Модифицированные углеродные гемосорбенты для избирательной сорбции соединений белковой природы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.04, кандидат химических наук Седанова, Анна Викторовна

• Седанова, Анна Викторовна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Седанова, Анна Викторовна

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1 Сорбционные материалы в медицине

1.2 Классификация углеродных материалов медицинского назначения

1.3 Краткое описание технологии получения активных углей

1.4 Особенности структуры и свойств углеродных гемосорбентов

1.5 Новое направление в технологии получения пористых углерод-углеродных материалов для создания сорбентов нового поколения

1.6 Белки - физиологические активные вещества, их физико-химические свойства

1.7 Углеродные сорбенты - материалы для иммобилизации физиологически активных веществ

1.7.1 Адсорбционные свойства углеродных сорбентов по отношению к соединениям белковой природы

1.7.1.1 Особенности молекулярной адсорбции белков из растворов, структурообразование и поверхностные явления в белковых системах

1.7.1.2 Теоретические модели адсорбции на поверхности твердых тел

1.7.1.3 Кинетика формирования адсорбционных слоев

1.7.2 Способы повышения адсорбционных свойств углеродных

сорбентов по отношению к соединениям белковой природы

Глава II. Экспериментальная часть

2.1 Объекты исследования

2.1.1 Углеродный гемосорбент

2.1.2 Белки

2.2 Модификаторы

2.3 Исследование физико-химических свойств углеродных гемосорбентов

2.3.1 Исследование рельефа, текстуры углеродных гемосорбентов.

Состав и содержания функциональных групп на их поверхности

2.3.2 Исследование адсорбционных свойств углеродных гемосорбентов

2.3.2.1 Спектрофотометрический метод определения адсорбционных свойств образцов углеродного гемосорбента по отношению к белкам в статических условиях

2.3.2.2 Спектрофотометрический метод определения ковалентно связанного белка на поверхности гемосорбента

2.3.2.3 Десорбция белков с поверхности образцов углеродного гемосорбента

2.3.2.4 Стендовые медицинские испытания исследуемых образцов углеродного гемосорбента

2.4 Модифицирование поверхности углеродного гемосорбента

2.4.1 Методика модифицирования образца углеродного гемосорбента полимером е-аминокапроновой кислоты

2.4.2 Методика модифицирования образца углеродного гемосорбента полимером адипиновой кислоты в смеси с этиленгликолем

2.4.3 Методика модифицирования образца углеродного гемосорбента полимером молочной кислоты

2.4.4 Методика определения закрепления модификатора на углеродном гемосорбенте

2.4.5 Методика получения биоспецифического углеродного гемосорбента

2.4.5.1 Разработка методики «активации» карбоксильных групп на поверхности образца углеродного сорбента карбодиимидным методом

2.4.5.2 Разработка методик синтеза полиальбумина и его иммобилизации на поверхности «активированного» сорбента

2.5 Достоверность полученных результатов и их статистическая обработка

Глава III. Получение модифицированных углеродных 78 гемосорбентов, целенаправленно «настроенных» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы, и исследование их физико-химических свойств

3.1 Определение параметров модифицирования, приводящих к 78 целенаправленному изменению физико-химических характеристик

углеродных сорбентов

3.1.1 Выбор углеродного сорбента

3.1.2 Выбор модификаторов

3.1.3 Определение условий и параметров модифицирования углеродной

поверхности гемосорбента

3.2 Физико-химические характеристики углеродных гемосорбентов,

модифицированных полимерами органических кислот

3.2.1 Рельеф (морфология) углеродных гемосорбентов

3.2.2 Текстурные характеристики углеродных гемосорбентов

3.2.3 Состав и содержание функциональных групп на поверхности углеродных гемосорбентов

3.2.3.1 Рентгеновский микроанализ поверхности

3.2.3.2 ИК спектроскопия

3.2.3.3 Титриметрический метод анализа

Глава IV. Исследование особенностей сорбции белков из модельных растворов на образцах углеродного гемосорбента,

модифицированных полимерами органических кислот

4.1 Отработка методики определения концентрации белков в растворе

спектрофотометрическим методом

4.1.1 Выбор длины волны

4.1.2 Построение градуировочного графика

4.1.3 Определение времени стабильности белковых растворов

4.2 Исследование зависимости адсорбции белков на образцах гемосорбента от времени контакта

4.2.1 Исследование зависимости адсорбции иммуноглобулина на образцах гемосорбента от времени контакта

4.2.2 Исследование зависимости адсорбции окситоцина на образцах гемосорбента от времени контакта

4.2.3 Исследование зависимости адсорбции альбумина на образцах гемосорбента от времени контакта

4.2.4 Сопоставление результатов и их обсуждение

4.3 Зависимость адсорбции белков на гемосорбентах от их концентрации

в растворе

4.3.1 Зависимость адсорбции окситоцина на гемосорбентах от их концентрации в растворе

4.3.2 Зависимость адсорбции альбумина на гемосорбентах от их концентрации в растворе

4.4 Изучение десорбции белков на образцах гемосорбента

4.5 Заключение

Глава V. Биоспецифический углеродный гемосорбент и его свойства

5.1 Получение биоспецифического углеродного гемосорбента

5.2 Исследование поверхности биоспецифического углеродного гемосорбента физико-химическими методами

5.2.1 Спектрофотометрический метод

5.2.2 Метод просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения

5.2.3 Метод атомно-силовой микроскопии

Глава VI. Стендовые медицинские испытания углеродных

гемосорбентов

6.1 Стендовые медицинские испытания образцов углеродного гемосорбента, модифицированных полимерами органических кислот

6.2 Стендовые медицинские испытания образца биоспецифического

углеродного гемосорбента

Выводы

Список литературы

Приложения

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ HBsAg - поверхностный антиген вирусного гепатита В; р1 - изоэлектрическая точка; АМ - аминокислота;

АСЭМ - атомно-силовая электронная микроскопия;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДМФА - Ы,Ы-диметилформамид;

ИЛ-1Р - интерлейкин 1(3;

ИЛ-4 - интерлейкин 4;

ИЛ-6 - интерлейкин 6;

ИЛ-8 - интерлейкин 8;

И1ШУ СО РАН - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской академии наук;

ИК СО РАН - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук;

ИХБФМ СО РАН - Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Сибирского отделения Российской академии наук;

ИФА - твердофазный иммуноферментный метод анализа;

кДа - кило дальтон, единица измерения молекулярной массы белков;

М.М. - молекулярная масса;

МУС-АДКЭГ - образец углеродного гемосорбента, модифицированный полимером адипиновой кислоты с этиленгликолем; МУС-АМК - образец углеродного гемосорбента, модифицированный полимером е-аминокапроновой кислоты;

МУС-МК - образец углеродного гемосорбента, модифицированный полимером молочной кислоты;

ПАВ - поверхностно-активные вещества;

ПЭМВР - просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения;

УС - углеродный сорбент;

ФНО-а - фактор некроза опухоли а;

ЦНИЛ ОмГМА - Центральная научно-исследовательская лаборатория Омской государственной медицинской академии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модифицированные углеродные гемосорбенты для избирательной сорбции соединений белковой природы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время большое внимание уделяется изучению особенностей адсорбции белковых молекул из модельных растворов на поверхности сорбентов различной природы. Актуальность данных исследований связана с разработкой биоспецифических сорбентов для избирательной адсорбции токсичных веществ белкового происхождения, накапливающихся в организме при онкологических, иммунных, инфекционных и других заболеваниях (прионы, провоспалительные цитокины, продукты вирусов и бактерий, желатиназа В, белки пт23, р53, ММР9, бета амилоид, тау-белок и др.). Известно, что такие патогенные соединения относятся к белкам средней молекулярной массы.

Особый интерес представляют поверхностные явления в системе «углеродные материалы - белковые соединения».

Углеродные сорбенты перспективны в качестве носителей для создания биоспецифических сорбентов, что обусловлено их уникальными свойствами.

Для повышения адсорбционных свойств сорбентов по отношению к соединениям белковой природы используют химическое модифицирование углеродной поверхности функциональными группами: окисление поверхности, иммобилизация аминокислот, ферментов и т.д.

В данной работе впервые приводятся результаты исследований особенностей адсорбции белков углеродными гемосорбентами, модифицированными органическими кислотами с их последующей поликонденсацией. Данный способ используется впервые применительно к углеродным гемосорбентам и представляет значительный интерес, т. к. выбранное направление модифицирования позволяет получить широкий спектр эффективных сорбентов, специфически связывающих белковые соединения.

Соответствующие исследования актуальны как в теоретическом отношении (выявление и объяснение закономерностей адсорбции белков на

углеродной поверхности, «локально» модифицированной полимерами), так и в практическом плане (создание биоспецифических углеродных гемосорбентов).

Цель работы: получение модифицированных углеродных гемосорбентов, целенаправленно «настроенных» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы и исследование их физико-химических свойств. Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Обосновать выбор способа химического модифицирования углеродной поверхности.

