Модификация фрактального подхода для анализа перестроек цитоскелета на примере фибриллярного актина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ревитцер Алла Вафаевна

• Ревитцер Алла Вафаевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Ревитцер Алла Вафаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Понятие фрактальной размерности

1.2 Современные цифровые подходы для оценки перестроек актиновых структур цитоскелета

1.3 Мезенхимные стволовые клетки (МСК)

1.3.1 Характеристика стволовых клеток

1.3.2 Источники МСК

1.4 МСК в регенеративной медицине

1.4.1 Критерии использования МСК в регенеративной медицине

1.4.2 Ограничения применения МСК в терапевтических целях

1.5 Модифицирование условий культивирования МСК как способ увеличить их регенеративный потенциал

1.5.1 Варьирование физико-химических факторов внеклеточной среды

1.5.2 Предсердный натрийуретический пептид - потенциальный модулятор миграции МСК

1.6 Клеточная подвижность и актиновый цитоскелет МСК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры

2.2 Подсчет клеток

2.3 Кривые роста и эффективность клонирования клеток

2.4 Проточная цитофлуометрия

2.5 Адипогенная дифференцировка

2.6 Остеогенная дифференцировка

2.7 Гистологические окрашивания

2.8 Выделение РНК

2.9 Обратная транскрипция (ОТ)

2.10 Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.11 ПЦР после ОТ (ОТ-ПЦР)

2.12 Электрофоретическое разделение продуктов после ПЦР

2.13 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)

2.14 Инкубация клеток с биологически активными веществами

2.15 Оценка миграции МСК с помощью метода зарастания раны

2.16 Окрашивание фибриллярного актина родамином, конъюгированным с фаллоидином

2.17 Окрашивание рецепторов системы натрийуретических пептидов иммунофлуоресцентными антителами

2.18 Визуализация образцов с помощью различных видов микроскопии

2.19 Измерение относительной интенсивности флуоресценции

2.20 Расчет фрактальной размерности изображения фибриллярного актина

с помощью плагина FracLac для ImageJ

2.21 Программная среда для разработки кода, рассчитывающего фрактальную размерность Минковского для изображения фибриллярного актина

2.22 Метод Блэнда - Алтмана для сравнения двух измерений

2.23 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Разработка улучшенного метода измерения фрактальной размерности Минковского для изображений клеточных структур

3.1.1 Оценка действия латрункулина Б в различных концентрациях на структуры фибриллярного актина в МСК человека (дермальных фибробластах линии FRSN)

3.1.2 Расчет фрактальной размерности Минковского для изображений фибриллярного актина в клетках FRSN

3.1.3 Расчет фрактальной размерности Минковского для изображений фибриллярного актина при флуоресцентной широкопольной и конфокальной микроскопии

3.2 Организация и перестройки фибриллярного актина в МСК, полученных из периренального жира крысы

3.2.1 Выделение и характеристика МСК из периренального жира крысы

3.2.2 Экспрессия рецепторов натрийуретических пептидов в МСК, выделенных из периренального жира крысы

3.2.3 Влияние предсердного натрийуретического пептида на фибриллярный актин и подвижность МСК из периренального жира крысы

3.3 Организация и перестройки фибриллярного актина в МСК, выделенных из костного мозга 5-6 недельного эмбриона человека (линия FetMSC)

3.3.1 Подтверждение мультипотентного статуса FetMSC в измененных условиях культивирования

3.3.2 Экспрессия рецепторов натрийуретических пептидов в FetMSC

3.3.3 Изменение организации фибриллярного актина FetMSC в присутствии предсердного натрийуретического пептида

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Перспективы применения модифицированного метода вычисления фрактальной размерности Минковского для анализа структур клетки

4.2 Мезенхимные стволовые клетки как модель для сравнительных исследований организации и перестроек актинового цитоскелета

4.2.1 Мультипотентный статус МСК из периренального жира крысы

4.2.2 Сохранение мультипотентных свойств МСК, выделенных из костного мозга 5-6-недельного эмбриона человека, при варьировании условий культивирования

4.3 Влияние предсердного натрийуретического пептида на организацию фибриллярного актина в МСК различного происхождения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация фрактального подхода для анализа перестроек цитоскелета на примере фибриллярного актина»

Актуальность работы

Клетка - это сложно организованная трехмерная система, обладающая целым рядом высокодинамичных клеточных структур, морфология которых сложна для описания, так как является протяженной, изрезанной, неровной. Примеры этих структур: эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, кристы митохондрий, цитоскелет (в частности актиновый). Форма и перестройки этих структур тесно связаны с функционированием клетки и возможность какой-либо характеристики этих изменений является актуальной задачей для исследователей. Проблема заключается в том, что клеточные структуры достаточно сложно количественно оценить - в настоящее время это чаще всего происходит «на глаз», что может привести к субъективным результатам. Получение численного эквивалента организации или формы позволило бы объективно и непредвзято сравнивать такие структуры в различных экспериментах, например, после воздействия биологически активных веществ. Вычисление фрактальной размерности изображений клеточных структур может дать численный ответ на этот вопрос. Фрактальная размерность - это коэффициент, описывающий структуры или множества на основе количественной оценки их сложности, как коэффициент изменения сложности (детализированности) рисунка с изменением масштаба. Существующие программы для вычисления фрактальной размерности изображений имеет недостаток, который может стать критичным для их использования в биологических задачах ученого-биолога: необходимость выбирать параметры расчета (например, размер и положение сетки для вычисления фрактальной размерности Минковского) вручную, что требует понимания принципов расчета. Учитывая огромное разнообразие размеров и форм клеток в общем, и клеточных систем в частности, некорректный выбор параметров может давать некорректные оценки, которые не позволят проводить сравнительный анализ. Но возможно модифицировать расчет так,

чтобы эти параметры определялись с помощью самой программы однозначно, пользуясь каким-то принципом, например на основе положения и размера клеточного ядра, размер и положение которого варьирует в небольших пределах в популяции клеток одного типа. В представленной работе такая модификация была разработана на основе анализа изображений флуоресцентно-окрашенных ядер и фибриллярного актина мезенхимных стволовых клеток (МСК). Эта модель привлекательна тем, что МСК имеют хорошо выраженные стресс-фибриллы.

