Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук Тучин, Святослав Викторович

• Тучин, Святослав Викторович
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Тучин, Святослав Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ТОТИПОТЕНТНОСТЬ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ.

ГЛАВА 2. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПШЕНИЦЫ.

ГЛАВА 3. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 5. ДОЗО'ВЫЕ ЗАВИСИМОСТИ ИНГИБИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА

ФАКТОРОВ, ИМИТИРУЮЩИХ СТРЕСС ОБЕЗВОЖИВАНИЯ.

5.1. Изучение дозовых характеристик селективных факторов на проростках пшеницы.

5.1.1. Полиэтиленгликоль.

5.1.2. Ь-азетедин-2-карбоновая кислота.

5.1.3. Абсцизовая кислота.

5.1.4. Анализ дозовых кривых селективных факторов, имитирующих стресс безвожи-вания.

5.2.' Изучение дозовых характеристик селективных факторов на каллусных культурах пшеницы.

5.2.1. Тотипонентность клеточных культур пшеницы поволжских э"котипов.

5.2.2. Влияние полиэтиленгликоля на клеточные культуры пшеницы.

5.2.3. Влияние Ь-азетедин-2-карбоновой кислоты на клеточные культуры пшеницы.

5.2.'4. Влияние абсцизовой кислоты на клеточные культуры пшеницы.

-35.2.5. Анализ дозовых кривых селективных факторов, моделирующих стресс обезвоживания в культуре изолированных клеток пшеницы.

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ СТРЕССА ОБЕЗВОЖИВАНИЯ НА ПОЛИМОРФНЫЕ БЕЛКОВЫЕ СИСТЕМЫ В КУЛЬТУРЕ И30ЛИР0ВАН-ННЫХ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ.

6.1. Адаптация клеток пшеницы к низкому химическому потенциалу воды и конформационная лабильность макромолекул.

6.2. Сомаклональная изменчивость полиморфных белковых систем, связанная с обезвоживанием изолированных клеточных культур.

ГЛАВА 7. ИЗМЕНЧИВОСТЬ СОМАКЛОНОВ ПШЕНИЦЫ, СВЯЗАННАЯ С

ОБЕЗВОЖИВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

1.1. Морфологические признаки.

7.1.1. Окраска растения.

7.1.2. Длина стебля растения.

7.1.3. Элементы продуктивности растения.

7.2. Физиологические признаки.

7.2.1. Устойчивость к бурой ржавчине.

7.2.2. Чувствительность сомаклонов к экзогенной гибберелловой кислоте.

7.2.3 Развитие растений сомаклонов.

1.3: Качество клейковины зерна сомаклонов пшеницы

7.4. Влияние обезвоживания каллусных культур на частоту проявления признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

ГЛАВА 8. ПОЛУЧЕНИЕ СОМАКЛОНОВ ПШЕНИЦЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ

ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ В ПОЛОВЫХ ПОКОЛЕНИЯХ.

8.1. Выбор адекватной селективной схемы для отбора клеточных культур, устойчивых к стресссу обезвоживания.

8.2. Оценка засухоустойчивости сомаклонов пшеницы на вегетирующих растениях.

8.3. Изучение термодинамических параметров воды у засухоустойчивых сомаклонов пшеницы

ГЛАВА 9. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОМАКЛОНОВ В СЕЛЕКЦИОННОМ

ПРОЦЕССЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия»

Более того, до настоящего времени практически отсутствуют данные, демонстрирующие справедливость наиболее важного для обоснования теории селекции клеточных культур постулата - о существовании положительной корреляции между устойчивостью изолированных тканей к обезвоживанию и проявлением этого признака у растений в виде способности сохранять урожай в условиях засухи.

Попытки экспериментального решения данной проблемы были предприняты в основном для двудольных растений, в результате которых было показано наличие такой коррелятивной связи. В то же время исследования на злаковых культурах, и особенно на пшенице, носят фрагментарный характер, не дают ответа на главный вопрос и совершенно оставляют без внимания ряд проблем, тесно связанных с ним.

Прежде всего это касается выбора наиболее эффективно действующего агента, способного в изолированной культуре адекватно моделировать стресс обезвоживания, отбирая устойчивые клетки, способные регенерировать растения с генетической устойчивостью к данному фактору, а также доз и сроков его воздействия на клеточные культуры, оценки экспрессии приобретенной, устойчивости и ее трансмиссии в ряду половых поколений.

Кроме того, выяснение биологических закономерностей адаптации растений к обезвоживанию остается, по-прежнему, актуальной задачей для всех сельскохозяйственных видов-мезофитов, анатомически не приспособленных к сохранению воды, но особенно для пшеницы, ареал возделывания которой в Российской Федерации приходится в основном на зоны, периодически страдающие от недостатка влаги и высоких температур.

Изучению влияния на пшеницу этих главных лимитирующих факторов среды в засушливых регионах посвящено громадное количество исследований, выполненных с использованием всего арсенала средств, имеющихся в современной науке. Тем не менее, до настоящего времени не удалось создать целостную физиолого-генетическую модель признака засухоустойчивости, основанную на понимании биологических реакций растений, адекватно отражающих процессы адаптации и формирования урожая в условиях длительного обезвоживания тканей.

Во многом это связано с недостаточной проработанностью вопросов, касающихся роли клеточных механизмов в подобного рода реакциях пшеницы на данный фактор внешней среды, что объясняется, прежде всего, методическими трудностями, возникающими при работе на клеточном уровне. Однако, значительный прогресс, достигнутый в разработке методов культивирования изолированных тканей пшеницы, открывает широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в формировании адаптивных реакций пшеницы в ответ на обезвоживание.

Цель исследования: изучить влияние факторов, моделирующих обезвоживание in vitro, на поведение молекулярных маркерных систем, изолированных тканей и целостных растений пшеницы; изучить биологические последствия обезвоживания культивируемых тканей пшеницы; разработать научно обоснованные селективные схемы для отбора сомаклонов пшеницы с хозяйственно-ценными признаками и создать на этой основе исходный материал для селекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ использования методов культуры тканей и клеточной селекции для получения генотипов пшеницы, устойчивых к стрессорам;

2. Изучить влияние факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, Ь-азетидин-2-карбо-новой кислоты и полиэтиленгликоля, на интегральные характеристики процессов роста и развития тканевых культур и целостных проростков пшеницы. Установить дозовые зависимости биологического эффекта этих факторов и степень их соответствия для изолированных тканей и целостных растений .

3. С помощью молекулярных маркерных систем выяснить причины, синхронизирующие ответные реакции на обезвоживание, и показать последствия этого явления для культивируемых тканей пшеницы, затрагивающие молекулярный уровень. Привести доказательства трансмиссии молекулярных изменений от клеточных культур, подвергнутых обезвоживанию, в половые потомства растений-регенерантов.

4. На основе принципов молекулярно-экологической концепции разработать теоретический подход к отбору клеточных культур пшеницы, устойчивых к стрессу обезвоживания. Выяснить эффективность различных селективных схем для отбора засухоустойчивых сомаклонов пшеницы и получить формы, экс-прессирующие этот признак в половых поколениях.

5. Изучить в лабораторных опытах и полевых испытаниях, полученные сомаклоны пшеницы, и установить биологические последствия обезвоживания изолированных тканей на вегети-рующих растения. Создать коллекцию сомаклонов с хозяйственно-ценными признаками, пригодную для использования в селекции.