2. Определить основные требования к свойствам носителя и модификаторам для получения углеродных гемосорбентов, целенаправленно «настроенных» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.

3. Установить параметры модифицирования, приводящие к целенаправленному изменению физико-химических характеристик углеродных гемосорбентов.

4. Исследовать физико-химические свойства углеродных гемосорбентов: химический состав, текстурные характеристики, кислотно-основные и адсорбционные свойства.

5. Выявить закономерности, описывающие адсорбцию различных по размеру белков модифицированными гемосорбентами, с учетом текстуры сорбента, природы и количественного содержания модификатора, а также концентрации белков в растворе.

7. Сопоставить результаты исследований особенностей адсорбции белков углеродными гемосорбентами, полученные в модельных условиях и в реальных системах (плазма крови).

Научная новизна работы.

1. Определены основные требования к свойствам углеродного носителя и модификаторам для получения гемосорбентов, целенаправленно «настроенных» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.

2. Впервые проведено модифицирование углеродного материала мезопористой структуры методом поликонденсации органическими кислотами с целью увеличения концентрации поверхностных функциональных групп, взаимодействующих с соединениями белковой природы.

3. Исследованы физико-химические свойства модифицированных углеродных гемосорбентов и сопоставлены со свойствами углеродного носителя: морфология поверхности, пористая структура, состав и содержание поверхностных функциональных групп, адсорбционные свойства по отношению к белкам различной молекулярной массы.

4. Установлено влияние природы модификатора, величины удельной поверхности, объема пор, состава и содержания поверхностных функциональных групп углеродных гемосорбентов на величину их адсорбции белков-маркеров (окситоцин, альбумин, иммуноглобулин).

5. Предложены схемы, описывающие взаимодействие углеродных гемосорбентов с белками.

6. Впервые разработаны способы получения биоспецифических углеродных гемосорбентов на основе углеродного гемосорбента для удаления из плазмы крови провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-Р, фактор некроза опухоли-а) при панкреатите и вирусных частиц при гепатите В.

Практическая ценность работы.

Получены углеродные гемосорбенты, целенаправленно «настроенные» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы:

- гемосорбент, модифицированный полимером е-аминокапроновой кислоты, для адсорбции провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухоли-а (ФНО-а), интерлейкина 1-|3 (ИЛ-1)3) из плазмы крови больных острым панкреонекрозом (патента № 2240844 Российской Федерации от 27.01.2012).

- гемосорбент, модифицированный полимером молочной кислоты с «активированными» карбоксильными группами и иммобилизованным

биолигандом - полиальбумином для адсорбции вирусных частиц из плазмы крови больных гепатитом В (поверхностный антиген гепатита В HBsAg, ДНК вируса гепатита В) (положительное решение о выдаче патента от 28.11.2011 по заявке на изобретение № 2011113927).

Модифицированные углеродные гемосорбенты успешно испытаны в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии (ЦНИЛ ОмГМА) г. Омска (стендовые медицинские испытания).

Вклад автора состоял в планировании, подготовке, проведении всех представленных экспериментов, обработке и анализе полученных результатов, в написании докладов и публикаций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и российских симпозиумов и конференций: Всероссийской научной молодежной конференции «Под знаком Сигма» (Омск, Россия, 2007, 2008, 2010), Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва-Клязьма, Россия, 2008, 2009, 2010), Международном IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), III International Symposium on Carbon for Catalysis «CarboCat III» (Berlin, Germany, 2008), Международной научной конференции «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, Россия, 2009), а также были представлены на конкурсе молодых ученых на VI Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011) и на III Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Секция «Нанотехнологии в медицине») III Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech 2010».

Исследования диссертационной работы являлись составной частью планов НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем переработки углеводородов СО РАН в рамках приоритетного направления фундаментальных исследований РАН «Современные проблемы химии материалов, включая наноматериалы». Программа «Создание нового поколения материалов различного функционального назначения для использования в технике, в медицине, в химической технологии. Химия наночастиц и нанообъектов». Проект «Развитие научных основ конструирования и методов синтеза структурно-организованных углеродных наносистем, в том числе модифицированных гетероатомами, как базы для разработки технологий получения функциональных углеродных материалов с заданными свойствами» (2007 -2009 гг.).

Результаты диссертационной работы входили составной частью в исследования, проводимые в рамках междисциплинарных интеграционных проектов фундаментальных исследований СО РАН № 60 "Изучение белков и белково-нуклеиновых комплексов методами функциональной, структурной и медицинской протеомики" (2006-2008 гг.) и № 88 «Разработка универсальных методологий на основе мультифункциональных пептидо-олигонуклеотидных конструкций для дифференциальной магнитно-резонансной визуализации клеток нормальных и опухолевых тканей и регуляции» (2009-2011 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 20 тезисов доклада.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 176 страницах и включает 36 таблиц, 41 рисунок. Список цитируемой литературы содержит 175 источников.

Заключение диссертации по теме «Физическая химия», Седанова, Анна Викторовна

ВЫВОДЫ:

1. Определены основные требования к свойствам углеродного носителя и модификаторам для получения гемосорбентов, целенаправленно «настроенных» на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.

2. Разработан способ химического модифицирования углеродного гемосорбента - пропитка растворами органических кислот (с участием сореагента и без) с последующей их поликонденсацией на поверхности, позволяющий целенаправленно изменять его физико-химические характеристики.

3. Исследованы физико-химические свойства полученных образцов углеродного гемосорбента и установлены закономерности их изменения в процессе модифицирования:

- нанесение модификатора на углеродную поверхность с последующей его поликонденсацией приводит к образованию «локально» распределенной полимерной пленки на углеродной частице, к уменьшению удельной величины поверхности материала и общего объема пор;

- модифицирование углеродного сорбента происходит с образованием сложноэфирных или амидных связей, что подтверждается изменениями интенсивности и положения полос поглощения кислород- азотсодержащих групп в ИК спектрах;

4. Изучено влияние модифицирования на адсорбционные свойства полученных образцов углеродного гемосорбента:

- величина адсорбции окситоцина зависит от величины удельной поверхности сорбента и уменьшается с увеличением количества нанесенного модификатора;

- модифицирование поверхности углеродного гемосорбента олигомерами аминокапроновой и молочной кислот приводит к повышению его адсорбционных свойств по отношению к среднемолекулярному белку альбумину (в 2-3 раза);

- увеличение содержания функциональных групп при модифицировании углеродного гемосорбента не влияет на его адсорбционную активность по отношению к высокомолекулярному белку иммуноглобулину в.

5. Установлено, что адсорбция белков на исследуемых образцах углеродного гемосорбента описывается различными теоретическими моделями в зависимости от их размеров (молекулярной массы):

- адсорбция низкомолекулярного белка - окситоцина протекает с образованием монослоя (модель Фрейндлиха);

- адсорбция среднемолекулярного белка - человеческого сывороточного альбумина - с образованием полислоев (модель полимолекулярной адсорбции);

6. Впервые разработаны способы получения биоспецифических углеродных гемосорбентов на основе углеродного гемосорбента для удаления из плазмы крови провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-|3, фактор некроза опухоли-а) при панкреатите и вирусных частиц при гепатите В.

4.5 Заключение

Вопросы об избирательных свойствах исследуемых сорбентов и их эффективности при адсорбции из многокомпонентных растворов представляют практический интерес.

Известно, что при сорбции из многокомпонентных разбавленных растворов многие вещества взаимно вытесняют друг друга. Следует отметить, что в случае совместной адсорбции веществ, значительно отличающихся по размерам молекул, характер взаимного влияния на адсорбируемость каждого из компонентов достаточно сложен.

Сопоставление размеров пор сорбента с размерами молекул белков позволяет прогнозировать адсорбционные свойства сорбентов.

Анализ построенных моделей пор сорбента и молекул белков с мопощью компьютерного моделирования (СЬешЗО, ЯазМо!) позволяет объяснить избирательные свойства исходного углеродного гемосорбента по отношению к соединениям низко- и средней молекулярной массы, а также по отношению к высокомолекулярным белкам. Так при сопоставлении размеров иммуноглобулина в с размером мезопор углердного гемосорбента можно объяснить тот факт, почему образцы углеродного сорбента не проявляют адсорбционных свойств к столь курупным по размерам молекулам данного белка - их размеры в на несколько порядков превышает размеры мезопор.

Изучение адсорбционных свойств сорбентов по отношению к белкам из их индивидуальных растворов позволяет смоделировать протекание процессов и в многокомпонентной смеси (плазма крови) и применить полученные знания в практических целях.

Исследование адсорбции белков различной молекулярной массы на полученных образцах углеродного материала показало: используя метод химического модифицирования поверхности, возможно не только повысить адсорбционные характеристики углеродных сорбентов по отношению к соединениям белковой природы, но и повлиять на их избирательное извлечение из растворов.

