Молекулярно-биологические особенности опухоли в индивидуальном прогнозировании результатов хирургического лечения немелкоклеточного рака легкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Юдин, Денис Иванович

• Юдин, Денис Иванович
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Юдин, Денис Иванович

ВВЕДЕНИЕ.

Список сокращении, использованных в диссертации.

Глава I. Проблема прогнозирования течения и исхода немелкоклеточного рака легкого (обзор литературы).

1.1 Молекулярно-биологические особенности опухоли в прогнозировании течения 14 немелкоклеточного рака легкого.^ ^

1.1.1 р53 — один из ключевых белков канцерогенеза.

1.1.2 Экспрессия белков семейства ВСЬ-2/ВАХ.

1.1.3 Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов ->•[ (УЕОР).¡

1.1.4 Пролиферативная активность опухоли.

1.1.5 Плоидность опухоли.

1.1.6 Нарушения микросателлитных маркеров.

1.2 Клиническое применение молекулярно-биологических маркеров опухолевого -эд роста в прогнозировании течения рака легкого.

1.2.1. Молекулярно-биологические факторы в прогнозировании результатов хирургического лечения рака легкого.

1.2.2. Использование биологических факторов в прогнозировании 33 эффективности адъювантной терапии.

Глава Н. Общая характеристика анализируемых наблюдении, материалы и методы.

2.1. Характеристика клинического материала.

2.2. Методы исследования биологических особенностей опухоли.

2.2.1. Иммуногистохимическое определение изучаемых маркеров.

2.2.2. Определение потери гетерозиготности микросателлитных маркеров.

2.2.3. Определение содержания ДНК методом лазерной проточной цитофлу-орометрии.

2.2.4. Статистическая обработка полученных данных.

Глава Ш. Определение изученных маркеров немелкоклеточного рака легкого.

3.1. Экспрессия мутантного белка р53 в опухолевых клетках НМРЛ.

3.2. Экспрессия белков-членов семейства ВСЬ-2.

3.3. Экспрессия УЕСБ.

3.4. Определение делеции в области короткого плеча первой хромосомы.

3.5. Оценка плоидности опухоли.

3.6. Пролиферативная активность клеток НМРЛ.

Глава IV. Оценка молекулярно-бнологичеекпх факторов в зависимости от морфологической структуры опухоли и ее распространенности

Глава V. Регрессионно-факторный анализ выживаемости у больных НМРЛ в зависимости от различных сочетаний изучаемых факторов.

5.1 Результаты регрессионно-факторного анализа значимости клинико-морфоло-гических и изученных молекулярно-биологических факторов в выживаемости пациентов немелкоклеточным раком легкого по критерию «умер в первые 3 года -прожил более 5 лет».

5.2Результаты регрессионно-факторного анализа значимости клинико-морфологических и изученных молекулярно-биологических факторов в выживаемости пациентов с плоскоклеточным раком и аденокарциномой легкого по критерию «умер в первые 3 года - прожил более 5 лет».

5.3 Результаты регрессионно-факторного анализа значимости клинико-морфологи-ческих и изученных молекулярно-биологических факторов в выживаемости пациентов немелкоклеточным раком легкого в группах с наличием или отсутствием метастазов (N0) во внутригрудных лимфатических узлах по критерию «умер в первые 3 года - прожил более 5 лет». Ю

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологические особенности опухоли в индивидуальном прогнозировании результатов хирургического лечения немелкоклеточного рака легкого»

Актуальность темы

Лечение больных раком легкого представляет собой одну из наиболее актуальных проблем клинической онкологии, что обусловлено неуклонным ростом заболеваемости и смертности, определенными трудностями диагностики и недостаточной эффективностью лечения. В последние годы рост заболеваемости раком легкого оправдывает наихудшие прогнозы ВОЗ и наносит огромный социально-экономический ущерб. В 35 развитых странах мира и в Российской Федерации рак легкого остается главной причиной смертности онкологических больных (мужчин). Годовой прирост заболеваемости раком легкого в России составляет в настоящее время 3,4%, ежегодно заболевают более 60 тыс. человек [Аксель Е.М., 2003]. В настоящее время основным общепризнанным методом лечения немелкоклеточного рака легкого, дающим надежду на выздоровление, является хирургическое вмешательство. Однако результаты лечения даже при ранних стадиях заболевания остаются недостаточно удовлетворительными. Важным шагом в улучшении прогнозирования течения рака легкого, стандартизации лечебной тактики стало введение понятия о стадийности роста опухоли, а затем уточненной системы распространенности TNM. Но, несмотря на огромную практическую ценность и простоту системы TNM, она дает лишь статистическую справку, по групповой выживаемости пациентов немелкоклеточным раком легкого, причем не особенно точную. Так, наилучшие результаты 5-летней выживаемости получены у больных при IA (T1N0M0) стадии - 60-80%. Однако, уже при стадии IB (T2N0M0) 5-летняя выживаемость достоверно снижается, составляя 50-60% [Spreafaco G., 1995; Padilla J., 2002]. Таким образом, прогноз течения заболевания, основанный исключительно на клинической оценке распространенности опухолевого поражения зачастую недостоверен и в настоящее время нуждается в привлечении к анализу дополнительных молекулярно-биологических факторов, определяющих и отражающих рост, дифференцировку и прогрессирование опухолевого процесса. Одним из путей повышения точности прогнозирования течения рака легкого и, следовательно, оптимизации лечебной тактики является изучение ряда биологических особенностей опухоли, характеризующих агрессивность течения заболевания.

Наиболее ранними событиями в процессах канцерогенеза и прогрессирования опухолей, являются нарушение механизмов пролиферации и программированной клеточной гибели. Наиболее изученными ключевыми белками, также участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства BCL-2 (BCL-2 и ВАХ) и белок-супрессор опухолевого роста р53.

Супрессор опухолевого роста, р53, известен как один из главных белков, регулирующий прохождение клеточного цикла. Активация р53 требуется для инициирования некоторых форм апоптоза, а мутации гена могут быть ассоциированы с агрессивностью течения заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к химио- или лучевой терапии.

Семейство белков BCL-2 играет ключевую роль в механизме программированной клеточной гибели. Очень тонкая регуляция апоптоза осуществляется за счет экспрессии белков семейства BCL-2 и других участников передачи сигнала программированной клеточной гибели. Исследования показывают, что экспрессия белков семейства BCL-2 (ВАХ) при немелкоклеточном раке легкого ассоциирована с лучшей безрецидивной и общей выживаемостью больных [PezellaF., 1993; Kaiser U., 1995; Higashiyama M., 1997; Apolinario R., 1997].

