Методы просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения для анализа наноструктуры биоматериалов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.18, доктор физико-математических наук Суворова, Елена Игоревна

• Суворова, Елена Игоревна
• доктор физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор физико-математических наук Суворова, Елена Игоревна

Введение

Глава 1. Электронная микроскопия высокого разрешения в исследовании наноматериалов: преобразование Фурье и моделирование изображений.

Глава 2. Особенности низкоразмерных систем.

2.1. Фосфаты кальция как нанодисперсные биоматериалы: структура и образование.

2.2 Нанокомпозиты на основе частиц металлов неметаллов), стабилизированных полимерами.

Глава 3. Методы и материалы.

3.1. Методы электронной микроскопии.

3.1.1. Оборудование, используемое в исследовании 65 методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения.

3.1.2. Компьютерное обеспечение для 66 количественной обработки.

3.1.3. Интерпретация электронно-микроскопических 68 данных с помощью моделирования.

3.1.3.1 Моделирование размерного эффекта.

3.1.3.2. Учёт отклонения от точной ориентировки 75 (наклон кристалла).

3.1.3.3. Учет атомных колебаний, вибраций и 78 смещения образца.

3.1.3.4. Нахождение корреляции между 79 экспериментальными и моделированными ВРЭМ изображениями.

3.1.4. Сканирующая электронная микроскопия.

3.1.5. Рентгеновская энергодисперсионная спектроскопия для химического анализа в электронной микроскопии. 3.2. Материалы и приготовление образцов.

3.2.1. Фосфаты кальция, синтезируемые из водных растворов при низких температурах.

3.2.2. Высокотемпературные керамики и пористые материалы на основе гидрокисапатита, синтезируемого из водных растворов.

3.2.3. Сухой синтез: осаждение гидроксиапатита из газовой плазмы на подложки и получение высокотемпературных трикальцийфосфатов.

3.2.4. Биологический гидроксиапатит: костная ткань и минеральная фаза на сердечных клапанах.

3.2.5. Наночастицы селена и серебра в различных органических матрицах-стабилизаторах.

Глава 4. Особенности морфологии и структуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, осаждаемых нз водных растворов в разных условиях.

4.1. Низкотемпературная кристаллизация гидроксиапатита и октакальций фосфата.

4.2. Образование смешанных кристаллов гидроксиапатит / октакальций фосфат, ориентационные соотношения между фазами, морфология и атомная структура.

4.3. Проявление размерного эффекта на картинах рентгеновской и электронной дифракции.

4.4. Моделирование ВРЭМ изображений для определения толщины кристаллов.

4.5. Особенности структуры «толстых» кристаллов 117 гидроксиапатита: появление запрещенных отражений на электронограммах.

4.6. Сравнение с данными рентгенофазового 124 порошкового анализа смесей, содержащих гидроксиапатит и октакальций фосфат.

4.7. Влияние электронного облучения на состояние 128 кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата.

Пределы энергодисперсионного рентгеновского анализа.

Краткое обобщение результатов Главы 4.

Глава 5. Высокотемпературные модификации фосфатов кальция.

5.1. Высокотемпературные пористые и твердые 134 биоматериалы на основе гидроксиапатита, синтезированного в низкотемпературных растворах.

5.2. Особенности структуры плазменных покрытий 139 гидроксиапатита на металлических подложках, на поверхностях монокристаллов хлорида натрия и фторида бария.

5.3. Образование фаз при высокотемпературном 150 спекании трикальций фосфатов.

Краткое обобщение результатов Главы 5.

Глава 6. Биоминерализация: характеризация минеральной фазы в костной ткани и в осадках на сердечных клапанах.

6.1. Строение костной ткани: структура, морфология 164 и текстура нанокристаллов гидроксиапатита.

6.2. Электронная микроскопия минеральных осадков 170 на сердечных клапанах: морфология частиц и фазовая идентификация. Модель патологической минерализации клапанов.

Краткое обобщение результатов Главы 6.

Глава 7. Влияние различных органических матриц на 182 структуру наночастиц селена и серебра.

7.1. Электронная микроскопия наночастиц серебра.

7.2. Электронная микроскопия наночастиц селена. 188 Краткое обобщение результатов Главы 7.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения для анализа наноструктуры биоматериалов»

Просвечивающая электронная микроскопия является в настоящее время наиболее эффективным и универсальным методом исследования материалов. Электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ) исторически явилась первым методом, реально обеспечивающим визуализацию структуры объектов с атомным разрешением, во многих случаях являясь единственным источником получения информации о внутренней структуре и структуре границ раздела многих нанообъектов. Успех в использовании электронного зонда в просвечивающей электронной микроскопии определяется рядом факторов. Электронный пучок легко фокусируется с помощью линз, что позволяет исследовать локальную структуру в нанообластях. Преимуществом электронной микроскопии является также возможность получения количественной информации как в обратном (электронная дифракция), так и в прямом пространстве (электронно-микроскопические изображения с высоким разрешением). Кроме того, современный просвечивающий электронный микроскоп оборудован различными детекторами, что открыло новые возможности для локального количественного химического анализа. Устранение механических, тепловых и электрических нестабильностей в приборах, использование автоэлектронных источников с размером кроссовера (виртуального источника электронов) порядка 10 нм и яркостью примерно в тысячу раз выше, чем обычный У-образный вольфрамовый катод позволило достичь теоретического предела разрешающей способности микроскопа. При высоком разрешении микроскоп становится электронным интерферометром, а полученные экспериментальные изображения с высоким разрешением - электронной интерференционной картиной. Поскольку для подавляющего большинства образцов не существует простой аналитической связи между изображением с высоким разрешением и кристаллической структурой образца, то для интерпретации полученных данных требуется проведение компьютерного моделирования. В настоящее время созданы и постоянно совершенствуются мощные компьютерные программы для моделирования и количественного анализа изображений с регулярной (нерегулярной) структурой, включая фурье-преобразование и фильтрацию. Моделирование проводится для заданных электроно-оптических параметров (ускоряющее напряжение, величина сферической и хроматической аберраций, угол расходимости пучка) и предполагаемых или точно известных кристаллической структуры образца и его оси зоны при изменяемых значениях толщины и дефокусировки. После чего рассчитанные и экспериментальные изображения сравниваются, и кристаллическая структура подтверждается или опровергается, оценивается толщина исследуемого образца, определяются его дефекты. Развитие математического метода - быстрого преобразования Фурье электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением -предоставило возможность количественной характеризации нанофаз, когда образцом становится само изображение.