В настоящее время регенеративная медицина активно разрабатывает методы лечения пораженных тканей организма с помощью клеток-предшественников и мезенхимных стволовых клеток (МСК), однако, не всегда такая терапия обладает высокой эффективностью. Основные проблемы данного вида терапии заключаются в том, что только небольшой процент введенных в организм клеток оказывается и остается в месте повреждения, большая же часть клеток обнаруживается в мелких кровеносных сосудах и, впоследствии, погибает в них [1]. Использование различных агентов, влияющих на актиновый цитоскелет и, соответственно, на миграционный потенциал клеток-предшественников и МСК, считается одним из способов преодоления этой проблемы. МСК культивируются исследователями в присутствии этих агентов до того, как клетки будут трансплантированы в организм реципиента. Известно уже много таких веществ, но продолжается и поиск новых.

Одним из потенциальных модуляторов актинового цитоскелета МСК является предсердный натрийуретический пептид (ПНП), он способен оказывать влияние на актиновые структуры и подвижность эндотелиальных клеток [2]; также показано нарушение миграции МСК у мышей с нокаутом рецептора натрийуретического пептида типа А [3]. Тем не менее, остается неизвестным, способен ли предсердный натрийуретический пептид оказывать существенное влияние на актиновый цитоскелет и миграцию стволовых

клеток; этот вопрос недостаточно изучен, как в моделях in vivo, так и в моделях in vitro.

В современных исследованиях используется большое количество методов оценки комплексных изменений миграционного потенциала и цитоскелета: метод «зарастания раны», измерение параметров формы и размера клеток, окраска актиновых структур и последующий анализ полученных изображений. Одним из методов описания перестроек цитоскелета является оценка фрактальной размерности [4,5]. Изображение сети микрофиламентов можно рассматривать как сложную геометрическую структуру, в таком случае именно фрактальная размерность - дробный коэффициент, используемый для оценки сложных геометрических структур, -является логичным выбором для описания организации актинового цитоскелета и его изменений после различных воздействий. Однако на сегодняшний день использование фрактальной размерности Минковского не является частой практикой в анализе изображений клеточных структур; скорее всего это происходит по причине большого влияния на конечный результат субъективного выбора параметров расчета.

Появление новых подходов в регенеративной медицине и необходимость более детального анализа данных все острее ставит вопрос о квантификации предполагаемых изменений актинового цитоскелета, актуальность таких задач очевидна, как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Есть основания полагать, что в качестве перспективного инструмента оценки перестроек актинового цитоскелета могут быть предложены и использованы новые модификации метода вычисления фрактальной размерности Минковского.

Степень разработанности темы исследования

В современной литературе описаны методы квантификации для фибриллярного актина, самым популярным из которых является вычисление средней интенсивности флуоресценции [6] для двумерного изображения, полученного с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако, этот подход

может только дать информацию о том, больше или меньше фибриллярного актина стало в клетке после ее обработки интересующими нас биологически активными веществами. Таким образом, вычисление средней интенсивности флуоресценции будет являться численным эквивалентом сборки или разборки фибриллярного актина. В других ситуациях, когда происходит не сборка или разборка, а изменение конфигурации («формы») фибриллярного актина, вычисление средней интенсивности флуоресценции становится неинформативным и не может быть использован для корректных оценок и получения статистически различимых результатов между экспериментальными группами. В свою очередь, существует фрактальная размерность Минковского [7], которая представляет собой коэффициент изменения сложности (детализированности) рисунка с изменением масштаба. Этот коэффициент позволяет количественно оценить сложность структуры, в том числе и для случаев изменения конфигурации фибриллярного актина. Примерно 10 лет назад были предприняты попытки применения фрактальной размерности Минковского для квантификации фибриллярного актина: в работе [8] проводят расчеты для МСК человека, выявляя влияние оксида азота; в работе [9] анализируют морфологию дендритов; в работе [4] оценивают воздействие микрогравитации на мышиные преостеобласты. Однако фрактальный подход с использованием размерности Минковского не стал повсеместно используемым. Разработанная модификация фрактального подхода позволит оценивать структуру фибриллярного актина в клетках и повысить применимость подхода.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Разработка модифицированного метода вычисления фрактальной размерности Минковского для характеристики перестроек фибриллярного актина в клетках, основанного на автоматическом подборе параметров расчета, учитывающем размер и положение клеточного ядра.

Задачи:

1. Разработать модифицированный метод вычисления фрактальной размерности Минковского, основанный на автоматическом подборе параметров расчета, учитывающем размер и положение клеточного ядра, используя изображения фибриллярного актина, выявить численный эквивалент морфологической характеристики.

2. С помощью разработанного подхода оценить организацию фибриллярного актина в МСК до и после обработки ингибитором полимеризации актинового цитоскелета латрункулином Б в различных концентрациях.

3. С помощью разработанного подхода проанализировать состояние сети актиновых фибрилл в МСК крысы и человека после культивирования в присутствии предсердного натрийуретического пептида, потенциального модулятора актинового цитоскелета и клеточной подвижности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан модифицированный метод вычисления фрактальной размерности Минковского, устанавливающий параметры вычислений автоматически на основе размера и положения клеточного ядра

2. Корректность разработанного метода показана на примере оценки изменения морфологии фибриллярного актина в МСК человека после обработки ингибитором полимеризации актина латрункулином Б по сравнению с контролем.

