Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат химических наук Норенко, Лада Михайловна

• Норенко, Лада Михайловна
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Норенко, Лада Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ__4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ__8

1.1. Экологические проблемы, возникающикающие

при получении энергии из ископаемого топлива_8

1.1.1. Исчерпание ископаемых топливных ресурсов _8

1.1.2. Энергетика на ископаемом топливе -

глобальное загрязнение_10

1.1.3. Современное моторное топливо : экологическая

опасность № 1___14

1.2. Возобновляемое сырье как источник энергии_17

1.2.1. Сырьевые источники возобновляемой энергии_19

1.2.2. Биоэтанол как альтернатива ископаемому топливу_

1.2.3. Бразильская спиртовая программа _26

1.3. Технология получения этанола из биомассы _29

1.3.1. Основные характеристики

целлюлозосодержащих материалов_31

1.3.2. Паровой взрыв - экологичный метод

предобработки растительных материалов_37

1.3.3. Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья-ключевая стадия получения биоэтанола_Ц

1.3.4. Реакторы для ферментативного гидролиза_43

1.4. Математическое моделирование и оптимизация процессов

ферментативного гидролиза целлюлозы__47

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ_53

2.1. Исходные вещества_53

2.2. Методы определения компонентного состава древесины_53

2.2.1. Определение экстрактивных веществ_53

2.2.2. Определение содержания гемицеллюлозы_54

2.2.3. Определение целлюлозы_54

2.2.4. Методы определения лигнина_55

2.3. Метод проведения ферментативного гидролиза_56

2.4. Метод определения восстанавливающих Сахаров_56

2.5. Определение глюкозы в ферментных гидролизатах_58

2.5.1. Определение содержания глюкозы_58

2.6. Определение активности ферментов целлюлазного комплекса_59

2.6.1. Определение суммарной целлюлазной активности_59

2.6.2. Определение целлобиазной активности_60

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_

3.1. Получение исходных данных для построения

математической модели эксперимента_

3.1.1. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза_

3.1.2. Биосинтез целлюлаз на отходах

ферментативного гидролиза_

3.2. Моделирование циклической схемы биоконверсии лигноцеллюлозного сырья_

3.2.1. Подсистема изменения вязкости в процессе гидролиза_74

3.2.2. Подсистема проникновения ферментов вглубь целлюлозного субстрата_86

3.2.3. Подсистема образования Сахаров в ходе гидролиза_91

3.2.4.Система биосинтеза ферментов на отходах гидролиза_99

3.3. Оптимизация циклического процесса биоконверсии растительного сырья в рамках предложенной модели__107

ВЫВОДЫ_124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ_126

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование экологически безопасного циклического процесса биоконверсии растительного сырья»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы :

В настоящее время все развитые страны уделяют большое внимание проблеме парникового эффекта. Согласно решению Конференции ООН по окружающей среде и развитию [Рио-де-Жанейро, 1992 г.], выброс парниковых газов к 2000 г. должен быть сокращен до уровня 1990 г. при одновременном сохранении темпов роста промышленности. Однако, оценка выбросов диоксида углерода за последнее десятилетие, проводимая ООН, зафиксировала повышение уровня на 20-25%. Таким образом, необходимость снижения эмиссии углерода стала глобальной мировой задачей,

Помимо глобальных экологических задач, существуют локальные задачи^ требующие немедленного разрешения, В России, при сегодняшней стагнации промышленности, такой проблемой, особенно для больших городов, стали отработанные газы двигателей автомашин. В Москве, по данным экологической милиции, их доля достигает 85% от общих выбросов парниковых газов.

В США для 9 наиболее загазованных городов проблема решается путем введения бензина новой формулы, содержащего оксигенаты. Наиболее распространеной добавкой в бензин является этанол. Смесь бензина с 10-20% этанола может использоваться в обычных двигателях без конструктивных изменений. Добавка этанола заменяет тетраэтилсвинец, используемый для повышения октанового числа и, как следствие, почти полностью прекращает загрязнение свинцом почвы и атмосферы.

Если прогнозировать получение этанола на перспективу - есть один способ - биотехнологический.

Ферментативный способ получения моносахаридов во многом лишен недостатков, присущих способу, основанному на кислотном

гидролизе, поскольку осуществляется в гораздо более мягких условиях по температуре, давлению и кислотности среды. Это требует значительно меньших расходов энергии, предотвращает деструкцию Сахаров и образование трудно утилизируемых отходов, снижающих биологическую ценность гидролизатов. Одновременно появляется возможность решения экологических проблем, связанных с необходимостью создания биотехнологических методов утилизации отходов и вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растительного сырья.

Для того, чтобы этот способ получения этанола стал экономичным и экологичным, необходимо, чтобы он был замкнутым.

Этим аспектам и посвящена данная работа, являющаяся составной частью исследований Экобиоцентра Института биохимии им. А. Н. Баха РАН и РУДН, направленных на создание экологически чистой технологии утилизации сельскохозяйственных, промышленных и городских отходов растительного происхождения.

Целью настоящей работы является оптимизация процесса ферментативной деструкции целлюлозосодержащего сырья, включающая в себя : выбор и разработку аппаратурного оформления процесса, условия проведения ферментативного гидролиза, анализ полученных сахарных сиропов, моделирование и оптимизацию процесса ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья с подпиткой исходным субстратом в ходе гидролиза, моделирование процесса культивирования гриба-продуцента целлюлаз на лигноцеллюлозных отходах после

гЪр.пмеНтатиттпгп гмттлпттгтзя

Научная новизна;

- Предложена схема циклической переработки растительного сырья, позволяющая повысить степень экологической чистоты процесса.

Показана возможность ферментативного гидролиза концентрированных суспензий лигноцеллюлозного сырья с содержанием субстрата 20-25% по массе.

Разработан и испытан новый тип биореактора, позволяющий проводить гидролиз вязких концентрированных суспензий в режиме непрерывной подгрузки субстрата и отвода растворимых продуктов гидролиза,

- Получены концентрированные растворы Сахаров с содержанием глюкозы до 16%.

- Разработана математическая модель двухстадийного процесса переработки растительного сырья, состоящей из стадии ферментативного гидролиза с подпиткой и стадии культивирования гриба-продуцента целлюлаз на лигноцеллюлозных отходах гидролиза,

Разработан новый принцип управления процессом ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы, основанный на анализе изменения вязкости суспензии субстрата в условиях непрерывной деструкции его частиц. Предложена эмпирическая формула расчета относительной вязкости такой системы в процессе гидролиза,

Практическая значимость работы. Предложенная схема двухстадийной утилизации растительного сырья является малоотходной, т, к, культивирование микроорганизмов ведется на твердых отходах стадии гидролиза, что одновременно снижает себестоимость ферментного препарата.

Разработаны методы ферментативного гидролиза отходов производства фурфурола для получения концентрированных сиропов Сахаров, с целью их последующего сбраживания в этанол. Эти методы являются экологически более безопасными по сравнению с применяемыми в отечественной гидролизной промышленности, а получаемые основные и побочные продукты могут быть использованы без какой-либо дополнительной очистки.

Предложены варианты упрощения аппаратурного оформления процесса гидролиза сырья, позволяющие сделать его менее энерго- и материалоемким за счет совмещения нескольких циклов (гидролиз и фильтрация).

Разработанная математическая модель показала пути оптимизации и управления процессом.

Заключение диссертации по теме «Экология», Норенко, Лада Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Обоснована циклическая схема утилизации растительного сырья, с получением этанола в качестве конечного продукта, являющейся экологически более безопасной альтернативой существующей в нашей стране кислотному способу гидролиза древесины. Схема включает ферментативный гидролиз лигноцеллюлозы с образованием 15-20% глюкозного сиропа для сбраживания в этанол. Обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибом-продуцентом ферментов с образованием высокоактивных целлюлаз, используемых на стадии гидролиза. Единственный побочный продукт - лигнин - сохраняет природную структуру, не содержит токсичных примесей и является экологически безопасным.

