Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Жаринов, Владислав Сергеевич

• Жаринов, Владислав Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Жаринов, Владислав Сергеевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Хромосомные аберрации при лейкозах у детей.

1.2. Методы анализа генома.

1.3. Минимальная остаточная болезнь.

1.4. Применение микрочипов в онкологии.

1.5. Изоформы химерных генов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами»

Проблема молекулярной диагностики лейкозов у детей может быть решена с помощью высокотехнологичного метода, использующего высокие производительность и чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР), точность и специфичность, обеспечиваемые гибридизацией с олигонуклеотидными микрочипами. Последние представляют собой объёмные гелевые ячейки на предметном стекле, которые являются «миниатюрными микропробирками», содержащими уникальные участки ДНК, комплементарные анализируемым фрагментам. Только такой подход позволяет использовать микрообъёмы пробы, обеспечивает необходимую экономичность. Кроме того, комбинация мультиплексной ПЦР и гибридизации дали возможность осуществить анализ значительного числа образцов силами небольшого коллектива в краткие сроки. Определение точных мест перестроек при образовании химерных генов стало возможным благодаря применению технологии гибридизации, выполняющей в данном случае и функцию методов секвенирования. Внедрение молекулярных методов диагностики в детскую онкогематологическую практику в нашей стране активно происходит в последние годы. Такие методы анализа возможно позволят улучшить выживаемость и качество жизни гематологических пациентов детского возраста.

Актуальность проблемы. Лейкозы - злокачественные заболевания кроветворной ткани. Ежегодно, в России регистрируется 1200 новых случаев лейкозов у детей. Еще несколько десятилетий назад, эта группа онкологических заболеваний считалась однородной, а успехи в лечении были не высокими. Однако, благодаря совершенствованию методов выявления лейкозов, росту возможностей лабораторной диагностики, проведению мультицентровых контролируемых исследований ситуация кардинально изменилась в лучшую сторону (Карачунский А.И., 1999, Самочатова Е.В., 1999). На основании данных морфологии, цитохимии, иммунофенотипирования удалось выявить варианты лейкозов и разделить ранее однородную патологию на конкретные нозологические формы и группы риска, требующие дифференцированной терапии. Это увеличило число пациентов, вышедших в стойкую ремиссию или излечившихся. Основным событием в исследовании лейкемии у человека последнего времени являются открытия конкретных генетических перестроек, либо приводящих непосредственно к появлению опухолевого клона, либо имеющих огромное прогностическое значение.

История прихода генетики в диагностику и лечение лейкозов ведёт начало с описания в 1960 году Nowell и Hungerford укороченной 22-ой хромосомы у больного с хроническим миелолейкозом. Такая картина повторялась от больного к больному, то есть она была «неслучайной» (Nowell, Hungerford, 1960). Эта хромосома была названа Филадельфийской и затем было показано, что она образуется в результате транслокации (de Klein А, 1982). Значение этого эпизода было колоссально, поскольку диагностика лейкозов была выведена на молекулярный уровень. В последние годы этот путь привел к созданию препаратов, которые выборочно блокируют действие онкобелков. Одним из первых был препарат Гливек, который открыл новую страницу в терапии хронического миелолейкоза. С тех пор было идентифицировано множество неслучайных хромосомных поломок напрямую участвующих в формировании онкологического заболевания, либо влияющих на его течение и прогноз, а в части случаев лишь помогающих следить за прогрессией заболевания или за остаточным пулом клеток опухоли (Rowley JD, Aster JC, 1993). Однако, ещё большее число обнаруженных транслокаций до сих пор носит характер случайных и требует дальнейшего изучения их роли в формировании или развитии опухоли.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют разделить всех пациентов с различными формами лейкозов на крупные подгруппы по наличию неслучайных транслокаций, или же их достоверному отсутствию. Для большей части этих аберраций выявлено клиническое значение в определении прогноза заболевания, и они являются важнейшими факторами риска в современных клинических исследованиях.