3. Разработанный метод определения численного эквивалента для морфологической характеристики цитоскелета позволил продемонстрировать и количественно охарактеризовать влияние предсердного натрийуретического пептида на организацию фибриллярного актина МСК человека и крысы.

Научная новизна работы

В работе впервые разработан и апробирован модифицированный метод вычисления фрактальной размерности Минковского, автоматически определяющий параметры расчетов. Усовершенствованный подход содержит определение параметров расчета на основе размера и положения клеточного ядра, что позволяет выбирать эти параметры без участия пользователя и быстрее производить вычисления, получать данные, не зависящие от положения изображения клетки на микрофотографии и от решения пользователя. Показано, что усреднение результатов расчета с помощью вычисления размерности при различных положениях исследуемого изображения фибриллярного актина позволяет определить наиболее вероятное значение фрактальной размерности для изображения и избежать статистических выбросов. Показано, что для получения используемых в расчете изображений можно использовать широкопольную флуоресцентную микроскопию наряду с конфокальной без влияния на результирующее значение размерности с помощью разработанного метода.

В работе впервые представлены данные о влиянии предсердного натрийуретического пептида на актиновый цитоскелет и миграцию мезенхимных стволовых клеток. Определены зависимости между концентрациями ПНП и миграционным потенциалом МСК, выделенных из периренального жира крысы и МСК, выделенных из костного мозга 5-6 недельного эмбриона человека. Для изучения эффектов использован современный метод прижизненной цейтраферной съемки для наблюдения за процессом зарастания экспериментальной раны, наносимой на монослой МСК. Так же впервые выявлены изменения организации фибриллярного актина МСК с помощью измерения фрактальной размерности изображений в контроле и после воздействия ПНП.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость заключается в разработке модифицированного метода вычисления фрактальной размерности

Минковского для описания структуры фибриллярного актина клетки, модифицированный метод в качестве численной «меры» структуры фибрилл позволяет оценить сложность морфологии цитоскелета, представляя цитоскелет как геометрическую фигуру. Численное описание архитектуры фибриллярного актина предоставляет возможность сравнить между собой значения, полученные в различных условиях, и делать выводы о воздействии использованных веществ, что может быть затруднительно сделать при визуальной оценке. Модификации метода, предложенные в работе, позволяют автоматизировать процесс подбора параметров для вычисления фрактальной размерности Минковского, что упрощает и ускоряет рабочий процесс для пользователя.

Практическая значимость заключается в том, что в рамках поставленной задачи полученные результаты дают представление о влиянии предсердного натрийуретического пептида на миграцию МСК, выделенных из периренального жира крысы, и МСК, выделенных из костного мозга 5-6 недельного эмбриона человека. Эти данные указывают на значимость концентрационного диапазона и необходимость дальнейшего изучения механизма влияния ПНП на миграцию и цитоскелет. Перспективы исследования состоят в дальнейшей оценке возможного применения ПНП в регенеративной медицине для усиления миграционного потенциала МСК и преодоления проблемы достижения МСК участков повреждения тканей и их заживления.

Методология и методы исследования

Для достижения поставленной цели и выполнения задач в диссертационном исследовании применялись следующие методы клеточной биологии, молекулярной биологии и биофизики клетки: выделение МСК из жировой ткани, культивирование клеток, направленная дифференцировка, выделение РНК, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, иммунофлуоресценция, гистохимические окраски, микроскопия (оптическая, флуоресцентная широкопольная, конфокальная), цейтраферная съемка с помощью

флуоресцентного микроскопа, метод заживления раны, метод Минковского для измерения фрактальной размерности изображения, компьютерная и статистическая обработка данных.

Личный вклад автора

Вклад Ревитцер А.В. в подготовку диссертации состоял в разработке нового подхода, опирающегося на использовании положения и размера клеточного ядра на микрофотографии при выборе параметров расчета, планировании исследования, проведении лично всех экспериментальных работ на базе Группы ионных механизмов клеточной сигнализации в составе Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии Российской академии наук. Идея и способ модификации метода принадлежат лично автору. Написание программного продукта для вычисления фрактальной размерности Минковского изображений фибриллярного актина мезенхимных стволовых клеток велась совместно со старшим преподавателем Высшей школы программной инженерии Института компьютерных наук и технологий Санкт-Петербургского государственного политехнического университета Петра Великого Селиным Иваном Андреевичем. Подготовка изображений, статистический анализ и обработка результатов выполнялась лично диссертантом, написание текстов публикаций проводилось совместно с соавторами.

Апробация работы

Основное содержание диссертационной работы изложено в 10 научных публикациях: 4 статьи в индексируемых в международных базах данных журналах (Web of Science, Scopus, eLIBRARY); 6 по материалам конференций.

Результаты исследования были представлены на VI Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (25 - 27 апреля 2018 г.), конференции с международным участием Неделя науки СПбПУ (19 - 24 ноября 2018 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы клеточной биологии и

клеточных технологий» (8 - 11 октября 2019 г.), VII Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (12-15 октября 2020 г.), Всероссийской конференции «Неделя науки ИФНиТ» (16-20 ноября 2020 г.), конференция для молодых ученых LifeSciencePolytech (25-26 ноября 2021 г.).

Результаты работы были включены в отчеты по научно-исследовательской работе по грантам Российского Фонда Фундаментальных Исследований (РФФИ) № 16-34-00952 и Российского Научного Фонда (РНФ) № 18-15-00106.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список публикаций по теме диссертации, список литературных источников. Текст диссертации изложен на 132 страницах, содержит 42 рисунка и 8 формул. Список литературы представлен 97 источниками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Понятие фрактальной размерности.

