Моделирование направленной реактивности иммунного ответа веществами различного происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, доктор биологических наук Катлинский, Антон Викентьевич

• Катлинский, Антон Викентьевич
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Катлинский, Антон Викентьевич

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. БАЗИСНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ.

1.1.Th1/Th2 баланс лимфоцитов - основа иммунитета.

1.2. Цитокины как регуляторы Th1/Th2 - баланса лимфоцитов.

1.3. Контроль за развитием Th1/Th2 клонов.

1.4. Костимулирующие молекулы.

1.5. Антиген-представляющие и дендритные клетки.

1.6. Пути представления антигенов.

2. ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ.

2.1.Механизм модуляции иммунного противоопухолевого ответа.

2.И.Опухолеспецифические антигены.

2.2. Причины низкой иммуногенности опухоли.

2.2.1. Низкий уровень экспрессии опухолевых антигенов и

MHCI.

2.2.2,Отсутствие костимулирующих молекул.

2.2.3. Факторы, подавляющие иммунитет.

2.3. Клетки-эффекторы в системе противоопухолевой защиты организма.

2.4. Иммунотерапия рака.

2.4.1. Противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства используемых в онкологии растительных препаратов.

3. НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ЛЕКАРСТВ. СОЗДАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКОВЫХ

ВЕКТОРОВ.

3.1. Альфа-фетопротеин в качестве молекулы-вектора.

3.2. Семейство эпидермальных факторов роста.

4. РАЗРАБОТКА ВАКЦИН И НОВЫХ МЕТОДОВ ИММУНОТЕРАПИИ.

4.1. Профилактические вакцины.

4.2. Генетическая иммунизация.

4.3. Использование белков и пептидов в качестве основного компонента вакцин.

4.4. Терапевтические вакцины.

4.5. Вакцины на основе белков теплового шока.

4.6. HSP-активация неспецифического иммунитета.

4.7. Иммуногенность комплексов «пептид-HSP».

4.8. HSP-активация специфического иммунитета.

4.9. HSP- вакцины против инфекционных и опухолевых заболеваний.

4.10. Необходимость в разработке противотуберкулезных вакцин и новых диагностических тест-систем на М. tuberculosis.

4.10.1. Ранняя диагностика туберкулезной инфекции.

4.10.2. Характеристика антигенов М. tuberculosis.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ВЫДЕЛЕНИЕ, УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ ОЛИГОМИЦИНОВОГО РЯДА.

1.1. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого культурой Streptomyces sp.№182.

1.1.1 .Таксономическая характеристика штамма-продуцента олигомицинового комплекса.

1.1.2.Физиологические свойства культуры.

1.1.3. Биосинтез антибиотического комплекса.

1.1.4.Выделение олигомицинового комплекса.

1.1.5.Биологическая активность олигомицинового комплекса.

1.1.6.Выделение и очистка.

1.1.7.Изучение физико-химических свойств.

1.2. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого культурой Streptomyces sp.№162.

1.2.1. Изучение морфологических признаков культуры Streptomyces №162 - продуцента антибиотического комплекса BSK17.

1.2.2.Физиологические характеристики.

1.2.3. Исследование изменчивости популяции штамма Streptomyces sp. 162 по морфологическим признакам и антибиотикообразованию.

1.2.4. Разработка метода биосинтеза антибиотического комплекса.

1.2.5. Выделение антибиотического комплекса, определение компонентного состава.

1.2.6. Антибактериальная активность BSK- 17.

1.2.7. Первичная иммунологическая оценка.

1.2.7.1. Угнетение ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов под воздействием BSK-17.

1.2.7.2. Влияние фракции 1 антибиотического комплекса BSK -17 на апоптоз трансформированных клеток

1.2.8. Изучение противовирусной активности антибиотического комплекса BSK-17 в сравнении с BSK-14.

2. РАЗРАБОТКА КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО

ТРАНСПОРТА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

2.1.Ковалентные и нековалентные конъюгаты белковых векторов с противоопухолевыми препаратами и антибиотиками.

2.1.1.Ковалентный конъюгат «DR -AFP».

2.1.2.Ковалентный конъюгат «эсперамицин-AFP».

2.1.3.Нековалентный конъюгат «ТХДД-AFP».

2.1.4.Конъюгаты «EGF-DR».

2.2.Антибактериальные и противоопухолевые препараты на основе респекриновых комплексов.