Стандартным методом диагностики значимых химерных генов, которые образуются при слиянии участков последовательностей протоонкогенов, при транслокации, на сегодня является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, которая обладает высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью для применения в клинических лабораториях (Cross N.C.P., 1994). Цитогенетическое исследование, остававшееся долгое время основным, и позволившее сделать множество открытий в определении генетической природы злокачественных новообразований крови у детей, не отвечает требованиям клиницистов. Обладая низкой чувствительностью, зависимостью возможности получить результат от множества факторов, влияющих на рост культуры клеток, субъективностью — оно уступает место новейшим разработкам в области анализа генома (Ma S.K. 1999, Prema Е. Devaraj, 1995). Необходимо отметить, что рано списывать стандартную цитогенентику из арсенала методов, применяемых в лабораторной и исследовательской практике, так как она даёт возможность представить комплексное изменение кариотипа в бластной клетке, однако, расширение возможностей новых методик, приводит всё более ограниченному использованию цитогенетического анализа в рутинной практике.

Сейчас возможно определение большого числа неслучайных хромосомных транслокаций, а точнее ещё более значимых их продуктов -химерных генов. Наиболее интересны с клинической точки зрения гибридные гены BCR/ABL, TEL/AML1, PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, MLL/AF4 и Е2А/РВХ. Тем не менее, тенденция к централизации онкогематологической помощи, создание кооперативных групп, ведущих совместные проекты, вводит новые требования к лабораторной службе. Данные о генетической природе бластных клеток, должны быть получены оперативно и быть абсолютно достоверными. Интеграция клиник для оптимизации помощи детям, страдающим лейкозами, увеличивает нагрузку на молекулярно-биологические подразделения лабораторных комплексов. Высокотехнологичные схемы лечения повышают ответственность, ложащуюся на крупные гематологические центры.

Требуется внедрение новых методов молекулярного анализа. Кроме того, они должны расширять данные, получаемые клиническим врачом о пациенте, о природе и свойствах опухолевых клеток, вызвавших онкологическое заболевание. И такие методы молекулярного анализа в последнее десятилетие появились.

Это, использующие нанотехнологии, — биологические микрочипы, которые находят всё более широкое применение в анализе экспрессии генов, определении точечных мутаций, выявлении онкобелков. Однако, в нашей стране, несмотря на международный приоритет отечественной науки в создании таких методов, анализ с их использованием практически не распространён. Возможности проведения молекулярно-генетического исследования всем пациентам детского возраста с острым лейкозом в России ограничены низкой оснащённостью лабораторий, высокой стоимостью расходных материалов. В то же время, тестирование доступных разработанных отечественных и высокоэффективных систем с использованием технологии микрочипов до последнего времени не проводилось.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: Улучшить качество диагностики и точность стратификации больных на группы риска при лейкозах у детей, путём определения хромосомных аберраций с использованием метода гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами.

Основные задачи исследования:

1. Провести испытания методики, основанной на мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом для анализа хромосомных аберраций в бластных клетках при лейкозах у детей на клеточных культурах и клинических образцах.

2. Применить в клинической диагностике указанный метод, определить диагностическую и прогностическую информативность разработанной методики и ее эффективность, сравнить с другими методами: ОТ-ПЦР, секвенированием.

3. Испытать метод мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе в анализе образцов пациентов с лейкозами для определения минимальной остаточной болезни.

4. Определить частоту встречаемости наиболее важных хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и вариантов мест перестроек методом мультиплексной ПЦР с гибридизацией на микрочипе и их корреляцию с клиническими характеристиками пациентов.

5. Внедрить в клиническую практику метод мультиплексной ПЦР и гибридизации для анализа наиболее значимых хромосомных транслокаций.

Научная новизна. Впервые применен метод мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипом для комплексной диагностики лейкозов у детей. Определена с помощью метода мультиплексной ПЦР и гибридизации с биологическим микрочипом частота наиболее клинически значимых транслокаций: 12% для TEL/AML1, 3,3% - MLL/AF4, 1% -BCR/ABL при ОЛЛ, 18% - PML/RARA, 13,3% - AML1/ETO при ОНЛЛ у группы онкогематологических пациентов в российской детской популяции. Показана возможность определения точки слияния в химерных генах при использовании данного метода. Прослежена связь субвариантов Ь2а2 и Ь3а2 химерного гена BCR/ABL, и bcrl, ЬсгЗ химерного гена PML/RARa с клиническим течением лейкоза у детей. Впервые проведён анализ клинических характеристик для пациентов с различными изоформами химерного гена BCR/ABL - Ь2а2 и Ь3а2, позволивший предположить их неравнозначное влияние на прогноз. Показана возможность отслеживания минимальной остаточной болезни или анализа не первичных образцов в условиях терапии острого и хронического лейкоза с помощью использования технологии микрочипов.

