Моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Пороховник, Лев Николаевич

• Пороховник, Лев Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пороховник, Лев Николаевич

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общее представление о рибосомном повторе в геноме человека

1.2. Количество и функциональное состояние копий генов рРНК человека

1.2.1 Число копий рДНК в индивидуальных геномах человека

1.2.2 Регуляция транскрипции рибосомных генов у эукариот

1.2.3 Функциональные состояния и факторы регуляции транскрипции рибосомных генов эукариот

1.3. Цитогенетический анализ ядрышкообразующих районов метафазных хромосом

1.3.1 Селективное окрашивание ядрышкообразующих районов метафазных хромосом и интерфазного ядрышка нитратом серебра

1.3.2 Цитогенетический метод определения числа активных рибосомных генов и его верификация методом микроспектрофотометрии

1.3.3 Цитофотометрическое определение размеров А^ОР

1.4. Количество активных копий генов рРНК и генетическая индивидуальность человека

1.4.1. Комбинаторика формирования и пределы варьирования индивидуальной копийности активных рибосомных генов человека

1.4.2. Репродуктивные потери у разных супружеских пар по признаку количества активных рибосомных генов в зиготах

1.4.3. Фенотипические проявления количества активных генов рРНК

1.5. Влияние копийности активных рибосомных генов человека на жизнеспособность клетки и организма

1.5.1. Гены рРНК при старении и при синдроме Дауна

1.5.2. Выживаемость и стрессоустойчивость в зависимости от.количества активных копий рибосомных генов в индивидуальном геноме

1.5.3 Эффект количества активных копий генов рРНК при мультифакториальных заболеваниях54

1.5.4 Модель взаимодействий «хищник-жертва» в биологии и медицине

1.6. Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Оформление полученных данных

2.2. Техническое описание программы управления базой данных размеров кластеров активных рибосомных генов (AgЯOP)

2.3. Отбор пациентов с ранним детским аутизмом

2.4. Цитогенетическое исследование размера AgЯOP и оценка общего количества активных рибосомных генов

2.5. Математический аппарат для статистической проверки гипотез и создания математических и вычислительных моделей

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Организация базы данных. Анализ точности метода визуальной оценки размеров AgЯOP

3.1.1 Содержание и функции базы данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека»

3.1.2. Надежность метода определения числа активных копий генов рРНК в отдельных ЯОР и в геноме индивида

3.1.3. Эмпирические популяционные частоты размеров А^ЯОР

3.2. Исследование стабильности полиморфизма размеров кластеров АкРГ у человека в ряду поколений

3.2.1. Пределы варьирования копийности АкРГ в индивидуальных геномах

3.2.2. Компьютерное моделирование условий стабильности полиморфизма размеров кластеров

АкРГ у человека в ряду поколений

3.2.3 Сравнение модельных и эмпирических данных о частотах «мутирования» размеров AgЯOP и о распределении зигот (индивидов) по числу «мутаций»

3.3. Зиготический стабилизирующий отбор по признаку копийности АкРГ на уровне семейной пары и популяции

3.3.1. Оценка среднепопуляционной величины зиготических потерь по признаку копийности

АкРГ

3.3.2. Сравнение зиготических потерь у супружеских пар с нормальной плодовитостью и с репродуктивными нарушениями неясной этиологии

3.3.3. Математическое моделирование и оценка влияния зиготических потерь по признаку числа копий АкРГ на плодовитость семейных пар

3.4. Копийность активных рибосомных генов при раннем детском аутизме и шизофрении ..103 3.4.1. Сравнение числа копий АкРГ в контрольной выборке, при шизофрении и при раннем

детском аутизме

3.4.2 Математическое моделирование динамики окислительного стресса в зависимости от количества копий активных генов рРНК

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - протоколы первичных данных цитогенетннеского

исследования

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 - структура СУБД

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 - анализ модели «хищник-жертва»

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3'ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 12970-13314) 5'ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 13314-42999) AgHOP - ЯОР хромосом, окрашенные азотнокислым серебром CV - коэффициент вариации IGS - межгенный спейсер

ITS1 - внутренний транскрибируемый спейсер (основания 5527-6623) ITS2 - внутренний транскрибируемый спейсер (основания 6779-7935) NoRC - ядрышковый ремоделирующий комплекс NTS - нетранскрибируемый спейсер

NuRD - комплекс ремоделирования и деацетилирования нуклеосом SD — среднеквадратическое отклонение SE - стандартная ошибка

UBF - фактор (транскрипции), связывающийся с рДНК перед промотором

А - активные (фракция рибосомных генов)

АД - атопический дерматит

АкРГ - активные рибосомные гены

АФК - активные формы кислорода

БД - база данных

БШ - больные шизофренией

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

М - молчащие (фракция рибосомных генов)

МГНЦ - Медико-генетический научный центр

МГС - межгенный спейсер

мРНК - матричная РНК

МТР - масса тела при рождении

МФЗ - мультифакториальное заболевание

НА - неактивные {фракция рибосомных генов)

нтмРНК - нетранслируемая малая РНК

НТС - нетранскрибируемый спейсер

ОС - окислительный стресс

ПА — потенциально активные (фракция рибосомных генов)

ПСБ - прочно связанные белки

ПФК - плотный фибриллярный компонент

РА - ревматоидный артрит

РАМН - Российская академия медицинских наук РДА - ранний детский аутизм РГ - рибосомные гены рДНК - рибосомная ДНК РНК -рибонуклеиновая кислота

РП - рибосомный повтор рРНК - рибосомная РНК СД - синдром Дауна

СУБД - система управления базой данных ТО - транскрибируемая область ФГА - фитогемагглютинин

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение

ФЦ - фибриллярные центры

ЯОР - ядрышкообразующие районы хромосом

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Рибосомы - цитоплазматические органеллы, осуществляющие синтез белков на матричных РНК. Основным компонентом рибосом являются рибосомные РНК (рРНК). Рибосомные гены (РГ), кодирующие рРНК, представлены в геноме человека множественными копиями. За один митотический цикл эукариотическая клетка продуцирует около 10 миллионов рибосом, а на рРНК приходится до 80% общего количества РНК в клетке.

Последние три десятилетия интенсивно изучаются молекулярные механизмы регуляции транскрипции РГ (см. обзоры Jacob S.T., 1995; Xie W. et al., 2012). При этом неоправданно мало внимания уделяется изучению биологической роли количества копий (копийности) РГ в геноме. В проекте «Геном человека» гены рРНК и вопросы их копийности в индивидуальных геномах не рассматривались. Это в значительной мере объясняется техническими трудностями определения копийности умеренно повторяющихся последовательностей в конкретном геноме. Кроме того, изучение копийности РГ затруднено наличием разных эпигенетических состояний активности этих генов (Santoro R., 2011; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

Вместе с тем, сотрудниками МГНЦ РАМН разработаны методы определения общего количества рибосомных повторов в индивидуальных геномах человека, и на больших выборках показано, что у разных индивидов этот признак варьирует в пределах от 250 до 670 копий на диплоидный геном (Вейко H.H., 2001; Вейко H.H. и др., 2003). Однако активна в отношении транскрипции и, следовательно, обеспечивает необходимое клетке количество рибосом только часть (около 30%) копий РГ (Вейко H.H., 2001; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

У человека кластеры тандемных повторов РГ разного размера формируют ядрышкообразующие районы (ЯОР) в коротких плечах пяти

пар акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). Уникальным свойством РГ является сохранение в метафазных хромосомах белков транскрипционного комплекса (UBF и РНК-полимераза I), обладающих в определенных условия селективной аргентофильностью (Roussel P. et al., 1996; Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994, Sirri V. et al., 2000). До настоящего времени единственным методом оценки общего количества активных копий РГ (АкРГ) в отдельных ЯОР и в индивидуальных геномах человека остается цитогенетический метод полуколичественной (ранговой) визуальной оценки (в условных единицах) размеров преципитатов серебра на 10 ЯОР метафазных хромосом (AgЯOP) после селективной окраски кластеров АкРГ нитратом серебра (Howell W.M., Black D.A., 1980). Сумма оценок 10 размеров AgЯOP служит мерой общего количества АкРГ в диплоидном геноме индивида (Ляпунова H.A. и др., 1988, 2001). В специальном исследовании было показано, что одной условной единице размера А§ЯОР соответствуют 8±1 копия рибосомного повтора (Вейко H.H., 2001).

С помощью этого метода в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН накоплен большой массив данных о количестве АкРГ в геномах индивидов разного пола и возраста, как практически здоровых индивидов, так и индивидов с разными формами наследственных и ненаследственных патологий. На основании наблюдаемых пределов варьирования признака высказано предположение о существовании стабилизирующего отбора. Выявлен внутрипопуляционный полиморфизм размеров AgЯOP, однако механизмы формирования и поддержания подобного полиморфизма неясны. Установлено, что размер AgЯOP, отражающий количество транскрипционно активных копий РГ в кластере, является стабильной и наследуемой характеристикой соответствующей хромосомы. Однако известно, что в кластерах тандемных повторов повышена вероятность неравного кроссинговера в профазе мейоза, приводящих к изменению числа повторов в кластере. Вопросы существования и частоты спонтанных «мутационных» изменений размеров кластеров АкРГ остаются

неизученными.

Ранее в ряде работ были продемонстрированы фенотипические проявления количества активных копий РГ человека в норме и патологии (Ляпунова H.A. и др., 2000), в том числе в раннем развитии (Воронина В.Н., 2001), при атопическом дерматите (Неудахин Е.В. и др., 2008), ревматоидном артрите (Шубаева Н.О., 2004; Вейко H.H. и др., 2005), при старении (Малиновская Е.М. и др., 2008) и др.

Одним из основополагающих факторов, определяющих способность клетки эффективно отвечать на стресс и выживать, является возможность быстрой активации белковых синтезов, что в свою очередь зависит от скорости синтеза рибосом de novo. Поскольку стадией, лимитирующей скорость биогенеза рибосом, является транскрипция генов рРНК (Larson D.E. et al., 1991; Sirri V. et al., 2008), естественно ожидать, что количество активных копий РГ в геноме влияет как на стрессоустойчивость здорового индивида, так и на развитие заболеваний. Это предположение было подтверждено в экспериментах по изучению преодоления окислительного стресса клетками в зависимости от количества АкРГ в их геномах (Вейко H.H. и др., 2005).

Патогенез мультифакториальных заболеваний (МФЗ) определяется аддитивным взаимодействием генетических и средовых факторов. Увеличение генетического груза и антропогенные изменения окружающей среды, многократно усилившие стрессорные средовые воздействия, приводят к наблюдаемому в последние десятилетия росту частоты МФЗ, в частности, аутоиммунных и нейродегенеративных. Так, частота раннего детского аутизма в США возросла десятикратно за два десятилетия (19882008 гг.), достигнув уровня одного случая на 150 детей (McCarthy М., Hendren R.L., 2009). Выработка персональной стратегии обследования, вакцинации, лечения пациента из группы риска по ряду МФЗ будет малоэффективна без учета количества активных копий РГ в геноме пациента.