2. Отработаны условия проведения процесса ферментативного гидролиза в биореакгоре нового типа, позволяющем работать с концентрациями субстрата до 25 масс. % в условиях вязкой лигноцеллюлозной суспензии с подгрузкой и отводом продукта гидролиза.

3. Определены фракционный, компонентный состав и степень конверсии субстрата на разных стадиях гидролиза,

4. Разработана математическая модель управления процессом подгрузки субстрата в реакцию в ходе гидролиза на основани предлагаемых уравнений расчета относительной вязкости, цчитывающих изменение размеров частиц субстрата под действием ферментов,

5. Путем численного моделирования определены оптимальные значения степени конверсии субстрата//.£%), продуктивности процесса (^г/л*час), концентрации Сахаров ^//(|г/л) для реализации циклической схемы.

6. Теоретически обоснован оптимальный выход ферментов при культивировании на обедненном целлюлозой остатке с определенным соотношением целлюлозы и лигнина.

Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям профессору Ю.П.Козлову и доктору химических наук М.Л.Рабиновичу за постоянную помощь, внимание и заботу при выполнении работа.

Автор признателен также коллективу Экобиоцентра экологического факультета РУДН и ИБХ им. А.Н. Баха за плодотворные дискусии, безусловно способствовавшие более четкому определению цели, методов и выводов исследования.

Заключение.

Таким образом, резюмируя сказанное, можно отметить, что экологически чистое топливо будущего - биоэтанол, получаемый из возобновляемых источников, в чистом виде или в виде добавки к бензину может решить многие из экологических проблем, стоящих перед человечеством.

В настоящий обзор не вошло детальное рассмотрение процесса получения этанола, хотя по даному вопросу существует большое количество литературы, описывающей процесс с использованием : имобилизованных клеток дрожжей, бактерий 1утотопаз МоЫНз, рекомбинантных штаммов, способных одновременно сбраживать гексозы и пентозы, а также термофильных анаэробных бактерий типа ШозЫйшт, способных осахаривать с одновременным переводом Сахаров в этанол.

Причина, по которой эти процессы остаются за рамками данной диссертационной работы, заключается в том, что существующая технология производства этанола из гидролизатов с высокой концентрацией углеводов является зрелой в инженерном отношении и может быть успешно применена, если производство последних будет оправданно с экономической и экологической точек зрения. Поэтому мы сконцентрировали свое внимание на процессе получения ферментативных гидролизатов лигноцеллюлозных материалов. Этому и посвящена экспериментальная часть работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Исходные вещества

Субстраты. В качестве субстрата для ферментативного гидролиза были использованы промышленные отходы фурфурольного производства коры дуба, подвергнутые паровой обработке на Шумерлинском химическом заводе. Предназначенное для последующей ферментативной деструкции сырье представло собой темно-коричневую мелковолокнистую массу со слабым фурфурольным запахом и размером частиц, не превышающим 1 мм.

Ферменты. Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих субстратов осуществлялся композиционным препаратом на основе очищенных ультрафильтрацией выпускаемых Приволжским биохимическим заводом целловиридина ГЗх (продуцент - Trichoderma reesei) и пектофоетидина (продуцент - Aspergillus foetidus). Активность композиционного препарата составляла 7-9 IFPU/r по фильтровальной бумаге и 2 IFPU/r по целлобиазе,

В качестве источника целлюлаз использовали также фильтраты культуральной жидкости Т[reesei штамма F-120 и мутантов этого гриба, полученные Е.С.Морозовой во ВНИИгенетика.

2.2, Методы определения компонентного состава древесины. 2.2.1. Определение экстрактивных веществ (смол). Экстрактивные вещества удаляли последовательной экстракцией древесных образцов спиртотолуольной либо спиртобензольной смесью (1 : 2), ацетоном, диэтиловым эфиром в аппарате Сосклета в течение 24, 24, 12 часов соответственно. Опилки высушивали от экстрагента, промывали горячей водой и вновь высушивали до воздушно-сухого состояния. Влажность определяли по стандартному методу TAPPI [55].

2.2.2.Содержания гемицеллнмозы определяли по разности массы образца до и после гидролиза 1 н К^СЬ [54 ]. 10 г образца смешивали с 500 мл 1 н ЬЬБСи и кипятили при температуре 98°С в течение 5 часов. Затем осадок отфильтровывали, высушивали до постоянного веса и взвешивали.

2.2.3. Определение целлюлозы азотно-спиртовым методом по Кюшнеру [55].

Навеску (1 г) субстрата помещали в коническую колбу объемом 250 cмJ и добавляли 25 см азотно-спиртовой смеси (1 объем конц. Н1ЧОз (р=1,4 г/см ) и 4 объема 95%-ного С2Н5ОН). Кипятили с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа. Остужали, фильтруя через высокий стеклянный фильтр. Затем опилки смывали азотно-спиртовой смесью обратно в колбу и снова кипятили 1 час. Такую обработку проводили 3-4 раза. Признаком конца делигнификации служило отсутствие красного окрашивания при действии на пробу целлюлозы (несколько волокон) солянокислого раствора флороглюцина. Присутствие лигнина обнаруживали по оранжево-желтому окрашиванию.

После последней обработки целлюлозу отфильтровывали через стеклянный пористый фильтр, промывали 10 см" свежей азотно-спиртовой смеси, а затем горячей водой до получения неизменного цвета метилоранжа. Фильтр с целлюлозой сушили в сушильном шкафу при температуре 103 ±20 С до постоянной массы и взвешивали.

Массовую долю целлюлозы, % к абсолютно сухой древесине, рассчитывали по формуле:

С = ((М1-М)/в) * 100, где М] - масса фильтра с целлюлозой , г

М - масса пустого фильтора , г О - масса абсолютно сухой навески древесины , г

2.2.4. Методы определения лигнина в образцах.

Сернокислый лигнин определяли как нерастворимый осадок после ступенчатого отделения экстрактивных веществ, гемицеллюлозы и целлюлозы.

Методика определения лигнина по ГОСТ 4845-54.

Навеску (1 г) обесмоленного и экстрагированного горячей водой субстрата помещали в коническую колбу на 250 мл. Туда же прибавляли 10 мл HCl и оставляли в термостате на 30 мин при 30° С, встряхивая через каждые 5-6 мин. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и прибавляли 90 мл 72% -ной H2S04. После этого вновь оставляли ее в термостате при температуре 20 ±2° С на 1,5 часа, встряхивая через 10=15 мин. Затем приливали 150 мл дистилированной воды, нагревали 12-25 мин и кипятили 1,5-2 мин с обратным холодильником. Остаток охлаждали, фильтровали, промывали горячей водой и сушили при 100° С до постоянной массы. Массовую долю лигнина рассчитывали по формуле:

М = ((М1-М2)/М3) * 100, где М - массовая доля лигнина в субстрате, % М2 - масса фильтра с остатком, г М2 - масса пустого фильтра, г

М3 - масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г.

Методика определения лигнина по Комарову,

1 г обессмоленного субстрата помещали в колбу на 250 мл, прибавляли 15 мл 72%-ной H2S04 и оставляли в термостате на 2,5 часа при температуре постоянно перемешивая. Затем прибавляли 200 мл дистиллированной воды и кипятили на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Фильтровали остаток, высушивали его в сушильном шкафу при Ю0°С. Массовую долю лигнина рассчитывали по формуле :

М = ((М, - M.J/Mj) * 100, где М - массовая доля лигнина в субстрате, % М; - масса фильтра с остатком , г М2 - масса пустого фильтра, г

М3 - масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г.