Научно-практическая значимость. Испытан новый метод диагностики основных хромосомных аберраций при лейкозах у детей. Частоты встречаемости хромосомных транслокаций соответствуют таковым для других регионов, что подтверждает целесообразность использования единых протоколов лечения в терапии лейкозов во всём мире.

Разработка и внедрение метода молекулярно-генетического исследования с использованием мультиплексной ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом позволяют точнее верифицировать опухоль, поставить диагноз, осуществлять долгосрочный прогноз, корректировать терапию в соответствии со свойствами опухоли.

В результате выполненной работы реализован ряд эффектов: медицинский - улучшение диагностики и определения прогноза; экономический - уменьшение затрат на диагностику и лечение; научный -появилась возможность скринингового анализа пациентов на наличие основных хромосомных аберраций, открылись возможности для мультицентровых исследований с целью определения значения тех или иных транслокаций и их изоформ; биологический - адаптирована методика применения олигонуклеотидных микрочипов для анализа химерных РНК путём гибридизации.

Организация исследования. Работа выполнена в ГУ НИИ Детской гематологии МЗ РФ (директор ГУ НИИ ДГ МЗ РФ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев) на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, РАН (директор ИМБ РАН - академик РАН, доктор химических наук, профессор А.Д.Мирзабеков ). Исследование проводилось в соответствии с планом НИР №005/019/001 по теме: «Разработка и внедрение в практику молекулярно-генетических методов диагностики и биологически обоснованных методов терапии и профилактики заболеваний крови у детей и подростков»

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 20-21 июня, 2002 г.); на III симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 6-7 февраля, 2003 г.); на III съезде онкологов и радиологов СНГ (Республика Беларусь, Минск, 25-28 мая 2004 г.).

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников ГУ НИИ Детской гематологии и Российской Детской Клинической Больницы 23 сентября 2004 года.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, отечественных и зарубежных авторов, приложения. Материал диссертации изложен на 108 страницах (без приложения), содержит 15 таблиц, 10 рисунков. Список литературы включает 148 источников литературы: 17 отечественных и 131 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Жаринов, Владислав Сергеевич

Выводы

1. Разработанный метод ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах - высокочувствительный и специфичный метод анализа ряда хромосомных аберраций. С его помощью возможно точное определение места перестройки без применения секвенирования образца.

2. Применение новой технологии является научно и экономически целесообразным. При возможности получения полной информации о наличии восьми транслокаций с их изоформами стоимость анализа в два раза меньшая, чем при использовании стандартной ОТ-ПЦР (60$ vs 100$).

3. Применение микрочипов имеет ряд преимуществ перед стандартными методиками. Основные из них: уменьшение числа необходимых манипуляций, повышенная специфичность, объективность анализа, производительность.

4. Частота обнаруживаемых с помощью мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с микрочипами значимых хромосомных аберраций при лейкозах у детей в российской популяции не отличается от данных, полученных с помощью стандартной ПЦР и данных из литературных источников.

5. Выявлено, что с помощью тест-системы на основе гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом возможны масштабные исследования больших групп пациентов на наличие основных клинически значимых хромосомных аберраций, а также мониторинг минимальной остаточной болезни. Показана высокая производительность методики и воспроизводимость данных.

6. Обнаружено, что при ХМЛ более неблагоприятным является Ь2а2 вариант химерного гена BCR/ABL. Выявлена тенденция к увеличению смертности в 2 раза по сравнению с вариантом Ь3а2.

7. При рецидивах ОЛЛ встречается с той же частотой что и при первичном ОЛЛ химерный ген TEL/AML1, с повышенной частотой химерный ген BCR/ABL (3% против 1% для первичных ОЛЛ), при рецидивах ОНЛЛ химерный ген AML1/ETO встречался в два раза чаще, чем при первичном ОНЛЛ.

Практические рекомендации

1. Для точной верификации диагноза, определения прогноза и группы риска следует в обязательном порядке проводить анализ инициальных образцов костного мозга и/или крови детей и подростков с впервые установленным диагнозом ОЛЛ или ОНЛЛ, а также ХМЛ на наиболее значимые хромосомные аберрации.

2. Следует проводить молекулярную диагностику для определения прогноза и верификации диагноза при рецидивах этих заболеваний.

