Моделирование старения на стационарных клеточных культурах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Прохоров, Леонид Юрьевич

• Прохоров, Леонид Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Прохоров, Леонид Юрьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование стационарных клеточных культур для изучения

старения

1.1.1. Сходство изменений параметров "стационарно стареющих"

клеток с изменениями аналогичных параметров, происходящих при старении in vivo, а также при старении in vitro "по Хейфлику"

1.2. Клеточно - кинетическая модель

1.3 Изучение причин ограничения пролиферации клеток в культуре

1.4. Клональный анализ как метод исследования в клеточной геронтологии

1.5. Эксперименты по влиянию антиоксидантов на культивируемые клетки

1.5.1. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием "модели Хейфлика"

1.5.2. Изучение влияния антиоксидантов на клетки, находящиеся в стационарной стадии

1.5.3. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием клеточно-кинетической модели

1.6. Исследование содержания и активности цитохромов Р-450 (в том числе 0-деалкилаз) в организме и в культивируемых клетках

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Используемые клетки и препараты

2.2. Культивирование клеток

2.3. Примененные способы клонирования клеток

2.4. Определение времени клонирования клеток

2.5. Математическое обеспечение работы

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследование некоторых закономерностей роста и "стационарного старения" клеток, а также происходящих при этом изменений их

свойств и характеристик

3.1.1. Изменение числа живых трансформированных клеток ки тайского хомячка, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стацио нарном старении" и последующей гибели этих клеток

- з -

в культуре

3.1.2. Изменение числа живых эмбриональных диплоидных фиброб-ластов человека, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стационарном старении" и последующей гибели этих клеток в культуре

3.1.3. Сравнение "стационарного старения" нормальных и транс формированных клеток

3.1.4. Влияние периодической замены среды на рост и "стацио нарное старение" клеток

3.1.5. Влияние "возраста" среды на рост клеток

3.1.6. Корреляция некоторых параметров, связанных с пролифе ративной активностью клеток, с продолжительностью жиз ни "стационарно стареющих культур" и с максимальной продолжительностью жизни млекопитающих

3.1.7. Некоторые дополнения к данным о связи пролиферации с продолжительностью жизни организмов и "стационарно стареющих" культур

3.1.8. Связь скорости пролиферации клеток с "общей и "стационарной " продолжительностью жизни культур трансформированных клеток китайского хомячка

3.1.9. Исследование параметров, связанных с ограничением пролиферации клеток

3.1.10. Математическая модель роста и "стационарного старения"

3.1.11. Распределение клеток по митотической активности и по фазам клеточного цикла после посева, при росте, переходе из логарифмической стадии в стационарную и на разных этапах стационарной стадии ("стационарного старения" )

3.2. Влияние буферной емкости среды на кинетику роста и "стацио нарного старения" трансформированных клеток китайского хомяч ка

3.3. Исследование 0-деалкилазной активности некоторых цитохромов Р-450 с использованием модели "стационарного старения"

3.4. Влияние различных веществ и препаратов (в том числе геропро-текторов и геропромоторов) на эффективность клонирования, а также на рост и "стационарное старение" трансформированных клеток китайского хомячка и диплоидных фибробластов человека

3.4.1. Влияние эпигида (хлоргидрата 2-этил-6-метил-3-оксипи-

ридина)

3.4.2. Влияние дибунола (4-метил-2,6-дитретбутилфенола, или бутилокситолуола)

3.4.3. Влияние анфена и глутатиона

3.4.4. Влияние Т-активина

3.4.5. Влияние холестерина и 7-кетохолестерина

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование старения на стационарных клеточных культурах»

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему моменту уже проведено значительное количество исследований на различных биологических объектах как in vivo так и in vitro, направленных на изучение процесса старения живых организмов. Однако природа этого феномена до сих пор не выяснена и не найдено реальных способов существенного увеличения активной продолжительности жизни.

В этом направлении изучение старения на культурах клеток занимает свое соответствующее место. Спустя некоторое время после получения возможности культивирования клеток на искусственных средах были созданы модели, которые могли применяться для указанных целей и позволяли как изучать процесс старения, так и исследовать влияние на него различных факторов.

Одна из таких моделей была разработана Хейфликом (Hayflick, Moorhead, 1961; Hayflick, 1965; 1992). В ней за основу принимается следующее экспериментальное открытие: многие нормальные клетки in vitro (в частности диплоидные фибробласты животных и человека ) имеют ограниченный потенциал удвоения, т.е. клетки в таких культурах могут поделиться только определенное ограниченное число раз. Причем, выяснилось, что максимально возможное число удвоений клеточной популяции (диплоидных фибробластов) пропорционально продолжительности жизни вида животного, от которого получены данные клетки. Кроме того когда клетки длительное время пересеваются в них происходят изменения, сходные с изменениями, происходящими в клетках стареющего организма. Это послужило основанием целесообразности использования модели для изучения старения на клеточном уровне. Недостатком этой модели является относительная длительность получения экпериментальных результатов, - как правило, от нескольких месяцев до года и более.

Большие возможности для изучения процесса старения предоставляют модель "стационарного старения" (Гринберг, 1971; Хохлов и др., 1983; Хохлов, 1988) и "клеточно-кинетическая" модель (Чиркова и др., 1984; Хохлов, 1988). Первая базируется на положении о ведущей роли ограничения пролиферации в накоплении в организме с возрастом дефектов на разных уровнях (Гринберг, 1971; Walton, 1982; Хохлов, 1988). Согласно модели, в находящихся в стационарной фазе роста культивируемых клетках должны накапливаться повреждения, сходные с повреждениями клеток стареющего организма. Пусковым механизмом на-

копления повреждений ДНК является уменьшение средней скорости пролиферации клеток организма или клеточной популяции ниже некоторого критического уровня. Процесс накопления таких повреждений в культивируемых клетках с увеличением времени после пересева (то есть при снижении скорости пролиферации клеток и в процессе дальнейшего их пребывания в стационарной фазе) и называется "стационарным старением" (Хохлов и др., 1983). Вторая модель основывается на существовании обратной корреляции между возрастом организма и насыщающей плотностью его клеток в культуре, растущей без пересева.

Эти модели позволяют получить экспериментальные результаты при изучении механизма старения in vitro максимально быстро, буквально за несколько недель. Многочисленные эксперименты, выполненные на модели "стационарного старения" и клеточно-кинетической модели подтвердили возможность использования этих моделей (Хохлов, 1988; Khokhlov, 1992).

В частности, на модели "стационарного старения" было показано, что в течение стационарной стадии в клетках происходит накопление повреждений ДНК и сшивок ДНК-белок, деметилирование ДНК, увеличение частоты спонтанных сестринских хроматидных обменов (Хохлов, 1988 а, б).

В то же время на модели "стационарного старения" было получено мало данных о закономерностях старения и гибели клеток в поздней стационарной стадии, об изменениях активности ферментов и колони-еобразующей способности клеток. Хотя кривые уменьшения числа живых клеток разных культур при "стационарном старении" могут отличаться между собой, не было создано математическое обеспечение, позволяющее учесть или предсказать эти различия. Отсутствовали данные о распределении клеток в культуре по их пролиферативному статусу: находящихся в цикле деления или в состоянии покоя, в том числе пролиферативно "живых" или пролиферативно "мертвых". Не были ис-ледованы соотношения между параметрами роста и "старения" культуры и параметрами роста и старения многоклеточных организмов, а также корреляционные связи пролиферативных параметров (число, скорость деления клеток, время роста) с продолжительностью жизни культур и организмов. В клеточно-кинетической модели не учитывалось реальное уменьшение числа живых клеток в течение стационарной стадии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлось совершенствование модели "стационарного старения" для того, чтобы расширить возможные сферы ее применения при изучении механизмов старения, в том числе для оценки связи

процессов развития и старения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В связи с поставленными целями требовалось решить следующие, важные с точки зрения использования указанных моделей для раскрытия механизма старения, задачи: выяснить особенности "старения" культур нормальных и трансформированных клеток в поздней стационарной стадии; определить, от чего зависит продолжительность жизни "стационарно стареющих" культур; сопоставить периоды роста культур с этапами роста целого организма; оценить влияние некоторых анти-оксидантов и других веществ на рост и "стационарное старение" культур, а также на эффективность клонирования "молодых" и "стационарно старых" клеток; определить активность некоторых цитохром Р-450 - зависимых О-деалкилаз в "стационарно стареющих" культурах; разработать математический аппарат для модели "стационарного старения" с целью оценки кинетики роста культуры и ее гибели при "стационарном старении".