Неоангиогенез или формирование новых микрососудов на основе уже существующей в ткани сети сосудов, является необходимым событием для роста опухоли и развития метастазов. Сосудистый фактор роста эндотелия (VEGF - vascular endothelial growth factor), является главным фактором, индуцирующим образование новых сосудов в опухоли путем стимуляции деления и миграции эндотелиальных клеток близлежащих сосудов. Повышение экспрессии VEGFa в злокачественных опухолях ассоциировано с процессами метастазирования, и укорочением безрецидивной выживаемости. Другие члены семейства VEGF (VEGFc, VEGFd и др) не оказывают значимого влияния на индукцию ангиогенеза при немелкоклеточном раке легкого [Ohta Y., 1997; Volm M., 1997; Yuan A., 2000; Yuan A., 2001].

Так же, весьма интересным представляется включение в спектр комплексного анализа биологических особенностей немелкоклеточного рака легкого ряда показателей генетической нестабильности опухолевой клетки.

Частым соматическим нарушением в клетках немелкоклеточного рака легкого являются делеции различных хромосомных локусов, и в частности короткого плеча первой хромосомы. Последние ассоциированы с поздними стадиями заболевания и могут иметь прогностическое значение. Предполагается, что эта область содержит кластер генов-супрессоров, ргаактивация которых существенна для прогрессии немелкоклеточного рака легкого [Зборовская И.Б, Чижиков В.В., 2003].

Нарушения кариотипа в злокачественных опухолях варьируют в широких пределах, и эти изменения касаются как числа хромосом, так и их структурных трансформаций. Количество ДНК в ядре пропорционально общему содержанию хромосомного материала. В постмитотических нормальных соматических клетках человека содержится диплоидный набор хромосом, который равняется 46 хромосомам и соответствует G1/0 фазе клеточного цикла; в S фазе клеточного цикла это значение равняется Зс, а в G2+M фазе - 4с. С помощью ДНК-проточной цитофлуорометрии с высокой достоверностью можно определить степень плоидности клеток опухоли с одновременной оценкой их пропорции в различных фазах клеточного цикла [Laerum О., 1981]. По данным литературы у больных немелкоклеточным раком легкого с нормальным содержанием ДНК (диплоидные) и низкой пролиферативной активностью отмечается лучшая выживаемость, чем у больные с анеуплоидией и повышенной пролиферацией опухоли [Полоцкий Б.Е, 1995; Chôma D., 2001; Ikonen J., 2002; Gawrychowski J. 2003].

В настоящее время практически ни один молекулярный маркер рака легкого не вошел в повседневную клиническую практику. Одной из причин этого является то, что большинство работ по прогнозированию течения рака легкого посвящены анализу связи между выявлением отдельных молекулярных и/или генетических факторов (их положительное или отрицательное, как правило, влияние) и опухолевой прогрессией. В настоящее время усилия молекулярных биологов и клиницистов направлены на создание алгоритмов маркерных «кластеров», дающих более полную и достоверную информацию в плане определения опухолевой прогрессии. Основной задачей данных работ является как можно более полное освещение различных характеристик и маркеров опухоли. Такой подход поможет клиницисту выработать адекватную тактику ведения конкретного больного немелкоклеточным раком легкого, опираясь на знание биологических особенностей опухолевого процесса.

Цель исследования

Целью исследования являлось совершенствование индивидуального прогнозирования результатов хирургического лечения немелкоклеточного рака легкого с использованием биологических характеристик опухоли.

Основные задачи исследования

1. Изучить частоту выявления онкомаркеров: экспрессии VEGFa, BCL-2, В АХ, р53; в сочетании с факторами генетической нестабильности (плоидностью, количеством клеток в S-фазе клеточного цикла, делецией короткого плеча 1 хромосомы) у больных немелкоклеточным раком легкого.

2. Оценить корреляцию между уровнем и характером изучаемых изменений с показателями выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого после радикального хирургического лечения.

3. Сравнить частоту встречаемости изучаемых факторов при аденогенном и плоскоклеточном раке легкого.

4. Провести многофакторный анализ для оценки весовой значимости изучаемых факторов в индивидуальном прогнозировании течения заболевания.

5. Разработать рекомендации по индивидуальному прогнозированию хирургического лечения немелкоклеточнго рака легкого с учетом биологических особенностей опухоли.

Научная новизна

Получены новые данные о корреляции между частотой выявления онкомаркеров УЕОБа, ВСЬ-2, В АХ, р53; в сочетании с факторами генетической нестабильности (плоидностью, количеством клеток в Б-фазе клеточного цикла, делецией короткого плеча первой хромосомы) и течением немелкоклеточного рака легкого после радикального хирургического лечения. Впервые проведено сравнение аденогенного и плоскоклеточного рака легкого по исследованному спектру факторов. Впервые после комплексного исследования единого клинического материала был проведен многофакторный анализ для оценки весовой значимости изученных клинических, морфологических и молекулярно-биологических факторов в индивидуальном прогнозировании течения немелкоклеточного рака легкого в зависимости от распространённости опухолевого процесса. На основе полученных данных с высокой точностью стало возможно разделить пациентов с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения заболевания.

Практическая значимость исследования

В результате проведенного исследования изучены не отдельные молекулярно-биологические факторы прогноза течения немелкоклеточного рака легкого, а проведена комплексная их оценка и определена их значимость в индивидуальном прогнозировании течения заболевания. Разработаны подходы к выработке алгоритма определения индивидуального прогноза больных немелкоклеточным раком легкого после радикального лечения. Внедрение результатов исследования в клиническую практику лечения больных немелкоклеточным раком легкого позволит выделить группу пациентов с неблагоприятным прогнозом заболевания (высоким риском прогрессирования в первые три года после оперативного вмешательства), исследовать эффективность новых методов адъювантного лечения именно у нуждающихся в этом пациентов, оптимизировать частоту наблюдения пациентов с благоприятным прогнозом заболевания.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. АК - аденокарцинома

2. БАР - бронхиолоальвеолярный рак

3. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

4. НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

5. ПРЛ - плоскоклеточный рак

6. ПЦР - полимеразная цепная реакция

Заключение диссертации по теме «Онкология», Юдин, Денис Иванович

ВЫВОДЫ.

1. Частота выявления изученных онкомаркеров у больных НМРЛ составила: экспресиия р53 - 53,4%, ВСЬ-2 - 26,4%, ВАХ - 48,5%, УЕОБа - 49,7%; анеуплоидия - 68,7%, делеция короткого плеча 1 хромосомы - 32,6%.

2. Простой статистический и регрессионно-факторный анализ молекулярно-биологических характеристик НМРЛ показал, что к достоверно неблагоприятным прогностическим факторам у пациентов НМРЛ можно отнести: экспрессию мутантного белка р53, экспрессию УЕОБа, увеличение процента опухолевых клеток в 8-фазе клеточного цикла, наличие делеции в областях 1р32.1 и 1р36.3. А к факторам благоприятно, влияющим на выживаемость пациентов относятся: экспрессия ВАХ, ВСЬ-2 и диплоидия опухоли.