3. В молекулярной диагностике лейкозов предпочтительно использование ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или мультиплексной ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией с олигонуклеотидным микрочипом.

4. Рекомендована организация широкомасштабных исследований клинического значения изоформ химерного гена BCR/ABL при ХМЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Жаринов, Владислав Сергеевич, 2004 год

1. Барский В.Е., Колчинский A.M., Лысов Ю.П., Мирзабеков А.Д.: Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике. Молекулярная биология, 2002,36, 563-584.

2. Карачунский А.И. Стратегия терапии острого лимфобластного лейкоза у детей. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук. Москва, 1999.

3. Кисляк Н.С. Гемобластозы у детей. Педиатрия, 1980, №5: с.3-12.

4. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев А.С.: Микрочипы на основе трёхмерных ячеек геля: история и перспективы. Молекулярная биология том, 2004,38, №1, 5-16.

5. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Храпко К., Шик В., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод. Доклады Академии Наук СССР, 1988,303, 1508-1511.

6. Пяткин Е.К. Цитогенетическое исследование при остром лейкозе. Проблемы гематологии и переливания крови, 1966, Май 11 (5), 14-23.

7. Румянцев А.Г., Карачунский А.И., Самочатова Е.В., Табет Хамдан: Лечение острого лимфобластного лейкоза по программе BFM. Педиатрия, 1991, №11: 5863.

8. Самочатова Е.В., Масчан А.А., Асланян К.С. и другие, Результаты программного лечения острого нелимфобластного лейкоза у детей в 8 клиниках России: ретроспективный анализ (1991-1997 гг.). Гематология и трансфузиология, 1999, т.44, № 2, с. 10.

9. Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. Пособие для врачей. Екатеринбург. Уральская Государственная медицинская Академия, 1998.

10. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Фечина Л.Г., Опыт использования полимеразной цепной реакции для выявления хромосоных аберраций в детской онкогематологии. Гематология и трансфузиология, 1999, т.44, №2, сс. 3-7.

11. Сергеев А.Г., Иванов Р.А., Фечина Л.Г.: Диагностическое и прогностическое значение генетических аномалий опухолевых клеток при лейкозах. Гематология и трансфузиология, 2000, Т. 45, с 28-35.

12. Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., Мирзабеков А.Д.: Бактериальный микрочип: принцип работы на примере обнаружения антибиотиков. Доклады Академии Наук, 2001, Т. 381, №6, с. 831-833.

13. Фролов А.Е., Годвин Э.К., Фаворова О.О.: Анализ дифференциальной экспрессии генов на ДНК-микрочипах и его применение в молекулярной онкологии. Молекулярная биология том, 2003, 37, №4, 573-584.

14. Херрис Н.Л., Яффе Э.С., Диболь Ж., Фландрин Ж., Мюллер Г.К., Вардимар Д., Листер Т.Э., Блумфилд Х.Д.: Классификация ВОЗ опухолей кроветворной и лимфоидной ткани. Проблемы гематологии, 2000, №3, с 35-51.

15. Armstrong SA., Stauton JE., Silverman LB., Pieters R, den Boer ML., et al: MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nature Genetics, 2002, vol 30 (1) January, 41-47.

16. Baesecke J., Griesinger F., Truemper L., Brittinger G.: Leukemia- and lymphoma-associated genetic aberrations in healthy individuals. Ann Hematology, 2002, 81: 6475.

17. Bains W., Smith G.C.: A novel method for nucleic acid sequence determination. J. Theor. Biol., 1988,135, 303-307.

18. Behm FG, Raimondi SC, Frestedt JL, Liu Q, Crist WM, Downing JR, Rivera GK, Kersey JH, Pui C-H. Rearrangement of MLL gene confers a poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia, regardless of presenting age. Blood, 1996, 87:2870-2877.

19. Benn P.A., Perle M.A.: Chromosome staining and banding techniques. Human Cytogenetics. Ed. By D.E. Rooney, 1992, Vol 1 (Constitutional Analysis), p91-118.

20. Bloomfield CP, Goldman Al, Alimena G, et al: Chromosomal abnormalities identify high-risk and low-risk patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1986, 67:415-420.

21. Boer J, Mahmoud H, Raimondi SC, Grosveld G, Krance R: Loss of DEK-CAN fusion transcript in a child with t(6;9) acute myeloid leukemia following chemotherapy and allogeneic bone marrow transplantation. Leukemia, 1997, 11:299-300.