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Установлена зависимость эффективности клонирования клеток, размера (среднего и максимального) колоний и их распределения по классам, а также уровня синтеза ДНК клеток от времени их роста и "стационарного старения". Разработана новая методика точного посева клеток на чашки Петри для определения эффективности их клонирования. Впервые выявлены корреляционные зависимости между "общей" и "стационарной" продолжительностью жизни (время до гибели культуры от посева или от момента достижения насыщающей плотности, соответственно) культуры и параметрами ее роста: временем роста от посева до насыщающей плотности, а также числом и скоростью удвоений клеточной популяции за тот же период. Обнаружены корреляционные зависимости между максимальной продолжительностью жизни млекопитающих и некоторыми параметрами их роста, связанными с пролифератив-ной активностью клеток: средним числом удвоений в эмбриональный период и за все время роста организма от оплодотворения до завершения его формирования, а также средней скоростью этих удвоении за те же периоды. Впервые выявлены аналогии между периодами роста и старения организма с периодами роста и "стационарного старения" клеточной культуры, оценены с использованием доработанной клеточ-но-кинетической модели и модели "стационарного старения" геропро-текторные и геропромоторные свойства некоторых препаратов,* исследована активность некоторых цитохром Р-450 - зависимых О-деалкилаз в трансформированных клетках китайского хомячка и эмбриональных

диплоидных фибробластах человека на разных стадиях "стационарного старения" этих клеток. Разработан математический аппарат, аппроксимирующий кривую числа живых клеток в популяции не только в период роста и в раннем периоде "стационарного старения", но также в позднем периоде "стационарного старения" и во время гибели клеточной популяции. Разработаны формулы, позволяющие оценивать процент делящихся и покоящихся клеток (в том числе способных и неспособных к пролиферации) в культуре в период ее роста, на разных этапах "стационарного старения" и при ее гибели.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты исследования будут способствовать открытию фундаментальных механизмов старения и разработке теории старения организмов; помогут в оценке геропротекторных или геропромоторных свойств различных препаратов; позволят ускорить внедрение в практику различных методов и препаратов, способствующих реальному улучшению здоровья людей и увеличению их активной жизни.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы обсуждались на 14 Всероссийских и международных конференциях, конгрессах, съездах, заседаниях, в частности на 5-м Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси, 1988), конференции по механизмам процесса старения (Москва, 1988), заседаниях (1988, 1989) Московского общества испытателей природы, ежегодных конференциях Американской ассоциации по изучению старения (США, 1992, 1993, 1994), 14 Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (Франция, 1994), II Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 1994), международных симпозиумах "Биологические механизмы старения" (Харьков, 1996, 1998), "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма" (Санкт-Петербург, 1996), "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" (Москва, 1997), 1-м Европейском конгрессе по биогеронтологии (Дания, 1998). ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликована 31 работа в отечественных и зарубежных изданиях.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БРОД - 7-бензилоксирезоруфин-0-дебензилаза; ДФЧ - диплоидные фибробласты человека; ДМСО - диметилсульфоксид;

МДСИ - модифицированная Дульбекко среда Игла; МКМД - 7-метоксикумарин 0-деалкилазы; МПЖ - максимальная продолжительность жизни; НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат. ОПЖ - "общая" продолжительность жизни; ПЖ - продолжительность жизни; ПРОД - 7-пентоксирезоруфин деалкилазы; СИ - среда Игла;

СКРС - сыворотка крупного рогатого скота; СтПЖ - "стационарная" продолжительность жизни; ТККХ - трансформированные клетки китайского хомячка; УКП - удвоение клеточной популяции;

ЭДФЧ - эмбриональные диплоидные фибробласты человека;

ЭК - эффективность клонирования;

ЭКМД - 7-этоксикумарин О-деалкилазы;

ЭРОД - 7-этоксирезоруфин деалкилазы;

ФСБ - фосфатно солевой буфер;

7-БРР - 7-бензилоксирезоруфин;

7-МКМ - 7-метоксикумарин;

7-ПРР - 7-пентоксирезоруфин;

7-ЭКМ - 7-этоксикумарин;

7-ЭРР - 7-этоксирезоруфин.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Прохоров, Леонид Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что эффективность клонирования, а также средний и максимальный размеры колоний увеличиваются в процессе роста культур трансформированных клеток китайского хомячка и эмбриональных диплоидных фибробластов человека с первого дня после пересева до

- 136 момента достижения насыщающей плотности и уменьшаются при "стационарном старении" клеток (процесс накопления в культивируемых клетках повреждений, сходных с повреждениями клеток стареющего организма, при снижении скорости пролиферации после пересева и в стационарной фазе); уровень синтеза ДНК, высокий в логарифмической фазе роста, уменьшается по мере приближения плотности культур к насыщающей и стремится к нулю при "стационарном старении".

2. С использованием модели "стационарного старения" обнаружено, что активность некоторых форм цитохрома Р-450 (0-деалкилаз) по-разному зависит от "возраста" (время от момента пересева) культур трансформированных клеток китайского хомячка и эмбриональных диплоидных фибробластов человека. Активность одних (7-пентокси- и 7-этоксирезоруфин-0-деалкилаз) - не меняется, других (7-этокси- и 7-метоксикумарин-0-деалкилаз) - отсутствует, а одного фермента (7-бензилоксирезоруфин 0-дебензилазы) - увеличивается с "возрастом" (трансформированные клетки китайского хомячка) или не изменяется (эмбриональные диплоидные фибробласты человека). Полученные данные in vitro коррелируют с результатами экспериментов in vivo, свидетельствующими о неоднозначности изменения активности разных форм цитохрома Р-450 с возрастом организма.

3. Установлено, что величины "общей" и "стационарной" продолжительности жизни (новые определения, обозначающие время до гибели культуры от пересева или от начала стационарной стадии, соответственно) культур трансформированных клеток китайского хомячка прямо пропорциональны времени их роста от посева до момента достижения насыщающей плотности и среднему числу совершенных при этом удвоений клеточной популяции, но обратно пропорциональны средней скорости удвоения клеточной популяции в этот период. Установлено (в результате анализа литературных данных по разработанным формулам), что максимальная продолжительность жизни млекопитающих разных видов прямо пропорциональна среднему числу удвоений составляющих организм клеток в эмбриогенезе и за весь период роста от оплодотворения до завершения его формирования и обратно пропорциональна средней скорости удвоения клеток в те же периоды. Связь перечисленных параметров с максимальной продолжительностью жизни животных оказалась аналогичной связи этих же параметров с продолжительностью жизни "стационарно стареющих" культур.

4. Показано, что с помощью таких изученных параметров, как эффективность клонирования, размер колоний клеток и их распределение по размерам, а также насыщающая плотность культуры, оцениваемых на

- 137 клетках логарифмической стадии роста, ранней и поздней стадий "стационарного старения", можно испытывать различные вещества и препараты и определять, обладают ли они геропротекторными или ге-ропромоторными свойствами. Таким образом протестированы эпигид, дибунол, анфен, глутатион, Т-активин, холестерин, окисленный холестерин .

5. Разработан математический аппарат, который, в отличие от существовавшего и описывающего изменение числа живых клеток только в период роста культуры и в начальной фазе "стационарного старения", может аппроксимировать изменение числа клеток также в поздней стационарной стадии (когда наблюдается гибель клеток из-за "стационарного старения"). При этом можно учитывать длительность стационарной фазы, интенсивность последующей гибели клеток и прогнозировать предстоящую продолжительность жизни культуры. Разработаны математические модели, позволяющие оценивать как доли клеток популяции, находящихся в цикле деления, в состоянии покоя или являющихся "пролиферативно мертвыми", так и их распределение по фазам клеточного цикла на всех этапах роста и "стационарного старения".