3. Наличие делеции в областях 1р32.1 и 1р36.3 достоверно чаще встречаются у пациентов с неблагоприятным прогнозом на ранних стадиях НМРЛ.

4. Раздельный анализ выживаемости пациентов ПРЛ и АК не выявил различий течения заболевания по сравнению с группой НМРЛ в целом при сопоставимой распространенности процесса.

5. При простом статистическом анализе из всего проанализированного спектра молекулярно-биологических факторов, лишь экспрессия ВСЬ-2 достоверно чаще встречается в группе пациентов ПРЛ, чем при АК легкого.

6. При регрессионно-факторном анализе в группах пациентов с различными клинико-морфологическими характеристиками, как-то: гистологическая структура опухоли (ПРЛ и АК), наличие или отсутствие метастазов во внутригрудные лимфатические узлы (N0 и N+3 выявлены значимые различия как в молекулярно-биологических, так и в клинических характеристиках опухолевого процесса.

Полученные данные указывают на необходимость использования этих характеристик в комплексной оценке выживаемости больных НМРЛ после радикального хирургического лечения с учетом особенностей каждой группы.

7. Изученный спектр молекулярно-биологических факторов, является оптимальным в настоящее время для оценки выживаемости пациентов НМРЛ после радикального хирургического лечения. На основе вычисленных значений весовых коэффициентов изученных клинико-морфологических и молекулярно-биологических факторов возможно с высокой достоверностью разграничить больных с неблагоприятным (прогрессирование в сроки до 3 лет) и благоприятным течением заболевания (живущих более 5 лет без признаков заболевания).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время основным общепризнанным методом лечения немелкоклеточного рака легкого, дающим надежду на выздоровление, является хирургическая операция. При этом только 10-20% пациентов из вновь заболевших могут быть прооперированы и радикальная операция возможна лишь у 70-80%) из этих больных. Однако результаты лечения даже при ранних стадиях заболевания остаются недостаточно удовлетворительными [Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е., 2003] и используемые в клинической практике методы анализа течения заболевания после радикального лечения дают весьма низкую точность прогноза [Лактионов К.К., 2004]. Одним из путей решения данной проблемы является идентификация молекулярных маркеров, дающих представление о поведении или агрессивности опухолей. Однако на сегодняшний день, несмотря на широкий спектр молекулярно-биологических факторов, изучаемых для прогнозирования течения опухолей, лишь единичные из них используются в клинической практике. Низкая информативность отдельных маркеров объясняется тем, что каждый из них вносит свой вклад в опухолевую" прогрессию и метастазирование и отвечает за отдельный этап клеточной трансформации [Зборовская И.Б., Чижиков В.В., 2003]. Нами была выполнена работа по прогнозированию течения НМРЛ после радикального хирургического лечения на основе изучения комплекса клинических, морфологических и молекулярно-биологических факторов.

В основу работы положены наблюдения за 163 больными немелкоклеточпым раком легкого, радикально оперированными в хирургическом отделении торакальной онкологии РОНЦ РАМН в период с 1980 по 1995 годы. В спектр анализа молекулярно-биологических маркеров опухоли были включены следующие: экспрессия мутантного р53, ВСЬ-2, ВАХ, УЕвРа, плоидность опухоли, содержание клеток в 8-фазе митотического цикла, наличие или отсутствие делеции в локусах 1р32-36 короткого плеча 1 хромосомы. Изучена встречаемость вышеперечисленных показателей в исследуемой группе больных, однако не во всех случаях нам представилась возможность определить полный спектр молекулярно-биологических показателей. В тоже время у 92 (56,4%) пациентов был изучен полный набор исследуемых факторов прогноза.

Из 163 больных НМРЛ мужчин было 133 (81,6%), женщин 30 (18,4%) -соотношение 4,4:1. Возраст пациентов варьировал от 34 до 76 лет. Плоскоклеточный рак был выявлен у 101 (61,9%), аденокарцинома определена у 57 (34,9%), БАР диагностирован у 4 (2,4%) и крупноклеточный рак у 1 (0,8%) человека. IA стадия была выявлена у 23 пациентов (14,1%); IB стадия у 72 (44,2%), IIA - у 9 (5,5%), IIB - у 23 (14,1%), ША-у 29 (17,8%), HIB - у 7 (4,3%). Всем пациентам проведено радикальное хирургическое лечение в зависимости от распространенности процесса, которое по принятой в торакальном отделении РОНЦ РАМН методике базируется на выполнении операций с полной медиастинальной лимфодиссекцией: в 95 случаях (58,3%) - лобэктомии и билобэктомии, а в 68 (41,7%) - пневмонэктомии. Никаких достоверных различий при сравнении групп с различными значениями молекулярно-биологических факторов по клинико-морфологическим, клинико-анатомическим характеристикам, по локализации и по стадии, типу оперативного вмешательства получено не было.

При изучении распространенности опухолевых маркеров у больных НМРЛ накопление белка р53 в ядрах опухолевых клеток встречалось в 53,4% (87 из 163) случаев. Это соответствует, в целом, данным литературы [Greenblatt М., 1994, Sidransky D., 1996, Brambilla Е., 1996; Eerola A-IC., 1997; Nishio M., 1996; Konishi Т., 1997; Ishida H., 1997, Gu J., 2003]. Более высокая общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость отмечена при отсутствии определения ядерного р53 в опухоли: 63,1% против 34,35% (р=0,001) и 59,8% против 35,7%о (р=0,01), соответственно. В группе пациентов с отсутствием метастазов в регионарные и лимфатические узлы средостения так же была отмечена более высокая 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость при отсутствии экспрессии р53: 74,6% против 38,7%> (р=0,001) и 69,7% против 37,7% (р=0,001), соответственно. При анализе выживаемости у пациентов с наличием метастазов в регионарные и лимфатические узлы средостения (N+) подобных достоверных различий получено не было. Так, у данных больных 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость составили 38,8% против 28,0% (р=0,38) и 35,5% против 31,7% (р=0,54). Таким образом, у больных с распространенным опухолевым процессом (метастазы в регионарные и средостенные лимфатические узлы) корреляция между экспрессией р53 и плохим прогнозом утрачивается и наблюдается лишь тенденция к увеличению выживаемости при отсутствии экспрессии мутантного р53 в опухолевых клетках. Это может быть связано с накоплением изменений в опухолевых клетках, в том числе случаев с ложно-отрицательным значением р53 [Степанова Е.В., 2002]. Полученные данные о наличии связи между экспрессией мутантного белка р53, определяемого иммуногистохимическим методом, и низкой выживаемостью при ранних стадиях HMPJI (отсутствие метастазов в лимфатических узлах) созвучно выводам ряда работ последних лет [Zhao Y., 1999; Ahrendt S., 2003; Cheng Y., 2003].