Разработка персонифицированного подхода к здоровью, диагностике

заболеваний и лечению пациента в последнее время выходит на передний план основных направлений медицины. Первостепенная роль в успехе этого направления принадлежит генетической характеристике индивида, и обязательной составляющей этой характеристики должно стать определение количества АкРГ в геноме.

В этой связи возрастает практическая значимость метода цитогенетического анализа копийности АкРГ в индивидуальных геномах, появляется необходимость в верификации надежности метода и в определении связей между копийностью АкРГ и предрасположенностью к тому или иному МФЗ и прогнозом протекания заболевания. Все вышесказанное позволяет сформулировать цель и задачи диссертационного исследования.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в оценке надежности цитогенетического полуколичественного метода определения копийности активных рибосомных генов, в изучении стабильности и изменчивости количества рибосомных генов человека на уровне ЯОР, индивида и популяции, а также в анализе фенотипических проявлений копийности активных рибосомных генов в норме и патологии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1) Создание компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» на основе экспериментальных материалов, полученных в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН за 1988-2013 гг.;

2) Анализ надежности (точности и воспроизводимости) метода визуальной полуколичественной оценки размеров кластеров активных рибосомных генов на материале компьютерной Базы данных;

3) Исследование условий стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров активных рибосомных генов в ряду

поколений;

4) Оценка среднепопуляционной величины стабилизирующего зиготического отбора, направленного на поддержание копийности активных рибосомных генов в интервале, обеспечивающем жизнеспособность клетки и организма человека;

5) Определение величины зиготических потерь по признаку копийности активных рибосомных генов в выборках здоровых и страдающих репродуктивными нарушениями супружеских пар и оценка возможного вклада этих потерь в нарушения репродуктивной функции;

6) Изучение копийности активных рибосомных генов у детей с ранним детским аутизмом и анализ влияния данного признака на развитие окислительного стресса как фактора патогенеза детского аутизма.

Научная новизна

В настоящей диссертационной работе первые на обширном материале проведена верификация надежности цитогенетического метода оценки числа копий активных рибосомных генов в кластере на основании ранговой оценки размера А^ОР и показана удовлетворительная точность и воспроизводимость метода.

На большой выборке уточнены пределы копийности активных рибосомных генов, обеспечивающие жизнеспособность клетки и организма, и определена среднепопуляционная доля зигот (около 9-10%), подлежащих элиминации по признаку копийности АкРГ.

Впервые показано, что для поддержания стабильного полиморфизма частот размеров А^ОР, наблюдаемого в реальной панмиктической популяции большого размера, необходимо и достаточно двух факторов: гибель зигот, количество активных рибосомных генов в геноме которых выходит за пределы, обеспечивающие жизнеспособность клетки (<15 или >24 усл.ед.), и «мутирование» размеров кластеров активных рибосомных генов с определенной частотой (около 3,5x10"2 на кластер на поколение). Частота «мутирования» размеров кластеров активных рибосомных генов

впервые определена экспериментально на выборке семей (родители и ребенок).

Впервые получены экспериментальные подтверждения того, что высокая вероятность появления зигот с недостаточным или избыточным количеством активных копий рибосомных генов может проявляться в снижении плодовитости супружеской пары.

Общее количество активных копий рибосомных генов впервые определено в геномах детей с ранним детским аутизмом и расстройствами аутистического спектра, и обнаружена достоверно более низкая копийность АкРГ по сравнению с контрольной выборкой здоровых индивидов.

На основе биоматематической модели Лотки-Вольтерра «хищник-жертва» создана оригинальная математическая модель, впервые увязывающая окислительный стресс у пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, со скоростью ответного синтеза антиоксидантных ферментов, зависящего от уровня синтеза рибосом, а следовательно, и от копийности АкРГ.

Научно-практическая значимость

Создана компьютерная база данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека», объединившая и систематизировавшая экспериментальный материал, полученный в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН за 1988-2013 годы. База данных позволяет формировать выровненные по полу, возрасту и размеру контрольные выборки; анализировать и сравнивать количество АкРГ в выборках индивидов разных возрастных групп и с различными патологиями; формировать случайные выборки разного размера из протоколов с идентифицированными хромосомами для проведения имитационных скрещиваний.

Обоснована целесообразность нового критерия для обследования супружеских пар с нарушением репродуктивной функции: определение количества активных генов рРНК в каждом из 10 ЯОР обоих супругов с

последующим расчетом ожидаемых потерь зигот по причине наследования ими избыточного или недостаточного для нормальной жизнедеятельности количества активных рибосомных генов.

Создана прогностическая таблица «Ожидаемая задержка наступления планируемой беременности в зависимости от зиготических потерь по количеству активных рибосомных генов» для возможного использования в медико-генетическом консультировании. Определена верхняя граница величины зиготических потерь для репродуктивно здоровых супружеских пар (15%).

Предложен новый критерий дифференциальной диагностики раннего детского аутизма и ранней шизофрении: низкая копийность активных рибосомных генов свидетельствует скорее о наличии раннего детского аутизма, а высокая копийность - о наличии шизофрении. Результаты диссертационной работы позволяют обосновать эффективность антиоксидантной терапии у детей с низкой копийностью активных рибосомных генов.

В целом научно-практическая значимость работы заключается в обосновании нового критерия для индивидуального подхода к диагностике, профилактике и лечению широкого круга заболеваний как наследственной, так и ненаследственной природы, учитывающего количество активных копий РГ в геномной ДНК пациента.

Апробация работы

Материалы исследования докладывались на V Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), II Съезде Общества клеточной биологии (С.-Петербург, 2007), IV Съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), V Конгрессе Всемирной Ассоциации Репродуктивной Медицины (WARM) (Москва, 2010) и на II Российском конгрессе с международным участием

«Молекулярные основы клинической медицины. Возможное и реальное» (С.-Петербург, 2012). 10 июня 2013 года успешно прошла апробация данной диссертационной работы в ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, глава в зарубежной монографии.

Основные положения, выдвигаемые на защиту

1. Воспроизводимость измерений размеров как отдельных AgЯOP, так и общего размера 10 А^ОР на метафазных хромосомах дает основания использовать цитогенетический метод ранговой оценки размеров А§^ЯОР для сравнения индивидов и групп индивидов по признаку копийности активных рибосомных генов в их геномах.

2. Достаточным условием стационарности частот размеров А§ДОР в панмиктической популяции человека является сочетание стабилизирующего отбора, поддерживающего копийность активных РГ в пределах от 120 до 190 копий, и определенного уровня спонтанного «мутирования» ЯОР. При этом предсказанная в модельном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров активных рибосомных генов в результате неравного кроссинговера находится в доверительном интервале эмпирической частоты «мутирования», а распределение зигот по числу возникших мутаций соответствует теоретически ожидаемому биномиальному закону.

3. В результате стабилизирующего отбора по количеству активных РГ элиминации подлежат 9-10% всех зигот в популяции, причем доля элиминируемых зигот является специфической характеристикой каждой супружеской пары и может варьировать в пределах от 0 до 45%. Одним из условий репродуктивного здоровья пары является небольшая величина зиготических потерь по данному признаку.

4. Динамика окислительного стресса в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень окислительного стресса обратно пропорционален копийности активных рибосомных генов в геноме клетки. Поскольку в геномах детей с ранним детским аутизмом количество транскрипционно активных копий генов рРНК достоверно ниже среднего значения как в контрольной выборке, так и в выборке больных шизофренией, можно предполагать более важную роль окислительного стресса в патогенезе детского аутизма, чем шизофрении, и обосновать эффективность антиоксидантной терапии в лечении детского аутизма, но не шизофрении.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Пороховник, Лев Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Цитогенетический метод ранговой . оценки размеров А^ОР обеспечивает достаточную воспроизводимость результатов (с коэффициентом вариации СУ<6%) и поэтому может использоваться для сравнения индивидов и групп индивидов по признаку копийности активных рибосомных генов (АкРГ) в их геномах.

2. Достаточным условием стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров АкРГ в вычислительном эксперименте оказалось сочетание стабилизирующего отбора по общей копийности АкРГ индивида, отсеивающего зиготы, несущие менее 120 или более 190 копий, и вероятности спонтанного «мутирования» (изменение размера кластера АкРГ) на уровне 3-4% на ЯОР на поколение.

3. Предсказанная в вычислительном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров активных рибосомных генов в результате неравного кроссинговера соответствует эмпирической частоте «мутирования», которая лежит в доверительном интервале Д.И.95о/о=(3,56±1,57)х10-2

4. Величина стабилизирующего отбора по количеству копий АкРГ, предсказанная в модельном эксперименте и подтвержденная на эмпирическом материале, составляет в среднем по популяции около 9-10% зигот. При этом величина зиготических потерь является специфической характеристикой каждой супружеской пары, которая у разных пар находится в интервале от 0 до 45%. У репродуктивно нормальных пар зиготические потери по данному признаку не превышают 15%, более высокие потери могут повлечь задержку планируемой беременности на полтора года и более.

5. У детей с ранним детским аутизмом (РДА) количество АкРГ (17,8±0,25 условных единиц) достоверно ниже среднего значения как в контрольной выборке (19,0±0,23 усл.ед., р<0,01), так и в выборке больных шизофренией (21,1±0,22 усл.ед., р<0,001).

6. Динамика окислительного стресса (ОС) в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень ОС обратно пропорционален копийности АкРГ в геноме клетки. Это позволяет объяснить противоречивость опубликованных данных о показателях ОС и антиоксидантого статуса клетки, а также об эффективности антиоксидантой терапии у пациентов с РДА и шизофренией.

1.6. Заключение

Анализ литературы показал, что изучению рибосомных генов (РГ) в разных группах организмов уделяется брлыиое внимание. Хорошо известно, что РГ в любом геноме, от бактерий до человека, представлены множественными копиями, причем количества копий на порядки различаются в разных группах организмов. Последние три десятилетия интенсивно изучаются молекулярные механизмы регуляции транскрипции РГ, в основном на низших эукариотах и культурах клеток высших растений и животных. Обычно полученные данные затем автоматически (что не всегда обоснованно) переносятся на человека. Биологической роли копийности РГ уделяется недостаточное внимание. В проекте «Геном человека» РГ и вопросы их копийности в индивидуальных геномах не рассматривались. Это в значительной мере объясняется техническими трудностями определения копийности умеренно повторяющихся последовательностей в конкретном геноме. Кроме того, изучение эффектов копийности РГ затруднено наличием разных эпигенетических состояний их активности. Помимо различий общего чисда копий РГ, имеет место индивидуальное варьирование размеров фракции активных копий РГ, способных к транскрипции. До настоящего времени единственным методом оценки общего количества активных РГ (АкРГ) в индивидуальных геномах человека остается цитогенетический метод полуколичественной (ранговой) визуальной оценки размеров преципитатов серебра на кластерах АкРГ на препаратах метафазных хромосом.