6. На основании анализа полученных данных о закономерностях изменения всех изученных параметров при росте и "стационарном старении" трансформированных (клетки китайского хомячка) и нормальных (эмбриональные диплоидные фибробласты человека) клеток сделан вывод, что в рамках модели "стационарного старения" можно использовать как нормальные, так и трансформированные клетки.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность научному руководителю д.б.н. А.Н. Хохлову за ценные идеи и замечания в процессе работы над диссертацией, благодарит д.б.н. Л.К. Обухову за предоставленные для исследований антиоксиданты, В.Л. Ушакова - за помощь в сборе литературных данных о некоторых параметрах многоклеточных организмов, С.С. Акимова за помощь в проведении радиоавтографии, П.С. Кудрявцева -за проверку математического аппарата, профессора М.В. Гусева - за предложение исследовать характер изменения клеток по пролифератив-ной активности при росте и "стационарном старении" культуры, профессора А.Х. Тамбиева - за критические замечания по поводу математической обработки результатов и графического представления данных, а также за советы по оформлению автореферата и форме устного доклада, профессора В.Д. Самуилова - за обсуждение общей идеи диссертации, названия диссертации и корректности терминологии, профессора В.Г. Харитоненкова - за поддержку работы и замечания по оформлению автореферата, профессора Г.И. Кирьянова - за внимательное прочтение диссертации и реферата и высказанные пожелания и замечания, профессора В.А. Голоченкова и д.б.н. Ю.К. Доронина - за высказанные замечания, A.A. Кущ - за оценку соответствия реферата и диссертации, профессора Т.Г. Корженевскую - за критические вопросы по докладу, к.б.н. Н.В. Воробьеву - за помощь в оформлении диссертации и решение организационных вопросов, других сотрудников кафедры клеточной физиологии и иммунологии, а также кафедры эмбриологии - за то или иное участие в работе над диссертацией.

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из основных направлений исследований в цитогеронтологии является изучение процессов старения с помощью различных моделей, использующих культивируемые клетки. Однако до сих пор неясно какие из них наиболее близки к реальной ситуации в организме. Нам представляется, что применяемая в наших работах модель "стационарного старения" способна вполне адекватно давать некоторые полезные результаты, сопоставимые с результатами, которые могут быть получены на целых организмах. Одним из основных доводов в пользу этого может служить сходство изменения пролиферативной активности в течение продолжительности жизни многоклеточного организма и культур клеток, подвергающихся "стационарному старению". Это сходство заключается в том, что там и там после завершения периода активного деления клеток (в течение роста организма или культуры клеток) их пролиферативная активность падает практически до нуля. Уже во время роста млекопитающих за период от рождения до окончания роста, когда остается пройти всего лишь несколько удвоений (3-5) из основной массы (34-49) (см. табл. 1) пролиферативная активность настолько низка, что одно удвоение составляющих организм клеток совершается только за 1,4 мес у мыши, за 1,9 года у тюленя, за 3,2 года у слона и за 4,5 года у человека. В то же время в десятки раз падает скорость удвоения составляющих организм клеток после рождения по сравнению со скоростью в эмбриональный период: в 59,7 раз -у мыши, в 94,2 раза - у тюленя, в 236 раз - у человека. В культуре перед моментом достижения насыщающей плотности скорость УКП также резко снижается, а после достижения насыщающей плотности (без замены среды) пролиферация практически прекращается.

Сходство изменений, происходящих с клетками при росте и "стационарном старении", с изменениями при росте и старении in vivo состоит еще и в том, что, как показано в данной работе, ЭК, средний и максимальный размеры колоний увеличиваются в течение роста культуры с первого дня после посева до момента достижения насыщающей плотности и уменьшаются при "стационарном старении" клеток; синтез

- 133

ДНК быстро уменьшается с момента посева и по мере приближения культуры клеток к стационарной стадии и стремится к нулю при "стационарном старении". Похожие изменения происходят в течение жизни и у многоклеточных организмов.

Установлено, что"общая" и "стационарная" продолжительность жизни культур ТККХ пропорциональны времени их роста от посева до момента достижения насыщающей плотности и среднему числу совершенных при этом УКП, но обратно пропорциональны средней скорости УКП в течение того же периода. Обнаружено также, что максимальная продолжительность жизни млекопитающих пропорциональна среднему числу удвоений составляющих организм клеток от оплодотворения до завершения формирования организма и обратно пропорциональна средней скорости удвоения этих клеток за тот же период. Выявленные зависимости для культур клеток оказались аналогичны таким же зависимостям установленным для млекопитающих, что также добавляет модели "стационарного старения" сходства с развитием и старением целого организма.

В ходе работы была обоснована гипотеза о том, что способные "стареть" в культуре "по Хейфлику" клетки в условиях "стационарного старения" учитывают календарное время, а без ограничения роста - число совершенных ими делений. Отсюда следует важный вывод, что для продолжительности жизни важен как тот так и другой параметр.

Разработан математический аппарат, позволяющий аппроксимировать кривую изменения числа живых клеток не только в период роста и в раннем периоде "стационарного старения", но также и в позднем периоде "стационарного старения" и во время гибели клеточной популяции .

Разработан новый методический прием при посеве клеток на ростовую поверхность с целью определения их ЭК, позволяющий точно оценивать число посеянных клеток.

В результате периодической замены среды в "стационарно стареющих" культурах ТККХ и НеЬа, гибнущие "старые" клетки открепляются от ростовой поверхности и их место занимают "молодые" клетки. В результате культура ТККХ может существовать неограниченно долго (наблюдение 6 мес), а продолжительность жизни НеЬа увеличивается примерно в 3 раза ( до 2,3 мес). При такой же периодической замене среды в культурах ЭДФЧ (наблюдение более 7 мес) "стационарно состарившиеся" клетки не открепляются от стекла и не замещаются "молодыми" клетками, поэтому их число практически не изменяется, хотя со временем размер клеток уменьшается, за счет чего увеличивается

- 134 пространство между ними, мембрана становится неровной, что свидетельствует о постепенной деградации и гибели клеток.

Ростовая среда даже из очень "стационарно старой" культуры ТККХ (22 сут) не полностью истощена и помещенные в нее "молодые" клетки могут еще расти (их число за 4 сут удваивается), а их индекс мече-ния 3Н-тимидином остается высоким и составляет 78,0±1,5.%. Даже в том случае, когда клетки в среде уже почти не делятся (26 сут) индекс мечения непропорционально высок - 65,1±5,7%. На основании расчетов пришли к выводу, что высокий уровень синтеза ДНК может быть следствием значительного (в десятки раз) увеличения длительности фазы Б.

Установлено, что ЭК, средний и максимальный размеры колоний увеличиваются в течение роста культур ТККХ и ЭДФЧ с первого дня после посева до момента достижения насыщающей плотности и уменьшаются при "стационарном старении" клеток; интенсивность синтеза ДНК быстро уменьшается с момента посева и по мере приближения культур клеток к стационарной стадии и стремится к нулю при "стационарном старении". Закономерности изменения изученных параметров при росте и "стационарном старении" трансформированных (ТККХ) и нормальных (ЭДФЧ) клеток сходны, поэтому в рамкам модели "стационарного старения" "нормальность" клеток не имеет существенного значения. Можно заключить, что как нормальные так и трансформированные клетки можно использовать в цитогеронтологических исследованиях.

Насыщающая плотность культур ТККХ в присутствии буфера НЕРЕБ (20 мМ) в ростовой среде уменьшается. Если предположить, что цито-токсичность буфера в применяемой концентрации незначительная (как следует из литературных данных), то это значит, что небольшое уменьшение рН (закисление) может оказывать благоприятное действие на рост и "стационарное старение" клеток в культуре и, возможно, аналогичное действие может быть и в многоклеточном организме.