Наноматерилы, как природные, так и искусственные, составляют в настоящее время огромное поле для исследования их структуры с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Особенностью нанообъектов является наличие размерных эффектов, т.е. зависимость их свойств от размера и появление новых свойств. Известны такие явления, как изменение теплоемкости, давления паров, температуры плавления, оптических, магнитных и электронных свойств. Например, последнее свойство наряду с высоким отношением поверхности к объему частицы и увеличенным числом краев и граней приводит к повышенной активности и селективности во время каталитических реакций.

Динамично развиваются в настоящее время технологии по получению нанокомпозитов на основе металлических (неметаллических) наночастиц, диспергированных и стабилизированных в органических матрицах в/на структурированных или мезопористых подложках. Важным направлением в данной области является создание отвечающих современным требованиям биоматериалов. Например, нанокомпозит А^полимер нашел свое применение в качестве нового эффективного бактерицидного средства, большие перспективы в фармакологии у композитов на основе наночастиц элементарного селена. Функциональность и устойчивость таких средств определяется структурой компонент, и любое изменение биологической активности связано с изменением состояния наночастиц, химических реакций и фазовых переходов, контроль за которыми может быть осуществлен методами ВРЭМ.

Природным нанокомпозитом является костная ткань, в состав которой входят коллагеновые волокна с нанокристаллами фосфата кальция - гидроксиапатита. Организация костной ткани, структура, размеры и морфология нанокристаллов - компетенция ВРЭМ.

В качестве искусственных костных заместителей создаются все более эффективные биоматериалы на основе разных фосфатов кальция. В этом ряду - гидроксиапатит, а- и |3-трикальций фосфаты, дикальций фосфат, а также керамики, включающие комбинации фосфатов кальция в разных соотношениях для достижения требуемых параметров (растворимости, механических свойств). Осуществление контроля над фазовым составом таких материалов требуется не только во время и после изготовления кальций фосфатного биокомпозита, но и после его взаимодействия с водой или биологическими жидкостями, для исключения образования побочных продуктов из-за наличия малых концентраций примеси. По данным рентгеноструктурного анализа к настоящему времени известно порядка 20 кальций фосфатных модификаций (без включения в это число соединений с различными катионными или анионными заместителями). Эти соединения подвергаются физическо-химическим превращениям в биологических жидкостях, что приводит в разной степени к изменениям рН, концентраций ионов кальция и фосфат ионов, уровня пересыщения и, соответственно, образования и осаждения кристаллов. На практике идентификация фаз осложняется чрезвычайной близостью параметров кристаллических структур разных фосфатов кальция, малыми размерами и морфологическими особенностями.

В электронной микроскопии существует несколько путей исследования нано-объектов, выбор которых диктуется природой материала. Нанодифракция или электронная дифракция в сходящемся пучке есть прямой метод определения структуры и фазового состава наночастицы. Однако, для исследования перечисленных объектов, а именно: всех фосфатов кальция и наночастиц в органических матрицах данный метод не является подходящим из-за радиационной нестойкости образцов. Под действием сфокусированного пучка в пробу диаметром 2-3 нм нанокристалл или органическая матрица разрушается раньше, чем может быть получена картина нанодифракции. К параллельному пучку электронов в режиме ВРЭМ такие материалы толерантны в течение времени, необходимого для записи изображений, хотя и требуют очень низкой интенсивности. Поэтому для таких особо чувствительных к электронному облучению материалов методы количественной обработки с помощью преобразования Фурье ВРЭМ изображений, а также их моделирование являются наиболее эффективными при интерпретации экспериментальных данных и получения информации о структуре, фазовом составе и морфологии нанокристаллов.

Необходимость структурно-морфологического исследования мелкодисперсных систем потребовала разработки новых подходов в моделировании ВРЭМ изображений и картин электронной дифракции. Проведенное в настоящей работе исследование наноструктуры биоматериалов стимулировало ряд выполненных в 1996-2004 г. изменений и введение дополнительных функций в созданную ранее программу JEMS, существенно расширяющих возможности и области её применения.

С другой стороны, анализ наноструктур помог установить механизмы протекания химических и биологических процессов, и выявить корреляцию между структурой веществ и условиями их формирования, определить оптимальные параметры приготовления требуемых материалов и корректного их использования.

Целью диссертационной работы являлось развитие и определение потенциальных возможностей количественных методов электронной микроскопии высокого разрешения (ВРЭМ) для характеризации нанофаз в биоматериалах, включая моделирование размерного эффекта на картинах электронной дифракции, установления влияния наклона образца на распределение контраста на ВРЭМ изображениях, установления влияния структурных особенностей кристаллов на появление запрещенных рефлексов.

Методы моделирования как ВРЭМ изображений, так и картин электронной дифракции, полученных от материалов с большой низкосимметричной элементарной ячейкой и значительным числом разных атомов (до 400) потребовали изменений в пользовательском интерфейсе, чтобы оптимизировать время расчетов и рациональное использование оперативной памяти.

Необходимость структурно-морфологического исследования продуктов синтеза гидроксиапатита в процессе осаждения потребовала разработки новых подходов в анализе результатов ВРЭМ при характеризации мелкодисперсных систем. Эффективность и работоспособность подходов были протестированы на ряде других материалов: трикальций фосфатах, октакальций фосфате, селене и его соединениях, серебре и его соединениях. Ряд выполненных в 1996-2004 г. изменений в программе моделирования и создание дополнительных функций, существенно расширяющих возможности и области применения, был стимулирован настоящим исследованием наноструктуры биоматериалов.

На основе экспериментальных данных определялась корреляция между структурой нанообъектов, относящихся к классу биоматериалов, механизмов их образования и биоактивности. Измерения методами ВРЭМ дополнялись исследованием с помощью рентгеновской энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС), а также рентгеновской дифракции и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для получения информации о фазовом составе в целом от мелкодисперсного образца и для сравнения морфологии различных кристаллов в макромасштабе.

При этом большинство экспериментов в диссертационной работе было выполнено впервые. Основное внимание уделялось практически неисследованным областям, например, изучению образцов, полученных при кристаллизации из пересыщенных кальций фосфатных в условиях невесомости. Также впервые были получены и исследованы чистые кристаллы октакальций фосфата, выяснены причины появления сильного диффузного рассеяния на картинах рентгеновской и электронной дифракции от нанокристаллов гидроксиапатита и проведено моделирование размерного эффекта.

Впервые выявлено влияние некоторых органических субстанций на кристаллизацию уже сформировавшихся и стабилизированных в растворах наночастиц селена.

Актуальность темы.