Методом модифицирования поверхности (изменяя природу модификатора и варьируя условия модифицирования), как показали исследования, можно снизить адсорбционную способность углеродного сорбента по отношению к белкам с небольшой молекулярной массой до 5 кДа (маркер окситоцин).

Для модифицированных образцов углеродного сорбента происходит заметное увеличение адсорбционных свойств по отношению к белку альбумину, используемого в исследованиях как маркер средиемолекулярных токсинов белковой природы. Это связано с тем, что, поликонденсация модификаторов - кислот на поверхности гидрофобной поверхности углеродного сорбента приводит к увеличению ее гидрофильности за счет увеличения количества функциональных групп.

При изучении свойств исследованных образцов было определено, что данные сорбенты не проявляют адсорбционной активности по отношению к белкам с высокой молекулярной массой. В качестве маркера данных соединений был выбран иммуноглобулин (молекулярная масса 150 к Да). Данный факт можно расценивать как положительный момент, так как к таким соединениям относятся белки, отвечающие за защиту иммунной системы человека, и уменьшение их в плазме крови может ослабить иммунную систему.

Модифицирование поверхности углеродного сорбента полимерами кислот с последующей поликонденсацией приводит к изменению как структурно-геометрических характеристик (текстуры), так и состава функционального покрова (химической природы поверхности) углеродного сорбента. Различия в условиях модифицирования и свойств используемых модификаторов позволили получить несколько модифицированных образцов углеродного сорбента.

Исследования показали, что адсорбция белка протекает на поверхности как исходного, так и модифицированного образцов углеродного сорбента. Можно предположить, что в случае адсорбции биополимера (как окситоцина, так и альбумина) на немодифицированной углеродной поверхности взаимодействие в системе белок-поверхность сорбента осуществляется в основном за счет физической сорбции молекул в порах углеродного материала, имеющего высокое значение удельной площади поверхности 425 м2/г. При этом немаловажную роль играет ориентация молекулы белка относительно поверхности сорбента. Известно, что в указанных условиях глобула белка

• ориентирована относительно углеродной . поверхности преимущественно гидрофобными участками [170-171].

Увеличение и образование на поверхности модифицированного образца углеродного сорбента -NH, -СООН, С=0, -CONH-групп, оказывающих влияние на электростатическое притяжение заряженных участков макромолекулярной I цепи альбумина, повышает его адсорбционную способность. Это является определяющим фактором при ориентации молекулы белка своими гидрофильными участками относительно функционализированной поверхности углеродного сорбента. Можно предположить увеличение взаимодействия в системах, ориентированных данным образом относительно друг друга. Это происходит при образовании межпептидной водородной связи и пептидной связи при химическом взаимодействии карбоксильных групп модифицированного сорбента с аминогруппами молекул белка [88, 95, 100-101, 105].

Изучая адсорбционные свойства углеродных материалов необходимо учитывать и влияние межмолекулярных взаимодействий молекул белка в растворе, возможное образование между ними водородных связей. Таким образом, можно предположить следующую схему взаимодействий в системе биополимер-модифицированный сорбент (рис. 4.20).

Адсорбционные свойства по отношению низкомолекулярному белку, сорбция которого протекает преимущественно по механизму физической адсорбции, уменьшаются в ряду образец УС

Рисунок 4.20. Схема адсорбции белка (на примере альбумина) на поверхности модифицированного образца углеродного сорбента полимером аминокапроновой кислоты

Наибольшими адсорбционными свойствами по отношению к белку альбумину - маркеру среднемолекулярных токсинов, обладает образец МУС-АМК и МУС-МК, имеющие в структуре высокое содержание реакционоспособных по отношению к белкам как азот-, и кислородсодержащих групп (рис. 4.23).

Исследуемые образцы углеродного сорбента не проявляют адсорбционной активности по отношению к белкам высокомолекулярной массы, которые выполняют защитную функцию в организме - к иммуноглобулинам.

ГЛАВА V. Биоспецифический углеродный гемосорбент и его свойства

5.1 Получение биоспецифического углеродного сорбента

Для создания углеродного биоспецифического гемосорбента необходимо:

- выбрать образец углеродного гемосорбента, имеющего на своей поверхности высокое содержание функциональных групп; биолиганд, физиологически активный белок, способный к иммобилизации на поверхности сорбента и обеспечивающий его биоспецифичность;

- метод иммобилизации биолиганда.

В качестве матрицы биоспецифического гемосорбента был выбран образец углеродного гемосорбента МУС-МК, модифицированный полимером молочной кислоты. Данный образец является перспективным материалом для создания на его основе селективного гемосорбента для задач сорбционной терапии и медицинской диагностики. Согласно результатам физико-химических исследований данного образца (п.п. 2.3.1) мезопористая структура, «локальное» распределение на поверхности модифицированного гемосорбента полимерной пленки придает ему выгодное сочетание как гидрофильных, так и гидрофобных свойств. Высокое содержание закрепленных карбоксильных функциональных групп, малая растворимость нанесенной полимерной пленки в органических растворителях позволит провести ковалентное закрепление биолиганда на поверхности выбранного образца.

Для получения биоспецифического углеродного сорбента, «направленного» на взаимодействие и связывание вирусных частиц гепатита В, согласно анализу литературных данных в качестве биолиганда был выбран человеческий сывороточный альбумин, полимеризованный раствором глутарового альдегида.

Согласно анализу результатов исследований сорбционных свойств модифицированных углеродных сорбентов (п.п. 3.2.2) образец МУС-МК достаточно хорошо сорбирует альбумин из модельного раствора. При правильно подобранном способе «активации» функциональных групп на поверхности образца, модифицированного полимером молочной кислоты, можно предположить, что «активированный» углеродный материал будет значительно эффективнее взаимодействовать с биолигандом.

По разработанным методикам «активации» карбоксильных групп (п.п. 2.4.5.1), синтеза полиальбумина с его последующей иммобилизацией на поверхности образца МУС-МК (п.п. 2.4.5.2) был получен образец биоспецифического углеродного сорбента.

5.2 Исследование поверхности углеродного биоснснифического гемосорбента физико-химическими методами

5.2.1 Спектрофотометрический метод

Определение ковалентно связанного биолиганда - полиальбумина на поверхности модифицированного углеродного гемосорбента МУС-МК проводили спектрофотометрическим методом (п.п. 2.3.2.2).

Анализ полученных УФ-спектров показал увеличение интенсивности спектра белка для модифицированного образца МУС-МК с иммобизироованным полиальбумином (рис. 5.1). Это вероятно всего подтверждает закрепления биолиганда на поверхности «активированного» модифицированного образца МУС-МК.

3.2

3,0 .

2.6 2 4

-с 11 рос нт без белка

-сорбент с угилсядиаы ином

- сорбент с белком

02 ОЯ -02 -0.4

Рис. 5.1. Спектры поглощении, полученные дли образца МУС-МК с иммобизованным белком

5.2.2 Метод просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения

Методом ПЭМВР исследованы образцы исходного углеродного гемосорбента УС и модифицированного с иммобилизованным белком ЧСА.

Полученные электронно-микроскопические снимки представлены на рис. 5.2-5.4. а

Рис.5.2. Электронно-микроскопические снимки исходного образца УС: а - глобулярная морфология частиц гемосорбента; б - слоистая структура углеродных глобул, состоящая из графитоподобвых (графеновых) слоев. Межслоевое расстояние близко к 4ой2 графита: ~ 0.35 им

Рис. 5.3. Электронно-микроскопические снимки модифицированного образца МУС-МК е иммобилнзированным белком

Рис. 5.4. Электронно-микроскопические снимки модифицированного образца МУС-МК с нммобилизнрованным белком с Фурье-прсобразованнсм изображений исходного углеродного сорбента и белка

На рисунке 5.2 показана углеродная структура исходного образца гемосорбента УС. Четко прослеживается глобулярная морфология частиц углеродного гемосорбента, показана слоистая структура углеродных глобул, состоящая из графитоподобных (графеновых) слоев.

После иммобилизации на поверхности модифицированного углеродного гемосорбента МУС-МК белка полимеризованного альбумина были получены соответственные электронно-микроскопические снимки (рис.5.3). На снимках видны частицы с размерами -10 нм (выделены красным контуром), закрепленные на поверхности глобул гемосорбента. Эти частицы образованы переплетением удлиненных цепей молекулярной дисперсности. Изображения ПЭМВР показывают, что характер упаковки этих цепей отличен от упаковки графитоподобных слоев исходного образца УС, в котором слои параллельны и следуют с периодом ёоог = 0.35нм. Можно предполагать, что закрепленные частицы принадлежат белку.

Вид глобул молекулы белка на углеродной поверхности, полученных методом ПЭМВР подтверждается при обзоре литературных источников (рис. 5.5) [172].