22. Bosman FT, Schaberg A.: A new G-binding modification for metaphase chromosomes. Nat New boil, 1973, Feb 14,241(111), 216-223.

23. Brian J. Druker. Imatinib and chronic myeloid leukemia: validating the promise of molecularly targeted therapy. European Journal of Cancer. 2002 Sep; 38 Suppl 5:70-6.

24. Bruchova H, Kalinova M, Brdicka R. Array-based analysis of gene expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia Research, 2004, Jan; 28(1): 1-7.

25. Burns CP, Armitage JO, Frey AL, Dick FR, Jordan JE, Woolson RF.: Analysis of the presenting features of adult acute leukemia: the French-American-British classification. Cancer, 1981, May 15; 47(10): 2460-2469.

26. Campana D, Pui C-H: Detection of minimal residual disease in acute leukemia: methodological advances and clinical significance. Blood 1995; 85: 1416-34.

27. Caspersson T, Farber S, Foley GE, Kudynowski J, Modest EJ, Simonsson E, Wagh U, Zech L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 1968, Jan;49(l):219-22.

28. Caspersson T, Gahrton G, Lindsten J, Zech L.Identiflcation of the Philadelphia chromosome as a number 22 by quinacrine mustard fluorescence analysis. Experimental Cell Research. 1970 Nov;63(l):238-40.

29. Caspersson T, Zech L, Johansson C, Modest EJ. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents. Chromosoma, 1970, 30(2):215-27.

30. Castri MH, Schaison G, et al, Philadelphia chromosome-positive chronic myelocytic leukemia in children. Cancer 1983; 52:721.

31. Catovsky D.: Symposium: classification of leukemia. 1. The classification of acute leukemia. Pathology, 1982, Jul; 14(3): 277-281.

32. Devaraj PE., Foroni L, Kitra-Roussos V and Seker-Walker LM.: Detection of BCR-ABL and E2A-PBX1 fusion genes by RT-PCR in acute lymphoblastic leukemia with faild or normal cytogenetics. British Journal of Haematology, 1995, 89,349-355.

33. Dhingra K, Talpaz M, Kataijian H, Ku S, Rothberg J, Gutterman JU, Kurzrock R: Appearance of acute leukemia-associated pi 90 BCRABL in chronic myelogenous leukemia may correlate with disease progression. Leukemia, 1991, 5:191-195.

34. Downing J R. The molecular pathology of childhood leukemia. American Society of Clinical Oncology. Book, 1999,417-431.

35. Druker B.J., Lydon N.B.: Lessons learned from the development of an abl tyrosine kinase inhibitor for chronic myelogenous leukemia. Journal clinical investigation, 2000,105,3-7.

36. Druker Brian J.: STI571 (Gleevec™) as a paradigm for cancer therapy. A TRENDS Guide to cancer Therapeutics. Trends in molecular medicine, 2002, vol.8 No.4,14-18.

37. Fenaux P, Chomienne C, Biology and treatment of acute promyelocytic leukemia. Current Opinion Oncology, 1996, 8:3.

38. Grimwade D, Lo Coco F: Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia, 2002,16, 1959-1973.

39. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N, de Klein A, Bartram CR, Grosveld G. Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22. Cell. 1984 Jan;36(l):93-9.

40. Hackwell SM, Robinson DO, Harvey JF, Ross FM: Identification of false-positive CBFp/MYHll RT-PCRresults. Leukemia, 1999,13, 1617-1619.

41. Hayashi Y.: Gene expression profiling in childhood acute leukemia: progress and perspectives. International Journal Hematology, 2003, Dec;78(5):414-420.

42. Hillestad LK. Acute promyelocytic leukemia. Acta Med Scand., 1957, Nov 29; 159(3): 189-94.

43. Hiorns L, Swansbury Gl, Mehta J, Min T, Dainton MG, Treleaven J, Powles RL, Catovsky D. Additional chromosome abnormalities confer a worse prognosis in acute promyelocytic leukaemia. British Journal of Haematology, 1997,96, 314-321.

44. Huret JL, An Atlas on chromosomes in hematological malignancies. Example: 1 lq23 and MLL partners; Correspondence, Leukemia, 2001,15,987-999.