С помощью этого метода в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН накоплен большой массив данных о количестве активных РГ в геномах индивидов разного пола и возраста, как практически здоровых, так и страдающих разными формами наследственных и ненаследственных патологий. Убедительно показаны фенотипические проявления количества активных копий РГ человека в норме и при ряде мультифакториальных заболеваний. Эти результаты особенно актуальны в свете большого внимания, уделяемого в последнее время разработке принципов персонифицированной медицины, девиз которой: «Лечить не болезнь, а пациента». Такой подход необходим для тестирования на предрасположенность, профилактики, ранней диагностики и лечения мультифакториальных заболеваний (МФЗ), развитие которых определяется аддитивным взаимодействием генетических (набор аллелей определенных групп генов) и средовых факторов. Увеличение генетического груза и техногенные изменения окружающей среды, многократно усилившие стрессорные средовые воздействия, приводят к наблюдаемому в последние десятилетия росту частоты МФЗ, в частности, нейродегенеративных, особенно в раннем детском возрасте. Выработка персональной стратегии лечения, вакцинации, обследования ребенка из группы риска по МФЗ невозможна без определения количества активных копий РГ в геноме ребенка. В этой связи возрастает практическая значимость метода цитогенетического анализа копийности АкРГ в индивидуальных геномах, появляется необходимость в верификации метода и в определении соотношений между копийностью АкРГ и предрасположенностью к тому или иному МФЗ и прогнозом протекания заболевания.

Исходя из всего вышесказанного, мы в настоящей работе стремились к тому, чтобы на систематизированном материале, полученном верифицированным цитогенетическим методом определения размеров кластеров активных РГ, изучить стабильность и изменчивость комплекса рибосомных генов человека на уровне индивида, супружеской пары и популяции, а также фенотипические эффекты геномной дозы (копийности) активных РГ в норме и при мультифакториальных заболеваниях. Это можно сделать только путем анализа обширного массива данных, что в свою очередь требует применения специальных программных средств и числовых методов, таких как проверка статистических гипотез, создание и анализ вычислительных и математических моделей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Оформление полученных данных

Данные исследования размеров А§^ЮР индивида заносятся в бумажные протоколы исследований с указанием номера и шифра протокола, даты исследования и сотрудника, проводившего исследование. Протокол имеет вид таблицы из 11 (или 12 - для индивидов с синдромом Дауна) колонок и 21 строки. В ячейки таблиц вносят целочисленные оценки размеров А§ЯОР в условных единицах. Каждой строке, кроме последней, соответствует одна метафазная пластинка (то есть, клетка), а каждой колонке, кроме последней, соответствует одна хромосома. В последнюю колонку вносят суммы размеров А£ЯОР для каждой метафазной пластинки (суммы по строкам), а в последней строке записываются усредненные оценки для каждой хромосомы (средние по колонкам). Крайняя правая ячейка в последней строке содержит сумму усредненных оценок, являющуюся оценкой общего количества активных РГ в геноме индивида.

В зависимости от того, была ли проведена идентификация хромосом, колонки с размерами А§^ЯОР подразделяются: а) без идентификации хромосом - на группы Б (колонки 1-6) и в (колонки 7-10). В пределах каждой группы оценки размеров записываются в порядке уменьшения слева направо, от большего к меньшему; б) с идентификацией хромосом - на пары хромосом 13, 14, 15, 21 и 22, по две колонки, соответствующие двум гомологам, в каждой паре. В пределах каждой пары гомологи записываются в порядке уменьшения, сначала больший, потом меньший.

Для пациентов с синдромом Дауна, в кариотипе которых присутствует одна дополнительная акроцентрическая хромосома (номер 21), предусмотрены особые формы протоколов, содержащие на одну колонку больше. В протоколах без идентификации хромосом в группе в пять колонок (7-11) вместо четырех, а в протоколах с идентификацией хромосом для 21-й хромосомы предусмотрены не два, а три гомолога (три колонки).

Примеры протоколов приведены в Приложении 1.

2.2. Техническое описание программы управления базой данных размеров кластеров активных рибосомных генов (AgЯOP)

Программные средства, использованные при реализации программы: программная среда Borland Delphi 7 язык программирования Object Pascal база данных реализована средствами системы управления базами данных (СУБД) Microsoft Access 2003

Структура базы данных в виде списка переменных и ключевых полей приведена в Приложении 2.

2.3. Отбор пациентов с ранним детским аутизмом

Образцы крови анонимных больных ранним детским аутизмом (п = 51) поступали из Федерального государственного бюджетного учреждения (ФГБУ) «Московский НИИ психиатрии» Минздравсоцразвития Российской Федерации и ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН (НЦПЗ РАМН).

В исследование вошли дети с расстройствами аутистического спектра, соответствующие критериям диагностики раннего детского аутизма (РДА) Международной классификации болезней (МКБ-10) и Американского общества психиатров (DSM-IV-TR).

Отбор больных проводился в детских психиатрических отделениях с использованием клинико-психопатологического метода, включавшего наблюдение за ребенком в различных ситуациях с психопатологической оценкой поведения, эмоциональных и когнитивных проявлений, особенностей социального функционирования, дополненных материалами медицинской документации (карты амбулаторных исследований, предоставляемые родителями). Проводили изучение наследственных факторов, раннего анамнеза пациентов, учитывали особенности течения беременности и родов у матери, сведения о перенесенных ею заболеваниях. Первичную оценку состояния производили также с помощью шкалы рейтинга детского аутизма (Childhood Autism Raiting Scale - CARS, Schopler E. et al, 1980).

Возраст пациентов на момент исследования колебался от 2 лет 8 месяцев до 13 лет при соотношении мальчиков и девочек 3.5 : 1. В исследование не включали детей, у которых аутистические проявления t были связаны с другими заболеваниями, такими, как органические поражения центральной нервной системы, эпилепсии, врожденные дефекты обмена веществ и др. Для исключения такого рода заболеваний наряду с клиническим анализом использовали метод сравнительного ЭЭГ-картирования. i

Получены информированные согласия законных представителей пациентов на проведение вышеописанных исследований.

2.4. Цитогенетическое исследование размера AgHOP и оценка общего количества активных рибосомных генов

ФГА-стимулированные лимфоциты периферической крови больных детским аутизмом культивировали стандартным методом. Фиксацию клеток и приготовление препаратов метафазных хромосом также проводили по стандартным методам. Селективную окраску препаратов нитратом серебра проводили по методу W.M. Howell и D.A. Black (1980) в нашей модификации (Ляпунова H.A. и др, 1998; Ляпунова H.A. и др, 2001). Определение числа активных копий РГ проводили путем суммирования усредненных по 20 метафазным пластинкам ранговых оценок размера преципитата металлического серебра над каждым из десяти ЯОР в условных единицах от 0 до 4.

2.5. Математический аппарат для статистической проверки гипотез и создания математических и вычислительных моделей

Программы имитационных скрещиваний и моделирования динамики популяционных частот размеров Ag^IOP в ряду поколений написаны автором на языке программирования SmallBasic версии 0.9.5.2.

Все статистические параметры выборок вычисляли при помощи стандартных встроенных функцией Microsoft Excel 2007. Сравнение групп проводили с применением методов непараметрической статистики для несвязанных выборок (Холлендер М., Вульф Д., 1983) или по критерию Стьюдента (для нормально распределенных величин) путем расчетов по введенным вручную формулам в Microsoft Excel 2007. Решение о наличии или отсутствии мутационного изменения размера (числа копий) кластера активных рибосомных генов при сравнении протоколов цитогенетических визуальных (ранговых) оценок размеров А§ЯОР принимали с помощью вычисления критерия хи-квадрат или по точному критерию Фишера. Вычисление точной вероятности по Фишеру проводили с помощью веб-приложения http://www.langsrud.com/fisher.htm. Моделирование и вычисления вероятностей проводили на основе закона геометрического распределения (Гмурман В.Е., 2005; Холлендер М., Вульф Д., 1983). Уровень значимости для отклонения нулевой гипотезы выбирали как р<0,01 или р<0,05 в зависимости от рода решаемой задачи.

Для математического моделирования внутриклеточной динамики АФК и антиоксидантных ферментов применяли аппарат обыкновенных дифференциальных уравнений. Использованные математические средства приведены в «Справочнике по математике» И.Н. Бронштейна и К.А. Семендяева (1981). Численное изучение модели проводили при помощи некоммерческого пакета программ ODE (Московский энергетический институт). Подробный математический анализ поведения модели динамики окислительного стресса и антиоксидантных ферментов изложен в Приложении 3.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Организация базы данных. Анализ точности метода визуальной оценки размеров А$»ЯОР

3.1.1 Содержание и функции базы данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека»

В базу данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» (далее именуемая «База данных») внесены все протоколы исследований (см. раздел «Материалы и методы» и Приложение 1), проведенных в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН в 1988-2013 гг.

Кроме того, для каждого внесенного в Базу данных индивида, как правило, вводятся следующие данные (см. Приложение 2):

• шифр донора, содержащий сведения о принадлежности к той или иной тематической выборке;

• пол;

• возраст (абсолютный в годах или условный в градациях от 0 -пренатальный период до 5 - старческий возраст);

• диагноз;

• дата исследования;

• сотрудник, проведший исследование;

• статус в семье (входит ли данный индивид в семью и в качестве кого, родителя или ребенка);

• статус идентификации хромосом (проводилась или не проводилась)

Постоянно пополняемая сотрудниками Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ База данных содержит сведения о количестве активных генов рРНК в геномах 1191 индивида, часть из которых обследована повторно несколько (от двух до восьми) раз. Сведения об индивидах, вошедших в базу данных, приведены в табл. 4.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пороховник, Лев Николаевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ахмеров P.P., Садовский Б.Н. Дифференциальные уравнения в биологии, химии, медицине // Очерки по теории обыкновенных дифференциальных уравнений. - [Электронный ресурс]. URL: http://wvm.ict.nsc.ni/ru/textbooks/akhmerov/ode/index.html

2. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. Соросовский образовательный журн. 2001. Т. 7. № 4. С. 21-28.

3. Боткина A.C. Клинико-метаболические и генетические аспекты атопического дерматита у детей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва. 2003. 162 С.

4. Боткина A.C., Еголина H.A., Мандрон И.А., Косякова Н.В., Неудахин Е.В., Ляпунова H.A. Низкая доза активных рибосомных генов у высоковесных детей может быть фактором повышенного риска заболевания атопическим дерматитом. // «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-ий съезд ВОГиС). Т. 2. М. 2004. С. 82.

5. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике. М.: Наука. 1981.718 С.

6. Вейко H.H. Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва. 2001. 258 С.