6. Оценить перспективы и направления использования молеку-лярно-экологической концепции для создания методами клеточной селекции устойчивых к обезвоживанию форм пшеницы и возможность ее применения для оценки адаптивности селекционного материала. Научная новизна. Впервые показано, что ингибирующее влияние низкого химического потенциала воды на процессы роста и развития клеточно-тканевых систем пшеницы подчиняется закономерностям функционирования биологического триггера. На основании этого предложен подход к установлению эффективной дозы селективного давления для получения засухоустойчивых форм пшеницы.

Доказана целесообразность одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с предельно низким химическим потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутаций, возникающих в культивируемых клетках, и способностью каллусных культур к регенерации растений.

Экспериментально установлено, что культивирование изолированных тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды сопряжено с проявлением наследуемых изменений в структурно-функциональных свойствах полиморфных белковых систем. При этом частота мутаций по глиадинкоди--рующим локусам в выборке сомаклонов коррелирует со степенью снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированных тканей, а наиболее подвержены изменениям глиадинкодирующие локусы генома Б.

Показано, что адаптация к обезвоживанию изолированных клеток пшеницы на уровне различных белковых систем осуществляется в направлении повышения структурной жесткости макромолекул.

Впервые обнаружено, что подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическое му потенциалу воды, несет мутацию, редуцирующую длину глав-^-ного побега растений, и в зависимости от генотипа пшеницы,; служившего донором культивируемых тканей, - мутацию, повышающую устойчивость сомаклонов к бурой ржавчине.

Анализ большого числа сомаклонов, отобранных in vitro на устойчивость к обезвоживанию, выявил у них наличие изменений и по другим морфологическим и физиологическим признакам, которые наследуются в ряду половых поколений.

Получены растения пшеницы с повышенной засухоустойчивостью, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, что реализуется в более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с исходным сортом.

Впервые обнаружено влияние обезвоживания изолированных клеток пшеницы гибридного происхождения на частоту проявления качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

Создана, коллекция сомаклонов (около 1000 номеров), представляющая интерес как для включения в селекционные программы, так и для использования в научных целях. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказательства существования у пшеницы биологического триггера, контролирующего ответные реакции на воздействие факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro -абсцизовой кислоты, Ь-азетедин-2-карбоновой кислоты и пониженного химического потенциала воды в среде.

2. Анализ селективных схем, используемых для отбора устойчивых к обезвоживанию сомаклонов пшеницы, с позиций моле-кулярно-экологической концепции и триггерного механизма адаптации растений к стрессорам. Данные о преимуществах одноступенчатой схемы отбора каллусных культур при использовании низкого химического потенциала воды в качестве селективного фактора и ауксина, как индуктора каллусо-образования.

3. Потенцирующий эффект низкого химического потенциала воды в среде на частоту мутаций в культивируемых клетках пшеницы. Множественный характер молекулярно-генетических и фенотипических изменений, выявляемых у сомаклонов, от-селектированных в стадии изолированных клеточных культур под воздействием данного фактора. Наследование мутаций, возникающих в культивируемых клетках, устойчивых к обезвоживанию.

4. Экспрессия засухоустойчивости в растениях - половых потомках регенерантов, полученных из каллусных культур, устойчивых к обезвоживанию, связана с повышением урожайности сомаклонов при засухе и изменениями термодинамических параметров воды в растениях.

Практическая значимость определяется разработкой способов получения наследственно измененных форм пшеницы, оформленных в виде двух изобретений (A.c. СССР № 1738171А1 и патент РФ № 2095971). С использованием указанных изобретений создан исходный материал для селекции, который включен в селекционные программы лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока и Ершовской опытной станции.

Коллекция сомаклонов, насчитывающая около 1000 образцов яровой мягкой пшеницы, содержит формы с новыми генетическими элементами, детерминирующими длину стебля растения, окраску растения, устойчивость к бурой ржавчине, качество клейковины зерна, длину вегетационного периода и другие признаки. Указанные формы используются в генетических и физиологических исследованиях в НИИСХ Юго-Востока и ВИЗРе.

Методические исследования в области совершенствования способов культивирования изолированных пыльников пшеницы реализованы в виде создания дигаплоидного сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (патент РФ на селекционное достижение № 034 4) районированного с 2000 года по Саратовской области.

Практической ценностью для биотехнологических исследований обладают полученные доказательства преимущества использования коротких селективных схем для отбора in vitro стрессустойчивых сомаклонов. При этом предложен научно обоснованный подход к определению дозы воздействия селективного фактора.

Данные о превалирующем значении химического потенциала воды, выступающего в роли сигнала для переключения биологического триггера при адаптации растений к обезвоживанию, открывают широкие возможности для построения прогностических моделей, предназначенных для повышения эффективности отбора засухоустойчивых форм в процессе проработки гибридного селекционного материала.

Результаты, полученные в ходе выполнения данной диссертации, используются в подготовке лекций по общей биологии для студентов физического факультета Саратовского государственного университета со специализацией "биофизика".

Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. В изучении лроростковых генов устойчивости к бурой ржавчине у сомаклонов пшеницы принимала участие научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского института защиты растений Е.И. Гультяева.

0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

В основе всех существующих ныне подходов и экспериментальных схем клеточной селекции растений на устойчивость к различным видам стрессоров лежат два фундаментальных положения сформулированных и экспериментально доказанных в последние десятилетия:

1. Свойство тотипотентности растительных клеток (Бутенко, 1975);

2. Феномен сомаклональной изменчивости растений (Ьагк:1п, 1987) .

Работы в этих направлениях на пшенице начались достаточно давно, однако технические трудности, связанные с регенерацией растений у этой и других злаковых культур, позволили получить достаточно обширный фактический материал по данным проблемам только к середине 80-х годов.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Тучин, Святослав Викторович

-243-ВЫВОДЫ

1. Угнетение ростовых процессов пшеницы, вызванное воздей ствием факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro, - абсцизовой кислотой, Ь-азетидин-2-карбоновой кислотой и .пониженным химическим потенциалом воды, осу ществляется по универсальному принципу, а именно - в соответствии с механизмом биологического триггера. Независимо от внутриклеточных мишеней эти факторы в боль шей степени воздействуют на рост клеток растяжением, чем на их биосинтетическую активность.

2. Динамика угнетения процессов морфогенеза клеточно-тка-невых систем пшеницы, пролифелирующих in vitro, под воздействием низкого химического потенциала воды подчи няется закономерностям функционирования биологического триггера. Границы зоны летальности на дозовой кривой для каллусных культур соответствуют таковым для целост ных проростков. Абсцизовая и Ъ-азетидин-2-карбоновая кислоты даже в высоких дозах (до 50 мг/л) не вызывают выраженного ингибирования роста и развития каллусных культур пшеницы.

3. Механизм поддержания водного гомеостаза как проростков так и каллусных культур пшеницы не в состоянии стабили зировать уровень химического потенциала воды в тканях при его снижении в культуральной среде до значений, вы зывающих переход биологической системы в зону летально сти.

4 . На основании исследования поведения маркерной системы полиморфного семейства эстеразы проростков пшеницы при снижающейся величине химического потенциала воды в сре де показано, что адаптивные реакции на молекулярном уровне осуществляются также по принципу биологического триггера, а траектории дозовых кривых находятся в про-тивофазе для генотипов, контрастных по засухоустойчивости.

