Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Качаева, Евгения Владимировна

• Качаева, Евгения Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Качаева, Евгения Владимировна

Введение 6 Обзор литературы

1. Системы транспорта калия в MX.

1.1. Транспорт калия в MX.

1.2. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в MX.

1.3. Физиологическое значение транспорта калия в MX.

2. АТФ-ингибируемые калий-транснортирующие каналы.

2.1. АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны.

2.1.1. Структурная организации цитонлазматического

АТФ-зависимого калиевого канала.

2.1.2. Биофизические свойства цитоплазматичсского калиевого канала.

2.1.3. Модуляторы цитоплазматического калиевого канала.

2.1.3.1. Внутриклеточные нуклеотиды - регуляторы цитоКдтф канала.

2.1.3.2. Фармакологические регуляторы цитоКдтф канала.

2.1.4. Функциональная роль цитоКдтф канала в клетке.

2.2. АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны MX.

2.2.1. Структурная организация митоКдтф канала.

2.2.2. Биофизические свойства митоКдтф канала.

2.2.3. Модуляторы митоКдтф канала.

2.2.3.1. Метаболические модуляторы митоКдтф канала.

2.2.3.2. Фармакологические модуляторы митоКдтф канала.

2.4. Функциональная роль митоКдтф.

2.4.1. Активация митоКдтф в развитии устойчивости организма к гипоксии.

2.4.2. Механизмы защиты сердца при гипоксии, опосредованные активацией митоКдтф.

2.4.3. Феномен прерывистой гипобарической тренировки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение MX.

1.1. Выделение MX печени крысы.

1.2. Выделение MX сердца крысы

2. Выделение и очистка митоКдтф канала.

3. Изучение энергозависимого входа К+ в MX методом спектрофотометрии.

4. Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из MX.

5. Полярографическое определение параметров дыхания MX.

6. Иммунохимическое исследование митоКдтф канала.

6.1. Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа. 56 6.1.1. Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка.

6.2. Иммунизация и анализ препарата антител. 56 6.2.1. Детекция специфических антител и определение титра.

6.2.1.1. Непрямой Дот-анализ.

6.2.1.2. Вестерн-Блот анализ.

6.3. Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа.

6.4. Ингибиторный анализ с использованием антител к белку с м.м. 55 кДа.

7. MS-MALDI-TOF/TOF анализ.

8. Модель экспериментального острого инфаркта миокарда.

8.1. Хирургические процедуры и модели животных.

8.2. Схема эксперимента

8.3. Анализ электрокардиограмм.

8.3.1. Анализ ишемических нарушений.

8.3.2. Анализ нарушений ритма.

8.4. Критерии отбора.

8.5. Статистический анализ. 65 9. Определение параметров функционирования митоКдтф канала крыс высоко- и низкоустойчивых к гипоксии.

9.1. Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных.

9.2. Адаптирование низкоустойчивых животных к недостатку кислорода методом прерывистой нормобаричсской гипоксии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение физиологической роли митоКдтф канала при гипоксии.

1.1. Изучение влияния активации митоКдтф канала уридиновыми нуклеотидами на повреждения миокарда при ишемии на модели экспериментального острого инфаркта миокарда.

1.1.1. Влияние уридина и уридин-5'-монофосфата на ишемические изменения сердечной активности, при введении препаратов до и после создания экспериментального инфаркта.

1.1.2. Антиишемическое действие уридина и уридин-5'-монофосфата.

1.1.3. Антиаритмичсский эффект уридина и уридин-5'-монофосфата.

1.2. Параметры функционирования митоКдтф канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии.

1.2.1. Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилированин в MX печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии.

1.2.2. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в MX печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии. 83 2. Изучение структурной организации митохондриального

АТФ-зависимого калиевого канала.

2.1. Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом

MS-MALDI-TOF/TOF.

2.2. Ингибиторный анализ активности митоКдтф канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа.

2.2.1. Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации.

2.2.2. Иммунизация и определение титра полученных антител.

2.2.3. Определение специфичности полученных антител.

2.2.4. Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии»

Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКдтф), осуществляющий вход калия в MX, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране MX в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой белка с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала, был изолирован из MX мембраны в виде [Миронова и др., 1981]. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].