7. Вейко H.H., Ляпунова H.A. Характеристика четырех фракций рибосомного повтора генома человека и их организация в ядрах лимфоцитов. Цитология. 2005. Т. 47. №9. С. 800а-801.

8. Вейко H.H., Карпухин А.Л., Салимов А.Г., Немцова М.В., Спитковский Д.М. Биотехнология. 1989. Т. 5. С. 414-419.

9. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Богуш Л.В., Цв'еткова Т.Г., Громова Э.В. Определение количества рибосомных генов в индивидуальных геномах человека. Сравнение результатов молекулярного и цитогенетического анализа. Молекулярная биология. 1996. Т.30. № 5. С. 1076-1085.

10. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Богуш А.И., Спитковский Д.М. Рибосомные гены человека содержат в транскрибируемой области белки, прочно связанные с ДНК. Молекулярная биология. 1998. Т.32. № 4. С.629-634.

11. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Ковалев Л.И., Ершова Е.С., Спитковский Д.М. Белки, прочно связанные с транскрибируемым участком рДНК в хроматине выделенных ядер, нуклеоиде и нуклеопротеиде лимфоцитов человека. Выделение и частичная характеристика белков-кандидатов. Молекулярная биология. 2000. Т. 34. №2. С.285-291.

12. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Косякова Н.В., Спитковский Д.М. Элементы структурной организации транскрибируемой области рибосомного повтора (рДНК) в лимфоцитах периферической крови челрвека. Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 1. С.62-64.

13. Вейко H.H., Еголина H.A., Радзивил Г.Г., Нурбаев С.Д., Косякова Н.В., Шубаева Н.О., Ляпунова H.A. Количественное определение повторяющихся

последовательностей в геномной ДНК человека. Обнаружение увеличенного количества рибосомных повторов в геномах больных шизофренией (результаты молекулярного и цитогенетического анализа). Молекул, биология. 2003. Т. 37. № 3. С. 409-419.

14. Вейко H.H., Шубаева Н.О., Цветкова Т.Г., Мандрон И.А., Малиновская Т.Н., Сперанский А.М., Ляпунова H.A. Особенности количественных характеристик комплекса рибосомных генов у пациентов с тяжелыми формами ревматоидного артрита. Медицинская генетика. 2005а. Т. 4. № 4. С. 166-167.

15. Вейко H.H., Терехов С.М., Шубаева Н.О., Смирнова Т.Д., Иванова С.М., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Спитковский Д.М., Ляпунова H.A. «Ранний» и «поздний» ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров и больных ревматоидным артритом на окислительный стресс. Взаимосвязь скорости гибели клеток и количества активных копий рибосомных генов в геноме. Молекуляр. биология. 20056. Т. 39. № 2. С. 264-275.

16. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука. 1972. 252 С.

17. Вольтерра В. Математическая теория борьбы за существование. М.: Наука. 1976. 286 с.

18. Воронина В.Н. Фенотипическое проявление дозы активных рибосомных генов в развитии детей первого года жизни. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 2001. 149 С.

19. Воронина В.Н., Пороховник Л.Н., Иванов В.П., Ляпунова H.A. Демонстрация фенотипического проявления геномной дозы рибосомных генов в физическом развитии детей в первый год жизни: формирование зубного аппарата и гармоничность развития. III ЗЧзд медичних генетиюв Украши з м1ждународною участю. Льв1в. 2002. С.37.

20. Воскобойник Н.И., Ляпунова H.A., Викторов В.В. Взаимосвязь функциональной активности ядрышкообразующих районов хромосом с репродуктивной патологией человека. Генетика. 1993. Т. 29. № 3. С. 508-513.

21. Гареева А.Э., Зайнуллина А.Г., Закиров Д.Ф., Казанцева A.B., Хуснутдинова Э.К. Репликативное исследование полиморфных вариантов генов PRSS16, PSORS1C1, АРВА2, NRXN1, CHRNA7, ZNF804A, ассоциированных с шизофренией, по данным полногеномных исследований в популяциях Волго-Уральского региона России. Медицинская генетика. 2012. № 1. С. 22-27.

22. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. Учеб. пособие для вузов. 11-е изд. М.: Высшая школа. 2005. 479 С.

23. Гутман Б., Гриффите Э., Сузуки Д., Куллис Т. Генетика. Пер. с англ. — М.: ФАИР-ПРЕСС, 2004. —448 с: ил.

24. Давудов А.З., Бенюш В.А., Захаров А.Ф., Еголина H.A. Близнецовый анализ наследуемости активности ядрышкообразующих районов хромосом у человека//Полиморфизм хромосом у человека. М., 1981. С. 140-153.

25. Джонес В.Р. Бесплодный брак: Пер. с англ. Под ред. Р.Дж. Пепперелла. М. 1986. С. 171-198.

26. Еголина H.A., Давудов А.З., Бенюш В.А., Захаров А.Ф. Генетическая детерминация активности ядрышкообразующих районов хромосом человека. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1981. Т. 91. № 3. С. 350-353.

27. Еголина H.A., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Пороховник JI.H., Местергази Г.М., Ляпунова H.A. Изменяется ли геномная доза рибосомных генов у человека при старении? // «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-ий съезд ВОГиС). Т. 2. Москва. 2004. С. 87.

28. Зенит-Журавлева Е.Г., Полковниченко Е.М., Лушникова A.A., Трещалина Е.М., Букаева И.А., Райхлин Н.Т. Нуклеофозмин и нуклеолин: кодирующие гены и экспрессия в различных тканях животных и человека. Молекулярная медицина. 2012. №4. С. 24-31

29. Иванова С.М., Вейко H.H., Терехов С.М., Смирнова Т.Д., Цветкова Т.Г., Спитковский Д.М., Сперанский А.И., Ляпунова H.A. Ответ на окислительный стресс фибробластов, полученных от больных ревматоидным артритом с разным количеством активных рибосомных генов в геномной ДНК. // «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-й съезд ВОГиС), т. 2. Москва, 2004. С 286.

30. Изместьева О.В., Галактионова М.Ю., Манашев Г.Г. Факторы, влияющие на сроки прорезывания временных зубов у детей. Забайкальский медицинский вестник. 2012. № 1. С. 117-123.

31. Кравец И.А. Цитогенетические подходы к изучению межхромосомного и межиндивидуального полиморфизма ядрышкообразующих районов хромосом человека. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Москва. 1994. 21 с.

32. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биологич. спец. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. школа. 1980. 293 С.

33. Ляпунова H.A., Вейко H.H. Рибосомные гены в геноме человека: Структурно-функциональная организация, фенотйпическое проявление и связь с патологией. // «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-ий съезд ВОГиС). Т. 2. Москва. 2004. С. 12.

34. Ляпунова H.A., Вейко H.H. Рибосомные гены в геноме человека: идентификация четырех фракций, их организация в ядрышке и метафазных хромосомах. Генетика. 2010. Т. 46. № 9. С. 1205-1209.

35. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Мхитарова Е.В., Викторов В.В. Межиндивидуальные и межклеточные различия суммарной активности рибосомных генов, выявляемые Ag-окраской ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом человека. Генетика. 1988. Т. 24. № 7. С. 1282-1288.

36. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Викторов В.В. Закономерности наследования полиморфных вариантов ядрышкообразующих хромосом человека // Хромосомы человека в норме и патологии. М.: Наука, 1989. С. 12-20.

37. Ляпунова H.A., Кравец-Мандрон И.А., Цветкова Т.Г. Цитогенетика ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом человека: выделение четырех морфофункциональных вариантов ЯОР, их межиндивидуальное и межхромосомное распределение. Генетика. 1998. Т. 34. № 9. С. 1298-1306.

38. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Вейко H.H., Кравец-Мандрон И.А., Громова Э.В., Косякова Н.В., Викторов В.В., Малиновская Т.Н. Рибосомные гены в геноме человека: вклад в генетическую индивидуальность и фенотипическое проявление дозы гена. Вестник РАМН. 2000. № 5. С. 19-23.

39. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Вейко H.H., Кравец-Мандрон И.А., Громова Э.В., Мхитарова Е.В., Косякова Н.В., Викторов В.В. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа. Биологические мембраны. 2001. Т. 18. №3. С. 189-199.

40. Малиновская Е.М., Смирнова Т.Д., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Мандрон И.А., Мхитарова Е.В., Костюк C.B., Терехов С.М., Местергази Г.М., Вейко H.H., Ляпунова H.A. Изменения комплекса рибосомных генов человека при старении. Медицинская генетика. 2008. Т.7. № 2. С. 10-16.

41. Марчук Г.И. Математические модели в иммунологии. М.: Наука. 1980. 240 С.

42. Моруков Б.В., Ляпунова H.A., Цветкова Т.Г., Вейко H.H., Ершова Е.С., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Мандрон И.А., Кобякова Н.В., Маркин A.A. Изучение геномной дозы активных рибосомных генов и ряда количественных показателей внеклеточной ДНК у испытателей в эксперименте с 7-суточной иммерсией. Авиакосмическая и экологическая медицина, 2008. Т. 42. № 5. С. 60-64.

43. Назаренко С.А., Карташева О.Г. Сравнительный анализ активности ядрышкообразующих районов хромосом у спонтанных и медицинских абортусов. Генетика. 1991. Т. 27. № 6. С.1095-1103.

44. Неудахин Е.В. Новые теоретические и практические аспекты хронической стрессовой реакции у детей. // Педиатрия: проблемы и перспективы. - Сборник к 70-летию кафедры детских болезней № 2 РГМУ. М. 2001. С. 77

45. Неудахин Е.В., Короткий Н.Г., Ляпунова H.A., Еголина H.A. Косякова Н.В., Боткина A.C., Кравец И.А. Значение геномной дозы активных рибосомных генов для оценки прогноза и степени тяжести атопического дерматита. Детская больница. 2008. № 3. С. 31-35.

46. Пороховник Л.Н., Викторов В.В., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Ляпунова H.A. Полиморфизм размеров кластеров активных рибосомных генов у человека и моделирование условий его стабильности в ряду поколений. Генетика. 2011, Т.

47. № 12. С. 1666-1675.

47. Прозоров A.A. Особенности расположения генов с различными функциями и некоторых других нуклеотидных последовательностей на бактериальной хромосоме. Микробиология. 2007. Т. 76. № 4 С. 437-447.

48. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии (изд. 2-е, испр. и дополн.). РХД. 2011. 560 С.

49. Росстат (Федеральная служба государственной статистики). Россия в цифрах. 2012: Крат.стат.сб. М.: 2012. 573 С.

50. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. Соросовский образовательный журн. 1996. №3. С.4-10.

51. , Холлендер М., Вульф Д. Непараметрические методы статистики. Пер. с англ. М.: 1983. 518 С.

