Мезопористые кремнеземы как носители для белков на примере гемоглобина и пероксидазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Овсянников, Роман Алексеевич

• Овсянников, Роман Алексеевич
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Овсянников, Роман Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Иммобилизация белков на твердых носителях.

Синтез и свойсгва мезопористых кремнеземных адсорбентов

1.1 Общие сведения

1.2 Методы иммобилизации ферментов

1.2.1 Необратимое связывание

1.2.2 Обратимое связывание

1.3 Особенности адсорбции белковых молекул

1.3.1 Термодинамика адсорбции

1.3.2 Химия поверхности носителя и фермента

1.3.3 Пористая структура носителя

1.4 Классификация носителей для иммобилизации ферментов

1.4.1 Природные высокомолекулярные соединения

1.4.2 Органические носители

1.4.3 Неорганические носители

1.5 Методы получения мезопористых кремнеземов

1.5.1 Принцип супрамолекулярного темплатирования

1.5.2 Регулирование размера пор

1.5.3 Синтез крупнопористых адсорбентов и создание вторичных мезопор

1.5.4 Модифицирование поверхности кремнезема

Глава 2. Иммобилизация белков на кремнеземных адсорбентах

2.1 Адсорбция белков на кремнеземных адсорбентах

2.1.1 Адсорбция белков на силикагелях и силохромах

2.1.2 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с одномерной системой пор (МСМ-41, БВА-15 и РБМ-16)

2.1.3 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с трехмерной системой пор (МСМ-48)

2.1.4 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с разупорядоченной структурой

2.1.5 Новые кремнеземные адсорбенты

2.2 Изотермы и кинетика адсорбции белков на кремнеземных адсорбентах

2.2.1 Изотермы адсорбции

2.2.2 Кинетика адсорбции белков

2.3 Свойства адсорбционных слоев ферментов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1 Синтез кремнеземных адсорбентов

3.1.1 Синтезы на основе неионогенных ПАВ

3.1.2 Синтезы на основе катионных ПАВ

3.1.3 Выбор носителей для адсорбции белков

3.2 Физико-химические методы исследования адсорбентов

3.2.1 Низкотемпературная адсорбция азота

3.2.2 Электронная микроскопия

3.2.3 ИК спектроскопия

3.2.4 Термопрограммированная десорбция аммиака

3.2.5 Термогравиметрия и дифференциально-термический анализ

3.3 Исследование адсорбции белков

3.3.1 Адсорбаты

3.3.2 Адсорбционные измерения

3.3.3 Измерение концентрации гемоглобина и пероксидазы

3.3.4 Вычисление предельных величин адсорбции белков

3.3.5 Измерение ферментативной активности пероксидазы

3.3.6 Определение кинетических параметров пероксидазной реакции

3.3.7 Приготовление растворов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Темплатный синтез кремнеземов

4.1 Синтез в присутствии полиэтиленгликолей (ПЭГ)

4.1.1 Первичные синтетические процессы

4.1.2 Постсинтетическая обработка

4.1.3 Детемплатирование

4.2 Синтез бипористых кремнеземов в присутствии ЦТАБ

4.2.1 Формирование крупных пор в системе «ЦТАБ-БЮг» при рН

4.2.2 Влияние концентрации ЦТАБ на текстуру материала

4.2.3 Изменение текстуры кремнезема при введении ТМБ

4.2.4 Влияние температуры на текстуру материала

4.3 Характеристика поверхности пористых кремнеземов

Глава 5. Адсорбция гемоглобина

5.1 Кинетика адсорбции

5.1.1 Двух стадийная кинетическая схема адсорбции белков

5.1.2 Обработка экспериментальных результатов

5.1.3 Кинетические закономерности адсорбции гемоглобина на кремнеземах

5.2 Изотермы адсорбции гемоглобина

5.2.1 Изотермы Ь-типа

5.2.2 Изотермы адсорбции на бипористых кремнеземах и алюмосиликатах

5.3 Свойства кремнеземов после адсорбции гемоглобина

5.3.1 Данные низкотемпературной адсорбции азота

5.3.2 Данные ИК спектроскопии

5.4 Зависимость предельной адсорбции от размера пор адсорбента

5.5 Гемоглобин как тестовый белок для оценки поверхности адсорбентов

Глава 6. Адсорбция и каталитические свойства пероксидазы

6.1 Адсорбция пероксидазы на мезопористых кремнеземах

6.1.1 Изотермы адсорбции и предельные величины адсорбции

6.1.2 Механизм адсорбции

6.2 Свойства адсорбционных слоев пероксидазы

6.2.1 Данные ИК спектроскопии

6.2.2 Активность фермента в адсорбционном слое

6.2.3 Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен

6.3 Адсорбция гемоглобина и пероксидазы — сравнительная характеристика

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мезопористые кремнеземы как носители для белков на примере гемоглобина и пероксидазы»