Рис. 5.5. Электронно-микроскопические снимки иммобилизированиого белка бычьего сывороточного на поверхности углеродной нанотрубки и в водной среде, полученные методой ПЭМВР ,

133 t

Проведено Фурье-преобразование изображений белка полиальбумина и исходного углеродного сорбента (рис. 5.4). Видно, что межплоскостное расстояние для углеродных слоев соответствует 0,35 нм, что характерно в целом для графита и др. углеродных материалов. Для аморфной структуры белка отмечается большее расстояние между слоями - 0,6 нм, что может свидетельствовать о присутствии на поверхности образца МУС-МК молекул белков.

Проведен энерго-дисперсионный анализ поверхности образца МУС-МК с иммобилизированиым на его поверхности белком (рис. 5.6). Анализ полученных спектров показал наличие спектральной линии азота, которую можно отнести к азоту, входящего в структуру молекулы белка (модификатор -молочная кислота не имеет элемента азота в своей структуре). Необходимо также отметить, что при наведении лазерного пучка на аморфные структуры, которые могут быть молекулами белков, с течением времени спектр азота постепенно уменьшается. Это можно объяснить тем, что белок при воздействии высоких температур постепенно разрушается.

0.00 0.14 0.28 0.42 0.56 0.70 0.84 0.98 1.12 1.26 1.41 кеУ

Рис. 5.6. Спектр рентгеновского микроанализа от модифицированного образца углеродного гемосорбента МУС-МК, содержащего альбумин (ЕМ=0.384 ксУ, 1\к - линия Ка азо та)

Таким образом, совокупный анализ полученных данных используемых методов определения иммобилизованного белка показывает, что биолиганд -полиальбумин иммобилизован на углеродной поверхности модифицированного образца МУС-МК.

5.2.3 Метод атомно-силовой микроскопии

Для исследования структуры поверхности образцов, модифицированных молочной кислотой использовали метод атомно-силовой спектроскопии (АСМ) [173-175].

Для проведения исследований методом АСМ были выбраны следующие образцы углеродного гемосорбента:

- исходный образец углеродного гемосорбента (немодифицированный) -образец УС;

- образец углеродного гемосорбента, модифицированный молочной кислотой МУС-МК;

- образец углеродного гемосорбента, модифицированный молочной кислотой после активации карбоксильных групп - МУС-МК-А;

- образец углеродного гемосорбента, модифицированный молочной кислотой, активированный (А), с иммобилизированным полиальбумином.

Методом атомно-силовой микроскопии было показано, что поверхность гранул исходного гемосорбента (УС) имеет сложную организацию (рис.5.7а). Рельеф поверхности частиц гемосорбента образован гладкими бугристыми образованиями, провалами, ямками и каньонами с преобладающим размером неровностей 1-2 мкм.

Изучение поверхности образца, модифицированного молочной кислотой (МУС-МК) (рис. 5.76) и поверхности образца, модифицированного молочной кислотой после активации (МУС-МК-А) (рис. 5.8а) не выявило заметных отличий от поверхности образца исходного гемосорбента (УС). Таким образом, было установлено, что модифицирование гемосорбента молочной кислотой и а)

6}

Рис. 5.7. Трехмерное представление поверхности исследуемых образцов углеродного гемо сорбента а) исходный образец углеродного гемоеорбента; б) образец, модифицированный молочной кислотой б)

Рис. 5.8. Трехмерное представление поверхности исследуемых образцов углеродного гемосорбента а) образец, модифицированный молочной кислотой после активации; б) образец, модифицированный молочной кислотой после активации с иммобилизованным белком его активация не оказывают влияния на топографические характеристики поверхности гранул в пределах разрешения использованного метода (-20 им).

Изучение поверхности образца с иммобилизованным белком выявило сглаживание рельефа - заполнение каньонов и ямок (рис. 5.86).

Обнаруженные изменения поверхности образца гемосорбента после взаимодействия с раствором сывороточного полиальбумина позволяет предположить, что в первую очередь белком заполняются более глубокие «впадины» (0.5-2 мкм), после чего заполняется оставшаяся поверхность (на снимках наблюдается как сглаживание рельефа).

Результаты атомно-силовой микроскопии также подтверждают наличие белка полиальбумина на поверхности модифицированного образца МУС-МК.

ГЛАВА VI. Стендовые медицинские испытания углеродных гемосорбентов

6.1 Стендовые медицинские испытания образцов углеродного гемосорбента, модифицированных полимерами органических кислот

Большой интерес для сорбционной терапии представляют исследования адсорбции из многокомпонентных растворов, а также вопросы об изучении избирательных свойств сорбентов.

В таблице 6.1 представлены данные стендовых медицинских исследований адсорбционных свойств образцов углеродного гемосорбента по отношению к провоспалительным цитокинам ФНО-а и ИЛ-1(3 (п.п.2.3.2.4) и противовоспалительному цитокину интерлейкину 4 (ИЛ-4).

Для подтверждения избирательных свойств модифицированных сорбентов в отношении белков средней молекулярной массы и для сопоставления результатов анализа, проведенных в модельных условиях, в плазме крови больных панкреатитом определено содержание белков иммуноглобулинов А, М, G (М.М. 140 - 900 кДа).

Подтверждены избирательные свойства модифицированных сорбентов по отношению к соединениям белковой природы средней молекулярной массы: при содержании в плазме крови белков различной молекулярной массы модифицированные образцы МУС-АМК и МУС-АДКЭГ не проявляют сорбционной активности в отношении низкомолекулярных белков (М.М. 1-5 кДа) и высокомолекулярных (М.М. 140-900 кДа). Необходимо отметить, что иммуноглобулины являются белками, отвечающие за защиту иммунной системы человека, и уменьшение их в плазме крови может ослабить иммунную систему. Данный факт можно расценивать как положительный эффект исследуемых образцов углеродного гемосорбента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Седанова, Анна Викторовна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Николаев, В. Г., Стрелко В. В. Гемосорбция на активированных углях /

B. Г. Николаев, В. В. Стрелко. - Киев : Наукова думка, 1979. - 288 с.

2. Покровский, С. Н. Сорбционные технологии - итоги и перспективы /

C. Н. Покровский // Эфферентная терапия. - 2003. - Т. 9, №. 1. - С. 42 - 47.

3. Покровский, С. Н.Сорбционные технологии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний / С. Н. Покровский [и др.] // Кардиологический вестник. - 2006. -Т.13, №1. - С. 47 - 52.

4. Бородин, Ю. И. Энтеросорбент Ноолит. Для физической и психологической реабилитации организма / Ю. И. Бородин [и др.]- Новосибирск : НИИКиЭЛ СО РАМН, 2006. - 228 с.

5. Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. Бреслеровские чтения II / под ред. В. А. Ланцова. - СПб. : ПИЯФ РАН, 2007. - 444 с.

6. Николаев С. В. Аффинное взаимодействие биомолекул: применение в биологии и медицине [Электронный ресурс] / С. В. Николаев. - URL: http ://www. sciteclibrary.ru/rus/catalog/pages/9694.html (дата обращения: 20.05.2010).

7. Koreck, L. Bioaffmity magnetic reactor for peptide digestion followed by analysis using bottom-up shotgun proteomics strategy / L. Koreck [et all] // J. Sep. Sci. - 2008. - Vol. 31. - P. 507 - 515.

8. Hemei, Chen. Preparation of C60-functionalized magnetic silica microspheres for the enrichment of low-concentration peptides and proteins for MALDI-TOF MS analysis / Chen Hemei [et all] // Proteomics. - 2009. - Vol. 9. - P. 380 - 387.

9. Горчаков, В. Д. Селективные гемосорбенты / В. Д. Горчаков, В. И. Сергиенко, В. Г. Владимирова. - М. : Медицина, 1989. - 224 с.

10. Стрелко, В. В. О возможности создания биоспецифических материалов на основе биосовместимых углеродных матриц // Доклады АН СССР. - 1983. -Т. 274. - №5.-С. 1236- 1239.

11. Алексейчук, B.C. Перспективы использования экстракорпоральной иммунокоррекции в комплексном лечении СПИД / В. С. Алексейчук, Д. Р. Петрунин, Ю. М. Лопухин // Иммунология. - 1991. -№ 3. - С. 17 - 21.

12. Ставицкая, С.С. Получение и свойства комбинированных сорбентов на основе модифицированного угля и глубоководных пелоидных систем / С.С. Ставицкая и [др.] // Эфферентная терапия. - 2007. - Т. 13. - №4. - С. 13 - 20.

13. Strelko, V. V. Mechanism of reductive oxygen adsorption on active carbons with various surface chemistry / V.V. Strelko [et all] // Surface Science. - 2004. - Vol. 548.-P. 281-290.

14. Власов, В. В. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови / В. В. Власов [и др.] // Биохимия. - 1993. - Т. 58. - С. 1247 - 1251.

15. Лактионов, П. П. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo / П. П. Лактионов [и др.] // Бюл. эксп. биол. мед. - 1999. - Т. 127. - С. 654 - 657.

