' ;................it................ 1 к

ESCTGACTATCATGAGACAGTTC

5 10 15 20

Рисунок 6. Пример дифференциации серотипов S. рпеишошае 6A и 6B с использованием пиросеквенирования. На сиквенсе выделены и отмечены стрелками полиморфные позиции нуклеотидной последовательности, позволяющие различать эти серотипы согласно [199].

3. 2 Методики, основанные на секвенировании

Секвенирование используется для генотипирования микроорганизмов с помощью МЛСТ и проведения антигенной характеристики вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis. Секвенирование проводится с использованием реагентов и оборудования, указанных в главе «Материалы и методы». При выполнении подобных задач могут быть использованы опубликованные протоколы, например [150, 180, 186], или их частичные модификации, доступные, например, на Интернет-ресурсах, посвященных МЛСТ соответствующих микроорганизмов [190, 206]. Принципиальным требованием при разработке собственных методик была возможность использования для исследования клинического материала, содержащего ДНК возбудителей.

При разработке методик были соблюдены все основные требования, предъявляемые для проведения МЛСТ возбудителей ГБМ и характеристики вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis, главное из которых - получение результатов секвенирования нуклеотидных последовательностей заданных локусов надлежащего качества на протяжении строго определенной длины, согласно принятой номенклатуре для обозначения соответствующих аллелей [190, 206]. Некоторая часть особенностей и непринципиальных модификаций, использованных протоколов для молекулярно-биологических методик, отражена в главе «Материалы и методы». Принципиальным изменением является выбор альтернативных пар праймеров и использование собственного протокола амплификации. Выбор праймеров был продиктован необходимостью увеличения специфичности и эффективности амплификации при работе с клиническим материалом, удобством, связанным с использованием одинаковых праймеров для проведения ПЦР и секвенирующей амплификации, а также собственным опытом проведения оптимизации ПЦР с использованием имеющегося в распоряжении лабораторного оборудования. При разработке методик для характеристики аллелей вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis основное условие при дизайне праймеров заключалось в необходимости отжига праймеров на последовательностях, соответствующих

трансмембранным участкам БНМ, предсказанных согласно [145, 229] для PorA и [221] для FetA. Нуклеотидные последовательности, кодирующие трансмембранные участки БНМ, являются достаточно консервативными для снижения вероятности неудачного отжига праймеров при постановке амплификации. Все праймеры, использованные в данной работе для проведения МЛСТ и антигенной характеристики, отличаются от праймеров, предложенных ранее: одни праймеры были частично модифицированы, другие выбраны заново.

3. 2. 1 Мультилокусное секвенирование-типирование

МЛСТ для основных возбудителей ГБМ основано на анализе фрагментов семи генов. Выбор фрагментов генов и характеристика их нуклеотидных последовательностей впервые были осуществлены в оригинальных схемах МЛСТ, опубликованных в работах [180] для N. meningitidis, [150] для S. pneumoniae и [186] для Hib. Праймеры для амплификации и секвенирования соответствующих фрагментов генов представлены в приложении 2.

Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов генов adk, fucK, mdh, pgi и recA (МЛСТ Hib) сконструированы Г.А. Шипулиным. Дизайн праймеров для фрагментов генов atpG и frdB (Hib) заключался в частичной модификации праймеров, предложенных в [81, 186]. Условия проведения ПЦР подбирались стандартным образом. Оптимальная температура отжига праймеров выбрана эмпирически. Методические подробности оптимизации ПЦР для амплификации фрагментов генов Hib и N. meningitidis изложены в исследовании [81], оптимизация ПЦР для амплификации фрагментов генов S. pneumoniae была выполнена аналогичным образом Г.В. Белошицким в рамках исследований [10, 38, 86] (научный руководитель исследований -д.м.н. И.С. Королева).

С помощью выбранных праймеров удалось получить фрагменты генов необходимой длины достаточной для обозначения соответствующих аллелей при проведении МЛСТ.

3. 2. 2 Определение вариабельных фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis

Согласно современной номенклатуре обозначения бактерий вида N. meningitidis обязательными элементами идентификации штамма, помимо определения серогруппы и генетической характеристики, основанной на МЛСТ, является обозначение антигенного профиля по трем аллелям вариабельных фрагментов БНМ [157, 168]. В связи с этим были разработаны молекулярно-биологические методики для секвенирования соответствующих фрагментов генов, кодирующих вариабельные фрагменты БНМ VR1, VR2 (PorA) и VR (FetA). Методики основаны на амплификации и секвенировании соответствующих фрагментов генов porA и fetA с использованием праймеров, представленных в таблице 9.

Таблица 9.

Праймеры для амплификации и секвенирования вариабельных фрагментов

БНМ N. meningitidis

Фрагмент Праймеры* 5'-3' последовательность

VR1 PorA SporA TACCgCCCTCgTATTgTCCgCAC

KVR1A gCCCAAATCCTCgCTCCCCTTA

VR2 PorA AporA CTTCCTCATAgCCgCCCgTCA

KVR2S gATATgCCggTTTCCgTACgCTA

VR FetA SFetA AACTTCAACTTCgACAgCCgCCTTgCCgAAC

AFetA gCTgCCAAATCACgCCgAAACTCgggTTA

* Температура отжига для пар праймеров SporA, AporA и SFetA, AFetA - 65 °С.

Праймеры SporA и AporA используются для амплификации фрагмента гена porA размером 830 п.о. (по референсной последовательности ЛБ143745). С праймера SporA проводится секвенирование вариабельного фрагмента VR1 (в прямом направлении), с праймера AporA - вариабельного фрагмента VR2 (в обратном направлении). Секвенирование с праймером AporA также позволяет

определить нуклеотидную последовательность, соответствующую вариабельному фрагменту VR3 [77, 81, 142]. Дополнительные праймеры KVR1A и KVR2S выбраны для секвенирования фрагментов VR1 и VR2 белка PorA по второй цепи: KVR1A - обратный праймер для фрагмента VR1 и KVR2S - прямой праймер для фрагмента VR2 (а также VR3).