5. Культивирование каллусных тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды в течение длительного времени 'вызывает заметные изменения в составе суммарных водорастворимых белков и полиморфной системы фермента эстеразы. Несмотря на то, что характер этих изменений связан с генотипическими особенностями сортов-доноров каллусных тканей, адаптация белковых систем при обезвоживании клеток осуществляется в едином ключе

- в направлении повышения структурной жесткости белковых макромолекул.

6. Изменения в полиморфных белковых системах (глиадиньг, изоферменты) обнаруживаются у значительной части половых потомств клеточных культур, устойчивых к низкому химическому потенциалу воды. Возникшие изменения наследуются в ряду самоопыленных поколений сомаклонов и при гибридологическом анализе показывают менделевское рас- . щепление признаков.

7. Величина снижения химического потенциала воды в среде культивирования тканей пшеницы определяет частоту появления сомаклональных вариантов, несущих мутации по глиадинкодйрующим локусам. Наиболее низкий химический потенциал воды способствует отбору сомаклонов с изменениями в глиадинкодирующих локусах, расположенных преимущественно в геноме Б.

8. Подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическому потенциалу воды, неоет мутацию, редуцирующую длину главного побега растений. Данная мутация имеет промежуточное наследование с неполным доминированием и связана со снижением чувствительности сомаклонов к экзогенному гиббереллину.

9. В зависимости от генотипа пшеницы, служившего донором культивируемых тканей, отбор каллусных культур на среде с низким химическим потенциалом воды может сопровож- \ даться повышением у сомаклонов устойчивости к возбудителю бурой -ржавчины, наследуемой в ряду поколений.

10.Показана целесообразность использования одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с очень низким химическим потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутаций, возникающих в культр!вируемых клетках, и способностью каллусных культур к регенерации растений. Определен подход к установлению эффективной дозы селективного давления, заключающийся в определении зоны летальности на дозовой кривой для -генотипа пшеницы -донора изолированных тканей.

11.Селекция на устойчивость к низкому химическому потенциалу воды в культуральной среде позволяет получать растения с повышенной устойчивостью к засухе, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении биосинтетической активности в условиях недостатка влаги, что реализуется в более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с исходным сортом.

12.Повышенная засухоустойчивость сомаклонов экспрессиру-ется в ряду половых поколений и сохраняется при вторичном введении в культуру соматических тканей этих форм.

-24 6

13.Культивирование соматических тканей пшеницы гибридного происхождения на среде с низким химическим потенциалом воды вызывает изменения в соотношении качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

14.Создана коллекция, насчитывающая около 1000 сомаклонов, отобранных на устойчивость к различным факторам, имитирующим стресс обезвоживания in vitro, которая ис-. пользуется как в селекционных программах, так и в научных исследованиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие технологий, позволяющих манипулировать клетками, изолированными от коррегирующего влияния целого организма, открыло широкие возможности для получения измененных форм растений с генетической устойчивостью к тому или иному стрессору.

Исследованиям в этом направлении посвящено большое число работ (для обзора см. Сидоров, 1990), но в основном в них превалирует эмпирический подход. Теоретические обоснования тех или иных технологических приемов встречаются крайне редко, и могут быть в грубом приближении сведены к двум альтернативным концепциям:

1) обогащение популяции культивируемых клеток устойчивыми генотипами происходит в результате адаптации при постепенном увеличении селективного давления (ступенчатая селекция) (Nabors, 1982.);

2) отбор устойчивых мутантных форм осуществляется за достаточно короткий срок на фоне гибели в жестких условиях основной части популяции клеток, в результате чего изменяется ее генетическая структура (прямая селекция) (Conner, 1986).

Отсутствие соответствующей теоретической базы клеточной селекции порождает крайнюю пестроту в методиках, используемых для отбора клеточных культур, устойчивых к тому или иному фактору, и, очевидно, является одной из причин частого отсутствия экспрессии селектируемого признака в регенерированных растениях и их потомствах.

Принимая- во внимание это обстоятельство, мы попытались теоретически обосновать и получить экспериментальные доказательства приложимости триггерной концепции адаптивности растительных систем (Веселова с соавт., 1993) для построения наиболее органичного подхода к разработке технологий клеточной селекции растений на устойчивость к абиотическим стрессорам на примере обезвоживания.

Вышеуказанная концепция была сформулирована в результате изучения структурно-динамической модели реагирования растительной клетки на варьирующие условия среды, которая позволяет, по мнению авторов, объективно оценивать критерии смены функциональных состояний клеток в зависимости от величины внешнего воздействия. При этом для анализа экспериментальных данных предложено использовать изучение дозовых зависимостей общих физиологических реакций от степени воздействия факторов среды.

Показано (Веселова с соавт. , 1993), что дозовые кривые отражают нелинейность ответных реакций растительных клеток на увеличение давления среды, и в общем виде имеют следующие зоны, отражающие три устойчивых состояния организма, и переходные области между ними: 1) уровень нормального метаболизма (зона толерантности); 2) уровень повышенной устойчивости (зона стресса); 3) мертвое состояние (зона летальных воздействий).

Нелинейные свойства живых организмов, проявляемые у растительных .клеток в виде биологического триггера, т.е. их способности переходить в новое структурно-функциональное состояние только при достижении пороговых значений величин внешнего воздействия, связаны с фундаментальной особенностью биополимеров и мембран, которые образуют единый структурно-функциональный комплекс клетки, и могут находиться в различных конформациях, кооперативно переходя из одной в другую при изменении условий среды (Конев с соавт., 1970).

В литературе накоплен обширный материал по изучению температурных адаптаций организмов, который интерпретирован с точки зрения соответствия конформационной подвижности биополимеров экологии организмов того или вида (Александров, 1985). Авторы концепции биологического триггера для экспериментального подтверждения соответствия разработанной структурно-динамической модели поведению растительных клеток в условиях стресса также использовали экспериментальные данные по температурным воздействиям на растительные клетки. При этом было показано, что траектории кривых "доза фактора - биологический эффект" полностью укладываются в рамки предложенной модели. Аналогичное поведение дозовых кривых обнаружено в случае воздействия засоления, обезвоживания и фумигации озоном на фотосинтетический аппарат клеток листьев гороха (Веселовский с соавт., 1993).

Адаптивные реакции внутриклеточных компонентов, выраженные в изменении фракционного состава растворимых белков листьев пшеницы под влиянием обезвоживания, уже пытались интерпретировать с позиции конформационно-кооперативных свойств (Гусев, Каримова, 1982). Однако из публикаций можно почерпнуть не очень много сведений для анализа дозовых кривых, где в качестве независимой переменной выступает степень обезвоживания клеток. Наиболее старой работой, относящейся к теме данного исследования и обнаруженной в доступной нам литературе, оказалась монография Н.М. Сисакяна (1940), в которой изучалась активность ряда ферментов в листьях пшеницы в зависимости от содержания воды в тканях. Дозовые кривые ферментативной активности при обезвоживании листьев, приводимые в этой работе, нелинейны, и большинство из них имеют зоны толерантности и стресса. Нелинейность скорости ферментативных реакций от величины рН, ионной силы или температуры среды общеизвестна. Однако в данном случае характерная траектория дозовых кривых означает, что белковые макромолекулы (ферменты) отреагировали на обезвоживание клеток по принципу триггерного механизма, изменением своей активности при достижении пороговых значений содержания воды в листьях.

Факты, приведенные выше, получены разными авторами, на разных объектах с использованием различных методик и не касаются вопросов клеточной селекции растений. В связи с этим в данной работе впервые все эксперименты по изучению дозовых зависимостей эффекта обезвоживания были выполнены на одном объекте - яровой пшенице - в условиях, стандартизированных по величине химического потенциала воды в среде, причем на разных уровнях организации живой материи - молекулярном, клеточно-тканевом и организменном.