В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, И); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.

Помимо важной роли митоКдтф в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.

Настоящая работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленнные на лечение сердечнососудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности в мире. Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений. В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является митоКатф [Yellon et al., 1998; Петрищев и др., 2001]. Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования митоКдтф достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной. Изучение структуры митоКдтф позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.

В связи с этим, целью данной работы было: изучить кардиопротекторное действие предшественников УДФ при ишемии миокарда, а также исследовать параметры функционирования митоКдтф У животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию , а также выяснить структурную организацию митоКдтф.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое действие специфического активатора митоКдтф уридиндифосфата на модели острого инфаркта миокарда у крыс.

2) Исследовать параметры функционирования митоКдтф У крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.

3) получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы;

4) Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.

5) Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных MX с использованием полученных антител (AT) с целыо доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в MX.

Новизна исследования. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторное действие веществ уридинового ряда -природных активаторов митоКдтф, на модели инфаркта миокарда. Впервые также исследовались параметры функционирования митоКдтф у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных. Проведено сравнение гомологии структуры митоКдтф с аминокислотной последовательностью известных белков.

Научно-практическое значение работы. Представленная работа имеет научно-практическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКдтф обладает выраженными анти-ишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемических повреждений. Результаты проведенных в работе исследований открывают перспективу разработки нового подхода к предотвращению и лечению инфаркта миокарда и различного рода аритмий с использованием предшественников природного активатора митоКдтф, УДФ

Изучение роли активации митоКдтф при тренировке животных к кислородной недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути повышения жизнеспособности организма в условиях гипоксии.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Качаева, Евгения Владимировна

выводы

1. Показано, что при экспериментальном инфаркте миокарда уридин и УМФ, предшественники уридиндифосфата, - активатора митоКАТФ, снижают размеры зоны инфаркта миокарда более чем в 3 раза, участвуют в нормализации Т-волны и сердечного ритма, а именно, в 4-6 раз сокращают количество экстрасистол, в 5-10 раз снижают длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции.

2. С использованием специфических ингибиторов цитоКдтф и митоКдтф каналов показано, что аптиишемическое действие уридина обеспечивается, в основном, митохондриальным Кдтф каналом, а антиаритмическое - цитоплазматическим.

3. Антифибрилляторный эффект обоих препаратов, связан не только с активацией этих каналов но, по-видимому, опосредуется также и другими механизмами.

4. Обнаруженное в работе кардиопротекторное действие уридина и УМФ позволяет говорить о перспективе использования этих веществ в качестве лекарственных препаратов для предупреждения и лечения инфаркта миокарда.

5. Формирование устойчивости животных к недостатку кислорода, а также адаптация нормобарической гипоксической тренировкой низкоустойчивых животных сопровождается сопряжением дыхательной цепи, активацией митоКдтф канала и К+/Н+ - обменника.

6. Показано, что белок с м.м. 55 кДа обладает высокой степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов.

7. В работе получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственную мембрану АТФ-ингибируемые К+ каналы. Ингибиторный анализ АТФ-чувствительного калиевого транспорта в интактных MX с использованием полученных антител показал, что белок с м.м. 55 кДа относится к системе АТФ-зависимого входа К+ митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению роли митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (митоКдтф) в защите сердца от ишемии, формировании адаптации животных к гипоксии, а также исследованию структурной организации данного канала.

Ранее было показано, что активация митоКдтф канала наряду с активацией цитоплазматического КАТф канала (цитоКдтф) играет важную роль в предохранении сердца от ишемических повреждений. К настоящему времени известно множество синтетических активаторов митоКдтф канала, обладающих кардиопротекторными свойствами. Ранее в нашей лаборатории был обнаружен природный активатор митоКдтф - уридип-5'-дифосфат (УДФ), способный в микромолярных концентрациях реактивировать канал, встроенный в искусственную бислойную липидную мембрану (БЛМ), и в инактных митохондриях, и предварительно заблокированный физиологической концентрацией АТФ [Негода, 2003, Mironova et al., 2004]. Механизм реактивирующего действия УДФ на канал пока не ясен. Тот факт, что УДФ является метаболическим препаратом, имеет большие перспективы в плане лечения, поскольку его концентрацию в клетке можно регулировать, и он не обладает побочными эффектами, возникающими при использовании синтетических препаратов.