52. Цветкова Т.Г., Еголина Н.А., Кравец-Мандрон И.А., Асанов А.Ю., Ляпунова Н.А. Сравнение количества активных рибосомных генов у новорожденных и взрослых пациентов с синдромом Дауна. III ЗЧзд медичних генетиюв Украши з мЬкдународною участю. Льв1в. 2002. С.37.

53. Шубаева Н.О. Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и интенсивность процессов гибели клеток у больных ревматоидным артритом. Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. ГУ МГНЦ РАМН. М. 2004. 131 С.

54. Шубаева Н.О., Цветкова Т.Г., Мхитарова Е.В., Иванова С.М., Сперанский A.M., Вейко Н.Н., Спитковский Д.М., Ляпунова Н.А. Интенсивность апоптоза клеток в организме и количество активных рибосомных генов в геноме при заболевании ревматоидным артритом. // «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-ий съезд ВОГиС). Т. 2. М. 2004. С. 42.

55. Юнда И.Ф., Иванюта Л.И., Имшинецкая Л.П. Бесплодие в супружестве. Киев: «Здоровья». 1990. 462 с.

56. Agostini М., Di Marco В., Nocentini G., Delfino D.V. Oxidative stress and apoptosis in immune diseases. Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2002. V. 15. P. 157-164.

57. American Psychiatric Association (АРА), 1994. Diagnostic and statistical manual of mental disorders (4th ed.). Washington, DC: Amer. Psychiatric Association. P.117-149.

58. Antequera P., Bird A.P. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90. № 24. P. 11995-11999

59. Baou M., Norton J.D., Murphy J.J. AU-rich RNA binding proteins in hematopoiesis and leukemogenesis. Blood. 2011. V. 118. № 22. P. 5732-5740.

60. Bartova E., Horakova A.H., Uhlirova R., Raska I., Galiova G., Orlova D., Kozubek S. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. J Histochem Cytochem. 2010. V. 58. № 5. P. 391-403.

61. Bell G.I. Mathematical model of clonal selection and antibody production. Nature. 1970. V. 228. № 5273. P. 739-744.

62. Bell S.P., Learned R.M., Jantzen H.M., Tjian R. Functional cooperativity between transcription factors UBF1 and SL1 mediates human ribosomal RNA synthesis. Science. 1988. V. 241. №4870. P. 1192-1197.

63. Bell S.P., Pikaard C.S., Reeder R.H., Tjian R. Molecular mechanisms governing species-specific transcription of ribosomal RNA. Cell. 1989. V. 59. № 3. P. 489-497.

64. Berger C., Horlebein A., Gogel E., Grummt F. Temporal order of replication of mouse ribosomal RNA genes during the cell cycle. Chromosoma. 1997. V. 106. № 8. P. 479-484.

65. Bird A.P. Methylation of the genes for 18S, 28S, and 5S ribosomal RNA. Сип-Тор Microbiol Immunol. 1984. V. 108. P. 129-141.

66. Bird A.P., Taggart M.H. Variable patterns of total DNA and rDNA methylation in animals. Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. № 7. P. 1485-1497

67. Bitanihirwe B.K.Y., Woo T.-U.W. Oxidative stress in schizophrenia: an integrated approach. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 2011. V. 35. P. 878-893.

68. Brock G.J, Bird A.P. Mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes. Hum Mol Genet. 1997. V. 6. № 3. P. 451-456.

69. Bross K, Krone W. On the number of ribosomal RNA genes in man. Humangenetik. 1972. V.14. № 2. P.137-141.

70. Bross K, Krone W. Ribosomal cistrons and acrocentric chromosomes in man. Humangenetik. 1973. V.18. № l. p.71-75

71. Bross K, Dittes H, Krone W, Schmid M, Vogel W. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions (NOR) of man. I. Comparison of trisomy 21 with balanced translocations t(DqGq). Humangenetik. 1973. V.20. № 3. P.223-229.

72. de Capoa A, Marlekaj P, Baldini A, Rocchi M, Archidiácono N. Cytologic demonstration of differential activity of rRNA gene clusters in different human tissues. Human genetics. 1985. V.69. №3. P.212-217.

73. de Capoa A, Aleixandre C, Felli M.P, Ravenna M.A, Costantino M.A, Giancotti P, Vicenti O, Poggesi I, Grappelli C, Miller D.A. Inheritance of ribosomal gene activity and level of DNA methylation of individual gene clusters in a three generation family. Human genetics. 1991. V. 88. P. 146-152.

74. Chauhan A, Chauhan V. Oxidative stress in autism. Pathophysiology. 2006. V. 13. P. 171-181.

75. Chauhan A, Chauhan V, Brown W.T, Cohen I.L. Oxidative stress in autism: Increased lipid peroxidation and reduced serum levels of ceruloplasmin and transferrin - the antioxidant proteins. Life Sci. 2004. V. 75. P. 2539-2549.

76. Chauhan V, Chauhan A, Cohen I.L, Brown W.T, Sheikh A. Alteration in amino-glycerophospholipids levels in the plasma of children with autism: a potential biochemical diagnostic marker. Life Sci. 2004. V. 74. P. 1635-1643.

77. Chez M.G, Buchanan C.P, Aimonovitch M.C, Becker M, Schaefer K, Black C, Komen J. Double-blind, placebo-controlled study of L-carnosine supplementation in children with autistic spectrum disorders. J. Child. Neurol. 2002. V. 17. № 11. P. 833-837.

78. Conconi A, Widmer R.M, Koller T, Sogo J.M. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle. Cell. 1989. V. 57. №5. P. 753-761.

79. Conconi A, Sogo J.M, Ryan C.A. Ribosomal gene clusters are uniquely proportioned between open and closed chromatin structures in both tomato leaf cells and exponentially growing suspension cultures. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. № 12. P. 5256-5260.

80. Dadheech G, Mishra S, Gautam S, Sharma P. Evaluation of antioxidant deficit in schizophrenia. Indian J. Psychiatry. 2008. V. 50. P. 16-20.

81. Dakhale G, Khanzode S, Khanzode S, Saoji A, Khobragade L, Turankar A. Oxidative damage and schizophrenia: the potential benefit by atypical antipsychotics. Neuropsychobiology. 2004. V. 49. P. 205-209.

82. Dante R, Percy M.E, Baldini A, Markovic V.D, Miller D.A, Rocchi M, Niveleau A, Miller O.J. Methylation of the 5' flanking sequences of the ribosomal DNA in human cell lines and in a human-hamster hybrid cell line. J Cell Biochem. 1992. V. 50. №4. P. 357-362.

83. Delany M.E., Muscarella D.E., Bloom S.E. Effects of rRNA gene copy number and nucleolar variation on early development: inhibition of gastrulation in rDNA-deficient chick embryos. J Hered. 1994. V. 85. № 3. P. 211-217.

84. De Winter R.F., Moss T. The ribosomal spacer in Xenopus laevis is transcribed as part of the primary ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 1986 V. 14. № 15. P. 6041-6051.

85. De Winter R.F., Moss T. A complex array of sequences enhances ribosomal transcription in Xenopus laevis. J Mol Biol. 1987 V. 196. № 4. P.813-827.

86. Dittes H, Krone W, Bross K, Schmid M, Vogel W. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions (NOR) of man. II. A family with the 15/21 translocation. Humangenetik. 1975. V.26. № 1. P.47-59.

87. Dolske M.C., Spollen J., McKay S., Lancashire E., Tolbert L. A preliminary trial of ascorbic acid as supplemental therapy for autism. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993. V. 17. № 5. P. 765-774.

88. Eaton W.W., Hayward C., Ram R. Schizophrenia and rheumatoid arthritis: a review. Schizophr. Res. 1992. V. 6. P. 181-192.

ii

89. Eaton W.W., Byrne M., Ewald H., Mors O., Chen C.Y., Agerbo E., Mortensen P.B. Association of schizophrenia and autoimmune diseases: linkage of Danish national registers. 2006. Am. J. Psychiatry. V. 163. P. 521-528.

90. Egolina N.A. Human ageing is not accompanied by decreasing of genomic dosage of ribosomal genes. Тез. 6-го европейского конгресса «Healthy and active ageing for all Europeans». / Egolina N.A., Lyapunova N.A., Veiko N.N., Mkhitarova E.V., Tsvetkova T.G., Mandron I.A., Kosyakova N.V., Malinovskaya E.M., Agapova R.K., Porokhovnik L.N., Mestergazi G.M. // Успехи геронтологии. 2007. Т. 20. № 3. С. 30.

91. Elia М. Energy expenditure in the whole body // Energy metabolism: tissue determinants and cellular corollaries. Eds Kinney J.M., Tucker H.N. N.Y. 1992. Raven. 289 p.

92. Evans H.J., Buckland R.A., Pardue M.L. Location of the genes coding for 18S and 28S ribosomal RNA in the human genome. Chromosoma. 1974. V.48. P.405-426.

93. French S.L., Osheim Y.N., Cioci F., Nomura M., Beyer A.L. In exponentially growing Saccharomyces cerevisiae cells, rRNA synthesis is determined by the summed RNA polymerase I loading rate rather than by the number of active genes. Mol Cell Biol. 2003. V. 23. № 5. P. 1558-1568.

94. Gaubatz J.W., Prashad N, Cutler R.G. Ribosomal RNA gene dosage as a function of tissue and age for mouse and human. Biochim Biophys Acta. 1976. V.418. № 3. P.358-375.

95. Gaume X., Monier K., Argoul F., Mongelard F., Bouvet P. Biochem Res Int. 2011. In vivo Study of the Histone Chaperone Activity of Nucleolin by FRAP. 2011:187624. PMCID: PMC3049323.

96. Gawryluk J.W., Wang J.F., Andreazza A.C., Shao L., Young L.T. Decreased levels of glutathione, the major brain antioxidant, in post-mortem prefrontal cortex from patients with psychiatric disorders. Int. J. Neuropsychopharmacol. 2010. V. 16. P. 1-8.

97. Ghoshal K., Majumder S., Datta J., Motiwala T., Bai S., Sharma S.M., Frankel W., Jacob S.T. Role of human ribosomal RNA (rRNA) promoter methylation and of methyl-CpG-binding protein MBD2 in the suppression of rRNA gene expression. J Biol Chem. 2004. V. 279. № 8. P. 6783-6793.

98. Gilvarry C.M., Sham P.C., Jones P.B., Cannon M., Wright P., Lewis S.W., Bebbington P., Toone B.K., Murray R.M. Family history of autoimmune diseases in psychosis. Schizophr. Res. 1996. V. 19. P. 3-40.

99. Gimelbrant A.A., Ensminger A.W., Qi P., Zucker J., Chess A. Monoallelic expression and asynchronous replication of pi 20 catenin in mouse and human cells. J Biol Chem. 2005. V. 280. № 2. P. 1354-1359.

100. Goldmit M., Bergman Y. Monoallelic gene expression: a repertoire of recurrent themes. Immunol Rev. 2004. V. 200. P. 197-214.