45. Jordan JA: Real-time detection of PCR products and microbiology. New technologies for life sciences: A Trends Guide. Trends in Microbiology 2000,December, pp. 61-66.

46. Kadkol SS, Bruno A, Dodge C, Lindgren V, Ravandi F. Comprehensive analysis of CBFbeta-MYHl 1 fusion transcripts in acute myeloid leukemia by RT-PCR analysis. Journal of Molecular Diagnostic, 2004, Feb;6(l):22-7.

47. Kalwinski DK., Raimondi SC, Schell MJ, Mirro J Jr, Santana VM, Behm F, Dahl GV, Williams D.: Prognostic importance of cytogenetic subgroups in de novo pediatric acute nonlymphocytic leukemia. Journal Clinical Oncology 1990, 8:75-86.

48. Karhu R, Vilpo L, Isola J, Knuutila S, Vilpo J: Cryopreserved Chronic Lymphocytic Leukemia Cells Analised by Multicolor Fluorescence in situ Hybridization after optimized mitogen stimulation. Genes, Chromosomes & Cancer, 2002,34:345-348.

49. Kaspers GJ, Smets LA, Pieters R, van-Zantwijt CH, van Wering ER, Veerman AJ.: Favorable prognosis of hiperdiploid common ALL may be explained by sensibility to antimetabolites other drugs. Blood, 1995, 85: 751-756.

50. Kees UR.: Gene expression signatures in lymphoid tumours. Immunology Cell Biology, 2004, Apr, 82(2): 154-60.

51. Kerney L: The impact of the new FISH technologies on the cytogenetics of haematological malignancies. British Journal Haematology, 1999,104: 648-658.

52. Khrapko K., Lysov Y., Khorlin A., Ivanov I., Yershov G., Vasilenko S., Florentiev V., Mirzabekov A.: A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Sequence 1, 1991,375-388.

53. Kohlmann A, Schoch C, Schnittger S, Dugas M, Hiddemann W, Kern W, Haferlach Т.: Molecular characterization of acute leukemias by use of microarray technology. Genes Chromosomes & Cancer, 2003, Aug, 37(4): 396-405.

54. Kohlmann A, Schoch C, Schnittger S, Dugas M, Hiddemann W, Kern W, Haferlach Т.: Pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) gene expression signatures classify an independent cohort of adult ALL patients. Leukemia, 2004, Jan, 18(1): 63-71.

55. Lemons RS, Keller S, Gietzen D, Dufner J, Rebentisch M, Feusner J, Eilender D: Acute promyelocytic leukemia. J Ped Hematol Oncol, 1995,17:198-210.

56. Lion T, Haas O. Acute megakaryoblastic leukemia with the t( 1 ;22)(p 13;ql3). Leuk Lymphoma, 1993,11:15-20.

57. Liu Yin JA, Tobal Kh: Detection of minimal residual disease in acute myeloid leukaemia: methodologies, clinical and biological significance. Review. British Journal of Haematology, 1999,106,578-590.

58. Loh ML, Silverman LB, Young ML, Neuberg D, Golub TR, Sallan SE, Gilliland DG: Incidence of TEL/AML1 fusion in children with relapsed acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1998,15:4792-4797.

59. Luna-Fineman S, Shannon K, Lange B. Childhood monosomy 7: epidemiology, biology, and mechanistic implications. Blood, 1995, 85:1985-1999.

60. Ma S.K., Wan T.S.K., Chan L.C.: Cytogenetics and molecular genetics of childhood leukemia. Hematology Oncology, 1999,17: 91-105.

61. Martinez-Climent JA: Molecular cytogenetics of childhood hematological malignancies. Leukemia, 1997,11,1999-2021.

62. Melnick Ar., Licht J. D.: Deconstructing a Disease: RARa, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of Acute Promyelocytic Leukemia. Blood, 1999,93,10 (May 15), 3167-3215.

63. Mitelman F, Mertens F, Johansson B, A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. National Genetics, Apr 15; Spec No: 417-74,1997.

64. Mohr St., Leikauf G.D., Keith G.and Rihn B.H., Microarrayes as cancer keys: an array of possibilities. Journal of Clinical Oncology, Vol 20, No 14 (July 15), 2002: pp 31653175.

65. Mrozek K, Heinonen K, and Bloomfield CD.: Prognostic value of cytogenetic findigs in adults with acute myeloid leukemia. Int. J. Hematol, 2000,72,261-271.