- ч

Показано, что антиоксидант эпигид в концентрации 5 10 М при постоянном присутствии в среде роста (с момента посева культуры) положительно влияет на "молодые" (активно делящиеся) ТККХ и ЭДФЧ, т.е. увеличивает насыщающую плотность культур, в то же время он неоднозначно влияет на "стационарно стареющие" клетки (плотность "стационарно старых" ТККХ ниже, а ЭДФЧ выше, чем в контроле), не оказывает действия на синтез ДНК в ядрах "молодых" ТККХ и ЭДФЧ, а также "старых" ТККХ, но способен дольше поддерживать синтез ДНК в "старых" ЭДФЧ. Кроме этого препарат увеличивает ЭК "молодых" ТККХ (10~4М) и ЭДФЧ (5 '10~5М) и не влияет на ЭК "старых" ЭДФЧ. В отли

- 135 чие от эпигида дибунол (также постоянно присутствующий в ростовой среде) уменьшает насыщающую плотность культур ТККХ при 10, 30 и 500 мкг/мл, в то же время при 10 и 30 мкг/мл он увеличивает ЭК "взрослых", а при 500 мкг/мл "старых" ТККХ, что говорит о его способности поддерживать жизнедеятельность клеток в неблагоприятных условиях "стационарного старения". Глутатион оказался самым токсичным, а анфен - самым нетоксичным из испытанных препаратов по действию на "молодые" ТККХ (глутатион сильно подавлял ЭК уже при 4 — 2

10 М, а анфен не оказывал влияние на ЭК до 10 М). Т-активин при концентрации 2 мкг/мл увеличивает ЭК "молодых" ТККХ, при 10, 20 и 50 мкг/мл не оказывает влияния на данный параметр, в то же время при концентрации 50 мкг/мл он незначительно замедляет скорость роста этих клеток, что видно по уменьшению числа больших колоний (256 и более клеток) и по увеличению числа колоний малого размера (классы 128-191 и 64-127 клеток) . Обогащение мембран "молодых" ТККХ 7-кетохолестерином полностью подавляет их способность образовывать колонии. Включение в мембраны этих же клеток только холестерина уменьшает их ЭК до 10%. Т.о. оба вещества сильно подавляют пролиферативную активность указанных клеток. Результаты свидетельствуют о том, что более полное представление о свойствах препаратов можно получить при комплексном исследовании, т.е. как на " молодых", так и на "стационарно старых" клетках.

Активность некоторых форм цитохрома Р-450 (0-деалкилаз) не зависит от "возраста" ТККХ и ЭДФЧ (ПРОД, ЭРОД), других (ЭКМД и МКМД) отсутствует, а одного фермента (БРОД) увеличивается с "возрастом" (ТККХ). Полученные результаты на наш взгляд имеют определенный интерес, потому, что во первых, на использованной нами линии ТККХ еще не производили измерение активности цитохрома Р-450. Во вторых, другие исследователи в экспериментах на ТККХ (хотя и других линий) не могли зафиксировать наличие активности цитохрома Р-450 без индукции (БоеЬшег, 1988; ^/ахтап et а1. , 1989). В третьих с помощью определенного субстрата может быть установлена активность соответствующих форм цитохрома Р-450.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Прохоров, Леонид Юрьевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арион В.Я. Т-активин и его иммунобиологические свойства // Дис...докт. биол. наук в форме научного доклада. - Москва, 1990.52 с.

2. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. - М.: Наука, 1975. -327 с.

3. Аксютина М.С., Липчина Л.П., Мамаев В.Б., Смирнов Л.Д., Сорокина A.B., Лебедева Т.В., Федотова И.И. Влияние антиоксидантов на пролиферацию диплоидных клеток человека в различные фазы роста культуры // Цитология.- 1988. - Т. 30. - N 12. - С. 1494-1498.

4. Бакулина Э.Д., Баранов B.C., Белоусов Л.В. и др. Объекты биологии развития. - М.: Наука, 1975.- 579 с.

5. Банников А.Г. (Ред.) Биология и промысел лося. - М.: Рос-сельхозизиздат, 1964.- 215 с.

6. Банников А.Г., Жирнов Л.В., Лебедева Л.С., Фандеев A.A. Биология сайгака. - М.: Изд. сельскохоз. лит-ры, журналов и плакатов, 1961.- 336 с.

7. Вермель Е.М. Исследования о клеточных размерах // Уч. зап. Моск. Гос. Пед. ин-та. - 1940.- Т. 25.- N 1.- С. 1-130.

8. Ворсанова С.Г. Стационарные клеточные популяции как модель старения // В сб.: Геронтология и гериатрия. 1977. Ежегодник.- Киев, 1977.- С. 118-123.

9. Гецадзе Х.А. Пролиферативная способность фибробластов кожи долгожителей in vitro // Сообщ. АН ГССР.- 1984.- Т. 115.- N 2.- С. 413-416.

10. Гринберг К.Н. Исследование цитогенетического действия некоторых метаболитов: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Москва, 1971.-

37 С.

11. Гусев М.В., Федоров В.Д. Изучение состояния морфологических дифференцированных клеток в развивающихся культурах сине-зеленых водорослей с помощью трифенил-тетразолий хлорида // Микробиология. - 1962. - Т. 31. - Вып. 3. - С. 478-481.

12. Дебова Г.А. Межиндивидуальная вариабельность частот спонтанных и химически индуцированных сестринских хроматидных обменов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Москва, 1984.- 24 с.

13. Дурнев А.Д., Серединин С.Б. Антиоксиданты как средства защиты генетического аппарата // Химико-фармацевтический журнал.-1990.- N 2.- С. 92-100.

14. Егоров Е.Е. Регуляция репликации в гибридах и цибридах не-делящихся дифференцированных и пролиферирующих клеток: Автореф. дис.... канд. биол. наук. - Москва, 1985.- 18 с.

15. Епифанова О.И., Терских В.В. Периоды покоя и активной пролиферации в жизненном цикле клетки // Журнал общей биологии.-1968.- Т. 29.- С. 392-402.

16. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме. М.: Наука, 1983.- 180 с.

17. Зотин А.И., Грудницкий В.А., Клевезаль В.А. (Ред.). Количественные аспекты роста организмов. - М.: Наука, 1975.- 291 с.

18. Иванов А.С., Захарова Т.е., Халилов Э.М. Перенос холестерина между мембранами липосом и эритроцитов // Биолог. мембраны.-1988.- Т. 5.- N 4.- С. 439-443.

19. Канунго М. Биохимия старения: Пер. с англ.- М.: Мир, 1982.295 с.

20. Капитанов А.Б. Микоплазма как объект для изучения клеточного старения // Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов.- Киев, 1986.- С. 167-176.

21. Капитанов А.Б., Аксенов М.Ю., Татищев О.С., Кольтовер В.К. Культура клеток Acholeplasma laidlawii как объект для изучения возрастных изменений биологических мембран // Докл. АН СССР.-1985.- Т. 281.-.N 1.- С. 186-189.

22. Комаристая В.П. Зависимость скорости роста культуры одноклеточных организмов после пересева от возраста исходной культуры //В сб. : м1жнародний симпоз1ум "Б1ологичн1 механ1зми старл.ння" (15-17 травня, 1996 р.). Тези доповл.дей. - Харк1в, 1996. - С. 75.

23. Корженевская Т.Г. Выживание и деструкция в темноте облигат-но фототрофной синезеленой водоросли Anabaena variabilis: Автореф. дис. канд. биол. наук.- Москва, 1975.- 23 с.

- 140 -

24. Корженевская Т.Г., Гусев М.В. Некоторые характеристики поведения сине-зеленой водоросли Anabaena variabilis в условиях темноты // Микробиология.- 1973.- Т. 42.- N 6.- С. 963-968.

25. Корчагин Н.В., Малиновский A.A., Анфалова Т.В. и др. Межвидовые корреляции у млекопитающих // Некоторые проблемы теории эволюции. Под ред. H.H. Иорданского, A.A. Малиновского. - М.: 2-й МОЛГМИ, 1973.- Т. 2.- С. 101-122.

26. Комфорт А. Биология старения: Пер. с англ.- М.: Мир, 1967.397 с.

27. Лильп И.Г. Влияние возраста и генотипа мышей на частоту сестринских хроматидных обменов в клетках костного мозга // Генетика.- 1984.- Т. 20.- N 2. С. 260-265.

28. Мамаев В.Б. Замедление старения антиоксидантами: медикобио-логические аспекты (препринт). - Черноголовка: Институт химической физики АН СССР, 1988.- 70 с.

29. Мауэрсбергер С., Матяшова Р.Н. Содержание цитохрома Р-450 в клетках дрожжей при росте на гексадекане // Микробиология.- 1980.Т. 49. - N 4.- С. 571-577.