2.3. Метод проведения ферментативного гидролиза.

Процедура гидролиза лигноцеллюлозных остатков заключалась в следующем : в мерном стакане объемом 1 л смешивали 100 г субстрата и

-5

225 см раствора целлюлазного препарата. Полученную густую вязкую суспензию выливали в термостатируемый конический реактор объемом 400 мл. Момент смешения фермента и субстрата принимали за начало реакции. Перемешивание осуществлялось посредством перистальтического насоса. Ферментативный гидролиз осуществляли при 50°С, рН=4,5 в течение 48 часов в нестерильных условиях. Для определения количества образующихся редуцирующих веществ и глюкозы в ходе ферментативного гидролиза с помощью ультрафильтрационной мембраны отбирали пробы гидролизатов объемом 0,5 мл.

2.4. Метод определения восстанавливающих Сахаров.

Определение концентрации востанавливающих Сахаров проводили динитросалициловым методом [162]. Стандартная процедура анализа заключалась в следующем : 0,5 мл исследуемого раствора помещали в градуированную пробирку объемом 10-15 мл и добавляли 1,0 мл динитросалицилового реагента. Смесь кипятили 5 мин на водяной бане, охлаждали до комнатной температуры, добавляли 1,5 мл дистилированной воды, тщательно перемешивали и определяли оптическую плотность раствора на длине волны 540 нм относительно кюветы сравнения, содержащей буферный раствор. Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по калибровочному графику, используя в качестве стандарта раствор глюкозы. График имеет линейный з ? вид для концентрации глюкозы 1*10" - 2*10 М.

Восстанавливающие сахара определяли также методом Шомоди-Нельсона [181]. Принцип метода состоит в первоначальном количественном окислении восстанавливающих Сахаров, образовавшихся при ферментативном гидролизе лигноцеллюлозы реактивом Шомоди в щелочной среде (рН 9) с образованием закиси меди и последующем окислении арсеномолибдатным реактивом Нельсона в кислой среде (рН 1,7-2,0) с образованием молибденовой сини, окраска которой устойчива в течение 24-36 часов.

К 1 мл ферментного гидролизата прибавляли 1 мл реактива Шомоди в мерных пробирках на 10 мл. Затем в течение 15 минут кипятили на водяной бане, охлаждали раствор после чего прибавляли 1 мл реактива Нельсона и доводили до объема 10 мл дистиллированной водой. Образующиеся сахара регистрировали по изменению оптической плотности раствора при помощи спектрофотометра Specord М40 при длине волны 610 нм. Содержание редуцирующих веществ рассчитывали по уравнению, полученному на основании статистической обработки результатов анализа 20 стандартных растворов глюкозы:

РВ=К*Д*К (г/л), где РВ - редуцирующие вещества,г/л; Д - поглощение окрашенного раствора при X = 610 нм; N - разведение исследуемого раствора.

Приготовление реактива Шомоди: Раствор 1: а) Взвешивали 30 г ИагСОз* 10 НзО (или 11,1 г №2СОз*безв.) и 12 г СШЮбК Na* 4 Н2О (или 10,47 г СиНЮвК Na* 2 Н2О) и растворяли соли в 250 мл дистиллированном воды. б) Смешивали раствор (а) с 40 мл 10 %-ного раствора медного купороса (4,2 г CuS04*5Ha0 в 35,8 мл диет. Н2О). в) К раствору (б) добавляли 1.6 г безводного бикарбоната Na.

Раствор 2: 18 г Na2SÜ4 растворяли в 500 мл диет. Н2О и кипятили в течение 1 часа. Затем раствор охлаждали, прибавляли раствор 1 и доводили объем до 1000 мл дистиллированной водой.

Приготовление реактива Нельсона. Взвешивали 25 г (NH4)2Mo04 Н2О и растворяли в 450 мл диет, воды, затем добавляли 25 мл конц, H2SO4 , в которой было растворено 4,3 г КазАв04. Доводили объем диет, водой до 500 мл. Выдерживали при температуре 36-40°С в течение 48 часов и отфильтровывали.

2.5. Определение углеводного состава ферментных гидролизатов лигноцеллюлозы.

2.5.1. Определение содержания глюкозы в ферментных гидролизатах лигноцеллюлозы определяли глюкозоксидазно-пероксидазным методом [58] с использованием глюкозоксидазы отечественного производства (активность 380 тыс. ед/г), пероксидазы из хрена (350 тыс. ед/г) производства "Реанал " Венгрия, Д-глюкозы марки х,ч. "Реахим ", о-дианизидина марки ч. "Реахим Регистрацию нарастания оптической плотности проводили при постоянной длине волны 460 нм на спектрофотометре Specord М40 (Carl Zeiss Jena, ГДР), используя кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см,

Хроматографический анализ глюкозы проводили методом высокоэффективной . жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на аналитическом хроматографе "Милихром". Для анализа использовали колонку размером 2*80 мм с носителем "Сепарон БСХ N132". Подвижной фазой была взята смесь ацетонитрил-вода с объемным содержанием ацетонитрила 70%. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,1 мл/мин в условиях изократического элюирования. Сахара детектировали с помощью дифференциального рефрактометра ЯШК 101 с объемом проточной кюветы 8 мкл. В качестве стандартов использовали растворы Сахаров известной концентрации. Идентификацию проводили по временам удерживания свидетелей. Концентрацию соответствующего продукта определяли по высоте пика, используя калибровочный график, с точностью не менее 5%. Высота пика пропорциональна концентрации соответствующего сахара в диапазоне 0,1-50 г/л. 2.6, Определение активности ферментов целлюлазного комплекса. 2,6.1, Определение суммарной целлюлозной активности заключалось в регистрации образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги восстанавливающих Сахаров [113, 152, 153]. Субстратом служила фильтровальная бумага "\¥а1тап №Р'. В две пробирки помещали сложенную гармошкой фильтровальную бумагу весом 50 мг. Так как в ферментном препарате могут содержаться редуцирующие сахара, параллельно готовили контрольную смесь, не содержащую субстрата. Во все три пробирки приливали по 1 мл цитрат-фосфатного буфера рН 4.8 и помещали в термостат при 50° С на 5 мин. Затем приливали во все пробирки исследуемый ферментный препарат (в опытные пробирки -разных разведениях) ^ закрывали пробками и термостатировали в течение 1 часа. После инкубации из контрольного и опытных растворов отбирали по 1 мл ферментного гидролизата и определяли в нем редуцирующие вещества по методу Шомоди-Нельсона [181, 164]. Суммарную целлюлазную активность определяли по формуле :

С0-Ск)*555*п

Аоб = -, мкмоль /мин

Е*1 где С0 и Ск - концентрация Сахаров в опытной и контрольной (без субстрата) пробах, определенная фотометрическим методом, г/л; п - разведение исследуемого раствора;

Е - концентрация исследуемого ферментного препарата, г/л; I - время гидролиза, мин,

2.6.2. Определение целаобиазной активности проводили по методу Клесова с соавторами [38], Метод основан на регистрации восстанавливающих групп в растворе при ферментативном гидролизе целлобиозы. Раствор целлобиозы (0,2 мл) в 0,02 М ацетатном буфере рН 4,5 термостатировали при 40 0 С, затем приливали к нему 0,1-0,2 мл раствора фермента в том же буфере. Доводили буфером общий объем инкубационной смеси до 2 мл.

Параллельно то же самое делали с контрольной пробой (без субстрата).

После инкубации смеси в течение 30 мин отбирали пробу объемом 1 мл и проводили количественный анализ на содержание глюкозы. Активность целлобиазы рассчитывали по уравнению:

С0-Ск)*2921*п

Ацб = - , мкмоль /мин

Е*1 обозначения те же, что и выше).

Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1. Получение исходных данных для построения математической модели.

В результате исследований процесса ферментативного гидролиза л игно целлюлозного сырья и культивирования микроорганизмов -продуцентов целлюлаз на трудногидролизуемых остатках гидролиза сложилась общая концепция комплексной малоотходной утилизации растительного сырья методами, не требующими никаких химических агентов, кроме неорганических солей. Эта концепция может быть представлена в виде следующей схемы : сжигание

Схема 1. Комплексное использование растительного сырья.

Предложенная циклическая схема биоконверсии растительного сырья состоит из трех стадий. На первой стадии проводится частичный ферментативный гидролиз лигноцеллюлозы с образованием глюкозного сиропа концентрацией до 20%. На второй стадии труднометаболизируемый, обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибом-продуцентом целлюлаз с образованием высокоактивных ферментов для стадии гидролиза. Конечной стадией является микробиологическое сбраживание глюкозно-ксилозных сиропов в биоэтанол. Такая технология является замкнутой и, следовательно, экологически более безопасной. Единственным твердым остатком является лигнин, который, в отличие от получаемого в гидролизной промышленности высококонденсированного лигнина со значительным содержанием серной кислоты, является фактически природным лигнином и в этом отношении не представляет никакой экологической опасности.

3.1.1. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза реального отхода фурфурольного производства.

Начальной стадией процесса гидролитического получения Сахаров ( см. схему 1) является стадия предобработки исходного субстрата с целью повышения реакционной способности последнего и увеличения скорости гидролиза.

В обзоре литературы показаны преимущества такого способа предобработки, как паровой взрыв, существенно увеличивающего реакционноспособность сырья и не использующего никаких химических реагентов. После такой предобработки разрываются связи между компонентами клеточной стенки древесины, лигнин выплавляется наружу, становится низкомолекулярным и более легкодоступным. Что касается целлюлозы, то паровой взрыв увеличивает ее пористость и площадь доступной ферментам поверхности, при этом скорость энзиматического гидролиза увеличивается на порядок, а выход Сахаров приближается к теоретически возможному.

Эти соображения предопределили выбор субстрата для разработки технологической схемы. Таковым стал реально существующий отход коры дуба фурфурольного производства Шумерлинского химического завода, технология получения которого близка к технологии обработки древесины в процессе парового взрыва.

В этой связи представляет интерес сопоставление взятого образца с обработанным взрывным автогидролизом образцом быстрорастущей породы ивы, любезно предоставленными профессором Гвидо Заччи (университет г. Лунда, Швеция).

Внешне образцы коры дуба и ивы сходны и представляют собой темно-коричневую мелковолокнистую массу со слабым фурфурольным запахом и размером частиц, не превышающим 1 мм. Необходимо отметить, что отход коры дуба прошел на производстве стадию удаления гемицеллюлоз. Поэтому для их удаления из образца ивы, последний подвергали водной экстракции. Результаты исследования компонентного состава обоих образцов приведены в таблице 10, Таблица 10.

Исследование компонентного состава образцов коры дуба и предобработанной паровым взрывом ивы с водной экстракцией и без нее.

Компоненты клеточной стенки древесины Рл TTiMtWQ 1TU А n A^nitOUQV ^^Дч^рлчлы.пл^ о ш/ра^цаЛ) /и . riAVArfUI- Iii. . 1DLJCL образец ивы «X. ГПр*. I »х : ОЛ ГТЛ" 0^X1,0 XI. образец ивы овтт: .:;: коры дуба

СМОЛЫ* 10,8 12 13,5

ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ 11 0 3-5

ЛИГНИН 19-23 22-26 28-32

ЦЕЛЛЮЛОЗА 55-59 62-66 48-52 - термин СМОЛЫ обозначает все вещества, извлекаемые последовательными экстракциями по методикам, описанным в [Оболенская и др., 1990], включая алифатические и ароматические кислоты и углеводороды, терпены, фенолы, смоляные и жирные кислоты, эфирные масла, смолы, жиры, стерины, таннины, красители, камеди, пектиновые и дубильные вещества, т.е. все неуглеводные и нелигниновые компоненты клеточной стенки.

Представленные результаты указывают на близость компонентного состава образца коры дуба и промытого водой предобработанного паром образца ивы. Небольшое расхождение образцов в соотношении лигнин : целлюлоза, возможно, связано с различием в породах и биологическом возрасте исходной древесины.

Отсутствие гемицеллюлозной фракции в изучаемом отходе коры дуба упрощает общий процесс за счет исключения стадии водной экстракции, необходимой при ферментативном гидролизе обработанной паром древесины [Sinitsynet aL, 1981],

Таким образом, взятый исходный субстрат коры дуба состоит из целлюлозы (48-52%), смол (13,5%), лигнина (28-32%) и не содержит гемицеллюлозной фракции, иначе говоря, представляет собой лигноцеллюлозу в формулировке Л .А. Головлевой, где термин "лигноцеллюлоза" определяется как природный комплекс, состоящий из лигнина и целлюлозы, структурно и химически связанных между собой. В дальнейшем будем пользоваться этим термином.

Эффективность процесса гидролиза зависит от уровня активности компонентов целлюлазного комплекса, минимальные требования к которому заключаются в том, чтобы он имел высокую экзоглюканазную активность, без которой невозможен глубокий гидролиз целлюлозы, а также необходима высокая целлобиазная активность для конверсии промежуточного растворимого продукта (целлобиозы) в глюкозу, являющуюся целевым продуктом гидролиза. Для гидролиза предобработанных таким способом субстратов оптимальная активность ферментного препарата по данным [Saddler, 1996] составляет 8-10 IFPU/r субстрата. Использование большего количества фермента нецелесообразно по экономическим соображениям. В данной работе использовались ферментные препараты в соотношении 7-9 IFPU/r субстрата. Данное соотношение позволяло быстро достигать высокой концентрации Сахаров и степени конверсии целлюлозы 80-85%.

Ферментативный гидролиз осуществлялся при 45-50 °С, рН=4,5 в течение 48 часов в нестерильных условиях. Исходная концентрация субстрата достигата 20-25 % по массе, что в 1,5-2 раза превышает обычно используемые концентрации (10-15%).

Для реализации процесса ферментативного гидролиза густых суспензий лигноцеллюлозного сырья был разработан и испытан реактор конического типа объемом 400 мл с насосом .для равномерного перемешивания реакционной массы и ультрафильтрационным модулем для непрерывного отбора проб в ходе гидролиза. Конструкция предлагаемого реактора позволяет вести процесс ферментативного гидролиза с подгрузкой новыми порциями субстрата и одновременным удалением гидролизата. Схема реактора представлена на рис. 11.

Реактор предлагаемого типа состоит из рабочей емкости (I), снабженной теплообменником для поддержания оптимальной для гидролиза температуры 45-50°С, Через эту емкость посредством перистальтического насоса (II) осуществляется циркуляция фермент-субстратной суспензии. Другой частью реактора является фильтрационный модуль (III), позволяющий осуществить " вывод растворимых продуктов гидролиза из контура циркуляции. Работа реактора начинается с загрузки в открытую рабочую камеру реакционной массы, причем перемешивание последней и дальнейшая ее циркуляция через контур, включающий фильтрационную мембрану осуществляется перистальтическим насосом. После частичного отделения гидролизных продуктов негидролизованный остаток вновь поступает в рабочую камеру. Подобная замкнутая система благодаря совмещению нескольких циклов (гидролиз и фильтрация) позволяет наиболее эффективно использовать ферментные компоненты реакционной смеси и с наименьшими затратами энергии осуществлять гидролиз исходного сырья.

8 + Е + Рперемешивающее устройство

III I

III

ФИЛЬТРАЦИОННЫЙ МОДУЛЬ

Б - субстрат Е - фермент Р - продукт гидролиза (глюкоза)

Рис. 11. Схема реактора для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья.