Для лучшего понимания фрактальной размерности следует разобрать, что такое фрактал. Понятие фрактал было введено Бенуа Мандельбротом в 1975 году, происходит от латинского &ас^ - ломанный, разбитый, нерегулярный. Бенуа Мандельброт определил, что «фракталом называется структура, состоящая из частей, которые в каком-то смысле подобны целому». Современное определение говорит, что фрактал - множество точек, обладающее нелинейной структурой и самоподобием на различных масштабах. Кроме этого, фрактал обладает дробной метрической размерностью, отличающейся от топологической размерности.

Классическим понятием природного фрактала является парадокс береговой линии, заключающийся в том, что невозможно точно измерить береговую линию из-за ее фрактальных свойств. Впервые об этой географической проблеме заговорил Люис Фрай Ричарсон в 1957 году, далее она была дополнена Бенуа Мандельбротом [10]. Существует проблема, что при измерении береговой линии с помощью окружностей масштаба Rl мы будем получать длину меньше, чем при измерении с помощью более мелких окружностей масштаба R2. Причем при уменьшении масштаба R длина береговой линии будет неограниченно расти (рисунок 1.1).

Рисунок 1.1 - Схематическая визуализация парадокса береговой линии. А -

участок береговой линии АВ длины L. Б. - участок береговой линии, покрытый N1 окружностями масштаба, равного масштабу (диаметру) Rl. В. -участок береговой линии, покрытый N2 окружностями масштаба, равного диаметру R2, меньшему, чем Rl. Полученная длина N2 больше, чем N1. При уменьшении масштаба длина береговой линии стремится к бесконечности. Г - определение фрактальной размерности D как углового коэффициента

графика ^(А^ и ^(1^)

Тем не менее, между размером масштаба R и количеством окружностей N существует связь С, Ридчарсон установил ее как:

C=N(R)*RD (1)

В этой формуле неизменным будет оставаться значение С, и D будет константой и будет принимать значение больше 1. Так же существует связь между длиной береговой линии L в зависимости от R: L(R)=N(R)*R (2)

Из формул (1) и (2) следует, что L(R)=C*R1-D (3)

Выразив N(R) через формулу (2) и подставив туда вместо L(R) выражение из формулы (3), мы получим

N(R)=C*R-d (4)

Константу D будут называть фрактальной размерностью выбранной береговой линии.

Для нахождения фрактальной размерности необходимо прологарифмировать выражение (3):

logL(^) = log С + (1-D) log Я (5)

Или прологарифмировать выражение (4)

log N(R^) = log С — D log Я (6)

Из выражений (5) и (6) следует, что D можно определить, как угловой коэффициент графика зависимости logL(R) и logR (или logN(R) и logR).

Для определения фрактальной размерности изображений используется способ задания фрактальной размерности известный как фрактальная размерность Минковского

D = lim (7)

logl/R v '

R^O

Где N(R) - минимальное количество множеств диаметра R, необходимых для покрытия изображения.

Альтернативный способ определения фрактальной размерности называется box-counting method или клеточная размерность, где изображение вместо множеств диаметра R покрывается квадратной сеткой со стороной Q

D = lim (8)

<HC l0gl/Q

Где N(Q) соответственно минимальное количество ячеек сетки со стороной Q, необходимых для покрытия изображения. Подробно этот вариант будет описан в следующем параграфе.

Фрактальная размерность береговой линии будет принимать значения между 1 (фрактальная размерность прямой) и 2 (фрактальная размерность плоскости), что, если рассматривать со стороны интерпретации «сложности» фигуры, означает, что фрактальный объект сложнее прямой, но не занимает столько же пространства, как плоскость. Фрактальная размерность более изрезанной береговой линии будет больше, чем у менее изрезанной. Таким образом, можно сделать вывод: фрактальная размерность Минковского может быть использована для оценки и сравнения различных двумерных структур между собой.

1.2 Современные цифровые подходы для оценки перестроек актиновых структур цитоскелета.

Количественная оценка цитоскелета имеет первостепенное значение для выявления клеточных механизмов миграции и регенерации, механизмов передачи и перцепции механических сил.

Актиновый цитоскелет представляет большой интерес для ученых, и ранее учеными были разработаны различные подходы к его изучению (помимо цифровых). На молекулярном уровне возможно оценить количество отдельно глобулярного и отдельно фибриллярного актина с помощью вестерн-блота. Так же возможно окрасить фибриллярный и глобулярный актин с помощью соответствующих антител или специфических веществ и оценить их количество, основываясь на изображениях, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа [11]. Интересно, что для окраски фибриллярного актина применяют не только антитела, но и органическое вещество фаллоидин, конъюгированное с флуоресцентным красителем, которое способно избирательно связываться с фибриллярным актином [12].

Фаллоидин является одним из компонентов яда бледной поганки (рисунок 1.2) и обладает токсичностью, смертельная доза для человека составляет примерно 25 мг.

\

но0

Рисунок 1.2 - Фаллоидин, вещество, способное связываться с фибриллярным

актином. А - бедная поганка Amanita phalloides, яд которой содержит фаллоидин. Б. - скелетная структура фаллоидина, изображение взято из [12]. В - скелетная структура фаллоидина, конъюгированного с флуоресцентным красителем TRITC, изображение взято с сайта https://www.rndsystems.com

каталожный номер 5783

Химически фаллоидин представляет собой бициклический гептапептид, способный встраиваться между двумя актиновыми единицами и блокировать АТФазную активность актина. Из-за неспособности проникать через клеточную мембрану соединения фаллоидина непригодны для мечения актина в живых клетках. Тем не менее, разработаны вещества, способные окрашивать актин в живых клетках, например соединения ясплакинолида (такие как SiR-actin, Spirochrome, Швейцария), другого токсичного вещества, выделенного из морской губки Jaspis johnston и обладающего свойством усиливать полимеризацию [13].