Праймеры SFetA и AFetA использовались для амплификации фрагмента гена fetA размером 388 п.о. (по референсной последовательности KF885447) и секвенирования фрагмента VR этого гена в прямом и обратном направлениях соответственно.

Главное условие при дизайне праймеров, представленных в таблице 9, заключалось в необходимости их отжига на консервативных трансмембранных последовательностях, расположенных так, чтобы определяемая нуклеотидная последовательность, соответствующая вариабельным фрагментам БНМ, качественно детектировалась на хроматограмме. Подробные соображения, которыми руководствовались при выборе праймеров для характеристики фрагментов VR1 и VR2 белка PorA, а также результаты апробации методики изложены в [77, 81].

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ

Характеристика антигенных свойств капсульных полисахаридов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae является ключевым элементом внутривидовой характеристики этих бактерий и основным объектом детекции при проведении микробиологического мониторинга циркулирующих возбудителей, проводимых в рамках эпидемиологического надзора за ГБМ. В отличие от бактерий вида H. influenzae, среди которых возбудитель ГБМ представлен единственным серотипом, и выявление Hib в СМЖ уже является основанием для принятия клинических или эпидемиологических решений, при проведении микробиологического мониторинга штаммов N. meningitidis и S. pneumoniae возникает необходимость в определении нескольких серологических вариантов капсульного полисахарида (см. таблицу 1). Дифференциация серотипа b от других серотипов H. influenzaе является решенной задачей: разработаны микробиологические и молекулярно-биологические способы диагностики ГБМ и существуют соответствующие методики и наборы реагентов (см. главу «Материалы и методы») [33, 115, 127, 175]. Для определения серогрупп N. meningitidis и серотипов S. pneumoniae общепринятых подходов не существует, поскольку спектр детектируемых серогрупп (серотипов) зависит от эпидемической ситуации на наблюдаемой территории, включающей информацию о наблюдаемых группах населения, и связанных с этим задач по планированию иммунопрофилактических мероприятий. В связи с этим нами были разработаны ПЦР-РРВ методики (см. раздел 3. 1) для проведения микробиологического мониторинга штаммов N. meningitidis и S. pneumoniae, циркулирующих на территории России.

Выбор метода ПЦР-РРВ как способа определения мишеней в бактериальном геноме связан со стандартными преимуществами этого подхода, заключающимися в возможности использования формата постановки ПЦР «мультипрайм» на оборудовании с несколькими каналами флуоресцентной детекции, пониженной контаминационной опасностью, по сравнению с ПЦР-

ЭФ, и удобством интерпретации результатов [24]. Разработанные ПЦР-РРВ методики основаны на детекции нескольких серогрупп- или серотип-специфических мишеней в одной реакции по пяти каналам флуоресцентной детекции. Обязательным условием дизайна ПЦР-РРВ методик, направленным на предотвращение получения ложноотрицательных результатов, связанных с неэффективным проведением выделения ДНК или амплификации, было присутствие в каждой реакции положительного внутреннего контроля, то есть ПЦР-мишени, присутствующей у всех инкапсулированных микроорганизмов. Для N. meningitidis в качестве положительного внутреннего контроля выступал фрагмент гена ctrA (праймеры и зонд из набора реагентов «АмплиСенс N. meningitidis / H. influenzae / S. pneumoniae - FL», см. главу «Материалы и методы»), для серотипов S. pneumoniae - фрагмент гена cpsA (см. раздел 3. 1).

4. 1 Серогруппы N. meningitidis

С целью повышения эффективности мониторинга циркулирующих штаммов была разработана ПЦР-РРВ методика, позволяющая определять серогруппы N. meningitidis, вызывающих ГФМИ на территории России [34, 40, 41, 101] к которым относятся представители серогрупп А, B, С и, в меньшей степени, W (см. главу «Обзор литературы»).

Эффективность методики для определения серогрупп с использованием клинического материала проведена на образцах СМЖ, выделенных и протестированных параллельно с исследованием, осуществленным с помощью набора реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis А, B, C - EPh» (см. главу «Материалы и методы»), при проведении микробиологического мониторинга N. meningitidis, циркулирующих на территории Москвы в 2007-2010 годах. Параллельно с использованием двух методик было проанализировано 187 образцов СМЖ, полученных от больных ГФМИ за этот период (см. главу «Материалы и методы»). Выявлено распределение серогрупп N. meningitidis, представленное на рисунке 7.

Использование генетических методов для определения серогрупп N. meningitidis выявило преобладание NmA (55%) среди инвазивных штаммов на территории Москвы, хотя согласно данным, полученным преимущественно с использованием серологических методов, на территории России эта серогруппа встречалась лишь среди одной трети изученных штаммов (при этом для 19-27% штаммов серогруппа не определяется) [70].

■ А ПВ ПС 1W □ Другие

Рисунок 7. Распределение серогрупп в 187 образцах СМЖ, содержащих ДНК N. meningitidis, выделенных на территории Москвы в 2007-2010 годах.

При постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C - EPh» были получены совпадающие результаты во всех случаях, за исключением 13 образцов, содержащих по данным ПЦР-РРВ ДНК N. meningitidis серогрупп А, B и С, но отрицательных при постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C - EPh», что, вероятно, объясняется относительно высокой длиной амплифицированных фрагментов и недостаточной чувствительностью электрофоретического способа детекции ПЦР-продуктов: значения пороговых циклов при постановке ПЦР-РРВ для двух из этих образцов составляли 29 и 30,5; а для 11 образцов находились в диапазоне от 32,5 до 37, что свидетельствует о низкой концентрации бактериальной ДНК в этих образцах.

Все образцы, содержащие ДНК NmW, и 4 образца, содержащие ДНК N. meningitidis неизвестных серогрупп, были истинно отрицательными при постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C -EPh».

Образцы, содержащие ДНК NmW и 27 образцов, содержащих ДНК NmA, были охарактеризованы методом МЛСТ в сочетании с антигенной характеристикой согласно [168]; результаты генотипирования опубликованы в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/. Во всех образцах найдены сиквенс-типы и аллели вариабельных фрагментов БНМ, характерные для представителей этих серогрупп (см. раздел 5. 1).