16. Муйдинов, М.Р. Перфторполимерсодержащие биосовместимые сорбенты медицинского назначения // Наука - производству. - 1998. - № 3. - С. 13 - 23.

17. Ландау, М. А. Молекулярная природа отдельных физиологических процессов / М. А. Ландау. - М.: Наука, 1985. - 264 с.

18. Бурмистров, В. А. Специфические сорбенты для профилактики и лечения различных заболеваний / В. А. Бурмистров [Электронный ресурс]. - URL: http://vector-vita.narod.ru/Documents/papers/2007_nano_64.htm (дата обращения: 20.10.2010).

19. Николаев, В. Г. Методы гемокарбоперфузии в эксперименте и клинике / В. Г. Николаев. - Киев : Наукова думка, 1984. - 327 с.

20. Рачковская, Л. Н. Углеродминеральные сорбенты для медицины / Л. Н. Рачковская. - Новосибирск : СО РАСХН, 1996. - 231 с.

21. Лопухин, Ю. М. Гемосорбция / Ю. М. Лопухин, М. Н. Молоденков. -2-изд. -М. : Медицина, 1985. - 288 с.

22. Суровикин, В. Ф. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов / В. Ф. Суровикин, Л. Г. Пьянова, Л. С. Лузянина. // Российский химический журнал. - 2007. - № 5. - С. 159 - 165.

23. Меныыутина, Н. В. Введение в нанотехнологию / Н. В. Меныыутина. -Калуга : Из-во науч. лит-ры Бочкаревой Н. Ф., 2006. - 132 с.

24. Саврилина, И. В. Междисциплинарные исследования в медицине / И. В. Саврилина, В. Н. Каркищенко, Ю. В. Горшкова. - М. : Техносфера, 2007. -368 с.

25. Маркелов, Д. А. Сравнительное изучение адсорбционной активности медицинских сорбентов / Д. А. Маркелов, О. В. Ницак, И. И. Геращенко // Хим.-фарм. журнал. - 2008. - Т. 42. - №7. - С. 30 - 33.

26. Болдырев, А. Г. Перспективы разработки биосовместимых гемосорбентов для экстракорпоральной иммунокоррекции путем направленного селективного воздействия на состав и концентрацию цитокинов в периферической крови / А. Г. Болдырев и [и др.] // Эфферентная терапия. - 2003. - Т. 9. - №1. - С. 61.

27. Бакалинская О. Н. Получение углеродных сорбентов с биоспецифической активностью / О. Н. Бакалинская, Н. В. Коваль, Н. Т. Картель // Эфферентная терапия. - 2003. - Т. 9. - №2. - С. 16 - 22.

28. Биосовместимость / Под ред. В. И. Севастьянова. - М. : Издано в ГУП «Информационный центр ВНИИгеосистем», 1999. - 368 с.

29.Федоров, Н. Ф. Химические свойства поверхности углеродных адсорбентов на основе технического углерода / Н. Ф. Федоров, Г. К. Ивахнюк, О. Э. Бабкин // Журнал прикладной химии. - 1990. - Т. 63. - №4. - С. 787 - 791.

30. Boehm, Н.Р. Surface properties of carbon / H. P. Boehm // Struct, and Reactive. Surface : Proc. Europ. Conf. Amsterdam. - 1989. - P. 145-157.

31. Тарковская, И. А. Окисленный уголь / И. А. Тарковская. - Киев : Наукова думка, 1981.- 200 с.

32. Лисичкин, Г.В. Химия привитых поверхностных соединений / Г. В. Лисичкин. - М. : Физматлит, 2003. - 592 с.

33. Тиноко И. Физическая химия. Принципы и применение в биологических науках / И. Тиноко [и др.]. - М. : Техносфера, 2005. - 744 с.

34. Грег, С. Адсорбция. Удельная поверхность. Пористость. / С. Грег, К. Синг. -М. : Мир, 1984.- 310 с.

35. Кировская, И. А. Поверхностные явления: Монография. / И. А. Кировская. -Омск : Из-во ОмГТУ, 2001.- 174 с.

36. Джейкок, М. Химия поверхностей раздела фаз / М. Джейкок, Дж. Парфит. -М. : Мир, 1984. - 269 с.

37. Мингалев, П. Г. Химическое модифицирование поверхности оксидных материалов органическими кислотами фосфора (V) и их эфирами / П. Г. Мингалев, Г. В. Лисичкин // Успехи химии. - 2006. - Т. 75. - №6. - С. 604 - 624.

38. Andrade, J. D. Coated adsorbents for direct blood perfusion: hema/activated carbon / J. D. Andrade [et all] // Transactions. American Soc. Artific. Inter. Organs. -1971. - Vol. XVII. - P. 222 - 228.

39. Esum, K. Chemical treatment of carbon nanotubes / K. Esum [et all] // Carbon. -1996. - Vol. 34. - № 2. - P. 279 - 281.

40. Суровикин В.Ф. Современные тенденции развития методов и технологии получения нанодисперсных углеродных материалов / В.Ф. Суровикин // Российский химический журнал. - 2007. - T. LI. - №4. - С. 92 - 97.

41. Лихолобов, В. А. Каталитический синтез углеродных материалов и их применение в катализе / В. А. Лихолобов // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №5. - С. 35 - 42.

42.Bansal, Chand R. Activated Carbon Adsorbtion / Chand R. Bansal, M. Goyal. -New York: Taylor&Francis Group, 2005. - 498 p.

43. Chen, S. / S. Chen, J. Liu, H. Zehg // Carbon '02,Intern. Conf. on Carbon. Beijung. - 2002. - paper 21.3.

44. Chen, S. / S. Chen, J. Liu, H. Zehg // New Carbon Materials. - 2002. - Vol. 17. -P. 26.

45. Пат. 2211727 Российская Федерация. МПК7 В 01 J 20/20 С 01 В 31/08. Способ обработки гранул углеродного материала для гемо- и энтеросорбции и реактор для его осуществления / Суровикин В. Ф. [и др.]; заявитель и патентообладатель Научно-техническое учреждение "Конструкторско-технологический институт технического углерода СО РАН". - № 2001123511/12; заявл. 22.08.2001; опубл. 10.09.2003.

46. Суровикин, В. Ф. Новое эффективное лекарственное средство "Энтеросорбент углеродный ВНИИТУ-2" / В. Ф. Суровикин, JI. Г. Пьянова, JI. С. Лузянина // Межд. науч. конф. «Химия XXI век: Новые технологии, новые продукты», Кемерово, 10-12 мая 2005: Труды VIII межд. научно-практ. конф. - Кемерово, 2005. - С. 343.

47. Fuente, Е. Basic Surface Oxides on Carbon Materials: □ A Global View / E. Fuente, J. A. Menendez, D. Suarez // Langmuir. - 2003. - V. 19. - P. 3505 - 3511.

48. Когановский, A. M. Адсорбция растворенных веществ / A. M. Когановский, Т. М. Левченко, В. А. Кириченко. - Киев : Наукова думка, 1977.

49. Кузнецов, Б. Н. Синтез и применение углеродных сорбентов / Б. Н. Кузнецов // Соросовский Образовательный Журнал. - 1999. - № 12. -С. 29-34.

50. Суровикин, В. Ф. Новые направления в технологии получения углерод-углеродных материалов. Применение углерод-углеродных материалов / В. Ф. Суровикин, Ю. В. Суровикин, М. С. Цеханович // Российский химический журнал. - 2007. - Т. LI. - №4. - С. 111 -118.

51. Лихолобов, В. А. Институт проблем переработки углеводородов СО РАН. Достижения науки и практики для решения проблем химической переработки углеводородов / В. А. Лихолобов // Российский химический журнал. - 2007. - Т. LI. - №4.- С. 4-10.

52. Суровикин, В. Ф. Закономерности формирования пористой структуры композитов на основе пиролитического и технического углерода / В. Ф. Суровикин [и др.] // Химия твердого топлива. - 1995. - №3. - С. 62 - 68.

53. Суровикин, В. Ф. Исследование новых высокоэффективных сорбентов медицинского и ветеринарного назначения. Углеродные материалы / В. Ф. Суровикин, П. И. Червяков, Л. Г. Пьянова // Тезисы докладов II научно практической конференции. - Новокузнецк, 1995.- С. 12-13.

54. Суровикин, В. Ф. Применение углеродного гемосорбента ВНИИТУ-1 для детоксикации организма в клинической практике как медицинского сорбента нового поколения / В. Ф. Суровикин // Тез. докл. регион, научно-практическая конференция «Химическая и химико-фармацевтическая промышленность в современных условиях». - Новосибирск, 1999. - С. 52 - 53.

55. Горчаков, В. В. Применение новых углеродных сорбентов в лечении больных острым описторхозом / В. В. Горчаков [и др.] // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2006. - Т. XVI. - № 1. -С. 28.