Задачи, рассматриваемые в диссертации, представляют фундаментальный интерес в исследовании структуры материалов на наноуровне и механизма роста кристаллов, что тесно связано с актуальной проблемой исследования и создания наноструктур, развития нанотехнологий. Многолетние исследования показали, что эффективность, доступность и безопасность создаваемых новых материалов в области химии катализа, биомедицины и фармакологии напрямую зависят от уровня методов характеризации исходных веществ и применения компьютерного мониторинга. Именно таким живым проблемам посвящено большое число международных симпозиумов и конференций как, например, 14-ая международная конференция по росту кристаллов в Гренобле (2004 г.), 13-й европейский симпозиум по электронной микроскопии в Антверпене (2004 г.) 16 международный симпозиум по биоматериалам в Порто (Bioceramicslö 2003г.), 2-ой Объединенный конгресс европейского общества по кальцифицированным тканям и Международного общества исследования костной ткани в Женеве (ECTS -IBMS, 2005), 16 Международный конгресс по микроскопии в Саппоро (IMC16, 2006) и т.д.

Научная новизна.

Разработаны подходы к исследованию влияния размеров кристаллов на появление диффузного рассеяния на картинах электронной дифракции. Соответствующая программа моделирования размерного эффекта внесена в версию программы JEMS. Это позволило выявить причины сильного диффузного рассеяния на электронограммах и сравнить с уширением максимумов на рентгеновских дифрактограммах.

Усовершенствована программа моделирования ВРЭМ изображений, в которой учтены отклонения от точной оси зоны на любой угол, случайные вибрации и дрейф образца для поиска более точного соответствия расчётных и экспериментальных изображений. Результатом проведённой модификации стала возможность надёжной идентификации нанофаз (размер кристаллитов или областей порядка 5 нм). Определены толщины естественных кристаллов гидроксиапатита и относительная разориентация нанозерен в кристаллах, установлены причины появления запрещенных рефлексов с ростом толщины.

Создана программа построения сверхячейки анизотропного кристалла и образования структурной модели изотропной сферической частицы.

Впервые проведены исследования микро- и наноструктуры кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата, выращенных в условиях микрогравитации и выявлены различия в морфологии, размерах и структуре кристаллов, полученных в разных режимах смешивания исходных растворов. Впервые получены и исследованы чистые и большие (несколько миллиметров длиной) кристаллы октакальций фосфата.

Исследована структура смешанных кристаллов гидроксиапатит / октакальций фосфат, впервые установлены ориентационные кристаллографические соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

Определена наноструктура слоев гидроксиапатита, полученных плазменным осаждением на подложки.

Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция СаО во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-Са3Р04 при температуре 1430°С, которая значительно ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе Са0-Р205 и равной 1720°С.

Исследована структура нормальной и патологически измененной костной ткани и получены изображения отдельных нанокристаллов гидроксиапатита на коллагеновых волокнах, оценены их размеры в трех направлениях.

Исследован фазовый состав минерального осадка на сердечных клапанах и предложена модель его образования.

Проведена характеризация образующихся нанофаз под влиянием внешних условий и определена устойчивость нанокомпозитов на основе органической стабилизирующей матрицы с внедрёнными частицами селена и серебра.

Впервые обнаружен и описан эффект кристаллизации внутри рыхлых бесструктурных наночастиц селена, синтезированных в водных растворах с помощью окислительно-восстановительной реакций и стабилизированных в разных органических средах.

Практическая значимость работы.

Главным практическим результатом, полученным в работе, является обоснование применения комбинации методов по идентификации фазового состава в наномасштабе на основе количественной обработки ВРЭМ изображений с помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ изображений от радиационно-чувствительных объектов, оценка толщины естественных (не утонченных) нанокристаллов.

Установлены закономерности изменений наноструктуры и морфологии кристаллов гидроксиапатита и октакальций фосфата в зависимости от скорости смешивания исходных растворов, температуры кристаллизации.

Определены условия для получения нанокристаллических гидроксиапатитных покрытий из плазмы газового разряда на различных подложках. Результаты исследования структуры как осаждающихся из растворов кристаллов гидроксиапатита, так и плазменных покрытий на подложках, актуальны с точки зрения производства эффективных и безопасных биоимплантатов, так и выяснения механизмов патологических отклонений в живых организмах.

Предложен механизм биоактивности бактерицидных средств, включающих наночастицы серебра, в основе которого химическое взаимодействие серебра с серосодержащими агентами в окружающей среде и в организмах, установлены причины недостаточной эффективности медицинских препаратов с наночастицами селена в органических средах.

Всё это способствовало прояснению различий и сближению позиций между химическими, биологическими, медицинскими подходами с одной стороны и физическими подходами в получении и интерпретации результатов, с другой стороны.

Основные результаты и научные положения, выносимые на защиту: 1. Комбинированный метод по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронной дифракции и электронно-микроскопических изображений с высоким разрешением - программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца; создания сверхячейки анизотропного кристалла; образования структурной модели изотропной сферической частицы; исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.

2. Результаты экспериментальных исследований наноструктуры, морфологии и размеров кристаллов гидроксиапатита, синтезируемых в водных растворах в условиях конвективного смешивания реагентов, в диффузионном режиме смешивания в невесомости и в случае принудительного смешивания с разными скоростями при низких (25-40°С) и высоких (95°С) температурах.

3. Установление зависимости и определение толщины малорастворимых в воде кристаллов от температуры растворов. Обнаружение запрещенных гексагональной симметрией отражений в кристаллах гидроксиапатита благодаря локальному разупорядочению в их структуре.

4. Обнаружение размерного эффекта на электронограммах и его моделирование на примере нанокристаллов гидроксиапатита; сравнение электронографических и рентгенодифракционных данных.

5. Результаты экспериментального исследования наноструктуры смешанных кристаллов гидроксиапатита / октакальций фосфата: определение кристаллографических ориентационных соотношений и напряжений.

6. Результаты экспериментального исследования наноструктуры плазменных покрытий гидроксиапатита на различных подложках: определение фазового состава, размеров и относительной ориентации нанокристаллов в покрытиях.

7. Результаты экспериментального исследования наноструктуры и устойчивости кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430°С.

8. Результаты сравнительной характеризации здоровой костной ткани и образцов с патологическими изменениями; модельное представление механизма снижения минеральной плотности кости и развития деструктивных процессов.

9. Результаты экспериментального исследования - определение фазового состава минеральной фазы, осаждающейся на сердечных клапанах, структуры, морфологии, размеров кристаллов в осадке. Модельное представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.

10. Обнаружение эффекта кристаллизации наночастиц селена под действием органических веществ. Анализ экспериментальных данных с помощью структурного моделирования наночастиц селена.