Для всех образцов, содержащих ДНК N. meningitidis неизвестных серогрупп, удалось определить сиквенс-типы и аллели вариабельных фрагментов БНМ согласно [168]. Все образцы содержали ДНК N. meningitidis известных сиквенс-типов и аллелей вариабельных фрагментов БНМ, охарактеризованных в предыдущих исследованиях, для двух образцов удалось определить принадлежность к известным клональным комплексам; результаты генотипирования этих образцов представлены в таблице 10. Поскольку серогруппу N. meningitidis, ДНК которых присутствовала в этих образцах, определить не удалось, результаты генотипирования не были опубликованы в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/.

Таблица 10.

Результаты генотипирования N. meningitidis с не определенными серогруппами,

найденных в СМЖ

Образец Клональный Сиквенс-тип Антигенный профиль

комплекс VR1 PorA VR2 PorA VR FetA

M288L/08 ST-92 complex ST-92 5-1 10-4 F3-6

M380L/08 ST-865 complex ST-3342 5-2 10-1 F5-5

M206L/07 Не определен ST-3015 18-1 3 F3-4

M357L/08 Не определен ST-10033 5-3 10-4 F3-6

Согласно информации, представленной в базе данных http://pubmlst.org/neisseria, в клональный комплекс ST-92 (ST-92 complex) входят негруппируемые N. meningitidis (42%) и N. meningitidis серогруппы Y (37%), преимущественно выявляемые от носителей. Клональный комплекс ST-865 (ST-

865 complex) включает NmB (47%), негруппируемые N. meningitidis (17%) и N. meningitidis с неуказанной серогруппой (13%). Представители других серогрупп встречаются в этих клональных комплексах существенно реже. Негруппируемыми N. meningitidis, обозначенными в базе данных http://pubmlst.org/neisseria как «NG», могут быть как безкапсульные штаммы, так и штаммы, серогрупповую принадлежность которых с помощью используемых методов определить не удалось. Из 7 изолятов N. meningitidis с ST-3015 пять принадлежат серогруппе Y. Из 2 изолятов с ST-10033 один идентичен по своим генетическим характеристикам российскому референсному штамму серогруппы Y, и один - серогруппы W (см. раздел 5. 1).

В связи с отсутствием культуры определение серогрупп N. meningitidis, присутствовавших в образцах M206L/07, M380L/08, M357L/08 и M288L/08, с помощью серологических методик невозможно. На основании уже имеющихся в базе данных результатов генотипирования можно предположить, что образцы M288L/08 и M206L/07, скорее всего, содержат N. meningitidis серогруппы Y. При необходимости, дальнейшая характеристика N. meningitidis неизвестных серогрупп может быть проведена путем секвенирования нуклеотидных последовательностей локусов, ответственных за синтез капсулы. Проведение подобного исследования в настоящее время вряд ли актуально, поскольку эти микроорганизмы не представляют существенного эпидемиологического интереса: они редко выделяются от больных ГФМИ и, по результатам МЛСТ, не относятся к известным гипервирулентным клональным комплексам и не представляют эпидемической опасности. В то же время, выявление ассоциированных с ГФМИ N. meningitidis с не определенными серогруппами диктует необходимость использования дополнительных молекулярно-биологических подходов для идентификации редких серогрупп возбудителей с целью мониторинга их появления и циркуляции.

Таким образом, созданная методика позволяет определять четыре серогруппы N. meningitidis, что должно обеспечить серогруппирование не менее 95% штаммов, выделенных от больных ГФМИ, или образцов СМЖ, содержащих

ДНК N. meningitidis. В совокупности с другими, основанными на ПЦР подходами для определения ДНК и генотипирования N. meningitidis, включающих проведение МЛСТ и определение вариабельных фрагментов БНМ, использование разработанной ПЦР-РРВ методики позволяет проводить комплексную характеристику образцов, содержащих ДНК N. meningitidis, без этапа высева возбудителя в соответствии с существующими требованиями для обозначения штаммов N. meningitidis [168]. Сочетание некультуральных методик, предназначенных для внутривидовой характеристики N. meningitidis, ДНК которых была обнаружена в СМЖ, позволяет осуществлять микробиологический мониторинг представителей основных серогрупп, вовлеченных в эпидемический процесс МИ, и, в случае обнаружения ДНК нетипируемых или неизвестных представителей вида N. meningitidis, проводить их идентификацию методами генотипирования с целью определения их потенциальной эпидемической опасности.

Дальнейшее практическое применение ПЦР-РРВ методики для определения серогрупп N. meningitidis было реализовано в следующих исследованиях. Методика была использована в ряде работ М.А. Королевой при проведении эпидемиологического надзора за МИ на базе Российского референс-центра по мониторингу за бактериальными менингитами (руководитель - д.м.н. И.С. Королева) [41, 42, 43, 44, 78]. Методика была использована при последующем наблюдении за распределением серогрупп N. meningitidis, циркулирующих на территории Москвы [63, 64, 65, 66, 82, 84, 87, 88] (научные руководители исследования - д.м.н. Ю.Я. Венгеров и к.м.н. О.Ю. Шипулина).

115

4. 2 Серотипы S. pneumoniae

С целью повышения эффективности наблюдения за циркулирующими штаммами S. pneumoniae нами была разработана ПЦР-РРВ методика, позволяющая определять основные серотипы микроорганизмов, способных вызывать инвазивные формы инфекций, и серотипы, входящие в состав 10- и 13-валентных конъюгированных пневмококковых вакцин.

Клиническая апробация ПЦР-РРВ методики проведена на образцах ДНК, выделенных из СМЖ и поставленных, в качестве контроля, параллельно с ПЦР-ЭФ методикой, в основе которой использовано 23 пары серотип-специфических праймеров, широко апробированных на различных выборках штаммов S. pneumoniae и рекомендованных [200] (см. раздел 3. 1. 2). Клинические образцы были получены при проведении микробиологического мониторинга пневмококков, циркулировавших на территории Москвы в 2007-2010 годах. С использованием двух методик было параллельно проанализировано 89 образцов СМЖ от больных ГБМ, вызванных S. pneumoniae, за указанный период. В исследование были включены только те образцы, для которых было подтверждено присутствие ДНК S. pneumoniae двумя методиками: с помощью набора реагентов «АмплиСенс N. meningitidis / H. influenzae / S. pneumoniae -FL» (см. главу «Материалы и методы»), и с помощью дополнительной диагностической методики, направленной на определение фрагмента гена lytA [80, 138]. Выявленное распределение серотипов и результаты постановок с использованием обеих методик представлены в таблице 11 .