Оказалось, что общий физиологический отклик целостных проростков (организменный уровень) на снижение активности воды в среде выращивания, имеет четко выраженные зоны толерантности, стресса и переходные зоны между ними. При этом проростки различающихся по засухоустойчивости сортов пшеницы реагируют на дозу внешнего воздействия несколько различно - зоны толерантности и стресса у них смещены относительно друг друга. Более того, возрастающие дозы ингибиторов метаболических путей, принимающих участие в адаптации растительных клеток к обезвоживанию (абсцизовая кислота и Ь-азетедин~2-карбоновая кислота), также вызывают ответные реакции нелинейного вида. Это означает, что совершенно разная природа угнетающего эффекта трех факторов, включает общий механизм, обеспечивающий типичную кинетику физиологических реакций растений на внешние воздействия. Анализ дозовых кривых не оставляет сомнений, что таковым является механизм биологического триггера, функционирующий по принципу "все или ничего".

Дозовые зависимости влияния обезвоживания на поведение молекулярных систем в целостных растениях были изучены нами на примере полиморфного семейства эстеразы проростков пшеницы. Эксперименты показали, что снижение химического потенциала среды выращивания проростков вызывает смену структурно-функциональных свойств эстеразы ступенчатым образом, тем самым подтверждая существование биологического триггера на молекулярном уровне.

Таким образом, растения пшеницы на молекулярном и ор-ганизменном уровнях организации реагируют на стресс обезвоживания по принципу триггерного механизма. Это означает, что снижение химического потенциала воды в клетках растений до- определенной величины индуцирует конформационно-кооперативные перестройки во внутриклеточных биополимерах, которые затем генерализуются до организменного уровня.

Изолированные культуры высших растений, естественно, лишены влияния целого организма, состоят в основном из недифференцированных клеток и вследствие этого могут рассматриваться как клеточные популяции, независимо от вида эксплантата - отдельных клеток или тканевых культур. Поэтому, с точки зрения клеточной селекции, наибольший интерес представляет экстраполяция концепции биологического триггера на уровень поведения клеточных популяций растительных клеток.

Согласно теоретическим выкладкам (Веселова с соавт., 1993), состояние популяции клеток в условиях нормальной жизнедеятельности (зона толерантности) контролируется в основном скоростью их деления. В случае внешнего воздействия, в дозе, не превышающей летальную, адаптация осуществляется за счет механизмов физиолого-биохимического гомео-стаза каждой клетки (область перехода дозовой кривой в зону стресса). При этом размножаются в основном клетки исходного генотипа. Мутантные формы получат селективное преимущество при давлении среды, соответствующем переходу основной части популяции клеток в зону легальности. Чувствительные генотипы в данном случае элиминируют, а сама популяция продолжит существование за счет размножения клеток с генетически обусловленной устойчивостью к селективному фактору. При этом выделяют три типа дозовых кривых: 1) ступенчатые кривые -имеют плато, наличие которого связано с медленным нарастанием эффекта с увеличением дозы, и пороги, при которых ответная реакция изменяется очень резко. Траектория подобных кривых обусловлена как задержкой процесса деления клеток, так и их гибелью при больших нагрузках; 2) экспоненциальные кривые - вызваны быстрой гибелью клеток под влиянием большой мощности действующего фактора; 3) Б-образные кривые -являются производными от кривых ступенчатой формы, и могут быть получены при изменении сроков наблюдения отклика на внешние воздействия.

В результате предлагается рассматривать состояние стресса в популяциях растительных клеток, при котором резко возрастает относительное число мутантных форм, как начальную стадию эволюционного процесса, а пребывание популяции в зоне стресса определять по "хвосту" на дозовой кривой, обусловленному наличием небольших количеств (в абсолютных величинах) устойчивых к селективному давлению генотипов (Веселова с соавт., 1993).

Действительно, дозовые зависимости эффекта обезвоживания на уровне популяций изолированных клеток пшеницы оказались также нелинейными, а траектории кривых имеют либо ступенчатый, либо экспоненциальный характер, в зависимости от признака по которому проводилась оценка биологического эффекта. Подобная форма дозовой зависимости свидетельствует о высокой степени ингибирующего влияния стрессового фактора и должна сопровождаться, согласно концепции биологического триггера, увеличением относительной частоты мутаций в популяциях переживающих клеток.

Это объясняется тем, что при снижении активности воды в окружающей .среде макромолекулярные внутриклеточные структуры изолированных клеток подвергаются давлению отбора точно также как органы, ткани или целостные растения в естественных условиях (Александров, 1985). Действительно, нами было установлено, что у каллусных культур пшеницы отсутствуют механизмы, стабилизирующие химический потенциал внутриклеточной воды при его значительном снижении в кульуральной среде. Поэтому адаптация изолированных клеток к обезвоживанию начинается на молекулярном уровне с таких изменений в белковых системах, которые снижают их чувствительность к стрессорам за счет упрочения их структуры и уменьшения конформационной лабильности молекул.

Поскольку вся информация о жизнедеятельности организмов содержится в макромолекулах нуклеиновых кислот, а ее реализация осуществляется через разнообразные белковые макромолекулы, практически любой признак, заложенный в культивируемых клетках, может быть подвергнут воздействию обезвоживания на генетическом уровне. Это предполагает наличие генетических последствий для растений - потомков каллусных клеток пшеницы, ДНК которых вынуждена функционировать в условиях низкого химического потенциала воды.

Изучение сомаклонов пшеницы, ведущих свое происхождение от клеточных культур, отобранных в условиях сниженного до уровня летальности химического потенциала воды в среде культивирования, показало резкое возрастание количества мутаций по глиадинкодирующим локусам генома Б. Выли обнаружены наследственные изменения в составе полиморфных семейств ферментов эстеразы и алкогольдегидрогеназы, а также общих водорастворимых белков, среди которых встречаются белки стрессустойчивости.

Кроме того, мутагенный эффект обезвоживания проявился на уровне морфологических и физиологических признаков сомаклонов (цвет растений, длина побега, устойчивость к болезням и др.).

Повышенная устойчивость мутировавших клеток к обезвоживанию экспрессировалась в целых растениях не только в виде изменения -состояния воды в тканях и увеличения урожайности сомаклонов при засухе, но и в клетках изолированных от сомаклонов для повторного культивирования при различных уровнях обезвоживания. В последнем случае форма дозовой кривой существенно отличалась, демонстрируя снижение чувствительности мутантов к наложенному фактору. Это означает, что на популяции культивируемых клеток было оказано такое внешнее давление, которое отбраковало генотипы неадекватные условиям среды. Устойчивые формы, напротив, сохранили возможность регенерировать растения, состоящие из клеток, способных переносить обезвоживание, а генетическая структура популяции сомаклонов оказалась смещенной по отношению к таковой исходного генотипа.

Аналогичный эффект,, в принципе, может быть получен не только путем снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированных тканей, но и при помощи специфических ингибиторов метаболических реакций, принимающих участие в адаптации клеток к обезвоживанию.

Так, использованные в нашем исследовании вещества -АБК и АЗТ - ингибировали рост целостных проростков, также как полиэтиленгликоль, в соответствии с механизмом биологического триггера. Кроме того, положительные результаты были получены при селекции клеточных культур табака и люцерны на устойчивость к токсическим' аналогам пролина, когда удалось отобрать стрессустойчивые растения (Новожилов, 1987; Дридзе с соавт, 1992).