Белки семейства BCL-2 являются одними из основных эффекторов апоптоза в клетке. Мы исследовали экспрессию двух белков этого семейства в ткани HMPJI: BCL-2, ингибитора апоптоза, и Вах, индуктора апоптоза. Экспрессия BCL-2 в цитоплазме опухолевых клеток выявлена нами в 26,4% случаев (43 пациента). При этом, анализ групп с наличием или отсутствием экспрессии BCL-2 не выявил различий в общей и безрецидивной 5-летней выживаемости, вне зависимости от распространенности опухолевого процесса. Определение частоты встречаемости экспрессии BCL-2 в группах переживших 5 лет после хирургического лечения и умерших также не выявило достоверной разницы в этих группах. Полученные результаты монофакторного анализа позволяют согласиться с рядом авторов [Fleming M., 1998; Anton R., 1997; Greatens T., 1998; Nguyen V., 2000, Lai R., 2002], что экспрессия bcl-2 не является независимым фактором прогноза выживаемости пациентов с НМРЛ.

Экспрессия ВАХ встретилась нам в 48,5% случаев (79 пациентов). Более длительная 5-летняя общая выживаемость отмечалась при наличии положительного ВАХ в группе больных без оценки распространенности: 56,7% против 38,7% (р=0,01). Так же, в группе с благоприятным прогнозом отмечена достоверная разница в более частой экспрессии ВАХ у пациентов в группе N0: 51,7% против 28,3% (р=0,02). Данная связь между наличием экспрессии ВАХ и благоприятным прогнозом НМРЛ утрачивалось в группе с наличием лимфогенных метастазов. Поученные данные созвучны результатам Gessner С. [2002] в том, что экспрессия Вах является значимым положительным фактором прогноза течения НМРЛ после радикального хирургического лечения.

Экспрессия VEGF - одного из основных стимуляторов апгиогенеза, была выявлена в цитоплазме опухолевых клеток в 49,7% (81 из 163) случаев Р1МРЛ. Данный фактор показал значимое влияние на выживаемость пациентов НМРЛ, особенно при отсутствии метастазов. Так, оценивая данную группу пациентов в целом, общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость была выше при отсутствии экспрессии VEGF: 64,3% против 31,6% (р=0,00002) и 59,3% против 28,1% (р=0,00006). Данная взаимосвязь сохранялась и при анализе пациентов с отсутствием метастазов в регионарные лимфатические узлы (Рис. 11): 74,4% против 35,0% (р=0,00000) и 72,6%) против 32,4% (р=0,00000). У пациентов с наличием лимфогенных метастазов выраженное отрицательное влияние экспрессии VEGF на выживаемость утрачивалось. Можно отметить, что экспрессия VEGF достоверно чаще встречается в группе пациентов с неблагоприятным прогнозом, но при выделении из общей когорты больных с лимфогенными метастазами данное влияние на выживаемость при HMPJI нивелируется. Эти результаты созвучны результатам ряда работ последних лет [Volm М., 2000; Yuan А., 2000, Yuan А., 2001, Степанова Е.В., 2002] и противоречат сообщению Marrogi А. (2000). Однако, корреляции с наличием поражения лимфатических узлов, на которую обращают внимание данные авторы [Volm М., 2000; Yuan А., 2001, Степанова Е.В., 2002] мы не отметили.

Влияние выявленной делеции' в области 1р32-36 мы оценили у 92 человек из рассматриваемой группы. Предполагается, что на коротком плече первой хромосомы локализован кластер генов, предположительно аптионкогенов, утрата которых коррелирует с низкими прогностическими показателями [Cheung Т., 1999]. Наличие делеции было выявлено в 32,6% случаев (30 пациентов). Оценивая результаты хирургического лечения у данных пациентов было выявлено, что в группе с отсутствием делеций в областях 1р32-36 SROl и SR02 общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость была выше: 63,9% против 38,3% (р=0,03) и 63,9% против 34,6% (р=0,02). Учитывая, что у большинства пациентов была ранняя стадия болезни (лишь у 6 человек имелись метастазы в регионарные лимфатические узлы), то влияние делеции в области короткого плеча первой хромосомы на выживаемость мы могли достоверно оценить лишь в группе N0. При анализе пациентов переживших или умерших в 5-летний срок, достоверно чаще делеции встречались в группе с неблагоприятным прогнозом (р=0,05). Таким образом, факт утраты области 1р32-36 является индикатором неблагоприятного прогноза при ранних стадиях опухолевого процесса (группа N0), связан с агрессивным течением опухолевого процесса и достоверным ухудшением выживаемости у данных пациентов, эти данные согласуются с результатами предыдущих исследований [Gasparian et al., 1998, Chizhikov et al., 2001].

Одним из важнейших свойств опухоли является высокая генетическая изменчивость, что позволяет выживать все более и более агрессивным клонам опухолевой популяции. Определение клеток с выраженной анеуплоидией в удаленной опухоли позволяет предсказать более агрессивное течение заболевания и использовать эти данные для адекватного прогнозирования. Литература последних лет содержит сведения об информативности ДНК-плоидности опухолевых клеток при различных новообразованиях человека, в том числе и при НМРЛ [Богатырев В.Н., 1998; Gawrychowski J.,2003]. Приведенные работы подчас противоречивы, не всегда выполнены на значительном количестве наблюдений, что не позволяет в полном объеме судить о прогностической значимости определения плоидности опухоли для онкологической клиники [Ikonen J., 2002].

Анализ плоидности ДНК опухоли мы провели у 115 пациентов из данной группы пациентов. Генетическая нестабильность в виде наличия апеуплоидии была выявлена в 66,08% случаев НМРЛ (76 пациентов). Общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость была достоверно выше в группе с диплоидными опухолями: 89,2% против 31,7% (р=0,00000) и 81,2% против 32,4% (р=0,00000). Такое же значимое влияние на выживаемость сохранялось независимо от наличия или отсутствия лимфогенных метастазов. В группе пациентов N0 общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость составила 90,3% против 37,1% (р=0,00001) и 81,2% против 35,7% (р=0,0004), соответственно. У пациентов с метастазами в регионарные и лимфатические узлы средостения общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость составила: 87,5% против 11,7%, соответственно (р=0,00375) и 87,5% против 11,6% (р=0,0299), соответственно. Изучение генетической нестабильности опухолевой клетки (анеуплоидии) может достоверно повысить точность прогнозирования результатов хирургического лечения НМРЛ даже при проведении монофакторного анализа при любой распространенности опухолевого процесса. Полученные результаты соответсвуют данным Gawrychowski J. [2003], исследовавшим значение плоидности опухоли и пролиферативной активности клеток при HMPJI у 191 пациента после хирургического лечения и выявившим, что анеуплоидия опухоли достоверно коррелирует с низкой выживаемостью больных.