Таблица 11.

Результаты параллельного определения серотипов S. pneumoniae в образцах СМЖ больных пневмококковым менингитом с помощью ПЦР-ЭФ и ПЦР-РРВ

Серотип Количество положительных проб

ПЦР-ЭФ Реакции ПЦР-РРВ

№1 №2 №3 №4

3 11 12 - - -

6BA 6 6 - - -

19F 3 3 - - -

9VA 0 0 - - -

1 5 - 5 - -

14 4 - 4 - -

23F 11 - 12 - -

4 7 - 8 - -

18 6 - - 7 -

9NL 4 - - 6 -

15AF 3 - - 3 -

11AD 2 - - 2 -

2 0 - - - 0

5 0 - - - 0

7FA 2 - - - 2

19A 0 - - - 0

12FA* 1 - - - -

8* 1 - - - -

Серотип Количество положительных проб

ПЦР-ЭФ Реакции ПЦР-РРВ

№1 №2 №3 №4

7C, 15BC, 22FA, 23B, 23C* 0 — — — —

Всего (%) 66 (74%) 21 (24%) 29 (33%) 18 (20%) 2 (2,2%)

70 (79%)

* Серотип-специфические мишени, определяемые ПЦР-РРВ методикой и не входящие в состав реакций для ПЦР-РРВ методики (см. таблицы 10 и 11).

Наиболее часто были выявлены серотипы 3 (12 образцов, 13%), 23F (13%), 4 (8 образцов, 9%) и 18 (7 образцов, 8%). Из найденных образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae серотипа 6А или серотипа 6В, в одном образце найдена ДНК серотипа 6А, в 5 образцах - ДНК серотипа 6В (см. раздел 3. 1. 2. 3).

В исследованных образцах СМЖ было выявлено 14 серотип -специфических мишеней ПЦР-ЭФ методикой и 12 серотип-специфических мишеней - ПЦР-РРВ методикой. В то же время серотип был определен ПЦР-ЭФ методикой у 66 (74%) образцов, а ПЦР-РРВ методикой - у 70 (79%) образцов, что обусловлено, по-видимому, более высокой чувствительностью технологии ПЦР-РРВ. Выявление ПЦР-ЭФ методикой серотипов 12F и 8, не характерных для возбудителей пневмококковых менингитов, циркулирующих на территории России [8, 70], и не входящих в состав конъюгированных вакцин, не дает основания полагать, что методика ПЦР-ЭФ (также как и ее аналоги [200]) будет иметь преимущество при проведении микробиологического мониторинга возбудителей ГБМ.

Наиболее эффективным способом определения серотипов S. pneumoniae, ДНК которых может быть обнаружена в СМЖ, является ПЦР-РРВ исследование с реакцией № 2, которое позволяет в одной постановке определить серотип у наибольшего количества образцов (33%). Наименее эффективным ПЦР-РРВ

исследованием для образцов СМЖ является реакция №2 4 (2%), которая, в первую очередь, предназначена для детекции редких в России серотипов 7F и 19A, входящих, тем не менее, в состав 13-валентной вакцины. В совокупности реакции № 1-3 позволяют определить серотип в не менее чем 75% образцах СМЖ. Поэтому, для определения серотипов S. pneumoniae в образцах СМЖ оптимальный алгоритм применения ПЦР-РРВ методики, должен выглядеть следующим образом: сначала проводится исследование образца в реакции № 2, затем cpsA-положительные образцы исследуются в реакциях № 1 и № 3. Если серотип не определяется, образец должен быть дополнительно исследован в реакции № 4 для определения двух серотипов, входящих в состав 13-валентной вакцины, или с использованием методики ПЦР-ЭФ для расширенного определения серотипов. В то же время при исследовании клинического материала, забранного в рамках изучения эффективности вакцинации при других формах пневмококковой инфекции, алгоритм исследования может быть изменен. Например, при ОСО, рациональнее начинать исследование с реакции № 1, с помощью которой, с учетом данных [92], можно рассчитывать определить серотип у 60% S. pneumoniae пневмококков, присутствующих в образцах, взятых при парацентезе.

Определенным недостатком всех использующихся в настоящее время основанных на ПЦР схем для определения серотипов S. pneumoniae является то, что внутри некоторых выявляемых серогрупп (например, серогруппы 18) не удается дифференцировать входящие в них серотипы (например, серотипы 18F, 18A, 18B, 18C). Этот недостаток не является принципиальным, поскольку, по данным эпидемиологических исследований [8, 163, 165], в популяции циркулирующих пневмококков доминирует только один серотип из такой группы (в данном случае - серотип 18C, входящий в состав конъюгированных вакцин), а остальные серотипы практически не обнаруживаются. Поэтому широко используемый в микробиологической практике набор реагентов для определения серотипов S. pneumoniae с помощью комплекта специфических пулированных сывороток «Pneumotest-Latex» (Statens Serum Institut, Дания) [215]

также не предусматривают возможности дифференциации серотипов внутри некоторых серогрупп. Если дифференциация серотипов внутри одной серогруппы имеет значение при выборе оптимального препарата для иммунопрофилактики, в схему исследования могут быть интегрированы дополнительные молекулярно-биологические методики: например, методика для дифференциации серотипов 6A (входит только в состав 13-валентной вакцины) и 6B (входит в состав всех вакцин) [80, 199] (см. раздел 3. 1. 2. 3).