В этих экспериментах концентрации токсических аналогов, исчисляемые величинами 1-100 мкМ, существенно подавляли рост клеточных культур, т.е. фактически переводили популяцию изолированных клеток в состояние стресса. Однако, в отличие от двудольных растений, клеточные культуры пшеницы оказались гораздо более устойчивыми к ингибирующему влиянию АЗТ и АБК. При этом анализ дозовых кривых показал, что их траектории для проростков и каллусных культур значительно отличаются, а зоны стресса у этих биологических систем не адекватны друг другу. Более того в отдельных случаях развивалась парадоксальная реакция, когда с увеличением дозы эффект угнетения снижался.

В результате было установлено, что угнетающим влиянием на каллусные культуры пшеницы обладают только экстремально высокие концентрации АЗТ и АБК , оказывающие общетоксический эффект. Устойчивые культуры, отобранные в таких условиях, не обладали способностью стабильно экспрессиро-вать засухоустойчивость в половых поколениях регенерантов.

В определенной степени такое положение связано с тем, что в случае информационного воздействия на биологические системы существенным моментом является чувствительность к нему внутриклеточных мишеней, которая зависит от генетических особенностей растительных клеток.

Таким образом, на основании анализа приведенных материалов мы пришли к заключению о соответствии экспериментальных данных по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к обезвоживанию основным положениям, постулированным в концепции биологического триггера.

Из этого следует, что прямая (одноступенчатая) селекция изолированных клеточных культур растений на устойчивость к обезвоживанию имеет явные преимущества перед многоступенчатой схемой, т.к. только летальные воздействия способны отселектировать устойчивые генотипы, вследствие чего первые пассажи культур на средах с низкими дозами стрессового фактора оказываются по крайней мере бесполезными.

Однако, для эффективного использования одноступенчатого отбора необходим предварительный анализ дозовой кривой каждого генотипа растений, подвергаемого селекции in vitro на устойчивость к обезвоживанию, с целью точного определения нижней границы зоны летальности.

Данное требование должно распространятся и на случай применения для отбора клеточных культур факторов информационного типа, действующих на специфические внутриклеточные мишени, когда анализ дозовых кривых особенно важен по причине возможного отсутствия подобных мишеней у некоторых видов растений или вследствие маскирующего эффекта экзогенных регуляторов роста.

Полученные нами на изолированных тканях и целостных проростках данные, раскрывающие молекулярный механизм формирования итегрированного ответа на воздействие стрессора, открывают широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в адаптивных реакциях вегети-рующих растений пшеницы в ответ на недостаток влаги в естественных условиях.

Прежде всего это касается вопроса о существовании и функционировании сигнальной системы, реагирующей на обезвоживание и запускающей адаптивные реакции на стресс. Считают (Альтергот, 1981), что у растений в ходе эволюционного процесса сформировалась такая сигнальная система, которая-, чутко реагирует даже на незначительное обезвоживание клеток, ингибируя рост растений. В подобном "анабиотическом" состоянии растение получает возможность направлять внутренние ресурсы на усиление признаков, обеспечивающих повышенную устойчивость к развивающемуся стрессу. При этом остается совершенно не выясненной природа внешнего сигнала и внутриклеточных мишеней, предназначенных для восприятия этого сигнала, а также механизм синхронизации всего комплекса разнообразных изменений, происходящих в растении в случае недостатка влаги.

На основании выполненных экспериментов с уверенностью можно предполагать, что адаптивные реакции при обезвоживании тканей растений до уровня, при котором гомеостатические механизмы не в состоянии поддерживать физиологически приемлемую величину активности воды, запускаются и синхронизируются самой водой, через изменение ее химического потенциала в клетке с последующим развитием цепи конформационных пере

-242строек биополимеров, кооперативно охватывающих все структурные уровни организации растений.

Данный вывод представляется весьма важным, так как, в \ принципе, позволяет подойти к созданию интегральной модели \ реагирования растения на обезвоживание, что является весьма ( I актуальной задачей на современном этапе разработки физиоло- / го-генетических аспектов засухоустойчивости пшеницы и дру- \ гих полевых культур.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Тучин, Святослав Викторович, 2000 год

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975. - 330 с.

2. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 1985. 318 с.

3. Альдеров A.A.' Наследование короткостебельности при гибридизации твердых пшениц // Бюллетень ВИР. 1979. - Вып. 89. -С. 27-31.

4. Альтергот В.Ф. Действие повышенной температуры на растение в эксперименте и природе.- М.: Наука, 1981.-56 с. Аникеева Н.В. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к Helminthosporium sativum // Генетика. 1994. - 30, прилож. - С. 7.

5. Бебякин В.M., Пискунова Г.В., Романова O.A. Микрометодики определения твердости зерна, количества и качества клейковины мягкой пшеницы // Вестник с.-х. науки Казахстана. -1976. № 2. - С. 24-28.

6. Вебякин В.М., Тучин C.B., Кибкало И.А. Тестирование качества клейковины: традиционные методы и новые разработки // Первая международная конференция "Качество зерна, муки и хлеба" (Россия, Москва, 4-8 мая 1998 г.), М. 1998. - С.95.

7. Беккужина С.С. Экспериментальный андрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам : Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., 1993. - 23 с. Беркутова Н.С. Методы оценки и формирования качества зерна. М.: Росагропромиздат, 1991. - 134 с.

8. Бриггс Ф., Ноулз П. Научные основы селекции растений. М.: Колос, 1972. 399 с.

9. Бритиков Е.А. Биологическая роль пролина. М.: Наука, 1975. - 88 с.

10. Веденеева M.JI., Аникеева Н.В., Тихонова Т.В. Испытание селективных схем для отбора сомаклонов пшеницы на устойчивость к гельминтоспориозу // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г.Пущино). Пущино, 1993. - С. 119.

11. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений (Биофизический подход). М.: Изд. Моск. Ун-та, 1993. 144 с.

12. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. Стресс растения. Биофизический подход // Физиол. раст. 1993. -40, № 4. - С.' 553-557.

13. Викторова JI.В., Максютова H.H. Регуляция абсцизовой кислотой синтеза белков зерновок пшеницы // Пятая международ, конф. "Регуляторы роста и развития растений (29 июня-1 июля 1999 года). Тез. докл. М., 1999. С. 17.

14. Виленский Е.Р., Щербаков В.К. Роль фитогормонов в естественном и индуцированном мутационном процессе // Цитология и генетика. 1985. - 19, N 3. - С. 214-217.

15. Внучкова В.А., Аш O.A. Об использовании селективных сред для создания in vitro форм пшеницы, устойчивых к корневой гнили // Сельскохозяйственная биология. 1992. - № 3. - С. 2-55.

16. Гирко B.C. Нетрадиционные методы создания селекционного материала пшеницы. Автореф. дисс. доктора сельскохозяйственных наук. Киев, 1999. 34 с.

17. Глазко В.И. Биохимические особенности регенерантов издген-ной линии мягкой пшеницы Новосибирская 67 // Цитология,и генетика. 1993. -27, № 5. - С. 49-55.

18. Гонзалес P.A., Уидхолм Д.М. Отбор клеток растений по тре-буемьм признакам: устойчивость к ингибиторам // Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агропромиздат, 1989. - С. 83-96.

19. Гусев H.A. Некоторые закономерности водного режима растений. М.: Изд. АН СССР, 1959. - 158 с.