101. Golse B., Debray-Ritzen P., Durosay P., Puget K., Michelson A.M. Alterations in two enzymes: superoxide dismutase and glutathione peroxidase in developmental infantile psychosis. Reviews in Neurology. 1978. V. 134. P. 699-705.

102. Goodpasture C., Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma. 1975. V. 53. P. 37-50.

103. Goren A., Cedar H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. V. 4. № l.P. 25-32.

104. Gorwood P., Pouchot J., Vinceneux P. Rheumatoid arthritis and schizophrenia: a negative association at a dimensional level. Schizophr. Res. 2004. V. 66. P. 21-29.

105. Grimaldi G., Di Nocera P.P. Multiple repeated units in Drosophila melanogaster ribosomal DNA spacer stimulate rRNA precursor transcription. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V. 85. № 15. P. 5502-5506.

106. Gupta M., Chauhan C., Bhatnagar P., Gupta S., Grover S., Singh P.K., Purushottam M., Mukherjee O., Jain S., Brahmachari S.K., Kukreti R. Genetic susceptibility to schizophrenia: role of dopaminergic pathway gene polymorphisms. Pharmacogenomics. 2009a. V. 10. № 2. P. 277-291.

107. Gupta M., Bhatnagar P., Grover S., Kaur H., Baghel R., Bhasin Y., Chauhan C., Verma B., Manduva V., Mukherjee O., Purushottam M., Sharma A., Jain S., Brahmachari S.K., Kukreti R. Association studies of catechol-O-methyltransferase (COMT) gene with schizophrenia and response to antipsychotic treatment. Pharmacogenomics. 20096. V. 10. № 3. P. 385-397.

108. Halle J.P., Muller S., Simm A., Adam G. Copy number, epigenetic state and expression of the rRNA genes in young and senescent rat embryo fibroblasts. Eur J Cell Biol. 1997. V. 74. № 3. P. 281-288.

109. Hardan A.Y., Fung L.K., Libove R.A., Obukhanych T.V., Nair S., Herzenberg L.A., Frazier T.W., Tirouvanziam R. A randomized controlled pilot trial of oral N-acetylcysteine in children with autism. Biol. Psychiatry. 2012. V. 71. № 11. P. 956-961.

110. Hartung M., Keeling J.W., Patel C. et al. Nucleoli, micronucleoli and nucleolus-like structures in human oocytes at meiotic prophase 1 studied by the silver-NOR technique. Cytogenetics and cell genetics. 1983. V. 37. № 1. P. 2-8.

111. Henderson A.S., Warburton D., Atwood K.C. Location of ribosomal DNA in human chromosome complement. Proceedings of National Academy of Sciences of USA. 1972. V.69. P.3394-3398.

112. Herken H., Uz E., Ozyurt H., Sogut S., Virit O., Akyol O. Evidence that the activities of erythrocyte free radical scavenging enzymes and the products of lipid peroxidation are increased in different forms of schizophrenia. Mol. Psychiatry. 2001. V. 6. P. 66-73.

113. Hisatake K., Nishimura T., Maeda Y., Hanada K., Song C.Z., Muramatsu M. Cloning and structural analysis of cDNA and the gene for mouse transcription factor UBF. Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. № 17. P. 4631-4637.

114. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia. 1980. V. 36. P. 1014-1015.

115. Howell W.M., Denton T.E. An ammoniacal-silver stain technique specific for satellite III DNA regions on human chromosomes. Experientia. 1974. V. 30. № 11. P. 1364-1366.

116. Howell W.M., Denton T.E., Diamond J.K. Differential staining of the satellite regions of human acrocentric chromosomes. Experientia. 1975. V.31. P.260-262.

117. Hozak P., Roussel P., Hernandez-Verdun D. 1992. Procedures for specific detection of silver-stained nucleolar proteins on western blots. J. Histochem. Cytochem. V. 40. P. 1089-1096.

118. Hubbell H.R. Silver staining as an indicator of active ribosomal genes. Stain Technol. 1985. V. 60. № 5. P. 285-294.

119. Jacob S.T. Regulation of ribosomal gene transcription. Biochem J. 1995. V. 306. № 3. P. 617-626.

120. James S.J., Cutler P., Melnyk S., Jernigan S., Janak L., Gaylor D.W., Neubrander J. A. Metabolic biomarkers of increased oxidative stress and impaired methylation capacity in children with autism. Am. J. Clin. Nutr. 2004. V. 80. P. Allien.

121. Johnson L.K., Johnson R.W., Strehler B.L. Cardiac hypertrophy, aging and changes in cardiac ribosomal RNA gene dosage in man. J Mol Cell Cardiol. 1975. V. 7. №2. P. 125-133.

122. Kamanli A., Naziroglu M., Aydilek N., Hacievliyagil C. Plasma lipid peroxidation and antioxidant levels in patients with rheumatoid arthritis. Cell. Biochem. Funct. 2004. V. 22. P. 53-57.

123. Karatas F., Ozates I., Canatan H., Halifeoglu I., Karatepe M., Colakt R. Antioxidant status and lipid peroxidation in patients with rheumatoid arthritis. Indian J. Med. Res. 2003. V. 118. P. 178-181.

124. Kouzarides T. SnapShot: Histone-modifying enzymes. Cell. 2007. V. 131. № 4. P. 822.

125. Kovacic P., Jacintho J.D. Systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases from endogenous and exogenous agents: unifying theme of oxidative stress. MiniRev. Med. Chem. 2003. V. 3. P. 568-575.

126. Krystal M., D'Eustachio P., Ruddle F.H., Arnheim N. Human nucleolus organizers on nonhomologous chromosomes can share the same ribosomal gene variants. Proc Natl Acad Sci USA. 1981. V. 78. № 9. P.5744-5748.

127. Kuloglu M., Ustundag B., Atmaca M., Canatan H., Tezcan A.E., Cinkilinc N. Lipid peroxidation and antioxidant enzyme levels in patients with schizophrenia and bipolar disorder. Cell. Biochem. Funct. 2002. V. 20. P. 171-175.

128. Kunz M., Gama C.S., Andreazza A.C., Salvador M., Cereser K.M., Gomes F.A., Belmonte-de-Abreu P.S., Berk M., Kapczinski F. Elevated serum superoxide dismutase and thiobarbituric acid reactive substances in different phases of bipolar disorder and in schizophrenia. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2008. V. 32. P. 1677-1681.

129. Larson D.E., Zahradka P., Sells B.H. Control points in eukaryotic ribosome biogenesis. Biochem Cell Biol. 1991. V. 69. № 1. P. 5-22.

130. Li J., Santoro R, Koberna K., Grummt I. The chromatin remodeling complex NoRC controls replication timing of rRNA genes. EMBO J. 2005. V. 24. № 1. P. 120127.

131. Liapunova N.A. Organization of replication units and DNA replication in mammalian cells as studied by DNA fiber radioautography. Int Rev Cytol. 1994. V. 154. P. 261-308.

132. Liapunova N.A., Egolina N.A., Victorov V.V. Polymorphism and the regularities in the inheritance of human nucleolus organizer chromosomes. // In: "Nuclear Structure and Function" (Harris J.R. and Zbarsky I.B., eds), Plenum publ. corp., New York-London, 1990. P. 219-222.

133. Long E.O., David J.B. Repeated genes in eukaryotes. Ann. Rev. Biochem. 1980. V.49. P.729-764.

134. Lotka A.J. Elements of physical biology. Baltimor: Williams and Wilkins, 1925.

135. Lyapunova N.A., Veiko N.N., Porokhovnik L.N. Human rDNA Genes: Identification of Four Fractions, Their Functions and Nucleolar Location // Proteins of the Nucleolus: Regulation, Translocation and Biomedical Functions. Eds D.H.O'Day and A.Catalano. Chapter 5. Springer, UK. 2013. P. 95-118

136. Main P.A., Angley M.T., O'Doherty C.E., Thomas P., Fenech M. The potential role of the antioxidant and detoxification properties of glutathione in autism spectrum disorders: a systematic review and meta-analysis. Nutrition and Metabolism. 2012. V. 9. P. 35.

137. Matsui S.I., Weinfeld H., Sandberg AA. Quantitative conservation of chromatin-bound RNA polymerases I and II in mitosis. Implications for chromosome structure. J Cell Biol. 1979. V. 80. № 2. P. 451-464.

138. Maurice M.M., Verweij C.L., Breedveld F.C. Characterization of the hyporesponsiveness of synovial T-cells in rheumatoid arthritis: Role of chronic oxidative stress. Drugs Today. 1999. V. 35. P. 321-326.

139. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Methods Enzymol. 1980. V. 85. P. 499.

140. Mayer C., Schmitz K.M., Li J., Grummt I., Santoro R. Intergenic transcripts regulate the epigenetic state of rRNA genes Mol Cell. 2006. V. 22. № 3. P. 351-361.

141. McCarthy M., Hendren R.L. Autism spectrum disorders have increased dramatically in prevalence in recent years // Psychiatric Clinic North America. 2009. V.32. P. xiiil—xiiilO.

142. McKeown P.C., Shaw P.J. Chromatin: linking structure and function in the nucleolus. Chromosoma. 2009. V. 118. № 1. P. 11-23.

143. McStay B., Grummt I. The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2008. V. 24. P. 131-157.

144. Ming X., Stein T.P., Brimacombe M., Johnson W.G., Lambert G.H., Wagner G.C. Increased excretion of a lipid peroxidation biomarker in autism // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2005. V. 73. P. 379-384.

145. Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Miller O.J. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Experimental Cell Research. 1976. V. 101. P. 235-243.

146. Miller O.L., Beatty B.R Visualization of nucleolar genes. Science. 1969. V. 164. №3882. P.955-957.

147. Mohan J., Ritossa F.M. Regulation of ribosomal RNA synthesis and its bearing on the bobbed phenotype in Drosophila melanogaster. Dev Biol. 1970. V. 22. № 3. P. 495-512.

148. Morris C.R., Agin M.C. Syndrome of allergy, apraxia, and malabsorption: characterization of a neurodevelopmental phenotype that responds to omega 3 and vitamin E supplementation. Altern. Ther. Health. Med. 2009. V. 15. № 4. P. 34-43.

149. Morton C.C., Corey L.A., Nance W.E., Brown J.A. Quinacrine mustard and nucleolar organizer region heteromorphisms in twins. Acta Genet Med Gemellol (Roma). 1981. V.30. № 1. P.39-49.

150. Mukeijee S., Mahadik S.P., Scheffer R, Correnti E.E., Kelkar H. Impaired antioxidant defense at the onset of psychosis. Schizophr. Res. 1996. V. 19. № 1. P. 19-26.

151. Murray K. The occurrence of epsilon-n-methyl lysine in histones. Biochemistry. 1964. V. 3.P. 10-15.

152. Nagler R.M., Salameh F., Reznick A.Z., Livshits V., Nahir A.M. Salivary gland involvement in rheumatoid arthritis and its relationship to induced oxidative stress. Rheumatology. . 2003. V. 42. P. 1234-1241.