Таким образом, разработанная методика ПЦР-РРВ позволяет определять серотип S. pneumoniae у не менее 75% штаммов или клинических образцов СМЖ, содержащих ДНК S. pneumoniae. Методика позволяет определять серотип-специфические мишени, необходимые для планирования и мониторинга эффективности иммунопрофилактики с применением существующих конъюгированных вакцин, и в перспективе может быть использована для микробиологического мониторинга серотипов штаммов S. pneumoniae, ассоциированных с другими формами ПИ. При проведении расширенного микробиологического мониторинга, выходящего за рамки исследования серотипов, входящих в состав конъюгированных вакцин, могут быть использованы как разработанная ПЦР-ЭФ методика (см. раздел 3. 2. 2. 1), так и дополнительные возможности для идентификации серотип-специфических мишеней с помощью альтернативных ПЦР методик [200]. Определение серотипов штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae, в совокупности с методиками генотипирования, в первую очередь МЛСТ, может быть использовано в комплексной характеристике циркулирующих штаммов без этапа высева возбудителя, что существенно расширяет возможности сбора эпидемиологически значимой информации.

Дальнейшее практическое применение ПЦР-РРВ методики для определения серотипов штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae, было реализовано к.м.н. Г.В. Белошицким в рамках работ, проводимых Российским референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами (руководитель - д.м.н. И.С. Королева) [6, 9, 70], методика также

была использована в других проспективных исследованиях, связанных с микробиологическим мониторингом S. pneumoniae [25, 83, 87, 89, 220].

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

С помощью разработанных методик, описанных в главе 3, удалось провести генетическую характеристику включенных в исследование штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК основных возбудителей ГБМ. Генетическая характеристика проведена согласно существующим стандартам МЛСТ бактерий видов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae [150, 180, 190, 197, 206]. В соответствии с требованиями для обозначения штаммов N. meningitidis [168] на основании секвенирования соответствующих последовательностей ДНК проведена антигенная характеристика трех вариабельных фрагментов БНМ N. meningitidis. Перед проведением МЛСТ для всех возбудителей был проведен анализ эпидемиологической информации об источнике возбудителя, включающей диагноз заболевания, возраст пациента, времени и месте выделения штамма (забора клинического материала), и, в некоторых случаях, собраны данные о других микробиологических и эпидемиологических параметрах. Для всех бактерий видов N. meningitidis и S. pneumoniae перед МЛСТ было проведено серологическое или основанное на ПЦР исследование (см. главу «Материалы и методы» и главу 4) с целью определения серогруппы (для N. meningitidis) и серотипа (для S. pneumoniae) возбудителей.

Все полученные результаты, за незначительными исключениями, в совокупности с необходимой дополнительной информацией, включающей, в первую очередь, информацию об источнике возбудителя, опубликованы в соответствующих базах данных (см. раздел 2. 2. 4) и доступны для проведения текущего проспективного эпидемиологического надзора за ГБМ.

5. 1 Характеристика N. meningitidis

Проведено определение генетических (методом МЛСТ) и антигенных (определение вариабельных фрагментов БНМ) свойств штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis. Большинство типированных штаммов и клинических образцов содержали N. meningitidis серогрупп А, В и С - серогрупп, представляющих повышенный эпидемиологический интерес, наиболее часто выделяемых от больных ГФМИ на территории России [40, 44]. В работе использованы N. meningitidis, выделенные в текущий межэпидемический период (с 1995 по 2013 год), при проведении проспективного эпидемиологического надзора за ГБМ (см. радел 2. 1). Большинство типированных N. meningitidis принадлежат серогруппе А, штаммы которой связаны со случаями эпидемического неблагополучия на территории России в предыдущие годы [34, 40, 48, 52, 100, 129], что продиктовало необходимость проведения ежегодного мониторинга менингококков этой серогруппы с использованием метода МЛСТ. Эпидемиологический интерес также представляла характеристика российских N. meningitidis серогрупп В и С в сопоставлении с зарубежными представителями гипервирулентных клональных комплексов, циркулирующими на территории Европы [136, 144, 222]. В исследование включены NmW, также ассоциированные со случаями ГФМИ, но встречающиеся значительно реже, что, возможно, связано с неэффективной расшифровкой случаев ГФМИ и недостатком данных о циркуляции представителей этой серогруппы на территории России в предыдущие годы [34].

Охарактеризованные N. meningitidis серогрупп А, B, С и W были получены преимущественно от больных ГФМИ, и, кроме этого, в рамках микробиологического мониторинга и анализа отдельных случаев МИ в работах [30, 60, 114] (научный руководитель - д.м.н. И.С. Королева), было также проведено генотипирование штаммов, выделенных от здоровых носителей.

Штаммы других серогрупп практически не были исследованы, что связано с их низкой вовлеченностью в эпидемический процесс ГФМИ. Отдельный интерес в рамках анализа биологических свойств бактерий вида N. meningitidis,

выделенных в очагах МИ, представляют N. meningitidis, серогруппу которых определить не удалось. Дополнительно исследование редких и нетипичных представителей вида N. meningitidis также позволяет получить данные об адекватности и надежности использования метода МЛСТ, для характеристики N. meningitidis, результатом чего может являться оценка потенциальных ограничений данного подхода при практическом применении МЛСТ [155, 180] в эпидемиологическом надзоре за МИ.

5. 1. 1 N. meningitidis серогрупп А, В, С и W

5. 1. 1. 1 Результаты МЛСТ

Результаты МЛСТ исследованных штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis серогрупп А, B, C и W, полученных от больных ГФМИ и здоровых носителей представлены в таблице 12.

Таблица 12.