66. Nasedkina T, Domer P, Zharinov V, Hoberg J, Lysov Y, Mirzabekov A: Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Haematologica, 2002, Apr; 87(4):363-372.

67. Nowell PC and Hungerford DA, A minute chromosome in human chronic granulocytic leukaemia. Science, 1960,132: 2213-2222.

68. Nowell PC and Hungerford DA, Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes. Journal of National Cancer Institute, 1960, Jul;25:85-109.

69. Pallisgaard N, Hokland P, Riishoj DC, Pedersen B, Jorgensen P.: Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood, 1998, 92: 574588.

70. Rapid molecular response during early induction chemotherapy predicts a good outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2000, Vol 95, No 3,790794.

71. Pinkel D: Five-year follow up of '4otal therapy" of childhood lymphocytic leukemia. JAMA, 1971,216:648-652.

72. Prigogina EL Fleischman EW, Puchkova GP, Mayakova SA, Volkova MA, Protasova AK, Frenkel MA: Chromosomes in acute nonlymphocytic leukemia. Hum Genet, 1986, 73: 137-146.

73. Prigogina EL, Fleishman EW, et al: Chromosomes in acute leukemia. Human Genetics; 1979, 53:5.

74. Puchkova GP, Prigogina EL, et al, Chromosome abnormalities in chronic myeloid leukemia in children. Human Genetics, 1983, 64:257.

75. Pui C-H, Williams DL, Raimondi SC, Rivera GK, Look AT, Dodge RK, George SL, Behm FG, Crist WM, Murphy SB: Hypodiploidy is associated with a poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1987,70: 247-253.

76. Pui Ching-Hon: Childhood leukemias. The New England Journal of Medicine, 1995, Vol.332, No. 24,1618-1630.

77. Raimondi S.C.: Current status of cytogenetic research in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1993, 81: 2237-2251.

78. Raimondi SC, Behm FG, Robertson PK, Williams DL, Pui C-H, Crist WM, Look AT, Rivera GK: Cytogenetics of pre-B-cell acute lymphoblastic leukemia with emphasis on prognostic implications on the t(l;19). J. Clin. Oncol, 1990, 8:13801388.

79. Raimondi SC, Pui C-H, Hancock ML, Behm FG, Filatov L, Rivera GK.: Heterogeneity of hyperdiploid (51-67) childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1996,10:213-224.

80. Raimondi SC, Robertson PK, Pui C-H, Behm FG, Rivera GK: Hyperdiploid (47-50) acute lymphoblastic leukemia in children. Blood, 1992,79: 3245-3252.

81. Riehm H, Gadner H, Henze G, et al: The Berlin childhood acute lymphoblastic leukemia study, 1970-1976. American journal of pediatric hematology and oncology, 1980,2:299-310.

82. Rivera GK and Mauer AM: Controversies in the management of childhood acute lymphoblastic leukaemia: treatment intensification, CNS Leukemia, and Prognostic factors. Seminars in Hematology, 1987, vol 24, No 1 (January): pp 12-26.

83. Rowley JD, A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature, 1973,243:290.

84. Rowley JD, Aster JC, Sklar J. The clinical applications of new DNA diagnostic technology on the management of cancer patients, JAMA, 1993, Nov 17;270(19):2331-2337.

85. Rowley JD, Rearrangements involving chromosome band 11Q23 in acute leukaemia. Seminars in Cancer Biology, 1993, Dec;4(6):377-385.

86. Rowley JD, Testa JR, Chromosome abnormalities in malignant hematologic diseases. Adventure Cancer Research; 1982, 36:103.

87. Rowley JD. Association of specific chromosome abnormalities with type of acute leukemia and with patient age. Cancer Research, Sep; 1981,41(9 Pt 1):3407-10.

88. Schroech E, Padilla-Nash H, Spectral karyotyping and multicolor fluorescence in situ hybridization reveal new tumor-specific chromosomal aberrations. Seminars in Hematology, 2000,37:334-347.

89. Shi R. Zh., Morrissey J. M., Rowley J.D., Screening and quantification of multiple chromosome translocations in human leukemia. Clinical Chemistry, 2003, 49:7,1066-1073.

90. Strehl S, Konig M, Mann G, Haas OA.: Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction screening in childhood acute myeloblastic leukemia. Blood, 2001,97:805-808.