153. Naviaux R.K. Oxidative Shielding or Oxidative Stress? J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012. V. 342. №3. P. 608-618.

154. Nikolis J., Kekic V., Diklic V. NORs and satellite associations in a family with 13/14 translocation. Human Genet. 1981. V. 59. № 4. P. 342-344.

155. O'Donovan M.C., Williams N.M., Owen M.J. Recent advances in the genetics of schizophrenia. Hum Mol Genet. 2003. V. 12. № 2. P. 125-133.

156. Ohno S., Trujillo J.M., Kaplan W.D., Kinosita R. Nucleolus organizers in the causation of chromosomal anomalies in man. Lancet. 1961. V.2. № 7194. P.123-126.

157. Oken R.J., Schulzer M. At issue: schizophrenia and rheumatoid arthritis: the negative association revisited. Schizophr. Bull. 1999. V. 25. P. 625-638.

158. Olesen A.B, Ellingsen A.R, Olesen H, Juul S, Thestrup-Pedersen K. Atopic dermatitis and birth factors: historical follow up by record linkage. BMJ. 1997. V. 314. №7086. P. 1003-1008.

159. Ono T, Okada S, Kawakami T, Honjo T, Getz M.J. Absence of gross change in primary DNA sequence during aging process of mice. Mech Ageing Dev. 1985. V. 32. №2-3. P. 227-234.

160. Ozturk H.S, Cimen M.Y, Cimen O.B, Kacmaz M, Durak I. Oxidant/antioxidant status of plasma samples from patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol. Int. 1999. V. 19. P. 35-37.

161. Pasca S.P, Nemes B, Vlase L, Gagyi C.E, Dronca E, Miu A.C, Dronca M. High levels of homocysteine and low serum paraoxonase 1 arylesterase activity in children with autism. Life Sci. 2006. V. 78. P. 2244-2248.

162. Pathak S, Elder F.F. Silver-stained accessory structures on human sex chromosomes. Human genetics. 1980. V. 54. P. 171-175.

163. Peterson C.R, Cryar J.R, Gaubatz J.W. Constancy of ribosomal RNA genes during aging of mouse heart cells and during serial passage of WI-38 cells. Arch Gerontol Geriatr. 1984. V. 3. № 2. P. 115-125.

164. Powell M.A, Mutch D.G, Rader J.S, Herzog T.J, Huang T.H, Goodfellow P.J. Ribosomal DNA methylation in patients with endometrial carcinoma: an independent prognostic marker. Cancer. 2002. V. 94. № 11. P. 2941-2952.

165. Qu G.Z, Grundy P.E, Narayan A, Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumors of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16. Cancer Genet Cytogenet. 1999. V. 109. № 1. P. 34-39.

166. Raffa M, Mechri A, Othman L.B, Fendri C, Gaha L, Kerkeni A. Decreased glutathione levels and antioxidant enzyme activities in untreated and treated schizophrenic patients. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2009. V. 33 P. 1178-1183.

167. Ranjekar P.K, Hinge A, Hegde M.V, Ghate M, Kale A, Sitasawad S, Wagh U.V, Debsikdar V.B, Mahadik S.P. Decreased antioxidant enzymes and membrane essential polyunsaturated fatty acids in schizophrenic and bipolar mood disorder patients. Psychiatry Res. 2003. V. 121. P. 109-122.

168. Raska I, Koberna K, Malinsky J, Fidlerova H, Masata M. The nucleolus and transcription of ribosomal genes. Biol Cell. 2004. V. 96. № 8. P. 579-594.

169. Reddy R, Sahebarao M.P, Mukherjee S, Murthy J.N. Enzymes of the antioxidant defense system in chronic schizophrenic patients. Biol. Psychiatry 1991. V. 30. P. 409-412.

170. Ritossa F.M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA. Proceedings of National Academy of Sciences of USA. 1968. V. 60. № 2. P. 509-516.

171. Ritossa F.M, Atwood K.C, Lindsley D.L, Spiegelman S. On the chromosomal distribution of DNA complementary to ribosomal and soluble RNA. National cancer institute monograph. 1966. № 23. P. 449-471.

172. Rossignol D.A, Frye R.E. Mitochondrial dysfunction in autism spectrum disorders: a systematic review and meta-analysis. Mol.Psychiatry. 2012. V. 17. № 3. P. 290-314.

173. Roussel P., Hernandez-Verdun D. Identification of Ag-NOR proteins, markers of proliferation related to ribosomal gene activity. Exp Cell Res. 1994. V. 214. № 2. P. 465-472.

174. Roussel P., Belenguer P., Amalric F., Hernandez-Verdun D. Nucleolin is an Ag-NOR protein; this property is determined by its amino-terminal domain independently of its phosphorylation state. Exp Cell Res. 1992. V. 203. № 1. P. 259-269.

175. Roussel P., André C., Comai L., Hernandez-Verdun D. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol. 1996. V. 133. № 2. P. 235-246.

176. Sáiz P.A., García-Portilla M.P., Arango C., Morales B., Alvarez V., Coto E., Fernández J.M., Bascarán M.T., Bousoño M., Bobes J. Association study of serotonin 2A receptor (5-HT2A) and serotonin transporter (5-HTT) gene polymorphisms with schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2007. V. 31. № 3. P. 741-745.

177. Sakai K., Ohta T., Minoshima S., Kudoh J., Wang Y., de Jong P.J., Shimizu N. Human ribosomal RNA gene cluster: identification of the proximal end containing a novel tandem repeat sequence. Genomics. 1995. V. 26. № 3. P. 521-526.

178. Salminen A., Kaarniranta K. SIRT1 regulates the ribosomal DNA locus: epigenetic candles twinkle longevity in the Christmas-tree. Biochem Biophys Res Commun. 2009. V. 378. № 1. P. 6-9.

179. Santoro R. The silence of the ribosomal RNA genes. Cell Mol Life Sci. 2005 V. 62. №18. P. 2067-2079.

180. Santoro R. The Epigenetics of the Nucleolus: Structure and Function of Active and Silent Ribosomal RNA Genes. In: M.O.J. Olson (ed.), The Nucleolus, Protein Reviews 15. Springer Science+Business Media, LLC. 2011. P. 57-82.

181. Santoro R, Grummt I. Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell. 2001. V. 8. № 3. P. 719-725.

182. Santoro R., De Lucia F. Many players, one goal: how chromatin states are inherited during cell division. Biochem Cell Biol. 2005. V. 83. № 3. P. 332-343.

183. Santoro R., Grummt I. Epigenetic mechanism of rRNA gene silencing: temporal order of NoRC-mediated histone modification, chromatin remodeling, and DNA methylation. Mol Cell Biol. 2005. V. 25. № 7. P. 2539-2546.

184. Santoro R., Li J., Grummt I. The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 2002. V. 32. № 3. P. 393-396.

185. Scherberg N.H., Refetoff S. Hybridization of RNA labelled with 125 I to high specific activity. Nat New Biol. 1973. V.242, № 118. P. 142-145.

186. Schmitz K.M., Mayer C., Postepska A., Grummt I. Interaction of noncoding RNA with the rDNA promoter mediates recruitment of DNMT3b and silencing of rRNA genes. Genes Dev. 2010. V. 24. № 20. P. 2264-2269.

187. Schopler E., Reichler R.J., De Vellis R.F., Daly K. Toward objective classification of childhood autism: Childhood Autism Rating Scale (CARS). J Autism Dev Disord. 1980 V. 10. № 1. P. 91-103.

188. Schumacher J., Laje G., Abou Jamra R, Becker T., Mühleisen T.W., Vasilescu C., Mattheisen M., Herms S., Hoffmann P., Hillmer A.M., Georgi A., Herold C.,

Schulze T.G., Propping P., Rietschel M., McMahon F J., Nöthen M.M., Cichon S. The DISC locus and schizophrenia: evidence from an association study in a central European sample and from a meta-analysis across different European populations. Hum Mol Genet. 2009. V. 18. № 14. P. 2719-2727.

189. Shiraishi M., Sekiguchi A., Chuu Y.H., Sekiya T.. Alteration of mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes in lung cancer. Biol Chem. 1999. V. 380. № 1. P. 81-84.

190. Schmickel R.D. Quantitation of human ribosomal DNA: hybridization of human DNA with ribosomal RNA for quantitation and fractionation. Pediatr Res. 1973. V.l. P.5-12.

191. Scheer U., Rose K.M. Localization of RNA polymerase I in interphase cells and mitotic chromosomes by light and electron microscopic immunocytochemistry. Proc Natl Acad Sei USA. 1984. V. 81. №5. P. 1431-1435.

192. Singh O.P., Chakraborty I., Dasgupta A., Datta S. A comparative study of oxidative stress and interrelationship of important antioxidants in haloperidol and olanzapine treated patients suffering from schizophrenia. Indian J. Psychiatry. 2008. V. 50. P. 171-176. 1

193. Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D. The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. Micron. 2000. V. 31. № 2. P. 121-126.

194. Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P., Hernandez-Verdun D. Nucleolus: the fascinating nuclear body. Histochem Cell Biol. 2008. V. 129. P. 13-31

195. Sozansky O.A., Zakharov A.F., Benjush V.A. Intercellular NOR-AG variability in man. Human genetics. 1984. V. 68. P. 229-302.

196. Sozansky O.A., Zakharov A.F., Terekhov S.M. Intercellular NOR-Ag variability in man II. Search for determining factors, clonal analysis. Human genetics. 1985. V. 69. P. 151-156.

197. Srivastava A.K., Hagino Y., Schlessinger D. Ribosomal DNA clusters in pulsed-field gel electrophoretic analysis of human acrocentric chromosomes. Mamm Genome. 1993. V. 4. № 8. P. 445-450.

198. Srivastava N., Barthwal M.K., Dalai P.K., Agarwal A.K., Nag D., Srimal R.C., Seth P.K., Dikshit M. Nitrite content and antioxidant enzyme levels in the blood of schizophrenia patients. Psychopharmacology (Berl). 2001. V. 158. P. 140-145.

199. Stancheva I., Lucchini R., Koller T., Sogo J.M. Chromatin structure and methylation of rat rRNA genes studied by formaldehyde fixation and psoralen cross-linking. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 9. P. 1727-1735.

200. Stefanovsky V., Moss T. Regulation of rRNA synthesis in human and mouse cells is not determined by changes in active gene count. Cell Cycle. 2006. V. 5. № 7. P. 735-739.

201. Strehler B.L., Chang M.P., Johnson L.K. Loss of hybridizable ribosomal DNA from human post-mitotic tissues during aging: I. Age-dependent loss in human myocardium. Mech Ageing Dev. 1979. V. 11. № 5-6. P. 371-378.