Пролиферативная активность опухоли, в том числе количество делящихся клеток, является интегральным показателем независимости от ростовых сигналов; нечувствительности к сигналам, блокирующим деление; неограниченной возможности деления; адекватного ангиогенеза. В нашем исследовании мы оценивали пролиферативную активность опухоли на основании определения процента опухолевых клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла у 112 пациентов, рассматриваемой группы, с помощью лазерной ДНК-проточной цитофлуометрии. Все пациенты были разделены на 2 группы: в I группу вошли 59 человек пережившие 5 летний рубеж, а во II -умершие в этот период времени. Среднее значение количества клеток в S-фазе составило: 5,57±0,31 % в I группе и 10,88± 0,66 во второй (р=0,001). Мы получили, что даже в монофакторном анализе определение процента опухолевых клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, как маркера пролиферативной активности опухоли, является прогностически значимым. А уменьшение количества опухолевых клеток в S-фазе цикла корреллирует с большей выживаемостью, независимо от местной распространенности заболевания. Эти результаты созвучны с данными Gawrychowski J.(2003), Полоцкого Б.Е. (1995) и противоречат исследованию финских авторов [Ikonen J., 2002].

В настоящее исследование различий между наиболее часто встречающимися формами немелкоклеточного рака легкого вошли 101 (61,9%) пациент ПРЛ и 57 (34,9%) - АК легкого. При анализе выживаемости пациентов после радикальных операций было выявлено, что она не различалась при хирургическом лечении больных плоскоклеточным раком и аденокарциномой легкого. Однако, оценивая в целом две рассматриваемые группы можно отметить различия, как в клинических, так и молекулярнобиологических характеристиках опухоли. Так в группе ПРЛ количество мужчин значительно преобладало, составляя 96,4% пациентов. А в группе АК женщины 43,9% больных, разница между сравниваемыми группами достоверна, р=0,001. Заметны отличия и в объеме выполняемых вмешательств у данных пациентов, так в случае ПРЛ количество выполненных пневмонэктомий достоверно превышает этот показатель у больных АК: 54,5% против 26,3%, соответственно (р=0,001). Этот факт может быть объяснен различиями рассматриваемых гистологических форм рака легкого в клинико-анатомической форме опухоли, превалирующей в каждом из случаев. Для АК легкого более характерно периферическое расположение первичного очага (75,4% против 22,8% при ПРЛ, р=0,001), что обусловливает техническую возможность чаще выполнять сохранные операции в объеме лобэктомий. При анализе характеристики метастазирования данных гистологических форм рака легкого заметно более частое поражение лимфатических узлов легкого и средостения при АК (р=0,001). Причем именно метастазирование в лимфатические узлы средостения (уровень N2) более частое явление в данном случае (33,3% против 8%, р=0,001). При анализе молукулярно-генетических особенностей опухоли лишь экспрессия BCL-2 была достоверно выше у пациентов ПРЛ (33,7% и 14%, р=0,01). Эти результаты подтверждают данные других исследований, что экспрессия BCL-2 при плоскоклеточном раке легкого (2540%) сравнительно выше, чем в аденокарциномах (около 10%) [Pezella F., 1993; Jiang S., 1996; Higashiyama M., 1997; Apolinario R.M., 1997, Степанова E.B., 2002].

Для оценки весовой значимости изучаемых параметров при прогнозировании течения НМРЛ был проведен регрессионно-факторный анализ. При регрессионно-многофакторном анализе было выявлено, что молекулярно-биологические особенности опухоли имеют более выраженное влияние на выживаемость пациентов НМРЛ после радикального хирургического лечения, чем клинико-морфологические факторы. Изученный спектр молекулярно-биологических маркеров позволяет на основе вычисленных значений весовых коэффициентов каждого отдельного фактора с высокой адекватностью сопоставлять расчетные и фактические группы пациентов НМРЛ. Вне зоны доверительных интервалов, разграничивающих пациентов с неблагоприятным прогнозом (проживших менее 3 лет) и с благоприятным (более 5 лет) находилось от 2,5% пациентов (2 человека) при оценке группы НМРЛ в целом. При этом было показано, что использование исключительно клинико-морфологических данных не позволяет нам делать это. Схожие результаты были получены в исследовании, проводившемся одновременно с нашим, Лактионовым К.К. (2004) при анализе пациентов с ПРЛ после хирургического лечения. Данный спектр молекулярно-биологических характеристик опухоли представляется оптимальным для достоверного сопоставления группы пациентов НМРЛ с расчетной и фактической выживаемостью. Исключение какого-либо молекулярно-генетического параметра резко снижает адекватность прогнозирования. Сравнение с другими подобными работами показываем сопоставимую точность прогноза. Так, в работе японских авторов [Напа1 Т., 2002] сделана попытка создать модель прогнозирования течения НМРЛ с 17 факторами в ее основе (12 клинико-морфологических и 5 молекулярно-биологических (р27 (процентное отношение и интенсивность), экспрессия генов р53, сусИп Из), использование данной модели многофакторного анализа показало, что на основании данных факторов и алгоритмов у 104 из 125 пациентов (83%) прогнозирование оказалось возможным.

При многофакторном анализе групп пациентов ПРЛ и АК легкого, было выявлено, что имеются различия во влиянии изученных клинических и биологических факторов на выживаемость пациентов. А гистологическая структура опухоли является важным показателем, значимо влияющим на прогноз течения заболевания после радикального хирургического лечения. И данный показатель должен быть использован при прогнозировании течения НМРЛ и результатов лечения. Этот вывод созвучен с результатами большинства авторов, пытающихся создать многофакторные модели прогнозирования течения НМРЛ после хирургического лечения [Кш1а1ко\Уз1а Б., 1998; В'Аттсо Т., 2000; Напа1 Т., 2002] и показавшим, что вклад молекулярно-биологических и клинических факторов различен при анализе различных морфологических подтипов НМРЛ.

Анализируя в дальнейшем влияние молекулярно-биологических и клинических факторов, было выявлено разнонаправленное и разновеликое значение изучаемых параметров на выживаемость пациентов НМРЛ в группах N0 и Подобный разнонаправленный и разновеликий вклад рассмотренных факторов в прогнозирование течения НМРЛ обуславливает необходимость оценки данных пациентов в группах, соответственно распространенности опухолевого процесса. Это созвучно с результатами, полученными Лактионовым К.К. (2004) для пациентов с ПРЛ.

Подводя итог данной работы, можно отметить, что полученные результаты позволяют использовать изученную панель молекулярно-биологических и клинико-морфологических параметров, как действенный инструмент и в формировании групп риска прогрессирования и для индивидуального прогнозирования конкретного пациента НМРЛ после радикального хирургического лечения. Рассчитанные нами прогностические функции для больных НМРЛ позволяют с высокой степенью адекватности реальной зависимости разграничить группы с благоприятным и неблагоприятным прогнозом (с высоким риском прогрессирования в первые 3 года). Основываясь на этих результатах, появилась возможность у пациентов НМРЛ и высоким риском прогрессирования заболевания после радикального хирургического лечения провести адъюваитное лечение до появления клинических признаков рецидива заболевания.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Юдин, Денис Иванович, 2005 год

1. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2001 году.// Сб. "Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000", Москва, РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003, 85-106.