Результаты МЛСТ N. meningitidis серогрупп A, B, C и W, выделенных на территории России с 1995 по 2013 годы

Серогруппа* Источник Клональный комплекс** Сиквенс-тип

A(177) Больной ГФМИ (156) ST-1 complex/subgroup I/II (145) ST-75 (70), ST-3349 (52), ST-2 (18), ST-73 (2), ST-5803 (2), ST-3337 (1)

ST-5 complex/subgroup III (3) ST-7 (3)

Не определен (8) ST-68 (3), ST-3336 (2), ST-3338 (1), ST-7221 (1), ST-7639 (1)

Здоровый носитель (21) ST-1 complex/subgroup I/II (21) 3349 (12), 75 (9)

B (59) Больной ГФМИ (54) ST-18 complex (16) ST-18 (5), ST-3355 (1), ST-3351 (1), ST-3350 (1), ST-3354 (1), ST-3356 (1), ST-3357 (1), ST-3358 (1), ST-3359 (1), ST-9394 (1), ST-9402 (1), ST-8065 (1)

ST-41/44 complex/Lineage 3 (9) ST-3346 (4), ST-8091 (1), ST-9393 (1), ST-9399 (1), ST-9401 (1), ST-9404 (1)

ST-226 complex (3) ST-10440 (2), ST-9386 (1)

ST-11 complex/ET-37 complex (1) ST-3361 (1)

ST-37 complex (1) ST-9385 (1)

Не определен (24) ST-8499 (4), ST-3352 (1), ST-3360 (1), ST-9388 (1), ST-9389 (1), ST-9390 (1), ST-9391 (1), ST-9392 (1), ST-9395 (1), ST-9396 (1), ST-9398 (1), ST-9400 (1), ST-9403 (1), ST-9405 (1), ST-9569 (1), ST-9570 (1), ST-9571 (1), ST-10030 (1), ST-10434 (1), ST-10437 (1), ST-10439 (1)

Здоровый носитель (5) ST-174 complex (1) ST-6877 (1)

ST-41/44 complex/Lineage 3 (1) ST-7640 (1)

ST-213 complex (1) ST-1815 (1)

Не определен (2) ST-8258 (1), ST-8259 (1)

С (52) Больной ГФМИ (47) ST-41/44 complex/Lineage 3 (24) ST-3346 (13), ST-8256 (3), ST-3278 (2), ST-3345 (1), ST-8255 (1), ST-9225 (1), ST-9397 (1), ST-8981 (1), ST-9572 (1)

ST-18 complex (2) ST-3341 (1), ST-3348 (1)

ST-865 complex (1) ST-3342 (1)

ST-174 complex (1) ST-3339 (1)

Не определен (19) ST-6926 (2), ST-9407 (2), ST-3343 (1), ST-3347 (1), ST-3340 (1), ST-3353 (1), ST-1258 (1), ST-8257 (1), ST-8416 (1), ST-9387 (1), ST-9406 (1), ST-9573 (1), ST-10031 (1), ST-10436 (1), ST-10438 (1), ST-10441 (1), ST-5238 (1)

Здоровый носитель (5) ST-41/44 complex/Lineage 3 (3) ST-3278 (1), ST-3346 (1), ST-6876 (1)

Не определен (2) ST-6926 (2)

W (20) Больной ГФМИ (19) ST-11 complex/ET-37 complex (14) ST-11 (11), ST-247 (2), ST-10850 (1)

ST-174 complex (1) ST-2977 (1)

Не определен (3) ST-3344 (1), ST-10033 (1), ST-10435 (1)

Здоровый носитель (1) ST-11 complex/ET-37 complex (1) ST-3751 (1)

* В скобках указано количество штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis.

** Клональные комплексы обозначены в соответствии с [144].

5. 1. 1. 2 Определение вариабельных фрагментов БНМ

Для большинства штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis серогрупп А, В, С и W, удалось охарактеризовать антигенный профиль по трем основным вариабельным фрагментам БНМ, рекомендуемым для проведения характеристики N. meningitidis согласно [157, 168]. Исключение составляет несколько штаммов, изученных на первых этапах исследования в [81], для которых не было проведено определение вариабельного фрагмента VR белка FetA, также несколько штаммов с полными или частичными делециями генов porA и fetA [77, 81, 226, 227]. Результаты определения аллелей БНМ N. meningitidis серогрупп A, B, C и W представлены в таблице 13.

При проведении исследования были найдены следующие аллели вариабельных фрагментов, не описанные ранее: аллели 5-37 и 22-30 [43, 78], 1030 [77, 81] и 10-67 [85] фрагмента VR2 белка PorA, аллели F3-52 и F4-35 [43, 78] фрагмента VR белка FetA. Нуклеотидные (аминокислотные) последовательности аллелей и эпидемиологическая информация об источниках N. meningitidis внесены в соответствующие базы данных http://pubmlst.org/neisseria/PorA/ и http://pubmlst.org/neisseria/FetA/. На момент окончания исследования все впервые выявленные аллели были обнаружены только у N. meningitidis, циркулирующих на территории России, за одним исключением: аллель 10-67 был также найден однократно у зарубежного изолята (id19701).

Таблица 13.

Результаты определения аллелей БНМ N. meningitidis серогрупп A, B, C и W, выделенных на территории России с

1995 по 2013 годы

Серогруппа* Источник Фрагмент БНМ Аллели

VR1 PorA 5-2 (142), 5 (5), 20 (3), 12-1 (1), 17 (1), 22 (1), 5-1 (1), 5-3 (1), 7-1 (1)

Больной ГФМИ (156) VR2 PorA 10 (139), 10-67 (6), 9 (3), 14 (2), 10-27 (1), 10-30 (1), 164 (1), 2 (1), 2-16 (1), 4-1 (1)

A(177) VR FetA F3-5 (123), F1-5 (18), F4-1 (3), F3-9 (2), F3-1 (1), F4-35 (1), F5-2 (1)

VR1 PorA 5-2 (21)

Здоровый носитель (21) VR2 PorA 10 (21)

VR FetA F3-5 (21)

Серогруппа* Источник Фрагмент БНМ Аллели

VR1 PorA 5-1 (11), 5-3 (9), 17 (8), 22 (6), 18-1 (4), 7-1 (3), 21 (2), 7 (2), 7-2 (2), 12-1 (1), 12-3 (1), 19 (1), 19-20 (1), 21-2 (1), 5-2 (1)

Больной ГФМИ (54) VR2 PorA 2-16 (9), 16-4 (8), 10-4 (4), 2-2 (4), 3 (4), 1 (3), 10-1 (3), 26 (3), 13-1 (2), 14 (2), 15 (2), 4 (2), 10 (1), 14-31 (1), 14-6 (1), 16 (1), 28 (1), 30-1 (1), 30-3 (1)