30. Мина М.В., Клевезаль Г.А. Рост животных. - М.:Наука, 1976. - 292 с.

31. Мэрдли Дж. Модели популяций // Математическое моделирование. - М.: Мир, 1979. - С. 109-127.

32. Наджарян Е.Л., Мамаев В.Б. Применение дибунола как геропро-тектора // Итоги науки техники. Общие проблемы биологии.- М.: ВИНИТИ, 1986. Т. 5.- С. 110-162.

33. Обухова Л.К. Свободнорадикальные механизмы старения в биологической эволюции // Итоги науки техники. Общие проблемы биологии.- М.: ВИНИТИ, 1986. Т. 5.- С. 36-69.

34. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Молекулярные механизмы замедления старения антиоксидантами // Итоги науки и техники. Серия: общие проблемы биологии. - М.: ВИНИТИ, 1984.- С. 44-80.

35. Объекты биологии развития. - М.: Наука, 1975.- 580 с.

36. Оловников A.M. Доклады АН СССР. - 1971. - Т. 201. - N 6. -С. 1496-1499.

37. Оловников A.M. (Ред.). Сборник статей: Теломера, теломера-за, рак и старение // Биохимия. - 1997. - Т. 62.- N 11.

38. Петушкова H.A., Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н., Арчаков А.И. Изучение деалкилазной активности некоторых цитохромов Р-450 на модели "стационарного старения". // В сб.: Материалы международного симпозиума "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функ-

- 141 -

ций организма" (25-27 ноября 1996 г., Санкт-Петербург). - СПб: Наука, 1996. - С. 66.

39. Прохоров Л.Ю. Что "считают" стареющие в культуре клетки: время или число делений? // Доклады МОИП 1989-1990 г. Общая биология. Некоторые биофизические аспекты исследования живых систем. Депонированная рукопись N 2789 - В92. Дата депонирования 15.9.92.

- Москва, 1992.

40. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. Исследование механизмов старения с помощью оценки эффективности клонирования клеток in vitro. // В сб.: Использование различных методов в изучении биологических систем. - М.: Наука, 1988. - С. 93-96.

41. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. Косвенные методы оценки эффективности геропротекторов и геропромоторов. // В сб.: Доклады МОИП 1987 г. Общая биология. Биофизические и биохимические аспекты функционирования живых систем. - М.: Наука, 1989. - С. 86-89.

42. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. Сравнение "стационарного старения" нормальных и трансформированных клеток. // В сб.: Механизмы процесса старения. Материалы конференции (ноябрь 1988 г., Москва).

- М.: Наука, 1989. - С. 23-30.

43. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. Моделирование возрастных изменений цитохрома Р-450 в экспериментах на клеточных культурах. //В сб.:: II Нацл.ональний конгрес геронтолог1в i repiaTpiB Укра1ни (4-6 жовтня 1994 р., Ки1в). Частина II. - Ки1в, 1994. - С. 529.

44. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. О дополнительных аналогиях между периодами жизни организма и стадиями роста и "стационарного старения" клеточной культуры. // В сб.: Мл.жнародний симпоз1ум "Бл.оло-гичнл. механл.зми стар1ння" (15-17 травня 1996 р., Харкав). XapKiB, 1996. - С 112.

45. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. О некоторых корреляционных зависимостях между продолжительностью жизни млекопитающих и параметрами их роста. // В сб.: Материалы международного симпозиума "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма" (25-27 ноября 1996 г., Санкт-Петербург). - СПб: Наука, 1996. -С. 71.

46. Смирнов Л.Д., Шолина С.И., Круглякова К.Е., Дюмаев К.М. Пространственно-затрудненные 3-оксипиридины. Сообщение 2. Синтез и изучение антиокислительных свойств некоторых 2,6-диалкил-З-оксипи-ридинов // Известия АН СССР, отд. хим. н. - 1963. - N 5.- С. 890-893 .

47. Терехов С.М. Клональный анализ при изучении наследственной

- 142 -

паталогии: Автореф. дис...канд. биол. наук.- М.:АМН СССР, 1984.22 с.

48. Терехов С.М., Гецадзе Х.А., Гринберг К.Н. Индивидуальная изменчивость пролиферативного потенциала диплоидных фибробластов человека in vitro // Бюл. эксперим. биол. мед.- 1984.- Т. 47.- N 4.- С. 465-466.

49. Терских В.В. Регуляция размножения клеток в культуре: Автореф.... докт. биол. наук. - Москва, 1979.- 27 с.

50. Трошина A.C. Биология клетки в культуре. - Л.: Наука, 1984.- 279 с.

51. Ушаков В.Л., Гусев М.В., Хохлов А.Н. Имеет ли смысл изучать механизмы клеточного старения на сине-зеленых водорослях? Критический обзор. Часть 3 // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. -1992. - N 4. - С. 3-22.

52. Хохлов А.Н. Пролиферация и старение // Итоги науки и техники, сер. Общие проблемы физ.-хим. биол.- М.: ВИНИТИ, 1988.- Т. 9.-С. 5-174.

53. Хохлов А.Н., Прохоров Л.Ю., Захарова Т.е., Иванов A.C., Ха-лилов Э.М., Арчаков А.И. Влияние липосом, содержащих холестерин или 7-кетохолестерин, на способность культивируемых клеток к образованию колоний. // Бюл. эксп. биол. мед.. - 1988. - N 9. - С. 348-349.

54. Хохлов А.Н., Прохоров Л.Ю. Антиоксиданты и пролиферация культивируемых клеток. // В сб.: II Нац1ональний конгрес геронто-лог1в i repiaTpiB Украз.ни (4-6 жовтня 1994 р., Ки1в). Частина II. - Ки1в. - 1994. - С. 645.

55. Хохлов А.Н., Прохоров Л.Ю., Петушкова H.A., Арчаков А.И. Деалкилазная активность цитохромов Р-450 и "стационарное старение" культивируемых клеток. // В сб.: М1жнародний симпоз1ум "Б:1ологичн1 механ1зми старл.ння" (15-17 травня 1996 р., Харк1в). Тези допов1-дей. - XapKiB, 1996. - С. 139.

56. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Ушаков В.Л. Использование стационарных культур для изучения механизмов клеточного старения // В сб.: Первый съезд Белорусского общества геронтологов и гериатров. Тез. докл.- Минск, 1983.- С. 188-189.

57. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Наджарян Т.Л. Деградация ДНК в покоящихся культивируемых клетках китайского хомячка // Цитология.- 1984а.- Т. 26.- N 8. С. 965-968.

58. Хохлов А.Н., Ушаков В.Л., Капитанов А.Б., Наджарян Т.Л. Влияние геропротектора 2-этил-б-метил-З-оксипиридина на пролифера-

- 143 -

цию клеток Acholeplasma laidlawii // Докл. АН СССР.- 19846.- Т. 274.- N 4.- С. 930-933.

59. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Чеботарев А.Н. Изменения уровня сестринских хроматидных обменов в культивируемых клетках китайского хомячка при ограничении их пролиферации. // Цитология и генетика.- 1985.- Т. 19. - N 2. С. 90-92.

60. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Горин А.Ю. Упрочнение ДНК-белкового комплекса в процессе "стационарного старения" культивируемых клеток // Бюл. эксп. биол. мед.- 1986. - N 4. - С. 416-418.

61. Хохлов А.Н., Головина М.Э., Чиркова Е.Ю., Наджарян Т.Л. Анализ некоторых кинетических закономерностей роста культивируемых клеток. III. Влияние плотности посева, геропротектора-антиоксидан-та, "стационарного старения" // Цитология.- 1987.- Т. 29.- N 3.-С. 353-357.

62. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Чеботарев А.Н. Изменения уровня сестринских хроматидных обменов в культивируемых клетках китайского хомячка при ограничении их пролиферации. Дополнитеельные исследования // Цитология и генетика.- 1987.- Т. 21. - N 3. С. 187-190.

63. Чиркова Е.Ю. Использование стационараных культур клеток для изучения процесса старения и действия на него физических и химических факторов: Автореф. дис... канд. биол. наук. - Москва, 1987.- 22 с.