2. Барышников А.Ю., Степанова Е.В., Давыдов М.И. Молекулярные биомаркеры рака легкого.// Вестник ОНЦ им. Н.Н. Блохина, №1, 2000, 51-59.

3. Богатырев В.Н. Метод лазерной протоковой цитометрии. М, 1998, 7499.

4. Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е. Рак легкого. М, "Радикс", 1994.

5. Давыдов М.И. Полоцкий Б.Е. Хирургическое лечение немелкоклеточного рака легкого. Современные принципиальные позиции. Анналы Московского онкологического общества ,№2, 1997, 16-17.

6. Давыдов М. И., Полоцкий Б. Е. Современные принципы выбора лечебной тактики и возможность хирургического лечения немелкоклеточного рака легкого.// Сб. «Новое в терапии рака легкого» под редакцией Н.И. Переводчиковой, М. 2003, 41-53

7. Гаспарян А.В. Полиморфизм онкогенов и микросателлитных последовательностей генома у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и первичномножественными злокачественными новообразованиями.// Дис. кан. биол. наук, М. 1997.

8. Зборовская И.Б., Татосян А.Г. / Молекулярно-биологические маркеры при раке легкого: онкогены и гены супрессоры. // Новое в терапии рака легкого. Bristol-Myers Squibb 1997, 5-17.

9. Зборовская И. Б., Чижиков В.В. Детекция молекулярных нарушений, характерных для рака легкого. Возможности использования в клинической практике.// Сб. Новое в терапии рака легкого, 2003, 16-40.

10. Ю.Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза (обзор). //Биохимия 2000, 65: 5-33.

11. И.Коган Е.А., Жак Г., Кайзер У., Шилли М., Виттен А., Шурман М., Шерер А., Хавеманн К. Иммуногистохимия биомолекулярных маркеров рака легкого.// Архив патологии 1997, 6:23-30.

12. Колосов Е.А., Сусулева H.A. Новая технология компьютерной обработки данных в научно-практической работе.// Научная сессия МИФИ-2001, М, 2001, 162-163.

13. Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены.// «Канцерогенез» под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Научный мир, 2000. М, Медицина, 2004.

14. Лактионов К.К. / Плоскоклеточный рак легкого (значение клинико-морфологических и молекулярно-биологических характеристик опухоли в прогнозировании результатов хирургического лечения)// Дис. докт.мед.наук. М.,2004.

15. Полоцкий Б.Е. / Хирургическое лечение немелкоклеточного рака легкого (результаты, факторы прогноза и биологические особенности опухоли)// Дис. докт.мед.наук. М., 1995.

16. Татосян А.Г. Онкогены.// «Канцерогенез» под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Научный мир, 2000, 57-74.

17. Трахтенберг А.Х., Чиссов В.И. Клиническая онкопульмонология.// М., изд-во «Геотар», 2000.

18. Харченко В.П., Кузьмин И.В. Рак легкого. //М., Медицина, 1994.

19. Чижиков В.В Соматические и наследственные Молекулярно-биологические изменения, ассоциированные с развитиемнемелкоклеточного рака легкого. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2001.

20. Чумаков П.М. р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. Т.65. С.34-48.

21. Ahrendt S., Ни Y., Buta М., McDermott М., Benoit N., Yang S., Wu L., Sidransky D., p53 mutations and survival in stage I non-small-cell lung cancer: results of a prospective study. J Natl Cancer Inst. 2003 Jul 2;95(13):961-70.

22. Anton R., Brown R., Younes M., Gondo M., Stephenson M., Cagle P. Absense of prognostic signoficance of BCL-2 immunopositivity in non-small lung cancer: analisys of 427 cases. Hum.Pathol., 1997 Sept, 28(9): 1079-82.

23. BouckN. p53 and angiogenesis. 1996 May 16; 1287(l):63-6.

24. Brambilla E., Nagoescu A., Gazzeri S., Lantuejoul S., Moro D., Brambilla C., Coll J-L. Apoptosis-related factors p53, BCL-2, and BAX in neuroendocrine lung tumors.//Am. J. Pathol. 149,1996, 1941-1952.

25. Carvalho P., Antonangelo L., Bernardi F., Leao L., Rodrigues O., Capelozzi V. Useful prognostic panel markers to express the biological tumor status in resected lung adenocarcinomas. Jpn J Clin Oncol. 2000 Nov;30(l l):478-86.

26. Chang J., Chen Y., Chen C., Chen J., Chen S., Wang Y. Correlation of genetic instability with mismatch repair protein expression and p53 mutations in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2000 May;6(5): 1639-46.

27. Cheng Y., Lee S., Harn H., Chen C., Chang Y., Chen J., Yu C. Prognostic prediction of the immunohistochemical expression of p53 and pl6 in resected non-small cell lung cancer. Eur J Cardiothorac Surg. 2003 Feb;23(2):221-8.

28. Cheung T., Chung T., Poon C., Hampton G., Wang V., Wong Y. Allelic loss on chromosome 1 is associated with tumor progression of cervical carcinoma. Cancer. 1999 Oct 1;86(7): 1294-8.

29. Chiba Y., Taniguchi T., Matsuyama K., Sasaki M., Kato Y., Tanaka H., Muraoka R., Tanigawa N. Tumor angiogenesis, apoptosis, and p53 oncogene in stage I lung adenocarcinoma. Surg Today. 1999;29(11):1148-53.

30. Choma D., Daures J., Quantin X., Pujol J. Aneuploidy and prognosis of non-small-cell lung cancer: a meta-analysis of published data. Br J Cancer. 2001 Jul 6;85(1): 14-22.

31. Chowdary D., Dermody J., Jha K., Ozer H. Accumulation ofp53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway//Mol Cell Biol, 1994, 14, 19972003.

32. Costa A., Silvestrini R., Mochen C., Lequagle C., BoiTachi P., Faranda A., Vessecchia G., Ravasi G. P53 expression, DNA ploidy and S-phase cell fraction in operaleble loccally advanced non-small-cell lung cancer. //BrJ.Cancer. 73 (1996) 914-919

33. Cox G., Walker R., Muller S. et al. Does immunoin- tensity account for the differences in prognostic signifi cance of BCL-2 expression in non-small cell lung cancer? // Pathol Oncol Res, 2000, 6, 87-92

34. Dosaka-Akita H., Katabami M., Hommura H., Fujioka Y., Katoh H., Kawakami Y. BCL-2 expression in non-small cell lung cancers: higher frequency of expression in squamous cell carcinomas with earlier pT status. Oncology. 1999 Apr;56(3):259-64.