11. Обнаружение продуктов химического взаимодействия наночастиц серебра с реагентами из окружающей среды. Модельное представление механизма бактерицидной активности наночастиц Ag.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. 9th European Symposium Gravity-Dependent Phenomena in Physical Science. Berlin, Germany, 2-5 May 1995;

2.16 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 29 ноября-2 декабря 1996;

3. 26th International School on Electron Crystallography, Erice, Italy, May 22-June 2,1997;

4.17 Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 15-18 июня 1998;

5.12th International Conference on Crystal Growth, Jerusalem, Israel 26-31 July, 1998;

6. 18th International Congress of the International Union of Crystallography, Glasgow, Scotland 4th- 13th August, 1999;

7. 18 Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 5 июня - 8 июля, 2000;

8. 9 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2000, Москва,

16-20 октября 2000;

9. First International Symposium on Microgravity Research and Applications in Physical Sciences and Biotechnology. Sorrento, Italy, 10-15 Sept. 2000;

10.11th Interdisciplinary Research Conference on Biomaterials (GRIBOI). Calais, France, 8 - 9 March 2001;

11. 4th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 24-28 September 2001;

12. Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" St Petersburg, Russia, May 27-29, 2002;

13.10 национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2002, Москва, 24-29 ноября 2002;

14. Gordon Research Conference on BIOMINERALIZATION. New London, USA, August 2002;

15. 9th General meeting of the Swiss Society for Biomaterials. Neuchatel, Switzerland, May 14-15, 2003;

16. 5th International Conference: Single Crystal Growth and Heat and Mass Transfer. Obninsk, Russia, 22-26 September 2003;

17.16th International Conference on Bioceramics, Porto, Portugal, November, 7-10,2003;

18.4-ая Национальная конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов-РСНЭ-2003, Москва, 17-22 ноября 2003;

19. XX Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 31 мая-4 июня, 2004;

20.13 European Congress on Electron Microscopy. Antwerp, Belgium, 23-28 August, 2004;

21. 14th International Conference on Crystal Growth. 9-13 August 2004, Grenoble, France;

22.2nd Joint Meeting of the European Calcified Tissue Society (ECTS) and the International Bone and Mineral Society (IBMS), Geneva, Switzerland, 24-29 June 2005;

23. XX International Congress of the International Union of Crystallography, Florence, Italy, 23-31 August, 2005.

24. 16th International Microscopy Congress (IMC 16), Sapporo, Japan, 5-9 Sept. 2006.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, включая 22 статьи в реферируемых журналах и сборниках научных трудов, 24 тезиса конференций, перечисленных в общем списке литературы.

Заключение диссертации по теме «Кристаллография, физика кристаллов», Суворова, Елена Игоревна

Результаты исследования радиационных повреждений и процесс разрушения кристаллов ОСР представлены на Рис. 4.36. Величина отношения Са/Р уже в начале электронной бомбардировки не соответствует атомному соотношению в ОСР, равному 1.33. Очевидно, что механизм разрушения включает образование оксидов фосфора, которые покидают кристалл поэтому отношение Са/Р возрастает.

Продолжение воздействия электронов приводило к полному разрушению материала. Скорость разрушения НАР и ОСР зависит от интенсивности электронного пучка. Процесс съёмки электронограмм с использованием падающего параллельного пучка, когда электроны фокусируются на наибольшем расстоянии от образца, можно проводить в течение 3 часов без ущерба для образцов. Однако, получение ВРЭМ изображений требует увеличения интенсивности для создания достаточного числа фотонов достигающих CCD камеры.

ОСР

--1-т-р--- 1-1-т--1-1-1-1---

1 23466789 10 К время облучения, мин

Рис. 4.36. Радиационные повреждения в кристалле ОСР: кристалл вначале исследования (а), поврежденная область кристалла после проведения микроанализа (б), изменение отношения Са/Р во время исследования(с); стрелки указывают характерные величина отношений Са/Р (НАР) =1.67, Са/Р (ТСР)=1.5 и Са/Р (ОСР)= 1.33.

Краткое обобщение результатов Главы 4.

На основе ВРЭМ с количественной обработкой изображений и моделированием как ВРЭМ-изображений, так картин электронной и рентгеновской дифракции установлена структура кристаллов ОСР с включениями НАР, и определены ориентационные отношениямежду фазами. Выявлен и описан размерный эффект от нанокристаллов НАР. Данный эффект проявляется резким уширением дифракционных максимумов и образованием диффузных колец на электронограммах. Значительную роль здесь играют структурные особенности НАР: большая элементарная ячейка с множеством легких атомов и близость дифракционных пиков, способствующая их перекрыванию. Обнаружена закономерность образования тонких (до 3-ех параметров ячейки в направлении [2ПО]) кристаллов в низкотемпературных растворах и значительно более толстых кристаллов в высокотемпературных растворах. Обнаружено, что для кристаллов толщиной в один параметр ячейки сохраняются правила погасания пр.гр. Р63/ш, в то время как с ростом толщины это правило нарушается, и на электронограммах и дифрактограммах появляются запрещенные рефлексы {0001}. Данный факт может быть объяснен с позиций динамической дифракции и нарушения гексагональной упаковки слоев в кристаллах толщиной, превосходящих высоту одной элементарной ячейки. Описаны эффекты радиационного повреждения кристаллов НАР и ОСР при электронно-микроскопическом исследовании. Результатом электронного облучения является образование многочисленных границ в толстых кристаллах с последующим разрушением и испарением кристаллов. Среднее время исследования тонких кристаллов с помощью пучка низкой интенсивности не превышает 20 секунд. Фазовый анализ различных кальций фосфатных модификаций по соотношению Са/Р методом ЭДС не представляется возможным из-за неопределенности состава и объема исследуемой области, подвергающейся радиационному облучению. При этом соотношение Са/Р имеет тенденцию к росту. Фазовых превращений между фосфатами кальция под действием электронного пучка не зафиксировано. Показана возможность оценки толщины кристаллов НАР, а также установления относительной разориентации нанозерен внутри кристалла с помощью моделирования ВРЭМ изображений. Используемая программа моделирования ВРЭМ изображений позволила учитывать в построении традиционных серий толщина/дефокус влияние отклонения от точной оси зоны (наклон кристалла), вибрации и дрейф образца с различными амплитудами.

Глава 5. Высокотемпературные модификации фосфатов кальция.

Рассмотрены особенности структуры биоматериалов на основе гидроксиапатита, осажденного из плазмы на различные подложки [179,180,192], а также керамик, полученных при высокотемпературном спекании синтезированного в растворе НАР [177], пористых гранул [177], образованных в кипящей суспензии и высокопористых материалов, полученных из а- и (3-трикальций фосфатов при повышенных температурах. Исходные материалы подвергались высокотемпературной обработке, в результате которой происходили или могли происходить фазовые переходы. Проведенное исследование методами рентгеновской дифракции и ВРЭМ включало фазовую идентификацию фосфатов кальция в полученных материалах, установление размеров частиц, обнаружение микро- и нанопримесей.