Преимуществами предложенного реактора по сравнению с ранее известными типами реакторов являются:

- возможность использования густых концентрированных (20-25% по массе) суспензий субстрата;

- высокая производительность на единицу объема реактора;

- простота и экономичность конструкции;

- возможность непрерывного отвода растворимых продуктов гидролиза;

- возможность постоянного введения новых порций реакционных компонентов.

В таблице 11 приведены типичные показатели процесса ферментативного гидролиза отходов фурфурольного производства коры дуба с использованием реактора нового типа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Норенко, Лада Михайловна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Артур Д. Реакции, иницированные излучением высокой энергии. Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974. Т. 2. С. 356-291.

2. Атлас древесины и волокон для бумаги. /Е.С.Чавчавадзе и др. М.: Ключ. 1992. 336 с.

3. Безбородов A.M., Астапович Н.И. Секреции ферментов у микроорганизмов. М.: Наука, 1984. 70 с.

4. Безбородов A.M. Биотехнология продуктов микробного синтеза : Ферментативный катализ как альтернатива органического синтеза. М.: Агропромиздат, 1991. 23 с,

5. Безбородов A.M., Аксенов А. В. Математическое моделирование микробиологических процессов, Пущино-на-Оке, 1973, 271 с.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической энженерии. /(Перевод с англ, А,А,Кирюшкина).Мл Мир, 1989. т.1, 2,

7. Березин И.В., Калунянц К.А., Рабинович М.Л., Клесов A.A. А.С.СССР № 949002. Способ получения сахара из целлюлозосодержащего сырья./ Бюл. - 1982. - № 29.

8. Березин И,В,, Калунянц К,А,, Рабинович MJL, Клесов А,А, А.С-,СССР № 962310. Аппарат для гидролиза полисахаридного сырья./ Бюл. - 1982. -№ 36.

9. Билай В. И., Билай Т. И, Мусич Е. Г. Трансформация целлюлозы грибами, Киев, 1982, 295с,

10.Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья. Сыктывкар, 1992. 76с.

11.Биотехнология. Принципы применения / под. Ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Д. Джонса. М., 1988. 479с.

12.Бирюков В,В,, Кантере В,М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.Наука. 1985. 296с.

13.Блэквол Д. Влияние различных обработок на микроструктуру целлюлозы // Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974. Т. 1. г

V^ • I ^ +J w' •

14.Босняцкий Г.П., Григорян К.Б., Кобзев Ю.В. Оценка экологической ситуации при отказе от использования природного газа //Экология в газовой промышленности, 1996. с.26-27.

15.Варфоломеев СД,, Калюжный C.B. Биотехнология, Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высш. ж., 1990. 294 с.

16.Гельфанд Е.Д. Комплексное совершенствование гидролизных производств с позиции экологической безопасности. Дисс. д.техн.н. Архангельск. 1996.

17.Глегг P.E., Ганг Л. Дж., Бруэр Р. Дж. Функционирование целлюлозы //Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974, Т, 1. С. 382-412.

18.Головлева Л.А., Ганбаров Х.Г. Микробная деградация лигнина// Успехи Микробиологии. М.: Наука, 1982.-Т 17. с136-158.

19.Грачева И, М, Гаврилова H, Н., Иванова Л, А, Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980. С. 83-90.

20.Гравитис А.Я., Эринш П.П., Веверс П,Я, Структурные изменения древесины в процессе взрывного автогидролиза и их влияние на ферментативный гидролиз углеволов. Тез, докл, 2-го научн, семинара "Превращения древесины при ензиматическом и микробиологическом воздействиях". Рига, 1985. с.67-73.

21.Гравитис А.Я. Теоритические и прикладные аспекты метода растительной биомассы. Химия древесины, 1987. №5. с.3-21.

22.Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. Математическая модель ферментативного гидролиза целлюлозы препаратом гриба Trichoderma longibrachiatum в реакторе периодического действия.// Приют, биохим. микробиол. 1986. Т 22, № 1. с,59-69.

23.Демьяненко Я.М. Проблемы комплексного использования ресурсов лесных экосистем. Дисс. к.б.н. Ростов н/Д. 1996.

24.Дмитриевский А.Н. Ресурсы углеводородного сырья и экологические проблемы их освоения // Экология в газовой промышленности, 1996. с.16-17.

25.Дорохов И.Н., Рабинович М.Л., Чань Хань Фук Новый принцип технологического и аппаратурного дизайна для ферментативных реакций в гетерогенных системах // Докл. РАН, 1993. № 332. С. 741-745.

26.Дорохов И.Н., Рабинович М.Л., Чань Хань Фук Новый класс гетерогенных реакторов для ферментативного превращения нерастворимых биополимеров// Теор. основы химич. технол., 1994. № 28. с. 505-514.

27.Евилевич А. 3,, Ахкмина А. И,, Разкин М. Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982. С. 4-40.

28.Блинов И. П. Химия микробных полисахаридов. М., 1984. С.162.

29.Жалсрайн А. Выращивание целлюлолитических ферментов Тпс1юс1егта геезе1 на труднометаболизируемых соединениях углерода, Дисс, к.б.н., М., 1993.

30.Иванов В.А., Марченко А,Е, Влияние распределения частиц наполнителя по размерам на реологические параметры концентрированных суспензий с неньютоновской матрицей // Исследование течений и фазовых превращений в полимерных системах. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1985. С. 95-105.

31.Иванов С.Н. Технология бумаги. М.: Лесная пром., 1970. с.696.

32.Калинникова Т В., Кантере В.М., Гернет М,В, и др. Математическое моделирование и оптимизация процесса биосинтеза целлюлазы//Ферменты микроорганизмов и деградация биополимеров. М.:ВНИИСЭНТИ, 1990. с.30-37.

33.Калунянц К. А., Шаненко Е. Ф., Зайцева Л. В. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов // Итоги науки и техники . Сер. Хим. и технол. Пищ. Прод. М., 1988. Т. 7. 187 с.

34.Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологического производства. М., Агропромиздат, 1990. 367с.

ЗЗ.Каткевич Р.Г., Каткевич Ю.Ю., Лиепиня Д.Э. Ферментативный гидролиз полисахаридов древесины и соломы . Сравнение ферментативной гидролизуемости соломы, предварительно обработанной водяным паром и растворами щелочей.- Химия древесины, 1980, 4, с. 4756.

36.Каткевич Р.Г. Сравнительные исследования процесса ферментативного гидролиза соломы с периодическим отделением Сахаров путем диализа и ультрафильтрации // Превращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях. Рига, 1985. № 3. с.51-56.

37.Клесов A.A., Рабинович М.Л.Ферментативный гидролиз целлюлозы // Инженерная энзимология и биоорганический катализ / Ред. В.Л.Кретович, И.В.Березин. Итоги науки и техники. Сер. Биол.химия. М.,1978. Т.12. С.39-91.

38. Клесов А. А., Рабинович М.Л., Синицын А. П. и др. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I . Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников//Биоорг. Химия. 1980. Т. 6. №8. С. 1235-1242.

39.Клесов А. А., Синицын А. П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV . Влияние физико-химических и структурных факторов субстрата на эффективность ферментативного гидролиза //Биоорг. Химия. 1981. Т. 7. №12. С. 1345-1367.

40. Клесов А. А. Ферментативное превращение целлюлозы // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.,1983. Т.1 .С. 63-150.

41.Коке-ев М.Е., Корякин Ю.И. Климат, политика и технология// Независимая газета-наука. 1998. №10, ноябрь, с. 13.

42.Колвин Дж. Р. Структура и образование целлюлозных микрофибрилл // Целлюлоза и ее производные // Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974. Т. 2.

Г

V . А*^ I ЧУ .