Интерес к биокаталитическим системам на основе иммобилизованных ферментов обусловлен их применением в качестве гетерогенных катализаторов, компонентов биосенсоров нового поколения, элементов биотопливных ячеек. Биокатализаторы на основе иммобилизованных ферментов отличаются высокой стабильностью, экологической чистотой, возможностью проведения реакций с участием оптически активных соединений. Иммобилизованные гемсодержащие белки — гемоглобин и пероксидаза — могут применяться в качестве биораспознающих элементов для безмедиаторных биосенсоров, биореакгоров и биомедицинеких устройств нового поколения.

Адсорбционная иммобилизация ферментов на мезопористых молекулярных ситах (ММС) привлекает внимание исследователей на протяжении последних пятнадцати лет, с момента синтеза первых представителей этого класса адсорбентов — МСМ-41 и SBA-15. Применение таких носителей для получения гетерогенных биокатализаторов представляет несомненный научный и практический интерес. К настоящему времени опубликованы результаты исследований адсорбции различных белков, в том числе гемоглобина и пероксидазы, на ММС структурных типов МСМ, SBA, FSM, однако полученные данные зачастую сильно расходятся или даже противоречат друг другу. Совершенно не изучены кинетические аспекты адсорбции белков, не исследованы особенности изотерм адсорбции белков на адсорбентах данного типа.

В последние 2-3 года появились первые публикации по адсорбции белков на адсорбентах с бимодальным распределением пор, однако они пока что немногочисленны. В литературе также нет достаточных сведений о закономерностях формирования структуры таких адсорбентов.

Цель данной работы — установить основные закономерности адсорбции белков и каталитических свойств адсорбированных ферментов на мезопористых кремнеземах с различным характером пористости. В связи с поставленной целью основные задачи исследования можно сформулировать следующим образом: изучить факторы, определяющие формирование пористой структуры мезопористых кремнеземов с моно- и бимодальным распределением пор, установить взаимосвязь между адсорбцией гемоглобина и пероксидазы на мезопористых кремнеземах и характером пористости адсорбента; сравнить каталитические свойства адсорбционных слоев пероксидазы на различных носителях.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Сокр. Расшифровка

EDX локальный рентгеноструктурный анализ

ЕО этиленоксид (звено цепи полиэтиленгликоля)

FSM Folded-sheet Mesoporous Material (класс мезопористых материалов)

НЬ гемоглобин

HRP пероксидаза хрена

Км константа Михаэлиса

РО пропиленоксид (звено цепи полипропиленгликоля)

MCF мезопористая ячеистая пена мсм Mobil Composition of Matter (класс мезопористых материалов)

SBA Santa-Barbara Acid (класс мезопористых материалов)

ДТА дифференциально-термический анализ ккм критическая концентрация мицеллообразования мк мезопористый кремнезем

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПЭГ полиэтиленгликоль пэм просвечивающая электронная микроскопия

СЭМ сканирующая электронная микроскопия

ТГА термогравиметрический анализ

ТМБ триметилбензол

ТПДЫНз термопрограммированная десорбция аммиака

ТЭОС тетраэтоксисилан

ЦТАБ бромид цетилтриметиламмония

Заключение диссертации по теме «Катализ», Овсянников, Роман Алексеевич

выводы

Размер и распределение пор в бипористых кремнеземах, получаемых в системе «БЮг — бромид цетилтриметиламмония — триметилбензол», определяется рН и температурой синтеза, а также концентрацией ЦТАБ и ТМБ в реакционной смеси. Условия получения материалов с максимальным вкладом пор диаметром 2080 нм: рН 10, температура синтеза 80-100 °С, концентрация ЦТАБ — 20 % мае.

Бипористыс кремнеземы являются лучшими носителями для пероксидазы по сравнению с другими исследованными адсорбентами. Широкие поры позволяют достигать высоких значений адсорбции, а благодаря дезагрегирующему действию узких пор биокатализатор проявляет наибольшую активность (до 25 % от исходной активности фермента в растворе).

На примере гемоглобина и пероксидазы показано, что для адсорбции белковых молекул в порах адсорбентов необходимо, чтобы их диаметр превосходил размер молекул белка по крайней мере в полтора-два раза.