В представленной работе было исследовано кардиопротекторное действие УДФ на митоКдтф. При этом использовались метаболические предшественники УДФ, способные, в отличие от самого УДФ, проникать в клетку [Matsushita et al., 1983; Aussedat et al., 1987]. Специфичность действия предшественников УДФ проверялась с использованием ингибитора как цитоплазматического, так и митохондриального Кдтф каналов, глибенкламида, а также специфического блокатора митоКдтф, 5-гидроксидеканоата (5-ГД). В работе с использованием модели острого экспериментального инфаркта миокарда у крыс определяли анти-ишемическое и антиаритмическое действие уридина и УМФ. Оценивались следующие параметры ишемических повреждений: размер зоны ишемической альтерации (ЗИА), выраженный л как индекс ишемической альтерации (ИИА) (ИИА=ЗИА/ линейное увеличение -массу сердца), а также изменение амплитуды Т-волны, являющейся основным показателем ишемических нарушений при инфаркте. При изучении антиаритмического действия препаратов методом электрокардиографии определялись количество экстрасистол, длительность желудочковой тахикардии и показатели фибрилляции желудочков.

Исследования показали, что при экспериментальной ишемии миокарда уридин и УМФ существенно снижают размеры зоны инфаркта миокарда (более чем в 3 раза), способствуют нормализации амплитуды Т-волны. Кроме того, наблюдается заметное улучшение параметров ритма сердца, а именно, количество экстрасистол снижается в 4-6 раз, длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции сокращается в 5-10 раз. При этом показано, что антиишемическое действие уридина и УМФ блокируется как глибенкламидом, так и 5-ГД, что говорит о преимущественном вкладе в защитное действие препаратов активации митоКдтф канала. В то же время антиаритмический эффект предшественников УДФ опосредован, активацией и митохондриалыюго, и цитоплазматического Кдтф каналов, но в большей степени, активацией цитоКдтф. Антифибрилляторный же эффект уридина и УМФ опосредуется не только активацией мито- и цитоКдтф каналов, но, в большей степени, другими механизмами, поскольку защитный эффект препаратов блокируется 5-ГД и глибенкламидом незначительно.

Поскольку в работе показано, что защитное действие препаратов проявляется также и при введении их уже после создания ишемии, то можно говорить о перспективах их использования не только для предупреждения, но и для лечения инфаркта миокарда.

В представленной работе также была изучена роль митоКдтф канала в формировании адаптации животных к кислородному голоданию. Для этого использовали крыс, разделенных на две группы (низкоустойчивые и высокоустойчивые) по способности выдерживать подъем на высоту в 11500 м. Кроме того, в работе низкоустойчивые животные, были адаптированы к недостатку кислорода прерывистой нормобарической гипоксической тренировкой.

Показано, что у высокоустойчивых животных митоКдтф канал работает эффективнее, а показатели сопряжения дыхательной цепи были выше, чем у низкоустойчивых. Адаптация низкоустойчивых животных к гипоксии сопровождается сопряжением дыхательной цепи и активацией митоКдтф канала. В то же время, поскольку набухания, которое, как предполагается, должно следовать за активацией митоКдтф, не наблюдается, так как количество калия в митохондриях, по нашим данным, не увеличивается, а даже снижается, вероятнее всего, активируется также и система выхода калия из митохондрий (система К+/Н+-обменника).

Задачей настоящей работы было также выяснение структурной гомологии белка с м.м. 55 кДа, формирующего канальную субъединицу митоКдтф канала [Mironova et al., 2004] аминокислотным последовательностям известных белков. Для этого проводился MS-MALDI-TOF/TOF анализ, с последующей обработкой результатов. Было показано, что белок с м.м. 55 кДа обладает высокой (54%) степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов.