56. Долгих, Т. И. Исследование эффективности использования нового углеродного гемосорбента при лечении больных перитонитом / Т. И. Долгих [и др.] // Эфферентная терапия. - 2006. - Т. XII. - № 3. - С. 36 - 37.

57. Горчаков, В. В. Применение углеродных гемосорбентов и альфа-фетопротеина в комплексной терапии хронических гепатитов и циррозов различной этиологии / В. В. Горчаков [и др.] // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии- 2006. -Т. XVI. - № 1. -С. 53.

58. Лихолобов, В. А. Изучение особенностей сорбции некоторых белковых молекул на новом углеродном сорбенте / В. А. Лихолобов, Т. И. Долгих, В. В. Мороз, Л. Г. Пьянова, В. Т. Долгих, Б. А. Рейс, Л. С. Лузянина, Ф. И. Разгонов, Т. Ф. Соколова, А. В. Глущенко, Веселовская А. В. (А. В. Седанова) // Общая реаниматология РАМН. - 2007. - Т.,3. - №2. - С. 50 - 52.

59. Веселовская, А. В. (Седанова, А. В.) Изучение кинетики сорбции альбумина на образцах углеродного сорбента / А. В. Веселовская (А. В. Седанова), В. А. Лихолобов, Л. Г. Пьянова // IV Всерос. науч. молодеж. конф. «Под знаком

Сигма», поев. 50-летию СО РАН, Омск, 29-30 мая 2007. - Омск, 2007. - С. 89 -90.

60. Горчаков, В. В. Клинико-лабораторное обоснование роли адсорбционных методов в противовирусной терапии / В. В. Горчаков, Л. Г. Пьянова, Л. С. Лузянина // Журнал Российской гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2008. - Т. XVIII. - № 5. - С. 177.

61. Измайлова, В. Н. Поверхностные явления в белковых системах / В. Н. Измайлова, Г. П. Ямпольская, Б. Д. Сумм. - М. : Химия, 1988. - 240 с.

62. Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - М. : Медицина, 1998. -704 с.

63. Общая органическая химия / под ред. Д. Бартона и У.Д. Оллиса. Т. 10. Нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, белки / под ред. Е. Хаслама. пер. с англ./ под ред. Н.К. Кочеткова и М.А. Членова. - М. : Химия, 1986. -704 с.

64. Финкелынтейн, А. В. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами / А. В. Финкелынтейн, О. Б. Птицын. - М.: КДУ, 2005. - 456 с.

65.Уайт, А. Основы биохимии / А. Уайт [и др.]. - М. : Мир, 1981. - 534 с.

66. Практикум по биохимии: Учеб. Пособие / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - М. : Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.

67. Химические реакции полимеров. Т.1. / под ред. Е. Феттеса. Пер. с англ. / Под ред. З.А. Роговина. - М.: Мир, 1967. - 503 с.

68. Семак, И. В. Биохимия белков; практикум для студентов / И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич. - Минск: БГУ, 2007. - 49 с.

69. Ройт. Основы иммунологии (пер. с англ.). - М.: Мир, 1991. - 328 с.

70. Кетлинский, С. А. Эндогенные иммуномодуляторы / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев, А. А. Воробьев. - СПб.: Гиппократ, 1992. - 256 с.

71.Фрейдлин, И. С. Цитокины и межклеточные контакты в противоинфекционной защите организма / И. С. Фрейдлин // Соросовский журнал. - 1996. - №6. - С. 19 - 25.

72. Бакаева, 3. В. Исследование противовоспалительных свойств гликопролинов на экспериментальной моделиострого перитонита у крыс / 3. В. Бакаева [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2008. - № 2. - С. 56.

73. Бутров, А. В. К вопросу о раннем энтеральном питании у больных с деструктивным панкреатитом / А. В. Бутров [и др.] // Consilium. - 2005. - Том 7. -N1.-C. 76.

74. Канючевский, А. Б. Случай успешного лечения больного с панкреонекрозом, осложненном полиорганной недостаточностью / А. Б. Канючевский [и др.] // Вестник интенсивной терапии. - 2002. - № 2. - С. 81 - 85.

75. Симбирцев, А. С. Цитокины: классификация и биологические функции / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2004. - № 2. - С. 28.

76. Lee, W. Hepatitis В virus infection /W. Lee // N. Engl. J. Med. 1997.- Vol. 337. -P. 1733 - 1745.

77. Beasley, R. P. Hepatitis В vims: the major etiology of hepatocellular carcinoma. / R. P. Beasley // Cancer. - 1988. - Vol. 61. - P.1942 - 1956.

78. McMahon, B. J. Hepatocellular carcinoma and viral hepatitis. / B. J. McMahon / In: Wilson R.A., ed. Viral Hepatitis. - New York: Marcel Dekker, 1997. - P. 315 -330.

79. Yu, M.W. Interaction Between Various Polymerized Human Albumins and Hepatitis В Surface Antigen/ M.W. Yu , J. S. Finlayson, J. W.-K. Shih // J. Virology. - 1985. - Vol. 55. - No.3. - P.736 - 743.

80. Harrison, Ph. M. Hepatology / Ph. M. Harrison, J. Y. N. Lau, R. Williams // Postgrad. Med. J. - 1991. - Vol. 67. - P. 719 - 741.

81. Майер, К.-П. Гепатит и последствия гепатита : практическое руководство / К.-П. Майер ; перевод с нем. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 720 с.

82. Davis, J. J. The immobilization of proteins in carbón nanotubes / J. J. Davis [et all] // Inorgánica Chimica Acta. - 1998. - Vol. 272. - P. 261 - 266.

83. Нестеренко, Ю. А. Диагностика и лечение деструктивного панкреатита / Ю. А. Нестеренко, В. В. Лаптев, С. В. Михайлусов. - М. : ООО «Бином-Пресс», 2004. - 304 с.

84. Бухарова, Е. М. Структура молекулярных ассоциатов флуоресцентных зондов в растворах сывороточного альбумина человека / Е. М. Бухарова, И. М. Власова, А. М. Салецкий // Журнал прикладной спектроскопии. - 2008. - Т. 75. -№ 6. - С. 782 - 787.

85. Шманай, В. В. Экспресс-определение иммуноглобулина G человека твердофазным иммуноферментным методом / В. В. Шманай, В. Э. Найденов // Журнал аналитической химии. - 1999. - Т. 54. - № 6. - С. 659 - 664.

86. Степанов, В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков / В. М. Степанов. - М. : Высшая школа, 2002. - 335 с.

87. Маринин, Д. В. Объемные эффекты при адсорбции альбумина углеродными адсорбентами / Д. В. Маринин, В. А. Авраменко, В. Ю. Глущенко // Журнал физической химии. - 1989. - Т.63. - № 9. - С. 2507 - 2508.

88. Тарасевич, Ю. И. Взаимодействие глобулярных белков с поверхностью кремнеземов / Ю. И. Тарасевич, Л. И. Монахова // Коллоидный журнал. - 2002.

- Т. 64. - № 4. - С. 535 - 540.

89. Ерецкая, Е. В. Исследование сорбции белков плазмы крови активированными углеродными волокнистыми материалами / Е. В. Ерецкая [и др.] // Хим.-фарм. журнал. - 1985. - № 3.- С. 360 - 365.

90. Измайлова, В. Н. Адсорбционные слои лизоцима на межфазных поверхностях водный раствор - октан / В. Н. Измайлова // Коллоидный журнал.

- 1982. - Т. 44. - Вып. 2. - С. 217 - 222.

91. Демин, А. А. Влияние конформации белковых макромолекул на процессы многокомпонентной сорбции / А. А. Демин, А. Д. Могилевская, Г. В. Самсонов // Журнал прикладной химии. - 1995. - Т. 68. - № 9. - С. 1453 - 1455.

92. Демин, А. А. Особенности многокомпонентной сорбции белков катионитсодержащими композитами / А. А. Демин, А. Д. Могилевская, Г. В. Самсонов // Журнал физической химии. - 1996.- Т. 70. - № 11. - С. 2059 - 2062.

93. Хохлова, Т. Д. Адсорбция белков на трековых полиэтилентерефталатных мембранах, модифицированных у-аминопропилтриэтоксисиланом / Т. Д. Хохлова , Б. В. Мчедлишвили // Коллоидный журнал. - 1996. - Т. 58. - № 6. -С. 846.

94. Чухрай, Е. С. Кинетика адсорбции глобулярных белков и проблема установления адсорбционных равновесий / Е. С. Чухрай // Журнал физической химии. - 1982. - № 4. - С. 777 - 785.

95. Сигал, В. Л. Структурные свойства адсорбционного слоя альбумина на поверхности гемосорбента / В. Л. Сигал, П. В. Осадчий // Коллоидный журнал. - 1987.-№5. - С. 949-954.