35. DA.mico T., Massey M., Herndon J. 2nd, Moore M., Harpole D. Jr. A biologic risk model for stage I lung cancer: immunohistochemical analysis of 408 patients with the use of ten molecular markers. J Thorac Cardiovasc Surg. 1999 Apr;l 17(4):736-43.

36. D'Amico T., Aloia T., Moore M., Herndon J. 2nd, Brooks IC., Lau C., Harpole D. Jr. Molecular biologic substaging of stage I lung cancer according to gender and histology. Ann Thorac Surg. 2000 Mar;69(3):882-6.

37. Eerola A., Tormanen U., Rainio P. et al. Apoptosis in operated small cell lung carcinoma is inversely related to tumour necrosis and p53 immunoreactivity.//J. Pathol. 1997. -Vol.181 -N2 -P. 172-177.

38. Folkman J. Tumor angiogenesis. In Cancer Medicine, JF. Holland, RC.Bast, DL.Morton, E.Frei, DW.Kufe, RR.Weichselbaum, eds. //(Baltimore, MD: Williams and Wilkins), 1997, 181-204.

39. Fong K., Zimmerman P., Smith P. Tumor progression and loss of heterozygosity at 5q and 18q in non-small cell lung cancer // Cancer Res. 1995a. V.55. P.220-223.

40. Fong K., Kida Y., Zimmerman P., Smith P. Loss of heterozyhosity frequently affects chromosome 17q in non-small cell lung cancer // Cancer Res. 1995b. V.55. P.4268-4272.

41. Fontanini G., Bigini D., Vignati S., Basolo F., Mussi A., Lucchi M., Chine S., Angeleti C., Harris A., Bevilacqua G. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. //J. Pathol. 177,1995,57-63.

42. Froudarakis M., Sourvinos G., Foumel P., Bouros D., Vergnon J., Spandidos D., Siafakas N. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosomes 9 and 17 in non-small cell lung cancer. Chest. 1998 Apr;l 13(4): 1091-4.

43. Fu X., Zhu X., Shi D., Xiu L., Wang L., Zhao S., Qian H., Lu H., Xiang Y., Jiang G. Study of prognostic predictors for non-small cell lung cancer.

44. Lung Cancer. 1999 Feb;23(2): 143-52.

45. Gasparian A.V, Laktionov K.K., Belialova M.S., Pirogova N.A., Tatosyan A.G., Zborovskaya I.B. Allelic imbalance and instability of microsatellite loci on chromosome lp in human non-small-cell lung cancer // Br J Cancer. 1998. V.77. P.1604-1611.

46. Gawrychowslci J, Lackowska B, Gabriel A., Prognosis of the surgical treatment of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC)—relation to DNA ploidy. Eur J Cardiothorac Surg. 2003 Jun;23(6):870-7.

47. Gessner C., Liebers U., Kuhn H., Stiehl P., Witt C., Schauer J., Wolff G. BAX and pl6INK4A are independent positive prognostic markers for advanced tumour stage of nonsmall cell lung cancer. Eur Respir J. 2002 Jan;19(l): 134-40.

48. Granone P., Margaritora S., Cesario A., Bonatti P., Galetta D., Picciocchi A. Concurrent radio-chemotherapy in N2 non small cell lung cancer: interim analysis.Eur J Cardiothorac Surg 1997 Sep; 12 (3):366-71.

49. Graziano S. Non-small cell lung cancer: clinical value of new biological predictors. Lung Cancer, 1997, vol. 17, h. 37-58.

50. Greatens T., Niehans G., Rubins J., Jessurun J., Kratzke R., Maddaus M., Niewoehner D. Do molecular markers predict survival in non-small-cell lung cancer? Am J Respir Crit Care Med. 1998 Apr; 157(4 Pt 1): 1093-7.

51. Greenblatt M.,Bennett W., Hollstein M., Harris C. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. //Cancer Res. 54, 1994, 4855-4878.

52. Hanahan D., Follanan J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 1996 Aug 9;86(3):353-64.

53. Harpole D. Jr, Richards W., Herndon J. 2nd, Sugarbalcer D. Angiogenesis and molecular biologic substaging in patients with stage I non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg. 1996 May;61(5): 1470-6.

54. Hirsch F., Franklin W., Gazdar A., Bunn P. Jr. Early detection of lung cancer: clinical perspectives of recent advances in biology and radiology. Clin Cancer Res. 2001 Jan;7(l):5-22.

55. Jassem E., Gozdz S., Badzio A., Kobierska G., Skolcowski J., Damps I., Urbaniak A., Jassem J. Prognostic value of P53 protein in cells of non-small cell lung cancer Pneumonol Alergol Pol. 2000;68(7-8):327-35.

56. Jiang S., Kameya T., Sato Y., Yanase N., Yoshimura H., ICodama T. BCL-2 protein expression in lung cancer and close correlation with neuroendocrine differentiation. //Am.J.Pathol. 148,1996, 837-846.

57. Jost C., Marin M., Kaelin W. Jr. p73 is a simian correction of human. p53-related protein that can induce apoptosis. Nature. 1997 Sep 11;389(6647): 191-4.

58. Kaghad M., Bonnet H., Yang A., Creancier L., Biscan J., Lelias J. Monoallellically expressed gene related to p53 at lp36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers // Cell. 1997. V.90. P.808-819.

59. Kaiser U., Schilli M., Haag U., Neumann K.3 Kreipe H., Kogan E., Havemann K. Expression of BCL-2-protein in small cell lung cancer. //Lung Cancer 15,1996, 31-40.

60. Kawai T., Suzuci M., Kono S. et al. // Cancer. 1994, Vol. 74, p. 2468-2475.

61. Khan OA, Fitzgerald JJ, Field ML, Soomro I, Beggs FD, Morgan WE, Duffy JP. Histological determinants of survival in completely resected Tl-2N1M0 nonsmall cell cancer of the lung. Ann Thorac Surg. 2004 Apr;77(4): 1173-8.

62. Kitagawa Y., Wong F., Lo P., Elliott M., Verburgt L., Hogg J., Daya M. Overexpression of BCL-2 and mutations in p53 and K-ras in resected human non-small cell lung cancers. //Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 15,1996, 45-54.

63. Konishi T., Lin Z., Fujino S., Kato H., Mori A. Association of p53 protein expression in stage I lung adenocarcinoma with reference to cytological subtypes. Hum Pathol. 1997 May;28(5):544-8.

64. Kubota Y., Petres R., Easley K. et al. // Cancer., 1992, Vol.70, P. 26022609.

65. Lai R., Wang J., Hsu H., Chang H., Lin C., Lin M. Prognostic evaluation of the expression of p53 and BCL-2 oncoproteins in patients with surgically resected non-small cell lung cancer. Jpn J Clin Oncol. 2002 0ct;32(10):393-7.