Полученный результат вызвал необходимость дополнительного исследования принадлежности исследуемого белка-канала к семейству митохондриальных белков. Для этого на 55 кДа белок, выделенный из митохондрий печени крысы и формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-чувствительный калиевый канал, были получены специфические поликлональные антитела. Вестерн-блот анализ с полученными антителами позволил выявить тканеспецифичность изучаемого белка-канала. Был также проведен ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях, результаты которого показали, что AT на белок из митохондрий печени крыс ингибировали этот транспорт в митохондриях печени, но не сердца крыс. При этом они не влияли на показатели сопряженного дыхания митохондрий печени крыс. Следовательно, белок с м.м. 55 кДа действительно относится к системе АТФ-чувствительного входа К+ в митохондрии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Качаева, Евгения Владимировна, 2007 год

1. Александров А.А., Берестовский Г.Н., Волкова С.П. Регуляция одиночного Ca/Na канала клетки в липидном бислое. // ДАН СССР. 1976, т. 227, с. 723-6.

2. Александров А.А., Берестовский Г.Н., Волкова С.П. Регуляция одиночного потенциалзависимого Ca/Na канала клетки в липидном бислое. // Биофизика сложных систем и радиационных нарушений. М.: Наука. 1977, с.33-39.

3. Антитела. Методы. Под ред. Китти. Изд-во "Мир", 1991, т. 1, с. 106-107.

4. Берестовский Г.Н. и Александров А.А. О транспотной структуре и воротном механизме реконструированного кальциевого канала клеток харовых водорослей. // Биофизика. 1983, т. 28, с. 816-20.

5. Бакеева Л.Е., Брустовецкий Н.Н. Межмитохондриальные септированные контакты в клетках печени суслика Citelius undulates при зимней спячке.// Биол.Мембр. 1993, 13(1): 36-43.

6. Березовский В.А. Гипоксия. Киев. Наука думка, 1978,250 с.

7. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Дискретный характер проводимости канала в нейронах прудовика. // Биофизика. 1983, т.28, с.994-8.

8. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Кластерная организация ионных каналов. М.: Наука. 1990,223 с.

9. Григорьев С. Диссертация кандидата биологических наук. 1999.

10. Евтодиенко Ю.В., Кудзина Л.Ю., МедведевБ.И., Юрков И.С. Непосредственное участие фосфолипидов в трансмембранном переносе ионов калия. // Биол.Мембр. 1996,13(5): 529-536.

11. Кудзина Л.Ю., Медведев Б.И., Поваляева Г.В., Фойгель А.Г., Евтодиенко Ю.В. Реконструкция К+-транспортирующей системы митохондрий на искусственных фосфолипидных мембранах. // Биофизика. 1974, 19(5): 765769.

12. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов,- М.: Мир, 1982.-270С.

13. Лукьянова Л. Функционально-метаболические особенности животных с различной индивидуально резистентностью к гипоксии. // Проблемы гипоксии: молеулярные, физиологические и медицинские аспекты. 2004, с. 156-170.

14. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Чернобаева Г.Н. и др. Прерывистая нормобарическая гипоксия. М., 1999, с. 139-153.

15. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Чернобаева Г.Н. и др., Прерывистая нормобарическая гипоксия. М., 1999, с. 139-153.

16. Лукьянова Л.Д., Коробков А.В. Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии, гипотермии. Под ред. А.В. Коробкова -М. Медицина, 1981, т.2, с. 73-76.

17. Лукьянова Л.Д., Коробков А.В. Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии, гипотермии. Под ред. А.В. Коробкова -М. Медицина, 1981, т.2, с. 73-76.

18. Маршанский А.А., Новгородов С.А., Ягужинский Л.С. Влияние специфических ингибиторов дыхательной цепи и АТФ-синтетазы на транспорт в митохондриях. // Биофизика. 1983,28(5): 830-834.

19. Маршанский А.А., Ягужинский Л.С. Влияние субстратов АТФ-синтетазы на индукцию процесса перекисного окисления липидов в митохондриях. // Биол.Мембр. 1985,2(11): 1081-1086.

20. Миронова Г.Д. Катион-транспортирующие белки митохондриальной и цитоплазматической мембран. Диссертация доктора биологических наук. 1985,270с.21.