З.ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЕЙ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ.

3.1. Иммуномодулятор растительного происхождения.

3.1.1.Биологические свойства ИРП.

3.1.2.Исследование противоопухолевой активности

3.1.3. Исследование эффективности профилактического применения ИРП для предупреждения образования опухолей.

3.2. Исследование противовирусной и иммуномодулирующей активностей препарата Гепон.

3.2.1. Оценка иммунного контроля оппортунистических инфекций у больных ВИЧ-инфекцией под влиянием иммуномодулятора Гепон.

3.2.2. Активация образования антител к антигенам ВИЧ при лечении больных ВИЧ-инфекцией.

3.2.3. Изучение динамики основных субпопуляций лимфоидных клеток крови.

3.2.4. Влияние на продукцию антител.

3.2.5. Изучение зависимости иммуноадьювантного действия Гепона от его пептидной структуры.

3.2.6. Изучение транскрипции генов цитокинов в перевиваемых клетках человека.

4. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ М. tuberculosis.

4.1. Конструирование плазмид и получение штаммов-продуцентов рекомбинантных антигенов М. tuberculosis.

4.2.Выделение рекомбинантного белка CFP10 из биомассы штамма-продуцента Е. coli методом лигандообменной хроматографии.

4.3.Выделение рекомбинантного слитого белка CFP10-ESAT6 из биомассы штамма-продуцента Е. coli методом лигандообменной хроматографии.

4.4.Тестирование диагностического реагента на основе белков ESAT-6 и CFP-10 для определения гиперчувствительности замедленного типа к М. tuberculosis.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование направленной реактивности иммунного ответа веществами различного происхождения»

Иммунная система является уникальным регуляторным органом, контролирующим организм как в норме, так и при различных патологических состояниях. Суть выздоровления, в общем случае, - это стремление организма как единой системы к некоему состоянию равновесия, дестабилизируемого болезнью. Баланс клеточного и гуморального иммунных ответов является определяющим в этом равновесии. Смещение активности в пользу одного из них вызывает необходимость внешней коррекции, выражающейся в специфическом моделировании активностей иммунной системы, прогнозирования иммунных ответов и управления ими. Подобные манипуляции возможны с развитием современных средств медицинской науки, которая располагает большим арсеналом средств для разработки новых препаратов направленной реактивности.

Моделирование иммунных ответов достигается многими средствами, часть из которых представлена готовыми фармакологическими формами, тогда как другая пока находится в стадиях различной степени изучения. Иммунный дисбаланс должен регулироваться направленно, и это достигается различными по своему происхождению веществами. Интенсивный поиск ведется среди антибиотиков с новыми активностями, традиционно - среди препаратов растительного происхождения, и, с учетом состояния развития мировой молекулярной медицины, наметилась четкая

• тенденция к разработке биоинженерных средств с иммунобиологическими и иммуномодулирующими свойствами. Поэтому, если рассматривать иммунную систему в частности, и организм в целом, как объекты моделирования биологических ответов, можно увидеть, что имеет место некая система, которую уместно охарактеризовать как моделирование направленной реактивности иммунных ответов (МНРИО).

Огромной проблемой всегда были и остаются лечение и профилактика опухолевых, аутоиммунных, инфекционных патологий. Большое количество различных препаратов, существующих на рынке, говорит только о том, что до сих пор не существует сколь-нибудь однозначного подхода для терапии вышеуказанных заболеваний. Кроме того, большинство из них обладает нежелательными побочными эффектами, коррекция которых выливается порой в дополнительную проблему. С одной стороны, причиной этому является отсутствие селективности действия используемых лекарственных средств, а с другой, как это ни парадоксально, - отсутствие грамотного выбора среди множества аналогичных средств. Все это диктует необходимость в разработке препаратов нового поколения, метаболизм которых в организме может быть однозначно предсказуем, которые могут быть управляемы и которые должны иметь минимум побочных эффектов или, в идеале, не иметь их вовсе. Организм млекопитающих представляет собой сложную многоклеточную систему, и нарушение его гомеостаза влечет необратимые нарушения органов и систем. Интеллектуальные «возможности» новых иммуномодулирующих препаратов, селективно «узнающих» свои мишени in vivo среди множества других, являются фактором неоспоримого качества и важным показателем их надежности. Строго говоря, речь идет о работающей in vivo системе МНРИО. Данный подход может быть положен в основу комплексной терапии заболеваний не только самой иммунной системы, но и всех остальных патологий, возникших на фоне иммунного дисбаланса.