96. Горчаков, В. Д. Иммуносорбция на активированных углях / В. Д. Горчаков, Д. Д. Петрунин, В. Л. Рябова // Вопросы медицинской химии. - 1981. - Т. 27. -№ 4. - С. 544 - 547.

97. Bosker, W. Т. Е. BSA adsorption on bimodal РЕО brushes / W. Т. E. Bosker [et all] // Colloid and Interface Science. - 2005. - Vol. 286. - P. 496 - 503.

98. Halperin, A.. Polymer brushes that resist adsorption of model proteins: design parameters / A. Halperin // Langmuir. - 1999. - Vol. 15. - Is. 7. - P. 2525 - 2533.

99. Ball, V. Dynamic aspects of protein adsorption onto titanium surfaces: mechanism of desorption into buffer and release in the presence of proteins in the bulk / V. Ball [et all] // Langmuir. - 1996. - Vol. 12. - P. 1614 - 1621.

100. Shen, Jia-Wei. Molecular simulation of protein adsorption and desorption on hydroxyapatite surfaces / Jia-Wei Shen [et all] // Biomaterials. - 2008. - Vol. 29. - P. 513-532.

101. Эльтеков, А. Ю. Сорбция и хроматография альбумина и рибонуклеазы нанопористыми кремнеземными адсорбентами / А. Ю. Эльтеков, Н. А. Эльтекова // Журнал физической химии. - 2003. - Т. 77. - № 7. - С. 1264 - 1268.

102. Эльтекова, H. А. Ситовые эффекты при адсорбции альбумина и гамма-глобулина / Н. А. Эльтекова, Ю. А. Эльтеков // Журнал физической химии. -2000. - Т. 74. - № 6. - С. 1075 - 1079.

103. Метелица, Д. И. Адсорбционные свойства целлюлозных мембран по отношению к иммуноглобулинам человека / Д. И. Метелица [и др.] // Журнал физической химии. - 1989. - № 10. - С. 2736 - 2741.

104. Ghule, А. V. Carbon nanotubes prevent 2,2,2 trifluoroethanol induced aggregation of protein / A. V. Ghule [et all] // Carbon. - 2007.- Vol. 45. - P. 1583 -1595.

105. Davis, J. J. The immobilization of proteins in carbon nanotubes / J. J. Davis [et all] // Inorganica Chimica Acta. - 1998. - Vol. 272. - P. 261 - 266.

106. Сокольницкая, Т. А. Неравновесный характер адсорбции белков на пористых углеродных адсорбентах / Т. А. Сокольницкая [и др.] // Журнал физической химии. - 1990. - № 10. - С. 2864 - 2866.

107. Богдановская, В. А. Адсорбция альбумина на различных углеродных материалах / В. А. Богдановская, Г. Дзуккини, М. Р. Тарасевич // Коллоидный журнал. - 1991. - Т. 53. - № 5. - С. 801 - 804.

108. Masaya Kodama. Adsorption of human serum globulin on mesocarbon microbaeds / Masaya Kodama [et all] // Carbon. - Vol. 26. - № 6. - P. 777 - 783.

109. Белов, С. В. Взаимодействие сывороточного альбумина с различными анионообменниками / С. В. Белов, А. Е. Иванов, В. П. Зубов // Журнал физической химии. - 2000. - Т. 74. - № 4. - С. 749 - 754.

110. Эльтекова, Н. А. Оценка параметров пористой структуры силикагелей и углеродных сорбентов по адсорбции макромолекул / Н. А. Эльтекова, Ю. А. Эльтеков // Журнал физической химии. - 1992. - Т. 66. - № 3. - С. 1014 - 1020.

111. Valenti, L. Е. The adsorption-desorption prosses of bovine serum albumin on carbon nanotubes / L. E. Valenti [et all] // J. Colloid and Interface Science. - 2007. -Vol. - 307. - P. 349 - 356.

112. Коваленко, Г. А. Адсорбция и антифибринолитическая активность □-аминокапроновой кислоты на углеродсодержащих энтеросорбентах / Г. А. Коваленко // Химико-фармацевтический журнал. - 1998. - № 11. - С. 39 - 41.

113. Коваленко, Г. А. Иммобилизованные протеолитические ферменты для наружного применения / Г. А. Коваленко // Химико-фармацевтический журнал. - 1998.-№4.-С. 41 -43.

114. Бабкин, О. Э. Модифицированные сорбенты на основе технического углерода / О. Э. Бабкин, Г. К. Ивахнюк, Н. Ф. Федоров // Журнал физической химии. - 1993. - Т.67.- № 10. - С. 2056 - 2058.

115. Давыдов, В. И. Адсорбция аминокислот углеродным энтеросорбентом СКН из модельных растворов и биологических жидкостей / В. И. Давыдов, Н. М. Покрасен // Украинский химический журнал. - 1994. - № 7 - 8. - С. 554 - 559.

116. Коваленко, Г. А. Методы получения биоспецифических гемосорбентов / Г. А. Коваленко // Химико-фармацевтический журнал. - 1998. -№3.-С.36-40.

117. Seredych, Mykola. Surface functional groups of carbons and the effects of their chemical character, density and accessibility to ions on electrochemical performance / Mykola Seredych [et all] // Carbon. - 2008. - V 46. - P. 1475 - 14-88.

118. Бакалинская, О. H. Сорбционные свойства углеродных гемосорбентов с иммобилизованными белками / О. Н. Бакалинская, Н. В. Сухаренко, В. В. Стрелко // Украинский химический журнал. - 1989. - № 12. - С.1273 - 1276.

119. Сидорчук, В. В. Некоторые особенности модифицирования активных углей парами воды и пероксида водорода при высоких температурах и давлениях / В. В. Сидорчук // Журнал прикладной химии. - 2006. - Т. 79. - № 9. -С. 1444 - 1447.

120. Клименко, Н. А. Влияние различных режимов окисления на изменение структурных характеристик активного угля / Н. А. Клименко [и др.] // Химия и технология воды. - 2008. - Т. 30. - № 5. - С. 478 - 489.

121. Пат. 2142847 Российская Федерация. МПК6 В 01 J 20/30 А 61 М 1/38. Способ модификации углеродных сорбентов / Петросян Э. А., Сергиенко В. И.,

Сухинин А. А.; заявитель и патентообладатель Э. А. Петросян. - № 98110411/14; заявл. 01.06.1998; опубл. 20.12.1999.

122. Пат. 2240863 Российская Федерация. МПК7 В 01 J 20/20, С 01 В 31/08. Способ получения модифицированного активного угля / Юстратов В. П. [и др.]; заявитель и патентообладатель Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. - № 2003133936/15, заявл. 21.11.2003; опубл. 27.11.2004.

123. Yao, Z. Polymerization from the surface of single-walled carbon nanotubes -preparation and characterization of nanocomposites / Z. Yao, N. Braidy, G. A. Botton, A. Andronov // J. Am. Chem. Soc. - 2003. - Vol. 125. - № 51. - P. 16015 -16024.

124. Stevens, J. Sidewall amino-functionalization of single-walled carbon nanotubes through fluorination and subsequent reactions with terminal diamines / J. Stevens [et all] // Nano letters. - 2003. - Vol. 3. - № 3 - P. 331 - 336.

125. Островидова, Г. У. Иммобилизация глюкозооксидазы на графите / Г. У. Островидова, М. И. Чечот, Е. Н. Иванова // Прикладная биохимия и микробиология. - 1990. - Т. 20. - № 2. - С. 209 - 213.

126. Ежова, Н. М. Сорбция лизина молекулярно импринтированными карбоксильными сорбентами / Н. М. Ежова, И. В. Полякова, О. А. Писарев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - Т. 45. - №2. - С. 243 - 247.

127. Муйдинов, М. Р. Новое поколение модифицированных фторполимерами материалов с уникальными техническими характеристиками / М. Р. Муйдинов // Российский химический журнал. - 2002. - Т. XLVI. - № 3. - С. 64 - 71.

128. Niu Li. A highly selective chemical gas sensor based on functionalization of multi-walled carbon nanotubes with poly(ethylene glycol) / Niu Li, Luo Yanling, Li Zhanqing // Sensors and Actuators B. - 2007. - Vol. 126. - P. 361 - 367.

129. Qiao Chen, Riwei Xu, Dingsheng Yu. Multiwalled carbon nanotube/polybenzoxazine nanocomposites: Preparation, characterization and

properties / Qiao Chen, Riwei Xu, Dingsheng Yu // Polymer. - 2006. - Vol. 47. -7711 -7719.

130. Bazula, Piotr A. Surface and pore structure modification of ordered mesoporous carbons via a chemical - oxidation approach / Piotr A. Bazula [et all] // Microporous and Mesoporous Materials. - 2008. - Vol. 108. - P. 266 - 275.

131. Hiromi Kitano. Functionalization of single-walled carbon nanotube by the covalent modification with polymer chains / Hiromi Kitano, Kazutaka Tachimoto, Yasutaka Anraku // Journal of Colloid and Interface Science. - 2007. - Vol. 306. -P. 28-33.