43.Кононова М. М. Проблема почвенного гумуса и современные задачи его изучения. М., 1951. 250 с.

44.Ланге П. Распределение химических компонентов в клеточной стенке // Основные представления о волокнах, применяемых в бумажном производстве. Гослесбумиздат. 1962. 500с.

45.Лигнины. Структура, свойства и реакции / под ред. Сарканина К.В., Людвига К.Х./-М.: Лесная промышленность, 1975.

46.Максимов В. Ф., Вольф И.В., Яковлева О. И. Борьба с загрязнением окружающей среды в целлюлозно- бумажной промышленности М., 1970. 30 с.

47. Манн Д. Реакции дейтерироавния и тритирования целлюлозы // Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974. Т. 1. С. 91-166.

48.Мануковский Н.С., Абросов Н.С., Косолапова Л. Г. Кинетика биоконверсии лигноцеллюлоз. Новосибирск, Наука. Сиб. отд. 1990.160с.

49.Морозова Е.С., Рабинович М.Л., Сажина Л.И,, Селиванов А.С. и др. Способ получения целлюлаз.- Авт. св. СССР.- №1491886, 1987.

50.Мошев В.В. Вязкостные закономерности высоконаполненных суспензий// Реология. Полимеры и нефть: Тр. Всесоюз. школы по реологии. Новосибирск: ИТМП СО АН СССР, 1977. С. 53-64.

51.Мошев В.В., Иванов В.А. Реологическое поведение концентрированных неньютоновских суспензий, М.: Наука, 1990. 92с,

52.Мошев В.В., Иванов В.А. Влияние полидисперстности наполнителя на вязкостные характеристики высококонцентрированных суспензий // Процессы и аппараты производства полимерных материалов, методы и

оборудование для переработки их в изделия: Тез. докл. Всесоюз. науч.-техн. конф. М.: МИХМ, 1986. Т. 1. С. 33.

53.Никитин В. М., Оболенская А. В., Щеголев В. П. Химия древесины и целлюлозы. М., 1978. 363 с.

54.0боленская A.B., Щеголев В. П., Аким Г. Л., Аким Э. Л., Коссович Н. Л,, Емельянова И. 3. Практические работы по химии древесины и целлюлозы.-М.: Лесная промышленность, 1965,- 412с.

55.Оболенская A.B., Ельницкая З.П., Леонович A.A. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы.- М., Экология, 1991.

56.0гарков В. И., Киселев О. И., Быков В. А. Биотехнологические направления использования растительного сырья // Биотехнология. 1985. №3. cl-15.

57.Панцхава Е.С., Березин И.В. Техническая биоэнергетика. Био- и термохимическая конверсия биомассы в газообразное, жидкое и твердое топливо//Биотехнология. 1986. № 3. с.8-16.

58. Рабинович М.Л., Клесов А.А.,Березин И.В. Кинетика действия целлюлолитических ферментов из Geotrichum candidum, Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы. Биоорган, химия, 1977. т.З с,405-414.

59.Рабинович М.Л., Клесов A.A., Черноглазов В.М. и др. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов - фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы //Докл. АН СССР. 1981. т. 260, №6. с. 1481-1485.

60.Рабинович М.Л., Мельник М.С., Морозов А.М., Клесов A.A. A.C.СССР № 1541263. Аппарат для гидролиза растительного сырья./ Бюл. - 1990. -№5.

61.Роговин 3. А. Химия целлюлозы. М., 1972.519 с.

62.Родионова Н. А. Ферментативное расщепление целлюлозы // Целлюлозы микроорганизмов / под ред. Кретовича В. Л. М., 1981. С. 4-40.

63.Сассон А. Биотехнология : свершения и надежды. М., 1987. 411 с.

64. Селиванов A.C. Аппараты для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья // Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья. Сыктывкар, 1992. с. 21-31.

65.Синицын А. П., Наджеми Б., Митькевич О. В. и др. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов // Прикл. Биохим. Микробиол. 1986. Т. 22. Вып.З. С. 333-336.

66.Синицын А. П., Митькевич О., Калюжный C.B. и др. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса // Биотехнология. 1987. Т. 3, № 1. С. 39-46.

67.Синицын А. П., Митькевич О. В. Различие в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе ферментов // Биотехнология. 1987. Т. 3, № 2. С. 227-233.

68.Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов : Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

69.Сихтола X., Макконен X. Целлюлоза / Ред. В.Йенсен. // Химия древесины. М., 1982. С. 96-129.

70.Соловьева И.В. Разработка управления биосинтеза целлобиазы и ксиланазы грибами рода Aspergillus. Дисс. к.б.н. Пущино, 1996.

71.Тиунова Н. А. Применение целлюлаз // Целлюлозы микроорганизмов /Под ред. В. Л. Кретовича. М., 1981. С.40-73.

72.Трипп В. У. Определение кристалличности целлюлозы // Целлюлоза ее производные / Ред. Н. Байклс, Л. Сегал. М., 1974. Т. 1. С. 214-235.

73.Тээяэр Р.Э., Гравитис Я.А., Эринып П.П., Пугилис Я.А., Кулькевиц А.Я., Громов B.C., Липпмаа Э.Т. Изменения в фазовой структуре и конформационном состоянии компонентов древесины в процессе взрывного автогидролиза. - ДАН. 1986. N.288., 4, с.932-935.

74.Фрей-Висслинг А. Общая структура волокон// Основные представления о волокнах, применяемых в бумажном производстве. Гослесбумиздат, 1962. 500с.

75.Химия древесины / под ред. Уайз Л.Э., Джан Э.С. /-М.-Л.: Гослесбумиздат, 1959.с. 361

76.Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклс, Л. Сегал. М., 1974. Т. 1,2.

77.Шарков В. И., Куибина Н. И., Соловьева Ю. П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1971. 203 с.

78.Экологические проблемы лесного комплекса // Мат. научно-техн. конф. Л.: ЛДНТП, 1991. 105с,

79. Экспериментальные методы в адсорбции и газовой хроматогрфии / Ред. А. В. Киселев, В.П. Древинг. М., 1973. С. 214-216.

80.Элиас Г.-Г. Мегамолекулы : Пер. с англ./ Под ред. С.Я.Френкеля. Л.: Химия, 1990. 272с.

81.Эллефсен И., Теннесен Б. Полиморфные модификации целлюлозы // Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М., 1974. Т. 1. С. 154-182,

82.Эткинс П. Молекулы: Пер. с англ. -М.: Мир, 1991. 216с.

83.Юлдашев Б,Т,, Рабинович М,Л,, Рахимов М.М. Сравнительное изучение поведения целлюлаз на поверхности целлюлозы и лигноцеллюлозы в ходе ферментативного гидролиза.//Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. Вып. 2 ., с. 233-243.

84.Яблоков А,В. Атомная мифология : заметки эколога об атомной индустрии. М.: Наука, 1997. 271с.

85.Asplund D, The European Bioenergy Policy in Forestry. Proceedings of the 9-th European Bioeneigy Conference, Copenhagen, Denmark. 1996. V.l. P.78-83.

86.8.Basshsem J. A. Cellulose as a chemical resources. General consideration //Biotechnol. Bioeng. Symp. 1975. Vol. 5. P. 9-20.

87,Beltram P.L., Carniti P., Focher B. et al. Cotton cellulose : enzyme adsorpsion and enzymatic hydrolisis//J.Appl. Polym. Sci. 1982. Vol. 27. P. 3493-3502.

88.Beltram P.L., Carniti P., Focher B. et al. Enzymatic hydrolisis of cellulosic materials: a kinetic stady// Biotechnol. Bioeng. 1984. Vol.26. P. 1233-1238.

89.Bender R. Pat. 4136207 (USA), 1979.