Токсины, способные связываться с различными формами актина, используются и исследуются не только как компоненты для визуализации актина в клетке, но и как самостоятельные агенты, воздействующие на цитоскелет. Одно из таких вещество - латрункулин Б (рисунок 1.3), его выделяют из яда морских губок Latrunculia magnifica [14].

Рисунок 1.3 - Латрункулин Б, вещество, ингибирующее полимеризацию актина. А - красная губка Latrunculia magnifica, яд которой содержит латрункулин Б. Б. - скелетная структура латрункулина Б

Латрункулин Б представляет собой бициклический макролид, один из токсинов группы латрункулинов. Латрункулин Б связывается с глобулярным актином, предотвращая его полимеризацию, также он ингибирует способность к сокращению у комплекса актин-миозин. Одним из его потенциальных применений в медицине можно назвать противораковую терапию, так как его добавление к живым клеткам вызывает нарушение миграции и их программированную гибель [14].

Хотя флуоресцентная микроскопия является удобным инструментом для наблюдения за морфологией актинового цитоскелета, подходов для количественной оценки этих изменений немного.

Часто для манипуляций с изображениями, получаемыми в процессе биологических экспериментов, используется программа ImageJ (№Н, США), находящаяся в свободном доступе в интернете, в том числе она пригодна и для реализации различных подходов, позволяющих количественно оценить структуру актинового цитоскелета. Кроме этого, некоторые коллективы исследователей разрабатывают собственные программные продукты для вычислений или пользуются средами программирования для создания скриптов, обрабатывающих изображения. В качестве основных подходов для количественной оценки фибриллярного актина в клетке можно выделить измерение интенсивности флуоресценции актинового цитоскелета, расчет суммарной длины актиновых филаментов клетки, оценка фрактальной размерности фибриллярного актина.

Измерение интенсивности флуоресценции актинового цитоскелета. Распределение фибриллярного актина в клетке можно оценить с помощью измерения интенсивности флуоресценции изображения окрашенной родамин-фаллоидином или специфичными антителами клетки [6,11]. Общий порядок расчета заключается в следующем: в цветном изображении выделяется канал, содержащий изображение фибриллярного актина. Цветное изображение преобразуется в черно-белое, глубина цвета получаемого изображения кодируется 8 битами. Для каждого пикселя такого изображения существует цифровое значение, отображающее оттенок серого цвета (от 0 до 255). После этого возможно определить среднее значение интенсивности флуоресценции (рисунок 1.4).

Рисунок 1.4 - Схематическая визуализация вычисления средней интенсивности флуоресценции фибриллярного актина клетки. А - перевод цветного канала, содержащего изображение фибриллярного актина, в черно-

белое. Б. - числовая интерпретация оттенка полученных пикселей для 8-битного изображения. В. - формула для вычисления средней интенсивности флуоресценции (MGV), где GV - численный эквивалент яркости пикселя, а N

- количество пикселей в изображении

Так же при использовании подхода, основанного на оценке яркости пикселей изображения, возможно построить зависимость интенсивности флуоресценции от координаты для изображения. В общих чертах данный подход основан на выделении в клетке линии, проходящей от одного конца клетки к другому перпендикулярно направлению фибриллярного актина в клетке и построению графика зависимости относительной интенсивности пикселей (или участков из нескольких) изображения от расположения на проведенной линии (рисунок 1.5). Подробно метод описан в [15].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ревитцер Алла Вафаевна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Song C., Li G. CXCR4 and matrix metalloproteinase-2 are involved in mesenchymal stromal cell homing and engraftment to tumors // Cytotherapy. - 2011.

- Vol. 13, № 5. - P. 549-561.

2. Kook H. et al. Physiological concentration of atrial natriuretic peptide induces endothelial regeneration in vitro // Am. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. American Physiological Society, - 2003. - Vol. 284, № 4. - P. H1388-H1397.

3. Mallela J. et al. NPRA Signaling Regulates Stem Cell Recruitment and Angiogenesis: A Model to Study Linkage Between Inflammation and Tumorigenesis // Stem Cells Dayt. Ohio. - 2013. - Vol. 31.

4. Qian A.R. et al. Fractal dimension as a measure of altered actin cytoskeleton in MC3T3-E1 cells under simulated microgravity using 3-D/2-D clinostats // IEEE Trans. Biomed. Eng. - 2012. - Vol. 59, № 5. - P. 1374-1380.

5. Fuseler J.W. et al. Fractal and image analysis of morphological changes in the actin cytoskeleton of neonatal cardiac fibroblasts in response to mechanical stretch // Microsc. Microanal. Off. J. Microsc. Soc. Am. Microbeam Anal. Soc. Microsc. Soc. Can. - 2007. - Vol. 13, № 2. - P. 133-143.

6. Mishra P. et al. Fluorescence Imaging of Actin Turnover Parses Early Stem Cell Lineage Divergence and Senescence: 1 // Sci. Rep. Nature Publishing Group, -2019. - Vol. 9, № 1. - P. 10377.

7. Smith T.G., Lange G.D., Marks W.B. Fractal methods and results in cellular morphology--dimensions, lacunarity and multifractals // J. Neurosci. Methods. -1996. - Vol. 69, № 2. - P. 123-136.

8. Fuseler J.W., Valarmathi M.T. Nitric Oxide Modulates Postnatal Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Migration // Front. Cell Dev. Biol. - 2016.

- Vol. 4. - P. 133.

9. Ristanovic D., Stefanovic B.D., Puskas N. Fractal analysis of dendrite morphology using modified box-counting method // Neurosci. Res. - 2014. - Vol. 84. - P. 64-67.