Установлено, что адсорбция гемоглобина соответствует двухстадийной кинетической схеме с обратимой первой стадией. Рассчитанные константы скорости адсорбции и десорбции зависят от характера пористости кремнеземного адсорбента. Адсорбция гемоглобина не осложнена ассоциацией белка, а адсорбция пероксидазы происходит по механизму неограниченной линейной ассоциации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Овсянников, Роман Алексеевич, 2011 год

1. Березин И.В., Клячко H.JL, Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., ХмельницкийЮ.Л. /Иммобилизованные ферменты. //М.: Высшая школа. 1987. 296 с.

2. Cao L. / Carrier-Bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design. // Weinheim: Wiley-VCH. 2005.

3. Taylor R.F. / Protein Immobilization — Fundamentals and Applications. //N.Y.: Marcel Dekker. 1991. Pp. 305-318.

4. Brummer W., Hennrich N., Klockow M., Lang H., Orth H.D. / Preparation and Properties of Carrier-Bound Enzymes. // Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 25. No. 1. Pp. 129-135.

5. Cristallini C., Lazzeri L., Cascone M.G., Polacco G., Lupinacci D., Barbani N. / Enzyme-based bioartificial polymeric materials: the a-amylase — poly(vinyl alcohol) system. // Polym. Int. 1997. Vol. 44. No. 4. Pp. 510-516.

6. Dunlap B.R. Immobilised chemicals and affinity chromatography. //N.Y.: Plenum Press. 1974. Pp 123-134.

7. Martinek K., Mozhaev V.V. / Immobilization of enzymes: an approach to fundamental studies in biochemistry. //Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1985. Vol.57. Pp. 179-249.

8. Bickerstaff G.F. / Application of immobilised enzymes to fundamental studies on enzyme structure and function. // Top. Enz. Ferment. Biotech. 1984. Vol. 4. Pp. 162-201.

9. Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Егоров A.M. /Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена. // Рос. хим. ж. 2008. Т. 52. № 2. С. 60-65.

10. Hartmeier W. / Immobilized Biocatalysts. // Berlin: Springer-Verlag. 1988.212 p.

11. Nelson J.M., Griffin E.G. / Adsorption of invertase. //J. Am. Chem. Soc. 1916. Vol. 38. No. 5. Pp. 1109-1115.

12. Harkins W.D., Fourt L., Fourt P.C. / Immunochemistry of Catalase II. Activity in Multilayers. //J. Biol. Chem. 1940. Vol. 132. No. 1. Pp. 111-118.

13. Gale E.F., Epps H.M. /Studies on bacterial amino-acid decarboxylases: l.l(+)-lysine decarboxylase. // Biochem. J. 1944. Vol. 38. No. 3. Pp. 232-242.

14. Кобозев Н.И. /Катализатор и фермент (проблема сверхактивности природных веществ). //Учен. зап. Моск. ун-та. 1955. Т. 174. С. 125-154.

15. Полторак О.М. /Адсорбционное моделирование биомембран и ферментных комплексов.// Журн. физ. химии. 1967. Т. 41. № 10. С. 2544-2562.

16. Полторак О.М., Чухрай Е.С. / Липопротеидные слои на твердых носителях и свойства биомембран. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1970. № 2. С. 133-146.

17. Чухрай Е.С., Полторак О.М.* /Об изотерме адсорбции глобулярных белков на твердых носителях // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1973. Т. 14. № 3. С. 271-277.

18. Курганов Б.И., Лобода Н.И. / Регуляция активности ферментов в адсорбционных ферментных системах. // Биоорганическая химия. 1977. Т.,3. №10. С. 1407-1419.

19. Полторак 0:М., Пряхин А.Н., Чухрай« Е.С. / Адсорбционная иммобилизация* ферментов и проблемы ассоциации белков. Ниспадающие кривые удельной каталитической активности. //Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1977. Т. 18. №. 2. С. 125-142.

20. Tosa Т., Mori Т., Fuse N., Chibata I. / Studies on continuous enzyme reactions. I. Screening of carriers for preparation of water-insoluble aminoacylase. // Enzymologia. 1966. Vol. 31. No. 4. Pp. 214-24.

21. Silman I.H., Katchalski E. / Water-Insoluble Derivatives of Enzymes, Antigens, and Antibodies. //Annu. Rev. Biochem. 1966. Vol. 35. Pp. 873-908.

22. Axen R., Porath J., Ernback S. / Chemical Coupling of Peptides and Proteins to Polysaccharides by Means of Cyanogen Halides. //Nature. 1967. Vol.214. No. 5095. Pp. 1302-1304.

23. Sharp K., Kay G., Lilly M.D. /The kinetics of beta-galactosidase attached to porous cellulose sheets. // Biotechnol. Bioeng. 1969. Vol. 11. No. 3. Pp. 363-380.