Развитие современной медицины немыслимо без участия и совместного «сотрудничества» многих смежных дисциплин. Для разработки надежных диагностических тест-систем, направленного транспорта лекарств, вакцин нового поколения необходимо использовать наукоемкие технологии с учетом современных достижений медицины. Разработка новых лекарственных препаратов подразумевает знания о молекулярной основе заболевания для управления меж- и внутриклеточными сигнальными процессами на уровне клеток, вовлеченных в патологический процесс. Более полное понимание специфики функционирования вне- и внутриклеточных медиаторов стало доступным в последние годы, поэтому анализ и применение огромной базы накопленных знаний породили развитие принципиально новых подходов в создании биологически активных соединений. Изучение многообразия типов клеток, особенностей организации сигнальных каскадов, белок-белковых (лиганд-рецепторных) взаимодействий, способов активации и проведения сигналов внутри клеток-мишеней являются, таким образом, составляющими системы управления клеточными ответами, что является важнейшим достижением современной молекулярной биологии, биохимии, медицины.

Исследование биологических активностей различных факторов на клетку позволило по-новому взглянуть на способы лечения многих болезней человека, которые обычным, традиционным способом излечиваются не полностью, либо относятся к неизлечимым. По сути, современная молекулярная медицина призвана решать эти задачи. Это одна из «ветвей» медицинской науки, которую можно назвать как самой молодой, так и самой древней.

Моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) может быть реализовано с помощью веществ, созданных как природой, так и с помощью возможностей современных биотехнологических направлений. МНРИО создает основу для комплексной терапии заболеваний иммунной системы на уровне управления различных систем клетки, в том числе рецепторных (мембранных, ядерных), цитоплазматических, других органных систем.

Новый класс антибиотиков, относимых к олигомицинам, а также препараты на основе растительного сырья (ИРП) являются вновь открытыми природными объектами, на базе которых возможно создание новых биологически активных лекарственных средств, обладающих иммуносупрессивными, антифунгальными антибиотики), иммуностимулирующими, противоопухолевыми (ИРП) свойствами.

Разработанные конъюгаты на основе AFP, EGF в комплексе с цитостатиками, а также иммунотоксины нового поколения, респекрины, обеспечивают направленный транспорт лекарственного вещества в клетку, обладают низкой токсичностью и высокой избирательностью и могут служить основой для лечения опухолей любого генеза, на которых имеются возможности рецепторного узнавания вышеуказанными лигандами. Эти вещества являются примером возможностей биотехнологического разнообразия приемов и методов, использование которых позволяет добиться получения субстанций с заданными свойствами.

Иммуномодулятор Гепон является эффективным препаратом, имеющим позитивные результаты в клинике при лечении больных с инфекционными патологиями, в том числе с оппортунистическими инфекциями.

Все вышеуказанные препараты являются представителями новых классов иммунобиологических лекарственных средств, перспективных для клинического использования в комплексной терапии заболеваний, связанных с иммунным дисбалансом организма, в том числе в терапии опухолей.

Диагностикум на туберкулез, выполненный на основе белков RD-региона М.tuberculosis ESAT-6 и CFP-10 и представляющий собой классический пример биотехнологической наработки рекомбинантных белков через создание штамма-продуцента, является примером практического применения МНРИО и позволяет с высокой достоверностью отличать инфицирование вышеуказанным патогеном от любого другого микобактериального заражения.

Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование механизмов направленной реактивности иммунного ответа с помощью веществ различного происхождения, регуляции клеточного и гуморального типов иммунитета, а также подбор адекватных критериев использования МРНИО в практической медицине и медицинской биотехенологии.

Довольно быстрый прогресс в исследовании молекулярного взаимодействия клеточных медиаторов и их рецепторов наметился в последние 10-15 лет. Современные технологии по клонированию рекомбинантных ДНК позволили детально проанализировать многие аспекты белок-белковых взаимодействий с участием цитокинов, клеточных антигенов, факторов роста, установить особенности экспрессии данных белков, а также . получить возможность беотехнологической наработки чистых белков для использования их как объектов для молекулярной коррекции нарушенных клеточных функций при той или иной патологии.