10. Longley P.A., Batty M. Fractal measurement and line generalization // Comput. Geosci. - 1989. - Vol. 15, № 2. - P. 167-183.

11. Vallenius T. Actin stress fibre subtypes in mesenchymal-migrating cells // Open Biol. - 2013. - Vol. 3, № 6. - P. 130001.

12. Yao G. et al. Total Synthesis of the Death Cap Toxin Phalloidin: Atropoisomer Selectivity Explained by Molecular-Dynamics Simulations // Chem. Weinh. Bergstr. Ger. - 2019. - Vol. 25, № 34. - P. 8030-8034.

13. Andavan G.S.B., Lemmens-Gruber R. Cyclodepsipeptides from marine sponges: natural agents for drug research // Mar. Drugs. - 2010. - Vol. 8, № 3. - P. 810-834.

14. Spector I. et al. Latrunculins: novel marine toxins that disrupt microfilament organization in cultured cells // Science. - 1983. - Vol. 219, № 4584. - P. 493-495.

15. Zonderland J., Wieringa P., Moroni L. A quantitative method to analyse F-actin distribution in cells // MethodsX. - 2019. - Vol. 6. - P. 2562-2569.

16. Lichtenstein N., Geiger B., Kam Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy // Cytom. Part J. Int. Soc. Anal. Cytol. - 2003. - Vol. 54, № 1. - P. 8-18.

17. Vindin H. et al. Validation of an algorithm to quantify changes in actin cytoskeletal organization // J. Biomol. Screen. - 2014. - Vol. 19, № 3. - P. 354-368.

18. Karperien A., Ahammer H., Jelinek H.F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis // Front. Cell. Neurosci. - 2013. - Vol. 7. - P. 3.

19. Mushahary D. et al. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells // Cytom. Part J. Int. Soc. Anal. Cytol. - 2018. - Vol. 93, № 1. - P. 19-31.

20. Kolios G., Moodley Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine // Respir. Int. Rev. Thorac. Dis. - 2013. - Vol. 85, № 1. - P. 3-10.

21. Ohnuki M., Takahashi K. Present and future challenges of induced pluripotent stem cells // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 2015. - Vol. 370, № 1680. - P.20140367.

22. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3, № 4. - P. 393-403.

23. Zuk P.A. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue Eng. - 2001. - Vol. 7, № 2. - P. 211-228.

24. Ntege E.H., Sunami H., Shimizu Y. Advances in regenerative therapy: A review of the literature and future directions // Regen. Ther. - 2020. - Vol. 14. - P. 136-153.

25. Schinköthe T., Bloch W., Schmidt A. In Vitro Secreting Profile of Human Mesenchymal Stem Cells // Stem Cells Dev. Mary Ann Liebert, Inc., publishers, -2008. - Vol. 17, № 1. - P. 199-206.

26. Yang Z.X. et al. CD106 identifies a subpopulation of mesenchymal stem cells with unique immunomodulatory properties // PloS One. - 2013. - Vol. 8, № 3. - P. e59354.

27. Krylova T.A. et al. Comparative characteristics of new lines of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells, bone marrow, and foreskin // Cell Tissue Biol. - 2012. - Vol. 6, № 2. - P. 95-107.

28. Wang H.-S. et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord // Stem Cells Dayt. Ohio. - 2004. - Vol. 22, № 7. P. - 1330-1337.

29. Ichim T.E., O'Heeron P., Kesari S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells // J. Transl. Med. - 2018. - Vol. 16, № 1. - P. 212.

30. Huang H.-I. et al. Multilineage differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin // Tissue Eng. Part A. - 2010. - Vol. 16, № 5. - p. 1491-1501.

31. Lorenz K. et al. Multilineage differentiation potential of human dermal skin-derived fibroblasts // Exp. Dermatol. - 2008. - Vol. 17, № 11. - P. 925-932.

32. Denu R.A. et al. Fibroblasts and Mesenchymal Stromal/Stem Cells Are Phenotypically Indistinguishable // Acta Haematol. Karger Publishers, - 2016. - Vol. 136, № 2. P. - 85-97.

33. Brown C. et al. Mesenchymal stem cells: Cell therapy and regeneration

potential // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2019. - Vol. 13, № 9. - P. 1738-1755.

34. Koch C.M. et al. Specific age-associated DNA methylation changes in human dermal fibroblasts // PloS One. - 2011. - Vol. 6, № 2. P. - e16679.

35. Shammaa R. et al. Mesenchymal Stem Cells Beyond Regenerative Medicine // Front. Cell Dev. Biol. - 2020. - Vol. 8. - P. 72.

36. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues // Science. - 1997. - Vol. 276, № 5309. - P. 71-74.

37. Edgar L. et al. Regenerative medicine, organ bioengineering and transplantation // Br. J. Surg. - 2020. - Vol. 107, № 7. - P. 793-800.

38. Yudintseva N.M. et al. Reconstruction of connective tissue from fibrin-based dermal equivalent transplanted to animals with experimental wounds // Cell Tissue Biol. - 2010. Vol. 4, № 5. - P. 476-480.

39. Xu L. et al. CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia // N. Engl. J. Med. - 2019. - Vol. 381, № 13. - P. 12401247.

40. Zhou G. et al. In Vitro Regeneration of Patient-specific Ear-shaped Cartilage and Its First Clinical Application for Auricular Reconstruction // EBioMedicine. -2018. - Vol. 28. - P. 287-302.

41. Cai M. et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BM-MSCs) Improve Heart Function in Swine Myocardial Infarction Model through Paracrine Effects // Sci. Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 28250.

42. Dominici M. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, № 4. - P. 315-317.

43. Al-Nbaheen M. et al. Human stromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential // Stem Cell Rev. Rep. - 2013. - Vol. 9, № 1. - P. 32-43.