5.1. Высокотемпературные пористые и твердые биоматериалы на основе гидроксиапатита, синтезированного в низкотемпературных растворах.

Исходный синтезированный НАР для последующего приготовления твердых керамик представлял собой порошок с агломерированными наночастицами, размер которых увеличивался со временем нахождения осадка в маточном растворе (Рис.4.10 - 4.12). Установлено, что исходный размер нанокристаллов существенного влияния на их структуру не оказал.

Гранулированный материал, полученный из кипящей суспензии, представлен на Рис. 5.1. Максимальный диаметр отдельных гранул достигает 1 мм, средний диаметр - 300-500 мкм. Измерения показали, что плотность одной гранулы составляет 1/3 от плотности гидроксиапатита 3.07 г/см3 [72].

Каждая гранула является агломератом в основном анизотропных наночастиц НАР, вытянутых вдоль направления [0001]. Таким образом, в значительной степени форма и размеры нанокристаллов в гранулах

134 подобны кристаллам в исходных порошках с периодом кристаллизации от 60 сек. Различие состоит в том, что в гранулах примерно на порядок больше выявляется кристаллов НАР в виде гексагональных пластинок.

Рис. 5.2. Нанокристаллы НАР, образующие гранулы (а), поликристаллическая электронограмма (б), ВРЭМ изображение (в) и дифрактограмма (г), полученные вдоль оси зоны [4 510] для значения дефокуса 0 нм, толщины кристалла 3 нм и амплитуды вибрации по оси X с азимутальным углом -47.5°.

Электронно-микроскопические изображения нанокристаллов, полученных при разламывании гранулы, представлены на Рис. 5.2а с соответствующей поликристаллической электронограммой (Рис. 5.26). ВРЭМ изображения и дифрактограмма подтверждают кристаллическую фазу НАР (Рис. 5.2 в, г). Моделирование ВРЭМ изображения (Рис. 5.2 г, вставка М) проводилось для гексагонального НАР с пр. гр. Р63/т вдоль оси зоны [4 510] для значения дефокуса 0 нм, толщины кристалла 3 нм и амплитуды вибрации по оси X под азимутальным углом -47.5°. Получено отличное согласование между экспериментальным и рассчитанным изображениями.

Рис. 5.3. Внешний вид (а) и структура разлома (б) керамики НАР, полученной спеканием при 870°С.

Рис. 5.4. Внешний вид (а) и структура разлома (б) керамики НАР, полученной спеканием при 1200°С.

Внешний вид образцов - твердых керамик, спекаемых при температурах 870°С и 1200°С, а также внутренняя структура на разломе показаны на Рис. 5.3 и Рис. 5.4. Изображения, полученные в сканирующем электронном микроскопе, демонстрируют значительные отличия: в структуре керамики, полученной при 870°С ясно различимы нанокристаллы. Для высокотемпературной керамики характерна достаточно гладкая поверхность разлома, на которой выделяются несколько монокристаллических блоков размером до 2 мкм. Плотность керамики, отожженной при 870°С, составляет приблизительно 2/3 от плотности гидроксиапатита, в то время как, плотность ВРЭМ изображение высокотемпературной керамики приближается к плотности НАР и составляет около 98%.

Рентгенофазовый анализ не выявил присутствия посторонних фаз в обеих керамиках, в которых можно было ожидать появление а- или р-формы трикальций фосфата кальция, особенно при повышенных температурах.

Моделирование рентгенодифракционных картин показало, что предел чувствительности находится на уровне 2 вес.% Р-Саз(Р04)2 (Рис. 5.5). На присутствие примеси Р-Са3(Р04)г могут указать только малоинтенсивные отражения 214 с углом 20=27.78° и 0 2 10 в области 26=31.03°.

Рис. 5.5. Моделированная рентгенодифракционная картина от смеси 98 вес.% НАР - 2 вес.% ß-Ca3(P04)2. Стрелками показаны два наиболее интенсивных пика 214 (20=27.78°) и 0 2 10 (20=31.03°), принадлежащие примесной фазе ß-Ca3(P04)2. Отражения, относящиеся к НАР, указаны обычным шрифтом, отражения, относящиеся к ß-Ca3(P04)2, указаны итальянским шрифтом.

Морфология нанокристаллов (Рис. 5.6), составляющих 870-градусную керамику, значительно отличается от морфологии кристаллов в исходном порошке и в гранулах: их форма становится более изотропной. ВРЭМ изображение и дифрактограмма получены от гексагональной частицы вдоль оси зоны [0001] с характерными только для НАР межплоскостными расстояниями 0.815 нм (Рис 5.6 в,г).

Рис. 5.6. ПЭМ изображение частиц НАР из керамики, полученной при 870°С (а) и поликристаллическая электронограмма с указанием характеристических для НАР рефлексов 1010 и 2131 (б), ВРЭМ изображение (в) и дифрактограмма (г) от гексагональной частицы НАР с Рис. 10а (показана стрелкой).

Рис. 5.7. ПЭМ изображение частицы НАР из высокотемпературной керамики (а) и электронограмма (б), фильтрованное ВРЭМ изображение (в), дифрактограмма (г) и моделированное изображение М, полученное для значения дефокуса 35 нм и толщины образца 3.5 нм, который наклонен к оси зоны [1100] под углом 0.66° вдоль направления [0001], амплитуда вибраций составляла 0.148 нм.

В случае высокотемпературной керамики спекание при 1200 °С приводит к образованию поликристаллического стержня, при этом размеры составляющих его блоков достигают 2 мкм. Одна из частиц со своей электронограммой вдоль направления [1100] представлена на Рис. 5.7. ВРЭМ изображение (Рис. 5.7 в), дифрактограмма (Рис. 5.7 г) и моделированное изображение М, полученное для значения дефокуса 35 нм и толщины образца 3.5 нм, который наклонен к оси зоны [1100] под углом 0.66° вдоль направления [0001], подтверждают фазу гидроксиапатита.

Для каждого из исследованных образцов было обработано не менее 100 картин электронной дифракции и 100 ВРЭМ изображений от различных кристаллов, или частиц, или их агломератов в исходных материалах и конечных керамиках. Не установлено присутствия других кальций фосфатных модификаций в биокерамиках, соответственно, не выявлено признаков разложения гидроксиапатита при температуре спекания 1200°С.