B (59) VR FetA F3-9 (10), F3-6 (7), F1-5 (4), F5-5 (4), F5-8 (3), F1-15 (2), F2-7 (2), F3-1 (2), F3-5 (2), F3-7 (2), F5-14 (2), F5-7 (2), F1-2 (1), F1-21 (1), F1-47 (1), F1-62 (1), F1-7 (1), F3-16 (1), F3-3 (1), F3-4 (1), F4-21 (1), F4-23 (1), F5-16 (1), F5-2 (1)

VR1 PorA 5-1 (1), 21-2 (1), 7-4 (1), 22 (1), 7 (1)

Здоровый носитель (5) VR2 PorA 10-1 (1), 28 (1), 1 (1), 14 (1), 16 (1)

VR FetA F5-16 (2), F5-5 (1), F5-6 (1), F1-5 (1)

Серогруппа* Источник Фрагмент БНМ Аллели

С (52) Больной ГФМИ (47) VR1 PorA 17 (20), 5-3 (6), 18-1 (4), 21 (2), 22 (2), 22-30 (2), 5-1 (2), 5-2 (2), 12-1 (1), 18-2 (1), 19 (1), 20 (1), 5-37 (1), 7 (1), 7-1 (1)

VR2 PorA 16-4 (21), 2-16 (5), 34 (4), 16 (3), 26 (3), 10-1 (2), 1 (1), 10 (1), 10-8 (1), 13-1 (1), 14-31 (1), 15 (1), 2-2 (1), 35 (1), 9 (1)

VR FetA F3-9 (9), F3-7 (4), F5-7 (4), F2-9 (3), F4-1 (3), F1-7 (2), F1-33 (1), F3-5 (1), F3-52 (1), F3-6 (1), F5-1 (1), F5-14 (1), F5-2 (1), F5-59 (1), нет данных (14)

Здоровый носитель (5) VR1 PorA 5-3 (2), 17 (2), 18-1 (1)

VR2 PorA 2-16 (2), 16-4 (2), 34 (1)

VR FetA F3-7 (2), F3-9 (2), F1-5 (1)

Серогруппа* Источник Фрагмент БНМ Аллели

W (20) Больной ГФМИ (19) VR1 PorA 5 (13), 22 (2), 5-2 (1), 5-3 (1), 7-2 (1), 18-1 (1)

VR2 PorA 2 (13), 26 (2), 3 (1), 10 (1), 10-4 (1), 13-1 (1)

VR FetA F1-1 (12), F3-7 (3), F3-6 (1), F4-1 (1), нет данных (2)

Здоровый носитель (1) VR1 PorA 5 (1)

VR2 PorA 2 (1)

VR FetA F1-1 (1)

* В скобках указано количество штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis.

5. 1. 2 N. meningitidis, не принадлежащие серогруппам А, B, C и W

Среди штаммов N. meningitidis, не принадлежащих серогруппам А, B, C и W, было изучено три штамма серогрупп E, Х и Y, а также 16 штаммов, выделенных при выполнении работы [60]. Все штаммы были выделены от здоровых носителей, за исключением штамма серогруппы Y (выделен из СМЖ). Штаммы серогрупп E, Х и Y были использованы как референсные при характеристике аналитической специфичности ПЦР-РРВ методики для определения серогрупп N. meningitidis (см. раздел 3. 1. 1). Серогруппу штаммов, выделенных в рамках проведения работы [60] с помощью серологических методов и методик, основанных на ПЦР (см. главу «Материалы и методы»), определить не удалось; отсутствие капсулы характерно для штаммов N. meningitidis, выделяемых при бессимптомном носительстве [21, 47, 140].

Для штаммов серогрупп E, Х, Y и 1 2 негруппируемых штаммов удалось провести МЛСТ и охарактеризовать антигенный профиль по трем основным вариабельным фрагментам БНМ [157, 168], их генетическая характеристика представлена в таблице 14.

Для 4 негруппируемых штаммов не удалось провести генотипирование в полном объеме согласно рекомендациям для обозначения N. meningitidis [168]: у 2 штаммов не удалось определить сиквенс-тип и у 3 - один из вариабельных фрагментов БНМ (см. таблицу 15). Сиквенс-тип не был определен у штаммов: M622car/08 (не удалось получить продукт амплификации фрагмента гена abcZ) и M782car/08 (не удалось получить продукт амплификации фрагмента гена aroE). При использовании протокола амплификации, рекомендованного разработчиками схемы МЛСТ [205], с альтернативными парами праймеров abcZ-P1C и abcZ-P2C, aroE-P1B и aroE-P2B также не удалось амплифицировать фрагменты бактериальной ДНК, необходимые для секвенирования. Штамму M622car/08 в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ присвоен идентификационный номер (id15207), штамм M782car/08 в базу данных отправлен не был.

У штамма М854саг/09 отсутствовал фрагмент VR2 белка РогА. С помощью комбинаций праймеров для фрагмента гена рогА (см. таблицу 13) была определена нуклеотидная последовательность длиной 774 п.о. Последовательность включает консервативные трансмембранные фрагменты, фланкирующие последовательности, соответствующие фрагментам УЯ1 и VR2. Нуклеотидная последовательность, соответствующая эпитопу УЯ2, в сиквенсе отсутствует. Полученная нуклеотидная последовательность депонирована в базу данных GenBank [196], ей присвоен идентификационный номер НМ037346.

Для двух негруппируемых штаммов М622саг/08 и М847саг/08 не удалось получить продукт амплификации фрагмента гена fetA. Использование альтернативного протокола амплификации с праймерами S1 и S8, рекомендованного авторами методики [221], также не позволило амплифицировать фрагмент гена, необходимый для определения аллеля УЯ Бе1А.

Таблица 14.