202. Strohner R., Nemeth A., Nightingale K.P., Grummt I., Becker P.B., Längst G. Recruitment of the nucleolar remodeling complex NoRC establishes ribosomal DNA silencing in chromatin. Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 4. P. 1791-1798.

203. Stults D.M., Kitten M.W., Pierce H.H, Pierce AJ. Genomic architecture and inheritance of human ribosomal RNA gene clusters. Genome Res. 2008. V. 18. № 1. P. 13-18. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2134781)

204. Su M.H., Delany M.E. Ribosomal RNA gene copy number and nucleolar-size polymorphisms within and among chicken lines selected for enhanced growth. Poult Sci. 1998. V. 77. № 12. P. 1748-1754.

205. Sylvester J.E., Whiteman D.A., Podolsky R., Pozsgay J.M., Respess J., Schmickel R.D. The human ribosomal RNA genes: structure and organization of the complete repeating unit. Hum Genet. 1986. V.73. №3. P. 193-198.

206. Tajrishi M.M., Tuteja R., Tuteja N. Nucleolin: the most abundant multifunctional phosphoprotein of nucleolus. Commun Integr Biol. 2011. V. 4. № 3. P. 267-275.

207. Taylor E.F., Martin-DeLeon P. A. Familial silver staining patterns of human nucleolus organizer regions (NORs). Am J Hum Genet. 1981. V. 33. P. 67-76.

208. Taysi S., Polat F., Gui M., Sari R.A., Bakan E. Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol. Int. 2002. V. 21. P. 200-204.

209. Velazquez M., Visedo G., Ludena P., de Cabo S.F., Sentis C., Fernandez-Piqueras J. Cytogenetic analysis of a human familial 15p+ marker chromosome. Genome. 1991. V. 34. № 5. P. 827-829.

210. Volterra V. Variazone e fluttuazini del numero, d'individui in specie animali conviventi. Mem. Accad. naz. Lincei. 1926. Ser. 6.

211. Volterra V. Leçons sur la Théorie Mathématique de la Lutte pour la Vie. Paris: Gauthier-Villars. 1931.

212. Voit R., Schnapp A., Kuhn A., Rosenbauer H., Hirschmann P., Stunnenberg

H.G., Grummt I. The nucleolar transcription factor mUBF is phosphorylated by casein kinase II in the C-terminal hyperacidic tail which is essential for transactivation. EMBO J. 1992. V. 11. №6. P. 2211-2218.

213. Wellauer P.K., Dawid J.B. Isolation and sequence organization of human ribosomal DNA. J Mol Biol. 1979. V.128. № 3. P.289-303.

214. Weissenberger D., Scheer U. A possible mechanism for the inhibition of ribosomal RNA gene transcription during mitosis. J Cell Biol. 1995. V. 129. № 3. P. 561-575.

215. Xie W., Ling T., Zhou Y., Feng W., Zhu Q., Stunnenberg H.G., Grummt I., Tao W. The chromatin remodeling complex NuRD establishes the poised state of rRNA genes characterized by bivalent histone modifications and altered nucleosome positions. Proc Natl Acad Sci USA. 2012. V. 109. № 21. P. 8161-8166.

216. Yang A., Shi G., Zhou C., Lu R., Li H., Sun L., Jin Y. Nucleolin maintains embryonic stem cell self-renewal by suppression of p53 protein-dependent pathway. J Biol Chem. 2011. V. 286. № 50. P. 43370-43382.

217. Yao J.K., Reddy R., McElhinny L.G., van Kammen D.P. Effects of haloperidol on antioxidant defense system enzymes in schizophrenia. J. Psychiatr. Res. 1998. V. 32. P. 385-391.

218. Yorbik O., Sayal A., Akay C., Akbiyik D.I., Sohmen T. Investigation of antioxidant enzymes in children with autistic disorder. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2002. V. 67. P. 341-343.

219. Young B.D., Hell A, Birnie G.D. A new estimate of human ribosomal gene number. Biochim Biophys Acta. 1976. V. 454. № 3. P.539-548.

220. Yui K., Koshiba M., Nakamura S., Kobayashi Y. Effects of large doses of arachidonic acid added to docosahexaenoic acid on social impairment in individuals with autism spectrum disorders: a double-blind, placebo-controlled, randomized trial. J. Clin. Psychopharmacol. 2012. V. 32. № 2. P. 200-206.

221. Zakharov A.F., Davudov A.Z., Benjush V.A., Egolina N. A. Polymorphisms of Ag-stained nucleolar organizer regions in man. Human genetics. 1982. V. 60. P. 334-339.

222. Zhang K., Sridhar V.V., Zhu J., Kapoor A., Zhu J.K. Distinctive core histone post-translational modification patterns in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 2007. V. 2. № 11. el210.

223. Zhang M., Zhao Z., He L., Wan C. A meta-analysis of oxidative stress markers in schizophrenia. Sci. China Life Sci. 2010. V. 53. P. 112-124.

224. Zhang X.Y., Zhou D.F., Cao L.Y., Zhang P.Y., Wu G.Y., Shen Y.C. The effect of risperidone treatment on superoxide dismutase in schizophrenia. J. Clin. Psychopharmacol. 2003. V. 23. P. 128-131.

225. Zentner G.E., Saiakhova A., Manaenkov P., Adams M.D., Scacheri P.C. Integrative genomic analysis of human ribosomal DNA. Nucleic Acids Res. 2011. V. 39. № 12. P. 4949-4960.

226. Zoroglu S.S., Armutcu F., Ozen S., Gurel A., Sivasli E., Yetkin O., Meram I. Increased oxidative stress and altered activities of erythrocyte free radical scavenging enzymes in autism. Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 2004. V. 254. P. 143-147.

227. Zorov D.B., Filburn C.R, Klotz L.O., Zweier JUL, Sollott S.J. Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release: a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes. J. Exp. Med. 2000. V. 192. №7. P. 1001-1014.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - протоколы первичных данных цитогенетического исследования

Приведены протоколы семьи - двух родителей и ребенка. На протоколах каждого родителя отмечены гомологи, унаследованные ребенком. На протоколе ребенка знаками мужского пола (с?) и женского пола ($) обозначены гомологи, унаследованные от родителя соответствующего пола.

Протокол № Анализ AgЯOP метафазных хромосом человека

(с идентификациейхромосом) л

Шифр: о^ Следователь-

Осооые замечания: *~([и>) Дата

X» / Пары ЯОР хромосом Сумма

П'П 13 14 15 21 22 по ¡0

а б о а б а б а б ^^ЯОР

1 Л / Н Я $ £ / 0 /а

1 1 / 5 л г г Д д * О /5

3 Я / 3 3 г £ ( /§

4 £ / 2 / ( ¿> г О /7

5 2 / £ 3 ( а О /е

О 2 ! / г г 3 д а £ Я О /3

* 1 / з г 3 / г 2 О

8 £ г д <Г 3 / Л О ¡г

9 Я / г гя $ £ 2- £ я 0 13

10 £ / Ъ г 3 з. 1 и О (3

11 £ / г г г % 3 О У

12 г / г * о 3 1 $ О 3 О /в

13 ь \ 1 3 3 £ 3 1 Я о го

14 % ! о г £ 3 £ 3 X я 0

15 1 / г г / 3 д О ¡3

16 / з £ 3 Д 1 / г 0 /з .

17 7- ч ,2 з А О

18 £ £ % £ 3 Д а О %о

19 3- 3 Д с/ Я 3 £ 3 О Зо

20 X 9 3 Л' 5 1 3 0 (9

Сред. 5,051 £ 3 № /,5Г 4/51 0 1%о£

V —(— у: V VI IV/

1 : 1

\ I ! 1 1 [

1 1 ■ ! 1

Протокол исследования отца

Протокол № Анализ AgЯOP метафазных хромосом человека

(с идeнтификaциeЙJ<poмocoм) л

Шифр: /^^Исследователь:

Особые замечания: ________Дата- ¡2/1-¿¿>/0?,

Л\> 11/11 Пары ЯОР - хромосом Сумма по 10 ЛеЯОР

13 и 15 21 22

а б а б а б а б а | б !

! г / ? л 3 ? 2 !

г / 5 £ 3 я 3 / 1 ! г? !$

.1 г / г * 3 г 5 я 71 о /9

4 1 / 3 3 3 я 1 \ о /В

5 £ / 3 3 я У г 1! / Ж

1 / з £ 3 я ятт .ж

1 / о2 3 г 3 ~хТ /

8 £ / / 3 2 3 »2 ГТТ м

9 1 0 г> ь Д 1 Я «г /! * М-

/ 0 3 Я 3 Я в з / 0

! 1 / / 3 я я я 3 Я / 0

12 / / я г я 3 3 X 0 №

П / 0 1 / г 3 3 я / /9

14 1 1 г я я Я / ¿д .л 15 13

15 / 0 3 я 3 «г 3 Я /-

! 6 / ( 3 £ я 2 £ £

1? / 1 3 я 3 Я 3 3 / ; 0

18 1 0 з ! % 3 Я 3 а Я 1 0 /3

19 1 0 г Д 3 1 3 Я /! ( Л /?

20 1 I £ 3 я 3 7 1 о

Сред. 1,3 о Л 3 X № 3 0,5"

V V V 1 V

--1—,—— 1-..... — ---

( 1

Протокол исследования матери

Протокол № & <>£<£ъ}1

Анализ AgЯOP метафазных хромосом человека

(с идентификацией хромосом) ^ Шифр: [у Исследователь: Особые замечания- ^^_Дата

X» Пары ЛОР хромосом Сумма

11'и 13 м 15 21 22 но ¡0

а 1 б б а б 3 б ¡1 б АцЯО!'

1 1 I / (гЪ щ 3 £ 3 д 0 /Я

-\ 1 \ 0 Я я я л г ( о к

3 н д д 3 л 1 0

4 г я 3 г ¿> 0 /8

5 М ' в л 3 Л / с

6 / 1 / >¿1 Д 3 я 3 X / 0 13

■7 д \ / 5 Я я 3 г— с 78

И * 1 ' Д Я я 3 О / о /3

ч ¿? Л Д о д / о п

10 Л~ 1 / 1г} Я я 3 п ^ / 0 Яв

1 ! 3 д 5 д 2 д / о ¿3

П 3 Д 3 Д д / о /9

13 1 Я ! л 3 9- 0 о*- / о М-

14 1> / 5 Л Д д ? ^ / 0 /з

15 / г ! 11/1 д1 / яъ 3 £ 2 д / о Зг>

¡0 ~1 7 ? X Я- 3 ' 3 I £ д 3 ^ 3 п я / о Го' 1 о /3 " Ч* '

19 ¿¿■То д 3 3 з г? ■ & /?

20 д : / I £ 3 д 3 д / ! о 13

Срсл $ 1 д 3 ! д р £ д

(Р ' % !

1 ! <

1 1 1 1

1 1 1 1

Протокол исследования ребенка