20. Гусев H.A., Каримова Ф.Г. Водообмен и засухоустойчивость растений // Развитие теоретических и экспериментальных исследований в борьбе с засухоустойчивостью. Ставрополь, 1982. - С.78-89.

21. Даргинавичене Ю.В., Меркис А.И., Улявичене P.P., Жяменас И.А., Максимов Г.Б. ИУК-связывающие свойства плазмалеммы колеоптилей пшеницы // Физиол. раст. 1992. -39, № 2. - С. 249-258.

22. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985.- 304 с.

23. Джозеф Е.Дж., Дмитриева А.К., Никифорова И.Д. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к засолению // II Российский симп. Новые методы биотехнологии раст. (18-20 мая 1993 г., г.Пущино): Тез.докл. Пущино, 1993. - С. 131.

24. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б. Селекция на осмо-устойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов // Физиология растений. 1994. - 41, вып. 1. -С. 114-117.

25. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пус-товойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэти-ленгликоля клеточных линий // Физиология растений. 1994. - 41, вып. 6. С. 853-858. :

26. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Агропромиздат, 1985. 351 С.

27. Драгавцев В.А., Цильке P.A., Рейтер Б.Г. Генетика признаков продуктивности яровых пшениц в. Западной Сибири.'- Новосибирск: Наука, 1984. 230 с.

28. Дьячук Т.И,, Дьячук П.А. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников. М.: ВАСХНИЛ, 1989. 37 с.

29. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина C.B., Давыдов С.Д., Сафронова Н.Ф. Получение гаплоидных растений яровой мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Доклады ВАСХНИЛ. 1986. - № 10. - С. 3-4.

30. Еаттатхоттам Д.Д. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к стрессам: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. М., 1991. - 18 с.

31. Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стессустойчивость растений.- Минск: Наука и техника, 1992. 14 4 с. Жученко A.A., Король A.B. Рекомбинация в эволюции и селекции. М.: Наука, 1985. - 4 00 с.

32. Ильина Л.Г. Селекция яровой мягкой пшеницы на Юго-Востоке. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1989. - 160 с. Калинин Ф.Ф., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наук, думка, 1980. -488 с.

33. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин E.H. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота. - М.: Наука, 1989. -184 с.

34. Козьмина Н.П., Любарский JI.H. Зерно и его качество. М.: Сельхозиздат, 1962. 152 с.

35. Кулаева О.Н. Физиологическая роль абсцизовой кислоты. Введение в публикацию материалов международного симпозиума (Пущино, 1993 г.) // Физиол. раст. 1994. -41, № 5. С. 645-646.

36. Кумаков В.А. Физиология яровой пшеницы. М.: Колос, 1980. -207 с.

37. Кумаков В.А., Игошин А.П. Оценка засухоустойчивости сортов пшеницы по коэффициенту реализации потенциальной продуктивности колоса // Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям (Методическое руководство). JI.: ВИР, 1988. С.30-34.

38. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 4. Изменчивость в процессе дедифференцировки и каллу-сообразования in vitro // Биополимеры и клетка. 1998. -14, №4. - С. 298-319.

39. Кунах В.А., Губарь Е.К. Хромосомная изменчивость клеток растений in vitro : состояние и перспективы исследований // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г.Пущино) Пущино, 1993. - С. 186.

40. Кушнаренко C.B., Рахимбаев И.Р. Морфогенез в культуре тканей яровой пшеницы // Вестн. АН Каз. ССР. 1988. - 3. - С. 63-68.

41. Кушнер В.П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. Д.: Наука, 1977. - 274 с.

42. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - 343 с. Левенко Б.А. Применение культуры изолированных клеток, тканей и органов растений в генетике и селекции // Общая генетика. Т.5. Генетика и селекция с/х растений.- М.: ВИНИТИ, 1978. - С.

43. Левенко Б.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к стрессовым факторам: Автореф. дис. . докт.биол. наук. -Киев, 1991. 41 с.

44. Лукъянюк С.Ф., Ружицкий A.B., Игнатова С.А., Авсенин В.И. Изучение влияния генов Yrn на каллусообразование у мягкой пшеницы // Тез. докл. Всес. конф. по биотехнологии злаковых культур. Алма-Ата,198 8. - С.69-70.

45. Маркова И.А., Тонких А.К., Салихов Ш.И. Обнаружение ауксин-связывающих белков у проростков хлопчатника // 2 съезд Всес. о-ва физиологов раст., Минск, 24-29 сент. 1990: Тез. докл. 4.2. М., 1992. - С. 131.

46. Неттевич Э.Д., Моргунов А.И., Максименко М.И. Повышение эффективности отбора яровой пшеницы на стабильность урожайности и качество зерна // Вестник сельхознауки. 1985. -№ 1. - С. 66-74.

47. Нечипоренко Г.А., Рыбалова Б.А. Применимость осмотически действующих агентов для исследования водного обмена растительных тканей // Физиол. раст.- 1980.- 27, № 1. С. 203208.

48. Одинцова И.Г., Пеуша Х.О. О сложности локуса Lr 23, контролирующего устойчивость пшеницы к бурой ржавчине / Сб. на-учн. тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. Л., 1984. - 85. - С.13-19.

49. Писарева JI.A. Методы тестирования короткостебельности растений мягкой пшеницы // Бюл. ВИР. 1987. - № 174. - С. 4346.

50. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд. Ленингр. ун-та, 1982.248 с.

51. Прилюк Л.В. Генетический анализ короткостебельности в первом и втором поколении от скрещивания мексиканских и отечественных пшениц // Генетика. 1978. - 14, № 5. - С. 757762 .

52. Пустовойтова Т.Н. Рост растений в период засухи и его регуляция // Проблемы засухоустойчивости растений. М.: Наука, 1978. С. 129-165.

53. Пустовойтова Т.Н. Роль геномных мутаций в повышении засухоустойчивости и изменении регуляторов роста растений // Рост растений и его регуляция. Кишинев: Штиинца, 1985. - С. 176-182.

54. Пустовойтова Т.Н., Жолкевич В.Н. Основные направления в изучении влияния засухи на физиологические процессы у растений // Физиол. и биохимия культ, раст. 1992. - 24, №1.- С. 14-26.

55. Пустовойтова Т.Н., Меликсетян H.A. Торможение роста абсци-зовой кислотой и засухоустойчивость проростков пшеницы /./ Физиол. раст. 1985. -32, №1. - С. 169-175. Рабинович C.B. Современные сорта пшеницы и их родословные.- Киев: Урожай, 1972. 328 с.

56. Рекославская Н.И. Адаптационные изменения в белковом и аминокислотном обмене у растений в условиях водного стресса // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука, 1989. - С. 113-142.

57. Родин Е.А., Худякова Т.В. Новый метод массового получения растений-регенерантов озимой ржи при создании исходного материала для практической селекции // Доклады ВАСХНИЛ. -1990. № 10. - С.5-7.

58. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышейшая школа, 1973. - 320 с.

59. Сидоров В.А., Моргун В.В., Логвиненко В.Ф., Матвеева H.A. Выделение и характеристика мутантов пшеницы, устойчивых к

60. S-аминоэтилцистеину, лизину и треонину // Цитология и генетика. 1990. - 24, № 5. - С. 37-41.

61. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985. 272 с.

62. Созинова Л.Ф., Швидченко В.К., Бадаев Н.С. Использование клеточных и хромосомных технологий при создании сортов мягкой пшеницы // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., г. Пущино). Пущино, 1993. - С. 212.