64. Чиркова Е.Ю., Головина М.Э., Наджарян Т.Л., Хохлов А.Н. Клеточно-кинетическая модель для изучения геропротекторов и героп-ромоторов // Докл. АН СССР. - 1984.- Т. 278.- N 6. - С. 1474-1476.

65. Федоров В.Д. О закономрности отмирания клеток в размножающихся культурах синезеленых водорослей Anabaena variabilis и Amorphonostoc punctiforme // Докл. АН СССР. Сер. Гидробиология. -1962. - Т. 144. - N 6. - С. 1380-1383.

66. Яровая Г.А. Биохимические основы действия алкоголя на организм - М. : Центр, ин-т усоверш. врачей, 1986. - 42 с.

67. Фрешни Р. (Ред.) Культура животных клеток. Методы. - М.: Мир, 1989.- С. 22-23.

68. Юрина Т.П. Изучение деструктивных процессов в суспензионных культурах клеток диоскореи и табака: Автореф. дис... канд. биол. наук. - Москва, 1984.- 23 с.

69. Absher P.M., Absher R.G. Clonal variation and aging of diploid fibroblasts (Cinematographic studies of cell pedigrees) // Exp. Cell Res.- 1976.- Vol. 103.- N 2.- P. 247-255.

70. Adler M.O.; Coronel С., Shelton E., Sigmiller O.E., Dewji

- 144 -

N.N. Increased gene expression of Alzheimer disease beta-amiloid precursor protein in senescent cultures fibroblasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.-Vol. 88.- N 1.- P. 16-20.

71. Adolphe M., Ronot X., Jaffray P., Hecquet C., Fontagne J., Lechat P. Effects, of donor's age on growth kinetics of rabbit articular chondrocytes in culture // Mech. Ageing and Dev.- 1983.-Vol. 23.- N 2.- P. 191-198.

72. Allison T., Cicchetti D.V. Sleep in mammals: Ecological and constitutional correlates // Science.- 1976.- Vol.194.- P.732-734.

73. Altman P.L., Dittmer D.S. (Ed.). Growth including reproduction and morphological development. - Washington: Federation of Amer. soc. for experimental, biology, cop., 1962.608 p.

74. Archakov A.I., Bachmanova G.I., Sondler M.K., Tutochkin I.Yu., Lisitsa A.V. Cytochrome P-450 database and its scientific application // Cytochrome P-450, Biochemistry and Biophysics. Ed. by A.I. Archakov and G.I. Bachmanova. - Moscow: INCO-Tint Stock Company, 1992.- P. 673-679.

75. Augenlicht L.H., Baserga R. Changes in the G4o Ostate of WI-38 fibroblasts at different times after confluence. // Exp. Cell Res.- 1974.- Vol. 89.- P. 255-262.

76. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S.E. Chiu C.-P. et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells // Science. - 1998. - Vol. 279. - P. 349 - 352.

77. Campisi J., Dimri G.P., Nehlin J.O., Testori A., Yoshimoto K. Coming of age in culture. // Exp. Gerontol.- 1996.- Vol. 31.-N 1/2. P. 7-12.

78. Chen H.W., Kandutsch A.A., Heiniger M.J. The role of cholesterol in malignancy // Progr. exp. Tumor. Res.- 1978.- Vol. 22.- P. 275-316.

79. Chou F.I., Tan S.T. Manganese (II) induces cell division and incriases in superoxide dismutase and catalase activities in an aging dienicoccal culture // J. Bacterid.- 1990.- Vol. 172.- N 4.- P. 2029-2935.

80. Cox D.C., Comai K., Goldstain A.L. Effects of cholesterol and 25-hydroxycholesterol on smooth muscle cell and endothelial cell growth // Lipids.- 1988.- Vol. 23.- N 2.- P. 85-88.

81. Cristofalo V.J., Parris N., Kritchevsky D. Enzyme activity during the growth and ageing of human cells in vitro // J. Cell. Physiol.- 1967.- Vol. 69.- P. 263-272.

- 145 -

82. Cristofalo V.J. Animal cell culture as a model system for the study of aging // Advances in Gerontological Research. Vol. 4. Ed. B.L. Strehler. - New York; London, Acad. Press, 1972. - P. 45-79.

83. Cristofalo V.O., Sharf B.B. Cellular senescence and DNA synthesis // Exp. Cell Res.- 1973.- Vol. 76.- P. 419-427.

84. Cudkowicz G., Upton A.C., Shearer G.M., Hughes W.L. Lymphocyte content and proliferative capacity of serially transplanted mouse bone marrow // Nature (London).- 1964.- Vol. 201.- P.165.

85. Daniel C.W., De Ohme K.B., Young O.T., Brair P.B., Faulkin L.O. The in vivo life-span of normal and preneoplastic mouse mammaly glands: a serial transplantation study // Proc. Nat. Acad. Sei. USA.- 1968.- Vol. 61.- P.53-60.

86. Dell'Oreo R.T. The use of arrested populations of human diploid fibroblasts for the study of senescence in vitro // Cell Impairment in Aging and Development. Eds V.O. Cristofalo, E. Holeckova. - New York - London: Plenum Press, 1975.- P. 41-49.

87. Dell'Oreo R.T., Mertens O.T., Kruse P.F. Doubl potential, calendar time, and donor age human diploid cells in culture // Exp. Cell. Res.- 1973.- Vol. 77.- P. 356-360.

88. Dell'Oreo R.T., Mertens O.T., Kruse P.F. Doubling potential calendar time, and donor age of human diploid cells in culture // Exp. Cell. Res.- 1974.- Vol. 84.- N 1-2.- P. 363-366.

89. Dell'Oreo R.T., McClung O.K., Oupe E.R., Lu X-T. Prohibition and the senescent phenotype // Exp. Gerontol.- 1996.-Vol. 31.- N 1/2.- P. 245-252.

90. Diatloff-Zito C., Masieira-Coelho A. Effect of growth arrest on the doubling potential of human fibroblasts in vitro: a possible influence of the donor // In vitro.- 1982.- Vol. 18.- N 7.- P. 606-610.

91. Doehmer 0., Dogra S, Freidberg T., Monier S., Adesnik M.,Glatt H., Oesch F. Stable expression of rat cytochrome P-450IIB1 cDNA in Chinese hamster cells (V79) and metabbolic activation of aflatoxin B1 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1988. Vol.- 85.- N 16. P. 5769 - 5773.

92. Epifanova 0.1., Terskikh V.V. On the resting periods in the cell life cycle // Cell, and Tissue Kinet.- 1969.- Vol.2.-P.75-93.

93. Evans C.H. Is the A(G0) state time - independent? // 0. Theor. Biol. - 1979a. - Vol. 79. - P. 259-262.

- 146 -

94. Evans C.H. On the aging of organisms and their cells // Med. Hypothesis.- 1979b.- Vol. 5.- P. 53-66.

95. Fukuda N., Nagasumi Y. Population dynamics of mitochondria. II. Turnover and ageing of rat liver mitochondria // 0. Theor. Biol.- 1976.- Vol. 58.- P. 131-142.

96. Gelfant S. Cycling - noncycling cell transitions in tissue aging, immunological surveillance, transformation, and tumor growth // Intern. Rev. Cytol.- 1981.- Vol. 70.- P. 1-25.

97. Gelfant S., Smith O.G.,Jr (Ed.). Ageing: noncycling cells an explanation // Science.- 1972.- Vol. 178.- N 4059.- P. 357-361.

98. Gonzales F.G., Song B.J., Hardwick J.P. Pregnenolone 16-carbonitrile-inducible P-450 gene family: Gene conversion and differential regulation // Mol. Cell. Biol.- 1986.- Vol. 6.- P. 2969-2979.

99. Good P. I., Smith J.R. Age distribution of human diploid fibroblasts. A stochastic model for in vitro aging // Biophys. 0. - 1974. - Vol. 14. - N 11. - P. 811-823.

100. Harvey P.H., Martin R.D., Clutton-Brock T.H. Life histories in comparative perspective // Primate societies. Ed. B.B. Smuts, T.T. Struhsaker. - Chicago: Chicago univ. press, 1987.- P. 181-196.