Для температуры 1200°С в [67] было установлено максимальное значение прочности на изгиб порядка 100 МПа и рассчитаны размеры кристаллических блоков в чистой керамике НАР, равных 1-1.5 мкм. В нашей работе была получена та же величина прочности на изгиб и из электронно-микроскопических изображений измерены размеры блоков в высокотемпературной поликристаллической керамике. Хорошее согласование данных свидетельствует о воспроизводимости условий экспериментов и результатов.

5.2. Особенности структуры плазменных покрытий гидроксиапатита на металлических подложках, поверхностях монокристаллов хлорида натрия и фторида бария.

При исследовании кальций фосфатных покрытий [178-180] сначала проводился предварительный анализ исходного порошка. Гранулометрический анализ показал, что распределение по размерам частиц в порошке гидроксиапатита после отжига имеет два максимума при 2.5 мкм и 11.4 мкм.

Просвечивающая электронная микроскопия демонстрирует, что подобные частицы являются агломератами кристаллов (Рис.5.8), и, соответственно, величина таких агломератов может изменяться вплоть до размера одного кристалла (до 200 нм).

Фаза гидроксиапатита была определена из картин электронной дифракции, полученных от отдельных нанокристаллов (Рис.5.9) и подтверждена в результате сравнения экспериментальных и моделированных ВРЭМ изображений (Рис. 5.10).

Из дифрактограммы (FFT) от ВРЭМ изображения (Рис. 5.10) определена ориентировка [45 10] в нанообласти. Моделирование проводилось для набора толщин кристаллов и ряда значений дефокусировки, интервала углов наклона кристалла к точной оси зоны.

Рис. 5.8. Исходный порошок ПАР, используемый для получения покрытия. Кругом отмечен агломерат, показанный в увеличенном масштабе на Рис. 5.2.

Рис. 5.9. ПЭМ изображение агломерата кристаллов с Рис. 5.1. Электронограмма получена с отмеченного стрелкой кристалла НАР вдоль оси зоны [45 10].

Рис. 5.10. ВРЭМ изображение кристалла НАР с Рис. 5.2. ПФ (FFT НАР) получено вдоль оси зоны [4510], на вставках S1 и S2 - смоделированные ВРЭМ изображения, рассчитанные для направления [4510] НАР для дефокуса 21 нм и 23 нм, соответственно, и толщине кристалла 3.2 нм вдоль указанного направления.

Наилучшее соответствие между моделированием (на вставках 81 и Б2) и экспериментом получено для кристалла гидроксиапатита толщиной 3.2 нм с осью зоны [45 10] и значении дефокуса 21 и 23 нм. Таким образом, кристаллы гидроксиапатита в исходном отожженном порошке, используемом для запрессовывания в таблетки, весьма тонкие.

Рис. 5.11. Поверхность (а) и поперечное сечение (б) слоев НАР на подложках.

Изображения (Рис. 5.11 а), полученные в сканирующем электронном микроскопе, демонстрируют морфологию слоев (вид сверху), осажденных на металлические подложки и монокристалл ВаР2. В указанном масштабе покрытия выглядят плотными, однородными и имеют малую поверхностную шероховатость. Изображение поперечного сечения покрытия представлено на Рис. 5.11 б. Для получения этого изображения, поверхность подложки ВаР2 со слоем была установлена практически параллельно падающему электронному пучку в микроскопе, что и позволило определить толщину покрытия, а также оценить его шероховатость и скорость образования. Толщина слоя достигает 400 нм и, соответственно, средняя скорость его образования порядка 1нм/мин, шероховатость до 10 нанометров.

Рисунок 5.12 демонстрирует ПЭМ изображение тонкого среза покрытия (Рис. 5.12 а), ЭДС спектр (Рис. 5.5 б) и поликристаллическую электронограмму (Рис. 5.12 в). Химический анализ различных образцов

142 покрытий свидетельствует, что основными элементами являются кальций, фосфор и кислород (Рис. 5.12 б), пик от меди появляется из-за использования медной сетки. Поскольку материал покрытий является чувствительным к воздействию электронного облучения, то при выполнении спектроскопических измерений электронный пучок не фокусировался полностью на исследуемом участке. Например, при времени регистрации спектра 40 сек оптимальный диаметр электронного зонда для получения хорошей статистики измеряемого сигнала составлял не менее 50 нм.

Рис. 5.12. ПЭМ изображение (вид сверху) тонкого среза покрытия НАР (а), поликристаллическая электронограмма (б), ЭДС спектр (в) с основными химическими элементами Са, Р, О. Пик от Си появляется из-за медной поддерживающей сетки, пик С возникает благодаря углеродной плёнке-подложке.

Однако, используя только данные ЭДС о величине отношения Са/Р, определить структуру вещества, его фазовый состав невозможно, поскольку со временем облучения относительное количество кальция и фосфора изменяется в сторону уменьшения содержания фосфора. Например, полу количественный ЭДС анализ (Рис. 5.13), проведенный в первые 40 сек регистрации, дал отношения Са/Р = 1.8, что выше характерного для гидроксиапатита значения 1.67.

4.00 3.50

3.00 2 50

О 2.00 1 .50 1.00 0 .50 0.00

Рис. 5.13. Изменяющееся соотношение Са/Р в процессе регистрации ЭДС спектров для НАР покрытия.

Следует отметить, что электронограмма (Рис. 5.12 б) имеет первое яркое широкое кольцо, второе кольцо, составленное точечными рефлексами, достаточно тонкое, все следующие кольца довольно слабые и уширенные. Такая электронограмма не может быть использована для точного фазового анализа.

В данном случае структура покрытия была определена с помощью фурье-преобразования (дифрактограммы), полученного от ВРЭМ-изображения (Рис. 5.14). Для подтверждения фазового состава образца, проведено моделирование в области, отмеченной квадратом на Рис. 5.14. Поскольку образец является достаточно толстым, то сравнение экспериментального и рассчитанного изображений выполнялось с помощью фильтрованного изображения (IFFT), которое получали наложением маски на максимумы отражений на дифрактограмме. На

144 вставках Б1, 82 и БЗ представлены рассчитанные изображения при значениях дефокуса 40 - 43 нм, с предполагаемыми толщинами 60 - 72 нм и с углом разориентации к оси зоны [1100] порядка 1.2°. Таким путем показано, что покрытие состоит из нано- и субнанокристаллов гидроксиапатита со средним размером около 5 нм, разориентированых относительно друг друга.

Рис. 5.14. ВРЭМ изображение тонкого среза НАР-покрытия. ПФ (FFT НАР) получено вдоль оси зоны [1100]. На изображении обратного ПФ (IFFT НАР) промоделированы три нанообласти Sl, S2 и S3 для НАР вдоль [1100], значений дефокуса 40-43 нм, толщиной кристалла порядка 60-72 нм и разориентировкой нанозерен около 1.2° относительно [1100].