91. Timofeev E., Kochetkova S., Mirzabekov A., Florentiev V.: Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Research, 1996,24: 3142-3148.

92. Uckun FM, Nachman JB, Sather HN, Sensel MG, Kraft P, Steinherz PG, et al.: Clinical significance of Philadelphia chromosome positive pediatric acute lymphoblastic leukemia in the context of contemporary intensive therapies. Cancer, 1998,83:2030-2039.

93. Viehmann S., Borkhardt A., Lampert F., Harbott J.: Multiplex PCR- a rapid screening method for detection of gene rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia. Ann Hematology, 1999,78:157-162.

94. Wallace J, Zhou Y, Usmani GN, Reardon M, Newburger P, Woda В and Pihan G: BARCODE-ALL: accelerated and cost-effective genetic risk stratification in acute leukemia using spectrally addressable liquid bead microarrays. Leukemia, 2003,17, 1404-1410.

95. Wasserman R, Galili N, Ito Y, et al: Residual disease at the end of the induction therapy as a predictor of relapse during therapy in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Journal Clinical Oncology 1992; 10: 1879-85.

96. Weisberg E, Boulton C, Kelly LM, Manley P, Fabbro D, Meyer T, Gilliland DG, and Griffin JD: Inhibition of mutant FLT3 receptors in leukemia cells by thesmall molecule tyrosine kinase inhibitor, PKC412. Cancer Cell, 2002,1, June, 433443.

97. Wilhelm J, Pingoud A, Real-time Polimerase chain reaction. ChemBioChem, 2003,4,1120-1128.

98. Yeoh E-J, Ross ME., Shurtleff ShA., Williams WK, Patel D., et al: Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell: 2002, March, Vol.1.133-143.

99. Zaccaria A, Valenti A, Toschi M, Salvucci M, Cipriani R, Ottaviani E, Martinelli G Cryptic translocation of PML/RARA on 17q. A rare event in acute promyelocyte leukemia. Cancer Genetics Cytogenetics, 2002, Oct 15; 138(2): 169-73.

100. Zhang QY, Garner K, Viswanatha DS. Rapid detection of leukemia-associated translocation fusion genes using a novel combined RT-PCR and flow cytometric method. Leukemia. 2002, Jan;16(l):144-9.

101. Сокращения и условные обозначения

102. АЦП- аналогово-цифровой преобразователь ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ддНТФ - дидезоксинуклеотидтрифосфаты

103. ИМБ РАН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской Академии НауккДНК комплементарная ДНК мРНК - матричная РНК

104. МДГКБ Морозовская детская городская клиническая больница Мин. - минута Мкл - микролитр мМ - миллимоль

105. МОБ минимальная остаточная болезнь

106. МООД — Московский областной онкологический диспансер

107. Об. в мин. обороты в минуту

108. ОТ-ПЦР обратная транскрипция полимеразная цепная реакция

109. OJIJI острый лимфобластный лейкоз

110. ОЛЛ-МБ протокол ОЛЛ Москва-Берлин

111. ОНЛЛ острый нелимфобластный лейкоз

112. ПЗС -камера прибор с зарядовой связью (CCD)п.н. пар нуклеотидов1. ПкМ пикомоль

113. ПЦР — полимеразная цепная реакция

114. ППР полная продолжительная ремиссия

115. РДКБ — Российская детская клиническая больница

116. РНК рибонуклеиновая кислота

117. ХМЛ хронический миелоидный лейкоз

118. ЦНС — центральная нервная система

119. ЭДТА этилдиаминтетраацетат

120. ALL-BFM протокол OJLJI группы Берлин-Франкфурт-Мюнстер

121. ATRA — а11-транс ретиноевая кислота

122. BFM группа Берлин-Франкфурт-Мюнстер

123. COBRA-FISH multicolor combined binary ratio labeling fluorescence in situ hybridization - многоцветная комбинированная с двойным окрашиванием флуоресцентная in situ гибридизация

124. EFS бессобытийная выживаемость

125. FISH fluorescence in situ hybridization - флуоресцентная in situ гибридизация

126. HLA человеческий лейкоцитарный антиген

127. M-FISH multiplex- fluorescence in situ hybridization -мультиплексная флуоресцентная in situ гибридизация

128. RFS-безрецидивная выживаемость

129. Taq-полимераза ДНК полимераза Termophilus aquaticus