101. Hay R.J., Menzies R.A., Morgan H.P., Strehler B.L. The division potential of cells in continuous growth as compared to cells subcultivated after maintenance in stationary phase // Exp. Geront.- 1968.- Vol.- 3. P.35-44.

102. Hay R.J., Strehler B.L. The limited growth span of cell strains isolated from the chick embryo // Exp. Gerontol.- 1967.-Vol. 2.- P. 123-135.

103. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. // Exp. Cell Res.- 1965.-Vol. 37.- N 3.- P. 614-636.

104. Hayflick L. The cellular basis for biological aging // Handbook of the biology of aging. Eds C. Finch, L. Hayflick. - New York: Van Nostrand Reinhold Comp., 1977.- P. 159-186.

105. Hayflick L. Aging, longevity, and immortality in vitro // Exp. Gerontol.- 1992.- Vol. 27.- P. 363-368.

106. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. // Exp. Cell Res.- 1961.- Vol. 25.- N 3.- P. 585-621.

107. Hahn G.M., Stewart 3.R., Yang S.-J., Parker V. Chinese hamster cell monolayer cultures. I. Changes in cell dynamics and

- 147 -

modifications of the cell cycle with the period of growth. // Exp. Cell Res.- 1967.- Vol. 49.- P. 285-292.

108. Hochschild R. Effects of various additives on in vitro survival time of mouse macrophages // J. Gerontol.- 1973a.- Vol. 28.- N 4.- P. 447-449.

109. Hochschild R. Effects of various additives on in vitro survival time of human fibroblasts // 3. Gerontol.- 1973b.- Vol. 28.- N 4.- P. 450-451.

110. Inbar M., Shinitzky M. Increase of cholesterol level in the surface membrane of lymphoma cells and its inhibitory effect on ascites tumor development // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1974.- Vol.- 71. P.- 2128 2130.

111. Joannides S., Porke D.V. The cytochrome P-450I gene family of microsomal hemoprotein and their role in the metabolic activation of chemicals // Drug metab. Rev.- 1990.- Vol. 22.- P. 1-85.

112. Kajl K., Matsuo M. Doubling potential and calendar time of human - diploid cells - in vitro // Exp. Geront.- 1979.- Vol. 14.-N 6.- P. 329-334.

113. Kajl K., Matsuo M. Aging of chick - embryo fibroblasts in vitro // Exp. Geront.- 1980.- Vol. 15.- N 5.- P. 481-485.

114. Karatza C., Stein W.D., Shall S. Kinetics of in vitro ageing of mouse embryo fibroblasts // J. Cell Sci.- 1984.- Vol. 65.- Jan.- P. 163-175.

115. Karatza C., Shall S. The reproductive potential of normal mouse embryo fibroblasts during culture in vitro // a. Cell Sci.-1984.- Vol. 66.- Mar.- P. 401-409.

116. Kawashima Y., Suzuki S., Kozuka H. et al. Effect of prolonged administration of perfluorooctanoic acid on hepatic activities of enzymes which detoxify peroxide and xenobiotic in the rat // Toxicology.- 1994.- Vol. 93.- N 2-3.- P. 85-97.

117. Khokhlov A.N. Testing of geroprotectors and geropromotors with the cell kinetics model // Age.- 1991.- Vol.14.- N 4.- P. 139.

118. Khokhlov A.N. The cell kinetics model for determination of organism biological age and for geroprotectors or geropromotors studies // Biomarkers of Aging: Expression and Regulation. Proceeding (Ed. by F. Licastro and C.M. Caldarera).- CLUEB, Bologna, 1992.

119. Khokhlov A.N. Stationary cell cultures as a tool for

- 148 -

gerontological studies // Annals of the New York Academy of Sciences.- 1992.- Vol. 663. - P. 475-476.

120. Khoklov A.N. Evolutionary cytogerontology as a new branch of experimental gerontology // Age.- 1994. - Vol. 17. - N 4. - P. 159.

121. Khokhlov A. N . , Prokhorov L.Yu., Ivanov A.S., Archakov A.I. Effects of cholesterol- or 7-ketocholesterol-containing liposomes on colony-forming ability of cultured cells. // FEBS. - 1991. Vol. 290. - N 1/2 v- P. 171 - 172.

122. Khokhlov A.N., Prokhorov L.Yu., Cell colony-forming ability analysis and cytogerontological studies. // Age. - 1992. -Vol. 15. - N 4. - P. 128.

123. Khokhlov A.N., Akimov S.S., Prokhorov L.Yu. Antioxidants and cellular aging: further investigations. // In: Abstracts of 23rd Annual Meeting of American Aging Association. - Quebec, 1993. -P. 15.

124. Khokhlov A.N., Prokhorov L.Yu. Effects of some geroprotectors-antioxidants on cell proliferation. // Age. - 1994.

- 17. - N 4. - P. 161-162.

125. Kimura S-> Donavan 3.C., Nebert D.W. Expression of the mouse P-450 gene during differentiation without foreign chemical stimulations // J. Exp. Pathol.- 1987.- Vol. 3 .P. 61-74.

126. Kirkwood T.B.L., Holliday R. Commitment to senescence: a model for the finite and infinite growth of diploid and transformed human fibroblasts in culture // 0. Cell. Biol. - 1975.

- Vol. 53. - N 2. - P. 481-496.

127. Kruth H.S., Avigan J., Gamble W., Vaughan M. Effect of cell density on binding and uptake of low density lipoprotein by human fibroblasts // J. Cell. Biol. - 1979. - Vol. 83. - N 3. - P. 588-594.

128. Kress E.D., Cristofalo V.J. The cell cycle and thymidine incorporation during aging in vitro // J. Cell Biol.- 1976.-Vol. 70. - P. 133a.

129. Krohn P.L. Review lectures on senescence. II. Heterochronic transplantation in the study of ageing // Proc. Roy. Soc. Med. 1962. - Vol. 157. - P. 128-147.

130. Leakey J.E.A., Cunny H.C., Feuers R.J., Bazare (Jr) J., Webb P.J., Duffy P.H., Hart R.W. Effects of aging and caloric restriction on hepatic drug metabolizing enzymes in the Fischer 344 rat. The cytochrome P-450 dependent monooxygenase system //

- 149 -

Mech. Ageing and Dev.- 1989. - Vol. 48. - P. 145-155.

131. Leaky J.E.A., Bazare J.D., Harmon J.R., Feuers R.J., Duffy P.H., Hart R.W. Effects of long-term caloric restriction on hepatic drug-metabolizing enzyme activities in the Fischer 344 rat. Biological effects of dietary restriction // ILSI monographs. Ed. L.Fishbein. - Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, N.Y.; London; Paris; Tokyo; Hong Kong; Barselona, 1991.- P. 207-216.

132. Lowry O.H., Rosenbrough N . 0 . , Farr A.L., Randall R.G. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193.- P. 265-275.

133. Macieira-Coelho A. Lepuisement du potentiel de division de cellules fibroblastiques au cours de la vie in vitro // Collog. intern. Centre nat. rech. sci. - 1974. - Vol. 240. - P. 349-351.

134. McHale J.S., Montion M.L., McHail J.T. Limited culture life-span of human diploid cells as function of metabolic time instead of division potential // Exp. Geront. - 1971. - Vol. 6. -P. 89-93.

135. Martin G.M., Ogburn C.E., Wight T.N. Comparative rates of decline in the primary cloning efficiencies of smooth muscle cells from the aging thoracic aorta of two murine species of contrasting maximum life-span potentials // Amer. J. Pathol.- 1983.- Vol. 110.- N 2.- P. 236-245.

136. Matsumura T., Zerrudo Z., Hayflick L. J. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA synthesis and morphology// D. Gerontol. - 1979. - Vol. 34. - N 3. - P. 328-334.

137. Mayer R.T., Netter K.J., Heubel F., Hahnemann B., Buchheister A., Mayer G.K., Burke M.D. 7-alkoxyquinolines: new fluorescent substrates for cytochrome P-450 monooxygenases // // Biochem. Pharmac. - 1990. - Vol. 40. - N 7. - P. 1645-1655.