63. Ооловьян В.Т., Захленюк О.В., Кунах В.А. Перестройки генома раувольфии в культуре in vitro // Всесоюз. конф. по генетике соматических клеток в культуре, посвященная памяти Н.И. Шапиро (Звенигород, 12-15 окт., 1989): Тез. докл. V М., 1989. - С. 100.

64. Сорта полевых культур Саратовской селекции // Ред. В.Ф. Ун-генфухт. Саратов: НИИСХ Юго-Востока, 1990. - 43 С. Старостенко Н.В. Некоторые особенности органогенеза в культуре тканей злаковых // М.: МГУ, 1986. - С. 244-246. Деп.

65. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агро-промиздат. 1989. - С. 97-127.

66. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, 1974.352 с.

67. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М.: Мир, 1984.- 512 с.

68. Чекуров В.М., Сергеева С.И., Сычев И.П., Килев С.Н. Гиббе-реллины и степень выраженности морфологических признаков растений // Генетические методы в селекции растений. Новосибирск: Наука, 1990. - С. 140-179.

69. Черницкий Е.А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. Минск: Наука и техника, 1972.278 с.

70. Шаяхметов И.Ф., Сурина О.В., Мулюкова Г.А. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к корневым гнилям // Генетика . 1994. - 30, прилож. - С. 181.

71. Шевелуха B.C., Рогинская В.А., Хижняк C.B. Перспективы использования токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых в клеточной селекции // С.-х. биология. 1992. - № 3. - С. 4 5-51.

72. Шевякова Н.И.< Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе // Физиол. раст. -1983. 30, №. 4. - С. 768-783.

73. Шевякова Н.И., Дмитриева Г.А., Кузнецов В.В. // IV Съезд J ОФР. Международн. конф. "Физиология растений наука IIIтысячелетия". Москва, 4-9 октября 1999 г. Тез. докл. М., 1999. С. 496-497.

74. Шегебаев О.Ш., Кабаева З.Н., Жамбакин К.Ж. Сомаклональная вариабельность селекционных признаков в условиях Казахстана // Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-15 октября 1989 г.): Тез.докл. М., 1989. - С.55.

75. Швидченко В. К., Созинова Л.Ф., Бадаев Н.С. Применение метода со-маклональной вариабельности растений в селекции яровой мягкой пшеницы // II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений (18-20 мая 1993 г., Пущино). Пущино, 1993. - С. 216.

76. Шматько И.Г., Григорюк И.А. Реакция растений на водный и температурный стрессы // Физиол. и биохимия культ, раст. -1992. 24, № 1. - С. 3-14.

77. Шматько И.Г., Григорюк И.А., Шведова O.E. Устойчивость растений к водному и температурному стрессам. Киев: Наук, думка, 1989. - 224 с.

78. Шматько И.Г., Жук О.И. Деление и растяжение клеток в интер-калярной меристеме листа кукурузы при дефиците воды и повышенной температуре // Физиол. и биохим. культ, раст. -1998. 30, № 1. - С. 60-65.

79. Юркова Г.Н., Левенко Б. А. Влияние различных ауксинов и рН среды на образование и прирост каллюса пшеницы // Генетические методы ускорения селекционного процесса. Кишинев, 1986. - С. 46-52.

80. Юркова Г.Н., Прилюк Л.В., Новожилов О.В., Левенко Б.А. Ци-тогенетический анализ растений-регенерантов мягкой пшеницы в третьем и четвертом поколениях // Генетика. 1990. - 2 6, № 1. - С. 72-77.

81. Ahloowalia B.S., Sherington J. Transmission of somaclonal variation in wheat // Euphytica. 1985. - 34, N 2. - 525537.

82. Ahloowalia B.S. Somaclones of wheat regenerated from primordial leaf callus // Gen. Manipulat. Plant Breed. Proc. Int. Symp., Berlin (Sept. 8-13, 1985). Berlin, 1986. - P. 577-579.

83. Arora R., Pitchay D.S., Bearce B.C. Water-stress-induced heat tolerance in geranium leaf tissues: A possible linkage through stress proteins ? // Physiol. Plant. 1998. - 103, N 1. - P.24-34.

84. Azzi A. The application of fluorescent probes in membrane studies // Quart. Rev. Biophys. 1975. - 8, N 2. - P. 237316.

85. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in wheat breeding // Biotechnology in agricultural and forestry. V.13. Wheat. Berlin -Heidelberg, 1990. P. 3-23.

86. Barlow E.W.R., Munns R.E., Scott M.S., Reisner A.H. Water potential, growth and polyribosome content of stressed wheat apex-// J. Exp. Bot. 1977. - 28, N 105. - P. 909916.

87. Bhaskaran S., Smith R.H., Newton R.J. Physiological changes in cultured sorghum cells in response to induced water stress.- I. Free proline // Plant Physiol. 198-5, -79, N 1. - P. 266-269.

88. Bohnert H.J.,- Sheveleva E. Plant stress adaptation making metabolism move // Cur. Op. Plant Biol. 1998. - 1, N 3. -P.267-274.

89. Bressan R.A., Hasegawa P.M., Handa A.K. Resistance of cultured higher plant cells to polyethylene glycol-induced water stress // Plant Sci. Lett. 1981. - 21. - P. 23-30.

90. Brettell R.I.S., Brown A.G.P., Whan B. Selection of wheat resistant to glume bloth disease through tissue culture // Gen. Manipul. Crops: Abstr. Inter. Symp. (Beijing, October 22-26, 1984). Beijing, 1984. - P. 69.

91. Bright S.W.J. Selection in vitro // Cereal tissue and cell culture. Dordrecht etc.: Martinus Nijhoff/Dr. W.Junk Pablishers, - P. 231-260.

92. Chauhan R.S., Singh B.M. Variation for some morphological traits and leaf rust reaction among régénérants of bread wheat cultivar Sonalica // Cereal Res. Com. 1995. - 23, N1-2. - P.109-116.

93. Chen Z., Evans D.A., Vasconcelos A. Use of tissue culture to bypass wheat hybrid necrosis // Theor. and Appl. Genet. 1989, - 78, N 1. - P. 57-60.

94. Chi-Chang Chen, Ksin-Shang Tsay and Chien-Rong Huang. Rice (Oriza sativa L.): factors affecting androgenesis // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin-Hedelberg: Springer-Verlag, 1986. P.123-138.

95. Close J. Dehydrins: testing the link between DHN genes and freezing tolerance in barley timothy // Plant physiol.-1996. -Ill, N 2, Suppl. P 28.

96. Conner A.J. Isolation and characterization of variants from plant cell culture // N.Z.J. Technol. 1986. - 2, N 2. - P.83-94.

97. Dunwell J.M. Embryogenesis from pollen in vitro // Biotechnology in plant science. N.-Y. London: Acad. Press, 1985. - P. 49-76.

98. Jonson B.B., Nguyen H. Somaclonal variation in spike characteristics of wheat // Gen. Manipul. Crops: Abstr. Inter. Symp. (Beijing, October 22-26, 1984).- Beijing, 1984. P. 61.

99. Fedak G., Armstrong K.C., Handyside R.J. Chromosome instability in wheat plants regenerated from suspension culture // Genome. 1987. - 29, N 4. - p. 627-629.

100. Fontdevil A. Genotipe temperature interaction in Droso-philla melanogaster. II. Body weight // Genetics. - 1973. -73, N 1. - P. 125-129.