Результаты МЛСТ N. meningitidis, не принадлежащих серогруппам A, B, C и W

Серогруппа* Клональный комплекс** Сиквенс-тип*** Полное обозначение штаммов

E (1) Не определен (1) ST-10034 (1) E: P1.19,15: F3-1: ST-10034 (-)

X (1) Не определен (1) ST-10032 (1) X: P1.21,16: F4-1: ST-10032 (-)

Y (1) Не определен (1) ST-10033 (1) Y: P1.5-3,10-4: F3-6: ST-10033 (-)

NG (16) ST-53 complex (7) ST-53 (5) NG: P1.7,30: F1-2: ST-53 (cc53) NG: P1.7,30: F1-9: ST-53 (cc53) NG: P1.7,30-2: F1-2: ST-53 (cc53) NG: P1.7,30-5: F1-2: ST-53 (cc53) NG: P1.7,30-2: F-ND: ST-53 (cc53)

ST-931 (1) NG: P1.7-2,30-3: F1-2: ST-931 (cc53)

ST-8262 (1) NG: P1.18-1,3: F1-2: ST-8262 (cc53)

ST-198 complex (1) ST-8264 (1) NG: P1.18,25: F5-70: ST-8264 (cc198)

ST-865 complex (2) ST-3342 (1) NG: P1.5-2,10-1: F5-5: ST-3342 (cc865)

ST-8261 (1) NG: P1.22,26: F1-5: ST-8261 (cc865)

Не определен (6)**** ST-6878 (1) NG: P1.18-1,3: F3-6: ST-6878 (-)

ST-8016 (1) NG: P1.21,A: F1-9: ST-8016 (-)

ST-8260 (1) NG: P1.5-1,10-8: F1-3: ST-8260 (-)

ST-8263 (1) NG: P1.19,15: F5-2: ST-8263 (-)

* В скобках указано количество штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis; NG -негруппируемые штаммы.

** Клональные комплексы обозначены в соответствии с [144].

*** Для одного штамма с БТ-53 и штамма с БТ-8016 не удалось определить по одному фрагменту БНМ (см. таблицу 15).

**** Помимо перечисленных сиквенс-типов клональный комплекс также не определен у двух штаммов, для которых не удалось определить сиквенс-тип (см. таблицу 15).

Таблица 15.

Результаты генотипирования негруппируемых штаммов N. meningitidis, для которых не удалось провести генетическую и антигенную характеристику в полном объеме согласно [168]

Штамм* Аллельный профиль** Сиквенс-тип Антигенный профиль**

abcZ adk aroE fum C gdh pdhC pgm VR1 PorA VR2 PorA VR FetA

M847car/08 16 2 6 25 17 25 22 ST-53 7 30-2 —

M854car/09 2 2 12 35 8 24 7 ST-8016 21 — F1-9

M622car/08 — 2 6 25 17 24 22 Не определен 7-2 30-3 —

M782car/08 5 4 — 17 14 7 12 Не определен 18 25-33 F5-10

* Год выделения штамма обозначен через знак «/». Информация о штамме М782саг/08 не включена в базу данных http://pubmlst.org/neisseria/.

** Знак «-» соответствует фрагменту, продукт амплификации которого (нуклеотидную последовательность) получить не удалось предположительно из-за делеции (см. раздел 5. 1. 2).

5. 1. 3 Публикация результатов в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/

Результаты генотипирования и информация об источнике штамма (клинического материала), полученные на отдельных этапах работы [71, 72, 74, 75, 78, 81, 82, 85], по мере накопления, публиковались в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/. У некоторых N. meningitidis были обнаружены не описанные ранее аллели и сиквенс-типы, информация о которых в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ отсутствовала. Номера новым аллелям и сиквенс-типам присваивались в процессе работы. В таблице 16 представлены выборочные данные о публикации результатов МЛСТ 257 штаммов и клинических образцов, содержащих N. meningitidis, в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ на протяжении шести этапов работы, отраженных в соответствующих публикациях.

Таблица 16.

Результаты МЛСТ 257 штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis, опубликованные в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ в

2005-2013 годах

id Количество изолятов Количество впервые найденных Публикация, год*

Аллелей Сиквенс-типов

4628-4687 60 11 27 [71], 2005

7096-7100, 7948-7960, 79938006 32 1 1 [75], 2005-2006

9227-9234, 9294-9299, 11585-11596 26 — 1 [85], 2007-2008

id Количество изолятов Количество впервые найденных Публикация, год*

Аллелей Сиквенс-типов

11528-11544, 13168-13178, 14664, 15048, 15050-15055, 15057-15061, 15063, 15207, 15208 44 3 12 [74], 2008-2010

13150, 13151, 13167, 15021, 15028, 15037, 15652,1916519193,19195-19206, 1946319470 56 12 32 [78], 2010, 2012

19475-19503, 19709, 19710, 20696, 20707-20714 39 — 5 [82], 2012-2013

* Указана статья, в которой описаны полученные на соответствующем этапе работы данные МЛСТ, и год публикации информации об изолятах в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/.

Остальные 69 типированных штаммов и клинических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis, были исследованы в рамках следующих исследований. При проведении микробиологического мониторинга менингококков серогруппы А было исследовано 38 образцов СМЖ от больных менингококковым менингитом на территории Москвы в рамках исследований, проводимых под руководством д.м.н. И.С.Королевой, д.м.н. Ю.Я. Венгерова и к.м.н. О.Ю. Шипулиной, при этом новых аллелей или сиквенс-типов обнаружено не было. При продолжении генотипирования N. meningitidis, циркулирующих на территориях других регионов России [78], в рамках исследования, проводимого М.А. Королевой [43], было охарактеризовано 15 штаммов и клинических образцов, содержащих N. meningitidis. Соответствующая информация

опубликована в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ ^ё26685-26699); среди типированных изолятов было найдено 2 аллеля и 8 сиквенс-типов, не выявленных в предыдущих исследованиях.

5. 2 Генотипирование S. pneumoniae

Результаты МЛСТ 93 московских штаммов S. pneumoniae, опубликованные в базе данных http://pubmlst.org/spneumoniae/, представлены в таблице 17. Все штаммы были выделены от больных ГБМ; за исключением трех штаммов, они были выделены в течение двух периодов: с 1980 по 1990 год (47 штаммов) и с 2008 по 2010 год (43 штамма).

Таблица 17.

Результаты МЛСТ S. pneumoniae

Штамм* id Аллельный профиль** Сиквенс-тип**

aroE gdh gki recP spi xpt ddl