138. McManus M.E., Felton J.S., Knize M.G., Burgess W.M., Roberts-Thomson S., Pond S.M., Stupans T., Veronese M.E. Activation of the food derived mutagen 2-amino-2-methyl--6-phenylimidazo(4,5,6)pyridine by rabbit and human liver microsomes and purified forms of cytochrome P-450 // Carcinogenesis. - 1989. - Vol. 10. - P. 357-364.

139. Merz G.S.(Jr), Ross J.D. Clone size variation in the human diploid cell strain, WI-38 // J. Cell. Physiol. - 1973. - Vol. 82. - P. 75-80.

140. Michl 0., Svobodova D. RNA turnover and the growth potential of human cells in culture // Exp. Cell Res. - 1967.

Vol. 47. - P. 616-619.

141. Moloney S.Y., Fromson J.M., Bridga J.W. Cytochrome P-450 dependent deethylase activity in rat and hairless mous skin microsomes // Biochem. Pharmacol.- 1982.- Vol. 31.- P. 4011-4018.

142. Nakanishi Y., Dein R.A., Schneider E.L. Aging and sister chromatid exchange. V. The effect of post-embryonic development on mutagen-induced sister chromatid exchanges in mouse rat bone marrow cells // Cytogenet. Cell Genet.- 1980.- Vol. 27.- N 2/3.-P. 82-87.

143. Namkung M.J, Yang H.L., Hulla J.E., Tuchau M.R. On the substrate specificity of cytochrome P450IIIA1 // Mol. Pharmacol.-1980.- Vol. 34.- P. 628-637.

144. Omura T., Sato R. The carbon-monoxide binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for it's hemoprotein nature // J. Biol. Chem. - 1964.- Vol. 239. - P. 2370-2378.

145. Pashko L.L., Schwartz A.G. Inverse correlation between species life span and specific cytochrome P-448 content of cultured fibroblasts // J. Gerontology.- 1982.- Vol. 37.- N 1. -P. 38-41.

146. Petushkova N.A., Prokhorov L.Yu., Khokhlov A.N., Bachmanova G.I., Archakov A.I. Fluorescence assay of cytochrome P450-dependent monooxygenase activities in Human fibroblasts. 14th European workshop on drug metabolism. - Paris, 1994. - P. 254.

147. Ponten J., Stolt L. Proliferation control in cloned normal and malignant human cells // Exp. Cell Res. - 1980.- Vol. 129. - N 2.- P. 367-375.

148. Potten C.S., Hendry J.H. (Ed. by) Cell clones: manual of mammalian cell techniques. - Edinburgh etc.: Churchill Livingstone, 1985.- 235 p.

149. Prokhorov L.Yu., Petushkova N.A., Khokhlov A.N. Cytochrome P-450 and "stationary phase aging" of cultured cells. // Age. 1994 - Vol. 17. - N 4. - P. 162.

150. Quastler H. The analysis of cell population kinetics // In: Cell proliferation. Ed. by L.L. Lamerton, R.J.M. Fry. Oxford: Blackwell Sci. Publ. - 1963. - P. 18-36.

151. Read A.F., Harvey P.H. Life history differences among the eutherian radiations // J. Zool.- 1989.- Vol. 219.- P. 329-353.

152. Reiners J.J., Cantu A.R., Pavone A. Modulation of constitutive cytochrome P-450 expression in vivo and in vitro in murine keratinocytes as function of differentiation and

- 151 -

extracellular Ca2 + concentration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1990.- Vol. 87.- March.- P. 1825-1829.

153. Robbins E., Levine E., Eagle H. Morphologic changes accompanying senescence of cultured human diploid cells // J. Exp. Med.- 1970.- Vol. 131.- P. 1211-1222.

154. Rogiers V., Vanderberghe Y., Callaerts A. et al. Phase I and phase II xenobiotic biotransformation in cultures and co-cultures of adult rat hepatocytes // Biochem. Pharmac.- 1990.-Vol. 40.- N 8.- P. 1701-1706.

155. Ruckpaul K., Rein H., Blanck CJ. Regulationsmechanismen der endoplasmatischen zitochrom P-450-systems der leber // Biomedica Biochimica Acta.- 1985.- Vol. 44.- P. 351-381.

156. Ryan 3.M., Cristofalo V. Chromatin template activity during ageing in WI-38 cells // Exp. Cell. Res.- 1975.- Vol. 90.-P. 456-458.

157. Shakespeare V., Buchanan O.H. Increased degradation rates of protein in aging human fibroblasts and in cells treated with an amino acid analog ]'/ Exp. Cell Res.- 1976.- Vol. 100.- P. 1-8.

158. Shall S., Stein W.D. A mortalization theory for the control of cell proliferation and for the origin of immortal cell lines // J. Theor. Biol.- 1979.- Vol. 76.- N 2.- P. 219-231.

159. Schneider E.L., Gilman B. Sister chromatid exchanges and aging. IIII. The effect of donor age on mutagen-induced sister chromatid exchange in human diploid fibroblasts // Hum. Genet.-1979.- Vol. 46.- N 1. P. 57-63.

160. Siminovitch L., Till J.E., McCulloch E.A. Decline in colony-forming ability of marrow cells subjected to serial transplantation into irradiated mice // 3. Cell. Comp. Physiol. 1964.- Vol. 64.- P. 23-31.

161. Smith J.R., Pereira-Smith O.M., Good P.J. Colony size distribution as a measure of age in cultured human cells // Mech. Ageing and Dev.- 1977.- Vol. 6.- N 2.- P. 283-286.

162. Smith J.R., Pereira-Smith O.M., Schneider E.L. Colony size distributions as a measere of in vivo and in vitro aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- Vol. 75.- N 3.- P. 1353-1356.

163. Spector W.S., Phildd L. (Ed.). Handbook of Biological Data. Philadelphia - London: Saunders, cop., 1956.- 584 p.

164. Srivastava B.I.S. Changes in enzymic activity during cultivation of human cells in vitro // Exp. Cell Res.- 1973.- Vol. 80.- P. 305-312.

- 152 -

165. Tittelbach M., Rothe H.-G., Weide H. Nachweis eines CO-bindenden Hamoproteins in Candida guilliermondii, Stamm H17, nach Kultur auf n-Alkanen // Z. Allg. Mikrobiologie.- 1976.- Vol. 16.- N 2.- P. 155-156.

166. Twentyman P.R., Bleehen N.M. Changes in sencitivity to cytotoxic agents occuring during the life history of monolayer cultures of a mouse tumour cell line // Ibid.- 1975.- Vol. 31.- P. 417-423.

167. Walton J. The role of limited cell replicative capacity in pathological age change. A review // Mech. Ageing and Dev.- 1982.-Vol. 19.- N 3.- P. 217-244.

168. Wang K.M., Rose N.R., Bartholomew E.A. Changes of enzymic activities in human diploid cell line WI-38 at various passages // Exp. Cell Res.- 1970.- Vol. 61.- P. 357-364.

169. Waxman D.J., Lapenson D.P., Morrissey J.J., Park S.S., Gelboin H.V., Doehmer J., Oesch F. Androgen hydroxylation catalyzed by a cell line (SD1) that stably expresses rat hepatic cytochrome P-450 PB-4 (IIB1) // Biochem J.- 1989.- Vol. 260.- N 1.- P. 81-85.

170. Winne H.A., Mutch E., James O.F.W. et al. The effect of age on mono-oxygenase enzyme kinetics in rat liver microsomes // Age and Ageing.- 1987.- Vol. 16.- N 3.- P. 401-405.

171. Winne H.A., Mutch E., James O.F.W. et al. The effect of age upon the affinity of microsomal monooxygenase enzymes for substrate in human liver // Age and Ageing.- 1988.- Vol. 17.- P. 401-405.

172. Woodhouse K.W., Mutch E., Williams F.M. et al. The effect of age on pathways of drug methabolism in human liver // Age and Ageing.- 1984.- Vol. 13.- N 6.- P. 328-334.

173. Zs.-Nagy I. A membrane hypothesis of ageing // J. Theor. Biol.- 1978.- Vol. 75.- P. 189-195.

174. Zuber M.X., Simpson E.R., Waterman M.R. Expression of bovine 17 alpha-hydroxylase cytochrome P-450 cDNA in nonsteroidogenic (cos 1) cells // Science.- 1986.- Vol. 234. - N 4781.- P. 1258-1261.