Чтобы выявить внутреннюю структуру покрытий были получены ВРЭМ-изображения с их поперечных сечений. Рисунок 5.15 (а) представляет ПЭМ изображение поперечного сечения на подложке монокристалла ВаР2. Электронограмма (Рис. 5.15 б) указывает на нанокристаллический характер материала.

Толщина плазменных покрытий при данных условиях получения составляла порядка 400 нм, покрытия были достаточно однородными, гладкими с малой шероховатостью, не превышающей 10 нм.

Рис. 5.15. Поперечное сечение покрытия на подложке BaF2 (а) и соответствующая электронограмма (б), в которой уширенные кольца принадлежат фазе НАР, а сетка точечных рефлексов принадлежит подложке монокристаллу [101] BaF2.

Электронограмма (Рис. 5.15 б) включает 3-4 видимых уширенных кольца - ряд отражений с наибольшими структурными факторами для атомных плоскостей {0002}, {2131} - {0330}, {224 2} - {32 13}, and {2460} - {0552}. Индицирование проводилось в рамках гексагональной структуры НАР, однако, нельзя полностью исключить присутствие другой кальций фосфатной модификации. Таким образом, электронная дифракция с выделенного участка из-за размерного эффекта кристаллитов в покрытии [142] не может дать полной гарантии точного фазового анализа. И как уже отмечалось выше, из-за высокой чувствительности к радиационным повреждениями микродифракция с нанообластей также не является подходящим методом.

ВРЭМ-изображение (Рис. 5.16) поперечного сечения демонстрирует, что покрытие состоит из нанокристаллов НАР размером от 3 до 20 нм. Эти нанокристаллы ориентированы случайным образом относительно друг друга и относительно подложки. Индицирование дифрактограмм от трёх нанообластей (Рис. 5.16 FFT a,b,c) показала присутствие только нанокристаллов НАР. На других ВРЭМ изображениях также никакой другой фазы не было установлено. Следует отметить, что непосредственно вблизи подложки наблюдались неупорядоченные области, появление которых можно объяснить образованием случайно ориентированных нанокристаллов НАР, размеры которых сравнимы с размерами элементарной ячейки.

Для сравнения структур разных кальций фосфатных покрытий, было проведено исследование нескольких образцов, полученных при других условиях. Образование областей с полностью нерегулярной структурой на атомном уровне было выявлено после изменения условий осаждения покрытий. На Рис. 5.17а представлено электронно-микроскопическое изображение образца кальций фосфатного покрытия, полученного на подложке титана анодным окислением с помощью разряда в водном растворе электролита СаЩгРО^г [89] при постоянном электрическом токе порядка 150 мА. В этом случае оказались важными результаты ЭДС анализа, поскольку электронограмма на Рис. 5.17 б с размытыми рефлексами аналогична электронограмме на Рис. 5.12 б, и при этом не было обнаружено регулярной структуры на ВРЭМ изображениях.

Однако количественный спектроскопический анализ (Рис. 5.18 а, б) показал резкое превышение содержания фосфора над кальцием (при аналогичных условиях измерений) в одной части образца и резкое превышение кальция над фосфором в другой части образца. Кругами на микрофотографии (диаметр электронного зонда) отмечены области, в которых проводился количественный рентгеновский ЭДС анализ и показавший разные значения отношения Са/Р, равные 0.12 и 5.9, в близко расположенных участках

Рис. 5.16. ВРЭМ изображение поперечного сечения покрытия НАР на подложке BaF2. Отдельные нанокристаллы выделены белыми квадратами а, Ь, с. Соответствующие дифрактограммы a, b, and с подтверждают фазовый состав нанокристаллов и указывают ориентировку относительно электронного пучка. Дифрактограмма d получена от подложки монокристаллического BaF2 (белый квадрат d) вдоль оси зоны [101].

FeNi ■.„Си FeCo CoBNI | i ' , 9 10

Рис. 5.17. Область покрытия на подложке титана после анодного окисления в результате разряда в водном растворе электролита Са(Н2Р04)2. Отмечены участки с различными значениями Са/Р (а), электронограмма с уширенными кольцами(б).

Рис. 5.18. ЭДС спектры от изображения на Рис. 5.10 с соотношениями Са/Р, равными 0.12 (а) и 5.9 (б).

Таким образом, данные ЭДС показали, что покрытие содержало несколько фаз, включая оксиды фосфора и кальция, смесь которых на атомном уровне образует разупорядоченную структуру.

5.3. Образование фаз при высокотемпературном спекании трикальций фосфатов.

В рамках исследований, направленных на развитие биотехнологий и методов приготовления новых материалов, трикальций фосфаты рассматриваются как биоактивные заместители в случае регенерации костной ткани. Известны несколько модификаций с химической формулой Са3(Р04)2, имеющих различную кристаллическую структуру [45, 46, 193, 194]. Здесь представлены результаты исследования, полученные при синтезе моноклинной фазы а-Саз(Р04)2 [46]. Данная модификация получена с помощью высокотемпературного фазового перехода из тригонального (3-Саз(Р04)2 [45]. Температура фазового перехода составляет 1125°С. Фаза а-Саз(Р04)г обладает более высокой растворимостью по сравнению с Р-Са3(Р04)2 и является термодинамически устойчивой до 1430°С, после чего образуется другая (супер) а-Сй^РО^ вплоть до точки плавления 1765°С [193].

Конечный продукт высокотемпературного спекания, названный СР50 и предполагающий в своём составе а-Саз(Р04)2, исследовался методами рентгеновской дифракции, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии для выявления возможных примесей других соединений кальция, включая микро- и наноуровень.

Изображения, полученные в сканирующем электронном микроскопе, пористого материала представлены на Рис. 5.19 (а, б, в) с возрастанием увеличения на микрофотографиях.

Моделирование с помощью компьютерной программы СаШпе С1у81а11о£гар11у 3.1 показало, что присутствие малых количеств других соединений кальция, которые могли бы образоваться в процессе высокотемпературного синтеза, не могут быть выявлены только с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

Рис. 5.19. Пористый конечный материал а-Са3(Р04)2, полученный в процессе высокотемпературного спекания начального порошка (3-Са3(Р04)2. Показан последовательный рост увеличений на микрофотографиях (а - в).

Расчет рентгенограмм показал зависимость интенсивности пиков от количественного соотношения между фазами а- и (3- Са3(Р04)2 в смеси. Если количество (3-фазы в смеси не превышало 10 %, то по одной только порошковой дифрактограмме было сложно определить, является ли материал одно- или двухфазным. материала СР50 (а-ТСР) и начального порошка Р-ТСР (а), часть рентгенограммы, записанной с малой скоростью для разрешения пика 200 от оксида кальция (б).