101. Handa A.K., Bressan R.A., Handa S., Hasegawa P.M. Characteristics of cultured tomato cells after prolonged exposure to medium containig polyethylene glycol // Plant Physiol.,1982. 69. - P. 514-521.

102. Handa A.K., Bressan R.A., Handa S., Hasegawa P.M. Clonal variation for tolerance to polyethylene glycol-induced water stress in cultured tomato cells // Plant Physiol.1983. 72, N 3. -P. 645-653.

103. Handa S., Handa A.K.-, Hasegawa P.M., Bressan R.A. Proline accomulation and the adaptation of cultured plant cells to water stress // Plant Physiol. 1986. - 80, N 4. - P. 938945.

104. Hart G.E., Langston P.J. Chromosomal location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat // Heredity. 1977. - 39, N 2. - P. 269 - 277.

105. He D.G., Yang Y.M., Scott K.J. A comparision of scutellum callus and epiblast callus induction in wheat: the effect of genotype, embryo age and medium // Plant Sci. 1988. -57. P. 225-233.

106. Henry rX., Buyser J. Factors influencing the response of anther cultures If Biotechnology in agricultural and forestry. Wheat. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1990. -P. 289 - 299.

107. Higgins P., Mathias R.J. The effect of the 4B chromosomes of hexaploid wheat on the growth and regeneration of callus cultures // Theor. and Appl. Genet. 1987. - 74, N 4. - P. 439-444.

108. Galiba G., Kertesz Z., Sutka J., Sagi L. Differences in somaclonal variation in three winter wheat (Triticum aestivum L.) varieties // Cereal Res. Commun. 1985, - 13, N 4. - P.343-350.

109. Galiba G., Kovacs G., Sutka J. Substitution analysis of plant regeneration from callus culture in wheat // Plant Breeding. 1986. - 97, N 3. - P. 261-263.

110. Galiba G., Yamada Y. A novel method for increasing the frequency of somatic embryogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KC1 supplementation // Plant Cell Reports. 1988. - 7. - P. 55-58.

111. Grandbastein M.A. Activation of plant retrotransposons under stress cjnditions // Trends in Plant Sci. 1998. - 3, N5. - P. 181-187.

112. Janes B. The effect of molecular size, concentration in nutrient solution and exposure time on the amount and distribution of polyethylene glycol in paper plants // Plant Physiol. 1974. - 54, N 3. - P. 226-230.

113. Henry Y., Beyser J. Factors influencing the response of anther cultures // Biotechnology in agricultural and forestry. Wheat. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1990, -P. 289-299.

114. Kinoshita T., Mikami T. Influence of alien cytoplasms on callus proliferation and streptomicin resistance in common wheat // Wheat Inf. Serv. 1985. - 60. - P. 34.

115. Mathias R.J., Boyd L.A. Cefotaxime stimulates callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L. em. Tell) // Plant Sci. 1986. - 46, N 3. - P. 217-223.

116. Mathias R.J., Fukui K. The effect of specific chromosome and cytoplasmic substitutions on the tissue culture response of wheat (Triticum aestivum) callus // Theor. and Appl. Genet. 1986. - 71. - P. 797 - 800.

117. Nomura K., Komanie A. Polarized DNA synthesis and cell division in cell clusters during somatic embryogenesis from single carrot cells // New Physiol., 1986. 104, N 1. - P. 25-32.

118. Orlov P.A. Nuclear and cytoplasmic control of wheat plant development in vivo and in vitro // 5th Inter. Wheat Conf. June 10-14, 1996, Anhara, Turkey. Abstr. Anhara, 1996. -P. 383.

119. Oziaz-Akins P., Vasil I.K. Proliferation of and plant regeneration from the epiblast of Triticum aestivum (wheat, Gramineae) embrios // Amer.J.Bot. 1983. - 70, N 7. - P. 1092-1097.

120. Pareek A., Singla S.L., Grover A. Evidence for accumulation of a 55 kDa stress-related protein in rice and several other plant genera If Plant Sci. 1998. - 134, N 2. - P. 191-197.

121. Pauk J. Breeding with half the genes: "J.K. Delibab" released, patented new winter wheat varieties // Ann. Wheat Newslet. 19'96. - 42. - P. 159.

122. Penzer G.R. l-anilinonaphtalene-8-sulphonate. The dependence of emission spectra on molecular conformation studied by fluorescence and proton-magnetic resonance // Eur. J. Biochem. 1972. - 25. - P. 218-228.

123. Purnhauser L. Improving plant regeneration in callus cultures of wheat // Ann. Wheat Newsletter. 1993. - 39. - P. 159-160.

124. Purnhauser L., Medgyesy P., Czako M., Dix P.J., Marton L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifola via tissue cultures using the ethylene inhibitor AgN03 // Plant Cell Repts. 1987. -6, N 1. - P. 1-4 .

125. Rebordinos L., Perez de la Vega M. Extent of genetic variability of endosperm esterases in Triticum aestivum L. 2n=6x=42 // Theor. and Appl. Genet. 1989. - 78, N 5. - P. 728-734.

126. Ryan S.A., Scowcroft W.R. A somaclonal variant of wheat with additional a- amilase isozymes // Theor. and Appl. Genet. 1987. - 73, N 3. - P. 495-464.

127. Ryschka U. Morphogenese bei Kalluskulture des Weizens // Tagunsgsber. Akad. Landwirt Schaftswiss DDR. -1983. N 207. - 15-22.

128. Sagi F., Beke B., Sagi L. Somaclonal variation in durumwheat (Triticum durum Desf.) // Biotechnology in Agriculture and Forestry 13. Wheat. Berlin etc.: Springer - Verlag, 1990. - P. 494-510.

129. Schuetze R., Leike H., Shlegel H. Selektion von resistenen mutanten in zellkulturen // Fortschrittsberichte fur die Landwirtschaft und Nahrungsguterwirterwirtsschaft.- 1984. 22, 1. - S. 1-48.

130. Sears R.G., Decard E.L. Tissue culture variability in wheat-callus induction and plant regeneration // Crop. Sci.- 1982. -22, N 3. P. 546-550.

131. Smith R., Bhaskaran S., Miller F. Screening for drought tolerance in sorghum using cell culture // In Vitro. -1985. 21, N- 10. - P. 541-545.

132. Swaaij A.C., 'Jcobsen E., Kiel J.A., Feenstra W.J. Selection, characterisation and regeneration of hydroxyprolineresistant cell lines of Solanum tuberosum: tolerance to NaCl and freezing stress // Physiol. Plant.- 1986. 68, N 3. - P. 359-366.

133. Thomas T.H. Some recent advances in plant hormone research in Europe // Annu. Bull. Brit. Soc. Plant Growth Regul. -1991. N 1. - P. 13-20.

134. Winfield M. 0., Schmitt M., Lorz H., Davey R., Karp A. Non-random chromosome variation and morphogenic potential in cell lines of bread wheat (Triticum aestivum L.) // Genome.- 1995. 38, N 5. - P. 869-878.

135. Wersuhn G. Obtaining mutants from cell cultures // Plant Breeding. 1989. - 102, N 1. - P. 1-9.

136. Yoshida S., Watanabe K,, Fujio M. Non-random gametoclonal variation in rice regenerants from callus subcultured for a prolonged period under high osmotic stress // Euphitica. -1998. 104, N 2. - 87-94.

137. Zhang L.J., Seilleur P. A simple and fast method to obtain high frequency of plant regeneration from mature and immature wheat embryos // Bull. Rech. Agron. Gembloux. 1987.- 22, N 3. P. 187-197.