Раздел фармации, изучающей изготовление фармакологических средств, в настоящее время имеет целью достижение оптимальности использования тех лекарственных форм, которые приводят к решению задач современной молекулярной медицины, обеспечивая быструю и точную доставку действующего агента к его мишени. Это направление часто объединяется исследователями в единую проблему создания системы доставки лекарственных препаратов (drug delivery systems, DDS). Для каждого препарата разрабатывается, как правило, своя одна или несколько систем. В их названиях нет единообразия. Одни DDS называются по пути доставки (пероральная, трансдермальная и др.), другие - по способу доставки, напр. липосомальные. Часть названий представляют собой комбинацию первого и второго подхода. В любом случае имеется в виду узкоспециализированная система транспорта конкретного БАС. Для оценки перспективности подобных разработок необходимо последовательное рассмотрение преимуществ отдельных способов и путей доставки БАС в различных комбинациях с учетом физико-химических свойств конкретного вещества.

Таким образом, в настоящее время в развитых странах ведется активное изучение путей и способов направленной доставки биологически активных соединений (БАС). В процессе создания современных систем доставки препаратов объединяются ученые различных специальностей.

При разработке фармакологических средств нового поколения, соответствующих уровню развития цивилизации XXI века, в совокупности решается ряд вопросов:

-проникновение через различные барьеры с изучением и использованием как механизмов активного транспорта молекул, так и диффузии;

-повышение результативности действия фармакологических препаратов;

-достижение стабильности его положительного результата; -снижение до минимума побочного или токсического действия; -экономичность и снижение стоимости лечения при сохранении его эффективности.

В зависимости от степени изученности механизмов заболевания, можно определить, на каком уровне происходит реакция взаимодействия. Медицина, использующая в своих целях знания и технологии, относящиеся к геному человека, получила название генной медицины. При этом мишенью терапевтического воздействия становится хромосома, ее участок, ген или какая-то его часть или одна молекула. Все многообразие представителей разных рас человечества, бесчисленные комбинации фенотипических признаков, в том числе молекулярные основы многих заболеваний, обуславливаются геномом человека. Вместе с тем, сохранение видового постоянства, стабильность организации работы систем жизнеобеспечения и их согласованность также обеспечивается геномом.

Процессы транскрипции, процессинга и трансляции сопровождаются рядом ферментативных реакций, изменения в которых могут быть критическими для организма. Использование знаний, полученных в процессе реализации проекта «Геном человека», развитие биотехнологии и компьютерных систем позволяет создавать новые лекарственные препараты на их основе. Для воздействия на геном могут быть использованы как дополнение гена, так и супрессия гена.

При помощи методов генной инженерии возможно создание препаратов, действующих на уровне РНК и ДНК, при этом они могут обладать малыми размерами и поэтому способны легко проникать через клеточные мембраны. Для успешной реализации задачи помимо правильно выбранного действующего начала важен оптимальный путь доставки генетического материала в клетку. Для этого могут использоваться физические и биологические средства доставки. Для создания эффективно действующих препаратов на основе достижений генной инженерии могут быть использованы различные механизмы.

При любых методических предпочтениях путь доставки специфической ДНК в клетки-мишени" станет основным способом создания БАС. В качестве наиболее перспективных обсуждаются БАС, регулирующие внутриклеточную передачу сигнала, клеточный цикл, а также синтез соединений, несущих генетическую информацию суицидального характера.

Другим способом доставки лекарственных препаратов в клетку является использование естественного для организма человека механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз является механизмом, используемым клетками для выборочной интернализации белков цитоплазматической мембраны (Jentschr et al., 1998). Таким образом, этот процесс служит механизмом захвата необходимых клетке макромолекул и осуществляет связь окружающей среды с отдельными компартментами клетки. Механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза может также использоваться для доставки ДНК в рецептор-экспрессирующие клетки.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз представляет собой лишь один из многочисленных механизмов, при помощи которых осуществляются биохимические реакции в организме, происходит транспорт разнообразных веществ, работают рецепторные системы и т. д. Тщательное изучение этих механизмов позволит создавать лекарственные препараты направленного действия и совершенствовать средства их доставки.

Таким образом, принципы моделирования направленной реактивности иммунных ответов вложены в механизм действия всех известных иммуномодуляторов, охватывают многие мишени на уровне клеток (мембранные, ядерные, цитоплазматические компоненты ), обладают направленной активностью, регулируют силу разных типов иммунных ответов. Задача исследователей и врачей в этом плане - объединить свои усилия и обозначить максимум специфики и силы взаимодействия лекарственного начала, которое установит нарушенное равновесие в организме больного.