66. Lavezzi A., Santambrogio L., Bellaviti N., Biondo B., Nosotti M., Radice F., Matturri L. Prognostic significance of different biomarlcers in non-small cell lung cancer. Oncol Rep. 1999 Jul-Aug;6(4):819-25.

67. Laudanski J., Niklinska W., Burzylcowslci T., Chyczewski L., Niklinski J. Prognostic significance of p53 and BCL-2 abnormalities in operable nonsmall cell lung cancer. Eur Respir J. 2001 Apr; 17(4):660-6.

68. Liao M., Wang H., Lin Z., Feng J., Zhu D. Vascular endothelial growth factor and other biological predictors related to the postoperative survival rate on non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2001 Aug-Sep;33(2-3): 125-32.

69. Marrogi A., Travis W., Welsh J. Nitric oxide synthase, cyclooxegenase 2 and vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of non-small cell lung cancer// Clin Cancer Res, 2000, 6, 4739-4744.

70. Mattern J., Koomagi R., Volm M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. //Br.J.Cancer 73, 1996, 931-934.

71. Mattern J., Koomagi R., Volm M. Characteristics of long-term survivors of untreated lung cancer. Lung Cancer. 2002 Jun;36(3):277-82.

72. Mitsudomi T., Oyama T., Nishida K., Ogami A., Osalci T., Sugio K., Yasumoto K., Sugimachi K., Gazdar A. Loss of heterozygosity at 3p in non-small cell lung cancer and its prognostic implication // Clinical Cancer Res. 1996. V.2. P.l 185-1189.

73. Mountain C. Revisions in the International System for Staging Lung Cancer//Chest. 1997 Jun;l 11(6): 1710-7.

74. Niklinska W., Burzykowski T., Chyczewsld L., Niklinski J. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in non-small cell lung cancer (NSCLC): association with p53 gene mutation and prognosis. Lung Cancer. 2001 Dec;34 Suppl 2:S59-64.

75. Niklinski J., Niklinska W., Laudanski J., Chyczewska E., Chyczewski L. Prognostic molecular markers in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2001 Dec;34 Suppl 2:S53-8.

76. Nguyen V., Mirejovsky P., Mirejovsky T., Melinova L., Mandys V. Expression of cyclin Dl, Ki-67 and PCNA in non-small cell lung cancer: prognostic significance and comparison with p53 and BCL-2. Acta Histochem. 2000 Aug;102(3):323-38.

77. Pezzella F., Turley H., Kuzu I., Tungekar M., Dunnil M., Pierce C., Harris A., Gatter K., Mason D. BCL-2 protein in non-small-cell lung carcinoma. //New Engl.J.Med. 329,1993, 690-694.

78. Pitterle D., Jolicoeur E., Bepler G. Hot spots for molecular genetic alterations in lung cancer. In Vivo. 1998 Nov-Dec; 12(6):643-58.

79. Pifarre A., Rosell R., Monzo M., De Anta J., Moreno I., Sanchez J., Ariza A., Mate J., Martinez E., Sanchez M. Prognostic value of replication errorson chromosome 2p and 3p in non-small-cell lung cancer // Br J Cancer. 1996. V.75. P.184-189.

80. Roberts H., Komaki R., Allen P., El-Naggar A. Prognostic significance of DNA content in stage I adenocarcinoma of the lung.

81. Rosell R, Li S., Skacel Z., Mate J., Maestre J., Canela M., Tolosa E., Armengol P., Barnadas A., Ariza A. Prognostic impact of mutated K-ras gene in surgically resected non-small cell lung cancer patients // Oncogene. 1993. V.8. P.2407-2412.

82. Shankey T., Rabinovitch P., Bagwell B., Bauer K. et al., Guidelines for implementation of clinical DNA cytometry.- Cytometry, 1993, v. 14, N2., p. 472- 477.

83. Simony J., Pujol J., Radal M. et al. // Cancer Res. 1996, Vol. 50, P. 43824387.

84. Schwarting R. // Lab. Invest. 1993. - Vol. 68. - P. 597-599.

85. Talcanami I., Imamura T., Hashizume T., Kikachi K., Yamamoto Y., Yamamoto T., Kodaira S. //Immunohistochemical detection of basic fibroblast growth factor as prognostic indicator in pulmonary adenocarcinoma. Jpn.J.Clin.Oncol. 26 (1997) 293-297.

86. Tanalca F., Kawano Y., Li M., Takata T., Miyahara R., Yanagihara K., Ohtalce Y., Fulcuse T., Wada H. Prognostic significance of apoptotic index in completely resected non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 1999 Sep;17(9):2728-36.

87. Tomita M., Matsuzaki Y., Edagawa M., Shimizu T., Hara M., Onitsuka T. Prognostic significance of BCL-2 expression in resected pN2 non-small cell lung cancer. Eur J Surg Oncol. 2003 Oct;29(8):654-7.

88. B.Tugekar M., Gatter K., Dunnill M., Mason D. Ki-67 immunostaining and survival in operable lung cancer. //Histopathology 19,1991, 545-550.

89. Volm M.5 Koomagi R., Mattern J. Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Fit-1 in squamous cell lung cancer. //Int.J.Cancer 74 (1997) 64-68.

90. Wistuba II, Behrens C., Milchgrub S., Bryant D., Hung J., Minna J., Gazdar A. Sequential molecular abnormalities are involved in the multistage development of squamous cell lung carcinoma. Oncogene. 1999 Jan 21;18(3):643-50.

91. Xinarianos G., Liloglou T., Prime W., Maloney P., Callaghan J., Fielding P., Gosney J., Field J. hMLHl and hMSH2 expression correlates with allelic imbalance on chromosome 3p in non-small cell lung carcinomas // Cancer Res. 2000. V.60. P.4216-4221.

92. Yuan A., Yu C.,Chen W. Correlation of total VEGF mRNA and protein expression with histologic type, tumor angiogenesis, patient survival and timing of relapse in non-small lung cancer// Int J Cancer, 2000, 89, 475-483.

93. Yuan A., Yu C., Kuo S. Vascular endothelial growth factor 189 mRNA isoform expression specifically correlates with tumor angiogenesis, patient survival and postoperative relapse in non-small lung cancer// J Clin Oncol, 2001, 19,432-441.

94. Zhao Y., Wu D., Xiang X., Zhang B., Zhou N., Hu Y. p53 gene mutations in non-small cell lung cancer detected by polymerase chain reaction singlestrand conformation polymorphism analysis. Chin Med Sci J. 1999 Sep; 14(3): 134-7.

95. Zhou X., Kemp B., Khuri F., Liu D., Lee J., Wu W., Hong W., Mao L. Prognostic implication of microsatellite alteration profiles in early-stage non-small cell lung cancer // Clinical Cancer Res. 2000. V.6. P.559-565.k