132. Jianfeng Shen. Thermo-physical properties of epoxy nanocomposites reinforced with amino-functionalized multi-walled carbon nanotubes / Jianfeng Shen [et all] // Composites: Part A. - 2007. - Vol. 38. - P. 1331 - 1336.

133. Tasis, Dimitrios. Chemistry of Carbon Nanotubes / Dimitrios Tasis [et all] // Chem. Rev. - 2006. - Vol. 106. - P. 1105 - 1136.

134. Gaixia Zhanga. The surface analytical characterization of carbon fibers functionalized by H2SO4/HNO3 treatment / Gaixia Zhanga [et all] // Carbon. -Vol. 46. - P. 196-205.

135. Зайцев, Б.Н. Применение атомносиловой микроскопии для изучения сорбции антител и захвата поверхностного антигена гепатита В на поверхности иммунологических планшетов / Б.Н. Зайцев, И.В. Юдина, А.Н. Канев // Биотехнология. - 2006.- №1.- С. 89 - 96.

136. Вергун, Л. Ю. Синтез иммуномагнитных сорбентов для сепарации вирусов гепатитов В и С / Л. Ю. Вергун [и др.] // Мшробюл. журнал. - 2009. -Т. 71.-№5.-С. 65-71.

137. Terman, D. S. Extracorporeal immunoadsorbens for extraction of circulating immune reactants / D. S. Terman // in Sorbents and their clinical applications; ed. C. Giordano. - N. - Y. : London Academic Press, 1980. - P. 469 - 491.

138. Jian Li. Preparation of multi-walled carbon nanotubes grafted with synthetic poly(L-lysine) through surface-initiated ring-opening polymerization / Jian Li // -Polymer. - 2007. - Vol. 48. - P. 4352 - 4360.

139. Якубке, Х.-Д. Аминокислоты. Пептиды. Белки / X. - Д. Якубке, X. Ешкайт - М. : Мир, 1985.

140. Глик, Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М. : Мир, 2002. - 577 с.

141. Плате, Н. А. Физиологически активные полимеры. / Н. А. Плате, А. Е. Васильев. - М. : Химия, 1986. - 296 с.

142. Программа визуализации молекул. [Электронный ресурс]. - URL: http://www.rasmol.org. (дата обращения: 10.03.2007).

143. Официальная свободная база данных белков. [Электронный ресурс]. -URL: http://www.pdb.org. (дата обращения: 15.11.2010).

144. Barton, S. S. Acidic and basic sites on the surface of porous carbon / S. S. Barton [et all] // Carbon. - 1997. -V. 35. - P.1361.

145. Noh, J. S. Estimation of the Point of Zero Charge of Simple Oxides by Mass Titration / J. S. Noh, J. A. Schwarz // J. Colloid and Interface Science. - 1989. -V. 130.-No. 1. - P. 157.

146. Noh, J. S. Effect of HNO3 treatment on the surface acidity of activated carbons / J. S. Noh, J. A. Schwarz // Carbon. - 1990. - V. 28. - No. 5. - P. 675.

147. Ермакова, M. А. Исследование химических свойств поверхности нановолокнистых углеродных материалов,получаемых каталитическим разложением метана / М. А. Ермакова, Д. Ю. Ермаков, В. В. Каичев // Журнал физической химии. - 2006. - Т. 80. - № 6. - С. 1015.

148. Jagiello, J. Application of inverse gas chromatography at infinite dilution to study the effects of oxidation of activated / J. Jagiello, Teresa J. Bandosz, J. A. Schwarz // Carbon. - 1992.- Vol. 30. - № 1. - P. 63.

149. Official methods of analysis. Association of Official Analytical Chemists. -Washington. D.C., 1970.

150. Janatova, J. The heterogeneity of bovine serum albumin with respect to sulfhydryl and dimer content / J. Janatova, J. K. Fuller, M. J. Hunter // J. Biol. Chem. - 1968. - V. 243. - P. 3612 - 3622.

151. Малахова, M. Я. Формирование биохимического понятия «субстрат эндогенной интоксикации» / М. Я. Малахова // Тез. Межд. Симпозиума «Эндогенные интоксикации». - СПб, 1994.- С. 38.

152. Малахова, М. Я. Метод регистрации эндогенно интоксикации: Пособие для врачей / М. Я. Малахова. - СПб. : ИАПОД995. - 33 с.

153. Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений / под ред. Сиггиа С. И. - М. : Мир, 1974. - 464 с.

154. Гершкович, А. А. Синтез пептидов. Реагенты и методы / А. А. Гершкович, В. К. Кибирев. - Киев: Наукова думка, 1987. - 264 с.

155. Kida, S. Studies on Heterobifunctional Cross-Linking Reagents, 6-Maleimidohexanoic Acid Active Esters / S. Kida [et all] // Chem. Pharm. Bull. -2007. - Vol. 55. - P. 685 - 687.

156. Полимерные пленочные материалы / под ред. Гуля В. Е. - М. : Химия,1976.

157. Коршаков, В. В. Успехи в области синтеза полипептидов / В. В. Коршаков [и др.] // Успехи химии. - 1965.- T. XXXIV. - Вып. 5. - С. 777 - 849.

158. Лопаткин, Н. А. Эфферентные методы в медицине / Н. А. Лопаткин, Ю. М. Лопухин. - М. : Медицина., 1989. - С. 44 - 48.

159. Кинле, X. Активированные угли и их промышленное применение / X. Кинле, Э. Бадер. - Ленинград: Химия, 1984. - С. 164.

160. Русьянова, Н. Д. Углехимия / Н. Д. Русьянова. - М. : Наука, 2000. - 316 с.

161. Сайдов, Г. В. Методы молекулярной спектроскопии / Г. В. Сайдов, О. В. Свердлова - СПб. : НПО «Профессионал», 2008. - 338 с.

162. Казицына, Л. А. Применение УФ-, ИК- и ЯМР - спектроскопии в органической химии: учеб. пособие для вузов / Л. А. Казицына, Н. Б. Куплетская. - М. : «Высш. Школа», 1971.

163. Shin, S. A study on the effect of heat treatment on functional groups of pitch based activated carbon fiber using FTIR / S. Shin [et all] // Carbon. - 1997. - Vol. 35.-№ 12.-P. 1739.

164. Ishizaki, C. Surface oxide structures on a commercial activated carbon / C. Ishizaki, I. Marti // Carbon. - 1981.- Vol. 19. - № 6. - P. 409.

165. Фенелонов, В. Б. Пористый углерод / В. Б. Фенелонов. - Новосибирск : Изд. отдел Института катализа СО РАН, 1995.

166. Barton, S. S. Acidic and basic sites on the surface of porous carbon / S. S. Barton [et all] // Carbon. - 1997. - V. 35. - P. 1361.

167. Kvon, R. I. XPS and ТЕМ study of new carbon material: N-containing catalytic filamentous carbon / Kvon, R. I. [et all] // Journal of Molecular Catalysis A: Chemical. - 2000. - V. 158. - P. 413.

168. Гальперн, Г. Д. Химия и технология синтетических высокомолекулярных соединенийю - М. : Издательство Академии наук СССР, 1959. - 598 с. - (Итоги науки. Химические науки Т.З)

169. Шулепов, Ю. В. Исследование эффекта изменения конформации сывороточного альбумина в процессе сорбции на активированной углеродной поверхности / Ю. В. Шулепов [и др.] // Доклады АН Украины. -1992. - № 12. -С. 123 - 128.

170. Иорданский, А. Л. Адсорбция белков в процесах взаимодействия полимеров с кровью и модельными растворами / А. Л. Иорданский, Г. Е. Заиков // Высокомолекулярные соединения. - 1983. - Т. 25а. - №3.- С. 451 - 476.

171. Mizutani, Т. Adsorption of proteins on silicone-coated glass surfaces / T. Mizutani // J. Colloid Interf. Sci. - 1973. - Vol. 82. - Is. 1. - PP. 162 - 166.

172. Камышный, А. Л. Адсорбция глобулярных белков на твердых носителях: некоторые физико-химические характеристики / А. Л. Камышный // Журнал физической химии. - 1981. - Т. 55. - № 3. - С. 562 - 579.

173. Wang Zh. Dispersing multi-walled carbon nanotubes with water—soluble block copolymers and their use as supports for metal nanoparticles / Wang Zh [et all] // Carbon. -2007. - Vol. 45. - № 2. - P. 285.

174. Tse-Ying Liu. On the study of BSA-loaded calcium-deficient hydroxyapatite nano-carriers for controlled drug delivery / Tse-Ying Liu [et all] // Journal of Controlled Release. - 2005. - Vol. 107. - P. 112 - 121.

175. Нолтинг, Б. Новейшие методы исследования биосистем / Б. Нолтинг. -М.: Техносфера, 2005. - 256 с.