Данная работа включает результаты, полученные в последние несколько лет при поиске новых классов антибиотических препаратов, оказывающих избирательные эффекты на функционирование иммунной системы и некоторые важные пути регуляции метаболизма, при разработке новых классов иммуномодуляторов пептидной природы, позволяющих их использовать для лечения вирусных и бактериальных инфекций, при создании новых систем избирательного направленного транспорта ряда цитостатиков и биологически активных соединений в опухолевые ткани. Кроме того, в данной работе положено начало для создания диагностикума на туберкулез на основе белков -антигенов М. tuberculosis ESAT-6 и CFP-10.

Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 438 ссылок.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Катлинский, Антон Викентьевич

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа состоит из четырех частей. Первая часть посвящена выделению, установлению структуры и изучению биологической активности антибиотических комплексов. Охарактеризованы таксономическая характеристика штаммов, выделение и очистка, физико-химические и морфологические характеристики антибиотических комплексов. На основании данных ЯМР и масс-спектров определены химические формулы компонентов антибиотических комплексов. Показано, что они принадлежат к группе олигомицинов и являются олигомицинами А, В, С. Кроме того, обнаружен абсолютно новый по своим свойствам антибиотический комплекс, который отнесен к классу макролидных соединений и идентифицирован как олигомицин SC II.

Вторая часть посвящена разработке базисных конструкций для направленной доставки лекарств в опухолевые и бактериальные клетки. Проблема направленной доставки лекарственного вещества в клетку является как сложной, так и интересной одновременно. В арсенале современной молекулярной медицины имеется множество подходов для поиска соответствующих решений, реализованных самыми различными способами. Последние несколько лет позволили однозначно сориентироваться и вычленить наиболее эффективные стратегии и перспективные направления, среди которых своеобразную популярность получили рецептор-опосредованный эндоцитоз, пассивная интернализация, взаимодействие «антиген-антитело». Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки, однако можно с уверенностью утверждать, что эти попытки являются довольно успешными и могут составлять достойную альтернативу традиционно применяемым цитолитическим и цитотоксическим препаратам. Препараты нового поколения, целенаправленно уничтожающие клетки-мишени, являются эффективным оружием против клеток, подвергшихся опухолевой трансформации, либо вирусному или бактериальному заражению.

В качестве носителей лекарств предложены альфа-фетопротеин и эпидермальный фактор роста. Выбор, сделанный в пользу этих белков, был не случаен: рецепторы к AFP экспрессируются как на пролиферирующих (фетальных) клетках, так и на опухолевых, а усиление экспрессии рецепторов к EGF является признаком пролиферации и роста опухолей эпидермального (эпителиального) происхождения. Поэтому лиганды AFP и EGF обладают определенным уровнем специфичности, необходимой и достаточной для проявления цитотоксического потенциала препаратов, образующих с ними комплексы, в отношении клеток-мишеней. На роль лекарственного начала в этих комплексах были выбраны доксорубицин, эсперамицин, 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин. Активность конъюгатов DR-AFP и DR-EGF исследовалась на опухолевых клетках человека линии SROV3, несущих рецепторы к AFP и EGF, а также опухолевых линий OQS и MCF-7.

Третья часть посвящена изучению биологической эффективности и целесообразности применения иммуномодулирующих препаратов нового поколения: иммуномодулятора растительного происхождения(ИРП)и препарата Гепон. Проанализированы наиболее важные аспекты, отражающие особенности биологических активностей этих препаратов.

Для характеристики ИРП исследованы его токсические свойства в отношении опухолевых и нормальных клеток человека in vitro, его митогенная активность в отношении лимфоцитов периферической крови человека in vitro, способность индуцировать секрецию мононуклеарных лейкоцитов, цитотоксических факторов, а также его способность влиять на противоопухолевую ЦТА мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека in vitro. Исследована эффективность профилактического применения ИРП для предупреждения образования опухолей.