90.Berg et al. Resources and Men //Science. 1974. Vol.184. P.322.

91.Brown D.B. Pat. 4163687 (USA), 1979.

92.Brown D.B., Bender R . Pat. 4211163 (USA), 1980.

93.Bungay H. R. Energy: The biomass options. New York, 1981. 347 p.

94. Bungay H. R.Biomass refining/ Science, 1982. Vol. 218. P. 634-644.

95.Bushe R.M., ScottC.D., Davison B.H., Lynd L.R. The Ultimate Ethanol : Technolo-economic Evaluation of Ethanol Manufacture, Comparing Yeast vs Zymomonas Bacterium Fermentation, 1991. ORNL/TM - 11852, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TM.

96.Canty T.S., Caruthers J.M. Viscometric properties of poly (dimetylsiloxane) filled with spherical silica particles // J.Apl. Polim. Sci. 1982. Vol. 27. P. 30793088.

97.Chong J.S., Christiansen E.B., Baer A.D. Reology of concentrated suspension //J.Appl. Polym. Sci. 1971. Vol. 15. P. 2007-2021.

98.Converse A.O., Matsuno R., Nanaka M. Model of enzyme adsorption and hydrolisis of microcrystalline celluljse with slow inactivation of the adsorbed enzyme // Biotechnol. Bioeng. 1988. Vol.32. P.898-900.

99.Cowling E. B. Physical and chemical constraints in hydrolysis of cellulose and lignocellulosic material// Biotechnol. Bioeng. Symp. 1975. No. 5. P. 163-181.

100.Delong E.A. Australian Patent AU-A1-37454, 1978; German Patent 2830 476, 1979.

101.Dekker R.F>H., Karageorg H. Pretreatment of hardwood (Eucalyptus regnans) sawdust by autohydrolysis explosion and its saccharification by Trichoderma cellulas//Biocatalis. 1987. Vol. 1. P.63-75.

102.Easleg C.E. et all (1989) Institute of Gas Nechnology, 13 th Annual Conference, New Orleans, LA, February.

103.Emert G.H.et all. Chem. Eng.Prog. 1980. V. 47.

104.Emert G.H. 1980. US patent 4.220. 721 Sept. 2.

105.Energy : an interdisciplinary theme for environmental education/ by J.P. Deleage and C.Souchon. Unesco, 1986.P. 18-25.

106.Farris R.J. Prediction of the viscosity of multimodial suspension from unimodial viscosity data //Trans. Soc. Rheol. 1968. Vol. 12. № 2. P. 281-301.

107.Fitchter. Berline, Heidelberg, New York. 1981.p. 15-32.

108.Foody B. Etanol from biomass. The factors affecting its commercial feasibility.

109.Gallo BJ. Hyperproducsing cellulase microorganism.USA WO 84/03902 Patent.T. 1984. P. 12.

110.Gharpuray M. M., Lee Y. H., Fan L. T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis // Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25. P. 157-172.

111.Chong J.S., Christiansen E.B. Reology of concentrated suspensions//!.Appl.Polym. Sci. 1971. Vol.15. P. 2007-2021.

112.Ghose T. K., Das K. Economic evaluation of enzymatic utilization of waste cellulosics//Adv. Biochem. Eng. 1971. Vol. l.P. 55-76.

113.Ghose T. K. Cellulase biosynthesis and hydrolysis of cellulose substances // Adv. Biochem. Eng. BerlLn, Heidelberg, 1977. Vol. 6. P. 39-48.

114.Ghose T. K.,Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. Measure of cellulase activity// International Union of pure and applied chemistry comission on biotechnology. 1981.

115.Graff G.M. High grade lignin schemes edge closer to reality. Chem. Engin. 1982, Vol. 25. P.25-27.

116.Gregg D.J., Saddler J.N. A techno-economic assessment of the preatreatment and fractionation steps pf a biomass-to-ethanol process. Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. Vol. 57/58, P. 711-727.

117. Gregg D.J. An historical perspektive on Brazil's Sugarcane-to-etanol industry//Newsletter. 1998. №2. P. 6-12

118.Gupta R.K., Seshadri S.G. Maximum loading levels in filled liquid systems // J. Rheology. 1986. Vol. 30. P. 503-508.

119.Gusakov A.V., Sinitsin A.P., Klyosov A.A. Kinetics of the ensymatic hydrolysis of cellulose. 2. A mathematical model for a batch reactor process// Enzyme Microb. Technol. 1985. Vol. 7. P. 346-352.

120.Harshbarger J.D., Bautz M., Davison B.H., Scott T.C., Scott C.D. Economic Assessment of Ethanol Production Comparing Traditional and Fluidized-Bed Bioreactor. Applied Biochemistry and Biotechnology. 1995. Vol. 51/52. P. 593604

121.Hasselgren K. Municipal Wastewater Recycling in Energy Forestry. Proceedings of the 9-th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark. 1996. V.l. P.90-95.

122.Herr D, Conversion of cellulose to glucose with cellulase of Trichoderma viride ITCC-1433// Biotechnol. Bioeng. 1980. Vol.22. № 10. P. 287-291.

123.Holtzapple M.T., Caram H.S. The HCH-1 model of enzymatic cellulose hydrolysis// Biotechnol. Bioeng. 1984. Vol. 26. P.753-757.

124.Howell J.A., Mangat M.N. Enzyme deativation during cellulose gydrolysis //Biotechnol. Bioeng. 1978. Vol. 20. P. 847-863.

125.Horstmann B, J., Kennedy C. N., Chase H. A. Adsorption of proteins on Sephrose affinity adsorbents of vaiying particle site // J. Chromatogr. 1986. Vol. 361. P. 179-190.

126.Huang A.A. Kinetic stadies on insoluble cellulose-cellulase system// Biotechnol. and Bioeng. 1975. Vol. 17, № 10. P. 1421-1433.

127.Huff et all. (1976)US patent 3.990, 844. Nov.9.

128.Hultberg S. Bioenergy Policy in the Nordic Countries// In Proceedings of the 9th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark 22-27 June 1996, Vol.1., P. 9-24

129.Ilsoe N.Th. Agricultural Experience as a Supplier of Biomass// In Proceedings of the 9th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark 22-27 June 1996, Vol.1., P. 29-35.

130.Johnson E.A., Reese E.T. inhibitation of Clostridium termocellum cellulase by end products of cellulysis // J. Appl. Biochem. 1982. Vol.4. P.64-71.

131. Jones Evan O., Lee James M. Kinetic analisis of byconversion of cellulose in attriiion bioreactor // Biotechnol.Bioeng. 1988, Vol. 31. № 1. P. 35-40.

132.Jorgencen U. Lowcost and safe establishment of miscanthus. Proceedings of the 8-th European Bioenergy Conference, 1995. V.l. P.541-547.

133.Jorgencen U. Miscanthus Yield in Denmark. Proceedings of the 9-th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark. 1996. V.l. P.48-54.

134.Kane S.M., Reilly J.M. Econnomics of Etanol Production in the United States. 1989. US Department of Agriculture Report № 607.

135.Katzen R. Etanol from Ligno-Cellulose. Agro-Industrial Revolution Conference, 1990. Washington, DC, June.

136.Katzen R., Monceaux D.A. Development of Bioconvertion of Cellulosic Wastes. Applied Biochemistry and Biotechnology. 1995. Vol. 51/52. P.585-592.

137.Kinoshita Shinichi. Hydrolisis oof cellulose by cellulases of Sporotrichum cellulophilwn in an ultrafilter membrane reactor // Ensyme and Microb. Technol. 1986. Vol.8. № 11. P.691-695.

138.Kitts W. D., Krishnamurpi J. A., Shaltord J. A. Et al. Use of wood and woody by- products as a source of energy in beef cattle rations // Cellulases and their applications. Washington, 1969. P. 279-297.