44. Waterman R.S. et al. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype // PloS One. - 2010. - Vol. 5, № 4. - P. e10088.

45. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects // JAMA. - 2013. - Vol. 310, № 20. - P. 2191-2194.

46. Squillaro T., Peluso G., Galderisi U. Clinical Trials With Mesenchymal Stem Cells: An Update // Cell Transplant. - 2016. - Vol. 25, № 5. - P. 829-848.

47. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics // Circ. Res. - 2004. - Vol. 95, № 1. - P. 9-20.

48. Hu C., Li L. Preconditioning influences mesenchymal stem cell properties in vitro and in vivo // J. Cell. Mol. Med. - 2018. - Vol. 22, № 3. - P. 1428-1442.

49. Saparov A. et al. Preconditioning of Human Mesenchymal Stem Cells to Enhance Their Regulation of the Immune Response // Stem Cells Int. - 2016. - Vol. 2016. - P. 3924858.

50. Sen S. et al. Genetic modification of human mesenchymal stem cells helps to reduce adiposity and improve glucose tolerance in an obese diabetic mouse model // Stem Cell Res. Ther. - 2015. - Vol. 6. - P. 242.

51. Qazi T.H. et al. Biomaterials that promote cell-cell interactions enhance the paracrine function of MSCs // Biomaterials. - 2017. - Vol. 140. - P. 103-114.

52. Yin K. et al. Low-Level Laser Effect on Proliferation, Migration, and Antiapoptosis of Mesenchymal Stem Cells // Stem Cells Dev. Mary Ann Liebert, Inc., publishers, - 2017. - Vol. 26, № 10. - P. 762-775.

53. Urnukhsaikhan E. et al. Pulsed electromagnetic fields promote survival and neuronal differentiation of human BM-MSCs // Life Sci. - 2016. - Vol. 151. - P. 130-138.

54. Liu C. et al. Pretreatment of mesenchymal stem cells with angiotensin II enhances paracrine effects, angiogenesis, gap junction formation and therapeutic efficacy for myocardial infarction // Int. J. Cardiol. Elsevier, - 2015. - Vol. 188. - P. 22-32.

55. Numasawa Y. et al. Treatment of human mesenchymal stem cells with angiotensin receptor blocker improved efficiency of cardiomyogenic transdifferentiation and improved cardiac function via angiogenesis // Stem Cells

Dayt. Ohio. - 2011. - Vol. 29, № 9. - P. 1405-1414.

56. Lu A., Wang L., Qian L. The role of eNOS in the migration and proliferation of bone-marrow derived endothelial progenitor cells and in vitro angiogenesis // Cell Biol. Int. - 2015. - Vol. 39, № 4. - P. 484-490.

57. Chen L. et al. Vasodilator-stimulated phosphoprotein regulates proliferation and growth inhibition by nitric oxide in vascular smooth muscle cells // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2004. - Vol. 24, № 8. - P. 1403-1408.

58. Revittser A. et al. P584PPARg and natriuretic peptides (NP) pathways are altered in adipose tissue from heart failure patients/ mesenchymal stromal cells (MMSC) as a tool to study cardiovascular metabolic disorders in vitro // Cardiovasc. Res. - 2014. - Vol. 103, № suppl_1. - P. S105.

59. Mallela J. et al. Natriuretic peptide receptor A signaling regulates stem cell recruitment and angiogenesis: a model to study linkage between inflammation and tumorigenesis // Stem Cells Dayt. Ohio. - 2013. - Vol. 31, № 7. - P. 1321-1329.

60. Gruden G., Landi A., Bruno G. Natriuretic peptides, heart, and adipose tissue: new findings and future developments for diabetes research // Diabetes Care. - 2014. - Vol. 37, № 11. - P. 2899-2908.

61. Kouyoumdzian N.M. et al. Natriuretic Peptide Receptor Type C (NPRC) // Encyclopedia of Signaling Molecules / ed. Choi S. Cham: Springer International Publishing, - 2018. - P. 3355-3361.

62. Song W., Wang H., Wu Q. Atrial natriuretic peptide in cardiovascular biology and disease (NPPA) // Gene. - 2015. - Vol. 569, № 1. - P. 1-6.

63. Fletcher D.A., Mullins R.D. Cell mechanics and the cytoskeleton // Nature. -2010. - Vol. 463, № 7280. - P. 485-492.

64. Svitkina T. The Actin Cytoskeleton and Actin-Based Motility // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. - 2018. - Vol. 10, № 1. - P. a018267.

65. Franco-Bocanegra D.K. et al. Molecular Mechanisms of Microglial Motility: Changes in Ageing and Alzheimer's Disease // Cells. - 2019. - Vol. 8, № 6. - P. E639.

66. Chi Q. et al. Rear actomyosin contractility-driven directional cell migration in

three-dimensional matrices: a mechano-chemical coupling mechanism // J. R. Soc. Interface. Royal Society, - 2014. - Vol. 11, № 95. - P. 20131072.

67. Zebisch K. et al. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes // Anal. Biochem. - 2012. - Vol. 425, № 1. - P. 88-90.

68. Bland J.M., Altman D.G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement // Lancet Lond. Engl. - 1986. - Vol. 1, №2 8476.

- P. 307-310.

69. Shapiro S.S., Wilk M.B. An analysis of variance test for normality (complete samples) // Biometrika. - 1965. Vol. 52, - № 3-4. - P. 591-611.

70. Anderson T.W., Darling D.A. Asymptotic Theory of Certain "Goodness of Fit" Criteria Based on Stochastic Processes // Ann. Math. Stat. Institute of Mathematical Statistics, - 1952. - Vol. 23, № 2. - P. 193-212.