Полученные результаты позволяют заключить, что исследуемый препарат обладает противоопухолевой эффективностью, причем его действие связано не только с непосредственным цитотоксическим или цитостатическим действием на клетку опухоли, но и с активацией защитных сил организма, о чем свидетельствует очень высокая противоопухолевая эффективность профилактического введения ИРП. Именно эта особенность позволяет отнести его к разряду иммуномодуляторов. Кроме того, высокая противоопухолевая эффективность профилактического в/ж введения ИРП, обнаруженная при использовании модели перевиваемых опухолей мышей, позволяет считать целесообразным исследование противоопухолевой эффективности ИРП в отношении радиационно-индуцированных (радиогенных) опухолей и опухолей, индуцируемых химическими канцерогенами и др. факторами окружающей среды. В случае его эффективности в отношении профилактики опухолей, индуцируемых перечисленными факторами, ИРП крайне актуален для лиц, составляющих группу риска в отношении возможности развития злокачественных новообразований. Низкая токсичность ИРП и его выраженная противоопухолевая активность позволяют рекомендовать ИРП для проведения 1-ой фазы доклинических испытаний для выяснения его эффективности в качестве средства сопутствующей терапии.

Под влиянием другого иммуномодулятора, Гепона, проведена оценка иммунного контроля у больных оппортунистических инфекций?у больных ВИЧ-инфекцией, проанализирована активация образования антител к антигенам ВИЧ при лечении больных ВИЧ-инфекцией. Кроме того, оценена динамика роста основных субпопуляций лимфоидных клеток крови, влияние Гепона на продукцию антител. Проведено изучение зависимости иммуноадъювантного действия Гепона от его пептидной структуры.

Изучена динамика транскрипции генов цитокинов под действием Гепона в перевиваемых клетках человека. Показано их влияние на активацию неспецифического иммунитета у больных различными инфекционными заболеваниями. Доказано их вовлечение в активацию Т-хелперов, NK-клеток, макрофагов. Данные получены как in vitro, так и in vivo. Получены статистически значимые различия между контрольной и опытной группой больных, получавших лечение этими препаратами.

Изучена связь между структурой и иммуномодулирующими свойствами препарата Гепон. Описано иммуноадъювантное действие структурных фрагментов Гепона у лабораторных мышей в моделях первичного синтеза lgM-антител к антигенам гетерологичных эритроцитов и вторичного синтеза lgG-антител к растворимому гетерологичному белковому антигену. Установлено, что синтетические фрагменты, копирующие N-конец (НР1-5, НР1-9, НР1-11), С-конец (НР10-14, НР6-14, НР4-14), а также центральную часть (НР4-11 и НРЗ-12) молекулы Гепона, обладают иммуноадъювантным действием. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца не нарушает иммуноадъювантной активности пептида. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 3 аминокислотных остатка с каждого из концов полипептидной цепи приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств. Пентапептиды, копирующие N- и С-концы полипептидной цепи Гепона, обладают иммуноадъювантной активностью, сравнимой с Гепоном

На сегодняшний день препарат Гепон успешно применяется как самостоятельный иммуномодулятор, но, учитывая его мощные иммуностимулирующие свойства, может быть использован в качестве адъюванта при вакцинировании.

Последняя часть работы посвящена разработке диагностикума на туберкулез, созданного на базе рекомбинантных белков -антигенов ESAT-6 и CFP-10 М М.tuberculosis, которые могут стать реальной альтернативой малоинформативной реакции Манту.

Разработанный в рамках данной работы диагностический препарат на основе двух рекомбинантных белков М.tuberculosis в эксперименте показал высокую чувствительность и специфичность для диагностики туберкулезной инфекции. Внедрение разработанного диагностикума в практику здравоохранения позволит решить следующие задачи:

• Получить достоверные сведения о распространенности туберкулезной инфекции среди населения Российской Федерации;

• Организовать серийный выпуск высокостандартизованного диагностического препарата нового поколения, позволяющего дифференцировать иммунные реакции, обусловленные инфекцией М.tuberculosis, поствакцинальный иммунитет и неспецифические реакции, возникающие при инфицировании непатогенными микобактериями;

• Уменьшить бюджетные ассигнования на проведение флюорографических обследований, микроскопических и бактериальных исследований;

• Значительно оптимизировать расходы бюджетных средств за счет точной постановки диагноза и избежать необоснованных лечебных мероприятий;

• Уменьшить риск распространения полирезистентных штаммов М.tuberculosis, возникающий при необоснованном назначении антибиотиков.