139.Kirk T.K, Biocemistry of lignin degradation by Phanerochaete chrisosporium //FEMS Simposium №43, Biochemistry and genetic of cellulose degradation, edited by J.-P.Hubert. Academic Press Limited, 1988. P. 312-319.

140.Klyosov A. A., Mitkevich O.V., Sinitsyn A. P. Role of the activity and adsorption of cellulases in the efficiency of the enzymatic hydrolysis // Biochemistiy. 1986. Vol. 25. P. 540-542.

141.Kovalef G. V., Sinitsyn A. P., Volf E, G. Et al . Enzymatic conversion of irradiated cellulosic materials// Brit. Polym. J. 1987. Vol. 19. P. 63-66.

142.Ladish M.L., Lin K.V. Process consideration in the enzymatic hydrolysis of biomass// Ensyme and Microb. Technol. 1983. Vol.5. № 2. P. 82-102.

143.Ladish M.L., Schwandt R. Report of the starch conversion work group in Proceeding, Technology for Expanding the Biofuels Industry, Biofuels Program, 1992, Department of Energy, Washington.

144.Larry U.L. Column celluljse hydrolysis reactor : The effect of retention time, temperature, cellulase concentration and exogenonously added cellobiase on the overall proccess//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. Vol.26. № 1. P.21-27.

145.Lee D. I. The viscosity of concentrated suspension // Ibid. 1969. Vol. 13, №2, P. 273-288.

146.Lee Y. H., Fan L. T. Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of insoluble cellulose : II.Analysis of the extended hydrolysis times // Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25. P. 939-966.

147.Lee J.M., Wolf J.H. Continuos attrition bioreactor with enzyme recycling for the bioconvertion of cellulose // Appl. Biochem. Biotechnol. 1988. Vol. 18. P.203-215.

148.Linko M. Cellulose hydrolysis // Adv. Biochem. Eng. Berlin, Heidelberg. 1977. V. 5. P. 27-42,

149.Lynd L.R., Cushman J.H., Nichols R.J., Wyman C.E. Fuel ethanol from cellulosic biomass. Science, 1991, Vol. 251. P.1381.

150. Lynd L.R., Elander R.T., Wyman C.E. Likely features and costs of mature biomass ethanol technology. Appl. Biochem. Biotechnol., 1996, Vol. 57/58. P.741.

151.Mamers H., Guritta J.P., Menz D.J. Explosive pulping of bagasse and wheat straw. -TAPP. 1981.V.64, 7. P.93-96.

152.Mandels M. Enzymatic saccharificationof waste cellulose // Third Biomass Energy System Conf. Golden, Colorado. 1979. P. 8-16.

153.Mandels M. Cellulases // Annual. Reports. Ferment. Process. 1982. №5. P. 35-78.

154.Marchessauth R.H., Colombe S., Hanai T., Morikawa H. Monomers and oligomers from wood.- Trans. Techn.Sec. 1980. V.6,2. P.52-56.

155.Marsden W.L., Grey P.P. Enzymatic hydrolysis of cellulose in lignocellulosic materials.-CRC Critical Revitws in Biotechnology. 1986. V. 3.(3). P. 235.

156.Mason W.H. Pat. 1824221 (USA), 1931.

157.Mason W.H., Boehm R.S., Koonce W.E, Pat. 2080178 (USA), 1937.

158.Mattson J.E. Overview of the development in the provision and production of solid biomass fuels//9-th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark. 1996. V.l. P. 111-114.

159.McLaren A.D.Ensyme in structurally restricted systems. IV. The digestion of insoluble substrates by hydrolytic enzymes//Enzymologia. 1963. Vol. 26, №4. P.237-241.

160.Mendels M., Kostick J. The use of adsorbed cellulas in the convertion of cellulose to glucose // J. Polymer Sci. 1971. Vol.36. P.445-459.

161.Milborrow D. Pricing polution in a competitive market // Windpower Monthly. 1996. May. P.34-37.

162.Miller G.L., Blum R., Glennon W.E., Burton F.L.-Anal. Biochem., 1960. V. 2. P. 127-132.

163.Mooney M. The viscosity of concentrated suspensions of spherical particles//J. Colloid and interface Sci. 1951. Vol. 6. P. 162-170.

164.Neilson N. G., Kelsey R. G., Shafizadeh F. Enhancement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulosic substrates // Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. 24. P.293-304.

165.Nguyen Q.A., Saddler J.N. An integrated model for tye technical and economic evaluation of an ensymatic biomass convertion process. Biores. Technol. Vol.85, P. 272-282.

166.0kazaki M., Moo-Young M. Kinetics of enzymatic hydrolisis of cellulose : analytical description of a mechanistic model // Biotechnol. Bioeng. 1978. Vol. 20. P. 637-663.

167.0kazaki M., Miura Y., Moo-Young M. Synergistic effect of enzymatic hydrolysis of cellulose //Adv. Biotechol. 1981. V.2. P. 3-8.

168.0oshima H., Sakata M., Harano Y. Adsorption of cellulas from Trichoderma virida on cellulose //Biotechnol. and Bioeng. 1983. Vol. 25, №12. P.3103-3114.

169.Puls J., Poutanen K., Korner H.U., Viikari L. Biotechnical utilization of wood carbohydrate after steaming pretreatment.- Appl.Microbiol.Biotechnol. 1985. V. 22.,6. P. 416-423.

170.Riddell-Black D.M., Rowlands C., Snelson A. Short Rotation Forest Productivity Using Sewage Sludge as a Nutraent Surce. Proceedings of the 9-th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark. 1996. V.l. P. 103110.

171.Ruang A.A. Kinetic studies on insoluble cellulose - cellulase systems // Biotechnol. Bioeng., 1975. Vol. 17. P. 1421-1433.

172.Ryu S.K., Lee I.M. Byconversion of waste cellulose by using an attririon bioreactor// Biotechnol. Bioengineer. 1983. Vol.25. № 1. P.53-65.

173.Saddler J. N., Brownell H.H. Pretreatment of wood cellulosics to enhance enzymatic hydrolisis to glucose. Proceedings of Intern. Symp. Ethanol Biomass., Ottawa, 1983. P.206-230.

174,Saddler J. N., Hogan C. M., Mes-Hartree M. Substrate effects limiting the efficiency of enzymatic hydrolysis of cellulose // Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. The Third Int. Conf. Stockholm. 1986. P. 96-98.

175.Saddler J.N. and Gregg D J. Tehno-economic Assessment of the Pretreatment and Hydroiysis of Wood for Ethanol Production// In Proceedings of the 9th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark 22-27 June 1996, Vol.1., P.349-355.

176.Scffell D.J., Vendor P. Test Studies Supporting the Design of a Biomass-to-Ethanol Pilot Plant. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995. Vol. 51/52, P. 549-557.

177.Scheiding W., Thoma M. Modelling of the enzymatic hydrolisis of cellobiose and cellulose by a complex enzyme mixturre of Trichoderma reesei QM 9414 //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984. Vol.20. P.176-182.

190.Wickowsci A., Strk F. Porowatosc mieszanin cial sypkich. Mieszaniny dwuskladnikowe// Chem. stocow. A. 1966. 1 B. S. 95-127.

191.Wickowsci A., StrkF. Porowatosc cial sypkich. Mieszaniny wieloskladnikowe// Ibid. 4 B. S. 431-447.

192.Wyman C.E. Progress on Ethanol Production from Lignocellulosic Biomass// In Proceedings of the 9th European Bioenergy Conference, Copenhagen, Denmark 22-27 June 1996, Vol.1., P.356-361.

193. Wyman C.E. Ethanol from lignocelluljsic biomass : technology, economics, and opportunitirs. Biores. Technol., 1994, Vol. 50, P.3.