71. Dunnett C.W. A Multiple Comparison Procedure for Comparing Several Treatments with a Control // J. Am. Stat. Assoc. Taylor & Francis, - 1955. - Vol. 50, № 272. - P. 1096-1121.

72. Hoogduijn M.J. et al. Human heart, spleen, and perirenal fat-derived mesenchymal stem cells have immunomodulatory capacities // Stem Cells Dev. -2007. - Vol. 16, № 4. - P. 597-604.

73. Sensebe L. et al. Mesenchymal stem cells for clinical application // Vox Sang.

- 2010. - Vol. 98, № 2. - P. 93-107.

74. Uppal S.O. et al. Morphological fractal analysis of shape in cancer cells treated with combinations of microtubule-polymerizing and -depolymerizing agents // Microsc. Microanal. Off. J. Microsc. Soc. Am. Microbeam Anal. Soc. Microsc. Soc. Can. - 2010. - Vol. 16, № 4. - P. 472-477.

75. Rajkovic N., Krstonosic B., Milosevic N. Box-Counting Method of 2D Neuronal Image: Method Modification and Quantitative Analysis Demonstrated on Images from the Monkey and Human Brain // Comput. Math. Methods Med. - 2017. Vol. 2017. - P. 8967902.

76. Revittser A. et al. The analysis of F-actin structure of mesenchymal stem cells by quantification of fractal dimension // PloS One. - 2021. - Vol. 16, № 11. - P.

e0260727.

77. Domínguez R., Holmes K.C. Actin structure and function // Annu. Rev. Biophys. - 2011. - Vol. 40. - P. 169-186.

78. Ревитцер А.В., Негуляев Ю.А. Влияние Предсердного Натрийуретического Пептида На Миграцию Мезенхимных Стволовых Клеток, Выделенных Из Периренального Жира Крысы // Цитология. - 2018. -Vol. 60, № 12.

79. Revittser A.V., Chubinsky-Nadezhdin V.I., Negulyaev Yu.A. The Effect of Atrial Natriuretic Peptide on Reorganization of Actin Cytoskeleton and Migration of Human Mesenchymal Stem Cells // Cell Tissue Biol. - 2020. - Vol. 14, № 2. - P. 154-159.

80. Kurzyk A. et al. Comparison of adipose stem cells sources from various locations of rat body for their application for seeding on polymer scaffolds // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. Taylor & Francis, - 2019. - Vol. 30, № 5. - P. 376-397.

81. Arrigoni E. et al. Isolation, characterization and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells: from small to large animal models // Cell Tissue Res. -2009. - Vol. 338, № 3. - P. 401.

82. Muñoz M.F. et al. Effect of Age and Lipoperoxidation in Rat and Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells // Oxid. Med. Cell. Longev. - 2020. - Vol. 2020. - P. 6473279.

83. Cleal L., Aldea T., Chau Y.-Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells // Adipocyte. - 2017. - Vol. 6, № 3. - P. 205-216.

84. Niemelä S.-M. et al. Fat tissue: views on reconstruction and exploitation // J. Craniofac. Surg. - 2007. - Vol. 18, № 2. - P. 325-335.

85. Kawai M., Rosen C.J. PPARy: a circadian transcription factor in adipogenesis and osteogenesis // Nat. Rev. Endocrinol. - 2010. - Vol. 6, № 11. - P. 629-636.

86. Campagnoli C. et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow // Blood. - 2001. - Vol. 98, № 8. - P. 2396-2402.

87. Suchacki K.J. et al. Bone marrow adipose tissue is a unique adipose subtype with distinct roles in glucose homeostasis // Nat. Commun. - 2020. - Vol. 11, № 1.

- P. 3097.

88. Horowitz M.C. et al. Bone marrow adipocytes // Adipocyte. - 2017. - Vol. 6, № 3. - P. 193-204.

89. Niehage C. et al. The cell surface proteome of human mesenchymal stromal cells // PloS One. - 2011. - Vol. 6, № 5. - P. e20399.

90. Abdelalim E.M., Tooyama I. BNP signaling is crucial for embryonic stem cell proliferation // PloS One. - 2009. - Vol. 4, № 4. - P. e5341.

91. Reynolds A.R. Potential relevance of bell-shaped and u-shaped dose-responses for the therapeutic targeting of angiogenesis in cancer // Dose-Response Publ. Int. Hormesis Soc. - 2010. - Vol. 8, № 3. - P. 253-284.

92. Veschini L. et al. Hypoxia-inducible transcription factor-1 alpha determines sensitivity of endothelial cells to the proteosome inhibitor bortezomib // Blood. -2007. - Vol. 109, № 6. - P. 2565-2570.

93. Pepper M.S. et al. Biphasic effect of transforming growth factor-beta 1 on in vitro angiogenesis // Exp. Cell Res. - 1993. - Vol. 204, № 2. - P. 356-363.

94. Celik I. et al. Therapeutic efficacy of endostatin exhibits a biphasic dose-response curve // Cancer Res. - 2005. - Vol. 65, № 23. - P. 11044-11050.

95. Gibellini L. et al. Different origin of adipogenic stem cells influences the response to antiretroviral drugs // Exp. Cell Res. - 2015. - Vol. 337, № 2. - P. 160169.

96. Zhou W. et al. Single-Cell Profiles and Clinically Useful Properties of Human Mesenchymal Stem Cells of Adipose and Bone Marrow Origin // Am. J. Sports Med.

- 2019. - Vol. 47, № 7. P. - 1722-1733.

97. Scuteri A. et al. Mesengenic differentiation: comparison of human and rat bone marrow mesenchymal stem cells // Int. J. Stem Cells. - 2014. - Vol. 7, № 2. -P. 127-134.