Таким образом, в настоящей работе реализованы современные молекулярно-биологические подходы, с помощью которых возможна модуляция иммунитета при всех заболеваниях опухолевого, вирусного, бактериального происхождения, а также во всех других случаях, где требуется управление и контроль иммунного статуса пациента. Продемонстрировано, что моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) достигается с помощью абсолютно разных по своему происхождению веществ. С одной стороны, это вещества, созданные самой природой - обсуждаемые здесь новые классы антибиотиков, а также иммуномодулятор растительного происхождения (ИРП). Иммуномодулятор Гепон является пептидом внутриклеточного происхождения, конъюгаты на основе факторов роста - основы для направленного транспорта лекарственного начала в клетку. И наконец, разработка диагностикумов МНРИО на М. tuberculosis на базе специфических антигенов М. tuberculosis ESAT-6 и CFP-10, являющейся примером практического применения принципов моделирования направленной реактивности иммунного ответа. Одни из этих подходов уже используются в практическом здравоохранении, тогда как другие являются объектом приложения наукоемких и практических ресурсов самого ближайшего будущего.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Катлинский, Антон Викентьевич, 2004 год

1. Цитокины как регуляторы Thinh2 баланса лимфоцитов В 1986 году Mossmann с соавторами произвели своеобразный переворот в иммунологии, обнаружив, что CD4+ Th-лимфоциты

2. Роль ты и Th2 цитокинов в индукции иммунитета. 1.

3. Контроль за развитием Th1/Th2 клонов Факторы, специфического которые оказывают влияние на поляризацию на иммунного ответа, основанного преимущественной активности Th1- или Th2 -подтипов, наиболее изучены на мышах и человеке. Было установлено, что существует третий подтип Th-клеток, а именно ThO, который является предшественником клонов Th1 и Th2, и способен синтезировать цитокины обоих подтипов, в норме поддерживая определенное соотношение между ними. Дифференцировка лимфоцитов на Th1 и

4. Показано, что блокада гена STAT4 приводит к ингибированию T h l ответа (Sozzani et al.,1997). С другой стороны, IL-4 активирует STAT6, а нокаутные мыши по STAT6-reHy имеют дефектный Th2ответ (Steinman 1991; Yanagihara et al., 1998). При различных Th1/Th2 патологиях баланса, наблюдается при котором нарушение наибольшей нормального активностью обладает какой-то один из двух подтипов Т-клеток, и при этом спектр цитокинов одного типа превалирует над другим. 1.

5. Костимулирующие молекулы Выделяют, в основном, два таких стимула, способных привести к активации CD4(+) Т- клеток и их дифференцировки в подтипы Thi и Th

6. Источником одного из них являются, с одной стороны, антиген-представляющие клетки (АРС), а с другой т.н.

7. Антиген-представляющие и дендритные клетки Специфический незрелых иммунный ответ начинается с клеток, активации именуемых антиген-представляющих дендритными клетками (DC), источником которых являются

8. Схема активации различных типов иммунных ответов, обусловленных влиянием ТЫ- и Th2- цитокинов.

9. Главный комплекс гистосовместимости

10. Пути представления антигенов.

11. Пути представления антигенов По способности представлять антигены на своей поверхности все клетки организма человека можно

12. Причины низкой иммуногенности опухоли. 2.2.

13. Низкий уровень экспрессии опухолевых антигенов и MHCI. Помимо низкого уровня экспрессии ОСА опухолевой клеткой, ее низкой иммуногенности может способствовать снижение или

14. Большая часть опухолей происходит из паренхимных или мезенхимных клеток, не экспрессирующих В7, поэтому способность опухолевых клеток представлять антиген должна быть важных механизмов, определяющих низкую иммуногенность опухолей даже для клеток экспрессирующих МНС и OCA(Schwar2, 1990). 2.2.

15. Клетки-эффекторы в системе противоопухолевой защиты организма В организме в процессе эволюции выработаны механизмы распознавания и элиминации трансформированных и инфицированных вирусами клеток. К системе противоопухолевой

16. Иммунотерапия рака Интенсивные исследования в области иммунологии опухолей позволили разработать несколько направлений в лечении рака, основанных иммунной на специфической организма. активации Это отдельных звеньев при защиты миелотрансплантация, которой осуществляется перенос стволовых клеток для замещения

17. Противоопухолевая активность коньюгатов альфафетопротеина (AFP) с цитотоксическими препаратами (ЦП).