24. Чухрай Е.С:, Полторак O.M. / Каталитические свойства адсорбированной сукцинат-дегидрогеназы. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1970. № 6. С. 10-13.

25. Nilsson Н., Mosbach R., Mosbach К. /The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes. //Biochim. Biophys. Acta, Enzymol. 1972. Vol. 268. No. l.Pp. 253-256.

26. Полторак O.M., Чухрай E.C., Хорикова Е.С. Веселова М.Н. / Некоторые аспекты механизма действия каталазы и возможность регуляции ее активности путем адсорбции и десорбции на твердых носителях. //Журн. физ. химии. 1974. Т. 48.- С. 2019-2023.

27. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Хорикова Е.С. / О механизме действия фосфо-глюкомутазы в растворе и в адсорбционно иммобилизованном состоянии. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1974. Т. 15. № 4. С. 410-416.

28. Messing R.A. / Carriers. // Immobilized Enzymes for Industrial Reactors. / Messing R.A. (ed.). N.Y.: Academic Press. 1975. Pp. 151.

29. Brodelius P., Mosbach K. / Immobilization Techniques for Cells/Organelles. //Methods Enzymol. 1987. Vol. 135. Pp. 173-454.

30. Andrade J.D., Hlady V., Wei A.P. / Adsorption of complex proteins at interfaces. // Pure Appl. Chem. 1992. Vol. 64. No. 11. Pp. 1777-1781.

31. Clark D.S. /Сап immobilization be exploited to modify enzyme activity? //Trends Biotechnol. 1994. Vol. 12. No. 11. Pp. 439-443.

32. Ramsden J J. / Puzzles and paradoxes in protein adsorption. //Chem. Soc. Rev. 1995. Vol. 24. No. l.Pp. 73-78.

33. Bruggink A., Roos E.C., de Vroom E. / Penicillin Acylase in the Industrial Production of p-Lactam Antibiotics. // Org. Process Res. Dev. 1998. Vol. 2. No. 2. Pp. 128-133.

34. Зайцева E.A., Чухрай E.C., Полторак O.M. Адсорбция и стабилизация дрожжевой гексокиназы. //Журн. физ. химии. 2001. Т. 75. №. 3. С. 549-552.

35. Cao L., Langen L.V., Sheldon R.A. / Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free? // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. Vol. 14. No. 4. Pp. 387-394.

36. Brodelius P. / Industrial applications of immobilized biocatalysts. // Adv. Biochem. Eng. 1978. Vol. 10. Pp. 75-129.

37. Bickerstaff G.F. / Immobilization of enzymes and cells. // Molecular Biology and Biotechnology. 5 ed. / Walker J.M., Rapley R. (ed.). London: Royal Society of Chemistry. 2009.

38. Scouten W.H. /Survey of Enzyme Coupling Techniques. //Methods Enzymol. 1987. Vol. 135. Pp. 30-65.

39. Bickerstaff G.F. / Characterization of Enzyme Activity, Protein Content, and Thiol Groups in Immobilized Enzymes. //Immobilization of Enzymes and Cells. Vol. 1. /Bickerstaff G.F. (ed.). Totowa,NJ: Humana Press. 1996. Pp. 253-259.

40. Brena B.M., Batista-Viera F. Immobilization of Enzymes: a Literature Survey. // Immobilization of Enzymes and Cells. Vol. 22. / Guisan J.M. (éd.). Totowa, NJ: Humana Press. 2006. Pp. 15-30.

41. Lawson T., Regnier F., Weith H. / Separation of synthetic oligonucleotides on columns of microparticulate silica coated with crosslinked polyethylene imine. // Anal. Biochem. 1983. Vol. 133. No. 1. Pp. 85-93.

42. Porath J., Axen R. / Immobilization of enzymes to agar, agarose, and Sephadex supports. // Methods Enzymol. 1976. Vol. 44. Pp. 19-45.

43. Guisan J. / Aldehyde-agarose gels as activated supports for immobilization-stabilization of enzymes. // Enzyme Microb. Technol. 1988. Vol. 10. No. 6. Pp. 375-382.

44. Drobnik J., Labsky J., Kudlvasrova H., Saudek V., Svec F. / The activation of hydroxy groups of carriers with 4-nitrophenyl and N-hydroxysuccinimidyl chloroformâtes. // Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. 24. No. 2. Pp. 487-493.

45. Miron T. / A spectrophotometric assay for soluble and immobilized N-hydroxysuccinimide esters. // Anal. Biochem. 1982. Vol. 126. No. 2. Pp. 433-435.49.