Анализ экспериментальных рентгенограмм (Рис. 5.20а), полученных от конечного продукта и исходного материала (3-ТСР, показал присутствие дифракционных пиков от исходного порошка Р-ТСР (1 0 10)р.тср и (314)р. тер- С помощью моделирования рентгенограмм от смесей, включающих обе фазы в разных соотношениях, было установлено, что количество исходного материала равно приблизительно 3-3.4 вес.% (Рис. 5.21).

Рис. 5.21. Рассчитанная рентгенограмма для смеси, содержащей 86.0 % а-ТСР {конечного продукта), 3.0 % [З-ТСР (остаточного исходного материала) и 11.0 % СаО (примесь, образовавшаяся в результате разложения трикальций фосфатов).

Разумно было также предположить, что часть трикальций фосфата может разложиться в результате термического воздействия. Поэтому в интервале углов 26 от 37° до 38° рентгенограмма записывалась с шагом 0.01° для того, чтобы разрешить пик 200 от оксида кальция. На Рис. 5.206 показано положение этого пика на экспериментальной рентгенограмме. Однако его величина слишком мала для количественной оценки, а моделирование показало, что количество кубического оксида кальция, надёжно детектируемого с помощью рентгеновской дифракции, должно быть не менее 11-16 вес.%. Оценка количества СаО с помощью моделирования дало величину в 11.0 - 15.0%.

Поэтому применение электронной микроскопии было естественным для исследования возможного присутствия микро- и нанофаз в конечном материале. Одно из ПЭМ-изображений с электронограммой от частицы из образца конечного материала а-Са3{РО^)2 показано на Рис. 5,22. а-Саз(Р04)2 [043] / / / / / /. ф . • • • а

Шо . ■• ••

434 \ \ * ^ Ч I / /

10 нм а)1 а-Саз(РОф [043] б)

Рис. 5.23. Экспериментальная электронограмма (а) и наложенные друг на друга экспериментальная и моделированная электронограммы (б). На электронограмме (а) обозначены Лауэ зоны высоких порядков: I, Л и III.

Рис. 5.24. Экспериментальное и моделированные (SI, S2, S3 и S4) ВРЭМ-изображения с дифрактограммой вдоль оси зоны [043].

Картина с наложенными друг на друга экспериментальной и моделированной электронограммами (Рис. 5.23 б) даёт возможность проиндицировать все видимые рефлексы и установить наличие отражений из нулевой, первой, второй и третьей лауэ-зон. Расчёт 120 электронограмм показал образование только одной кальций фосфатной модификации а

Са3(Р04)2.

ВРЭМ-изображения (экспериментальное и четыре моделированных для разных толщин кристалла) с дифрактограммой показаны на Рис. 5.24. Моделирование ВРЭМ изображений SI, S2, S3 и S4 проводилось вдоль оси зоны [043], при значениях дефокуса 45 нм, 45 нм, 30 нм and 30 нм с предполагаемыми толщинами 11.8 нм, 47.3 нм ,59.1 нм и 71.0 нм при углах наклона 0°, 0.1°, 0.23° и 0.23° к оси зоны [043] вдоль направления [001], соответственно. Экспериментальное и рассчитанные изображения хорошо соответствуют друг другу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Электронная микроскопия высокого разрешения в современном исполнении способна решать сложные задачи из многих областей: физики, химии, материаловедения, биологии, медицины. Характеризация нанофаз -это не только определение структуры материалов, но и установление механизма их образования, отработка методов синтеза и выявление оптимальных условий.

В настоящей работе проведено исследование возможности и эффективности метода преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ-изображений для характеризации нанофаз в биоматериалах: определения структуры и морфологии. Такой подход диктовался особенностями строения исследуемых материалов, а именно радиационной чувствительностью образцов и малыми размерами исследуемых областей. С помощью преобразования Фурье и моделирования ВРЭМ-изображений с хорошей точностью удалось определить структуру нанокристаллов гидроксиапатита в костной ткани и в осадках на сердечных клапанах, выявить включения гидроксиапатита в кристаллах октакальций фосфата, оценить толщины осаждаемых кристаллов, установить разориентировку зёрен внутри кристалла. Показана высокая эффективность и надёжность используемых компьютерных программ Digital Micrograph и JEMS, большим преимуществом которых является их многофункциональность и работоспособный графический пользовательский интерфейс. Это тот путь, который можно предложить для развития компьютерного обеспечения научных разработок: хорошая научная база и отличное графическое представление результатов.

В заключение можно сформулировать следующим образом основные результаты проведенных исследований:

1. Продемонстрированы возможности комбинированного подхода по идентификации нанокристаллов и нанофаз в разных биокомпозитах с помощью преобразования Фурье и моделирования электронномикроскопических изображений с высоким разрешением и электронной дифракции.

2. Для повышения точности интерпретации электронно-микроскопических данных разработаны специальные программы для моделирования ВРЭМ изображений с учетом отклонения от точной оси зоны, атомных вибраций, дрейфа образца, создания сверхячейки анизотропного кристалла и структурной модели изотропной сферической частицы, исследования зависимости уширения дифракционных максимумов с уменьшением размера частиц.

3. Определены толщины образующихся в водных растворах тонких кристаллов и установлена зависимость толщины от температуры растворов.

4. Обнаружены запрещенные гексагональной симметрией дифракционные отражения в кристаллах гидроксиапатита и предложено объяснение данного эффекта, возникающего благодаря локальному разупорядочению в структуре.

5. Выявлены причины диффузного рассеяния на дифракционных картинах, которое образуется благодаря размерному эффекту. Проведено моделирование размерного эффекта на примере нанокристаллов гидроксиапатита и оксида кальция, показан вклад перекрытия соседних дифракционных максимумов в уширение колец на электронограммах.

6. Впервые исследована структура больших чистых кристаллов октакальций фосфата, полученных из водного раствора в условиях невесомости, а также смешанных кристаллов гидроксиапатит /октакальций фосфат, выращенных в условиях конвективного (земного) смешивания реагентов. Установлены ориентационные соотношения между двумя фазами, вычислены напряжения в кристаллах.

7. Впервые получены результаты о наноструктуре на поперечных сечениях плазменных покрытий гидроксиапатита на подложках; определены размеры, относительная ориентировка между нанокристаллами в слое и по отношению к подложке.

8. Определена устойчивость кальций фосфатных биоматериалов, полученных при высоких температурах. Впервые выявлено образование оксида кальция во время спекания и приготовления пористого костного биозаместителя на основе а-СазР04 при температуре 1430°С, которая значительно ниже температуры, определённой фазовой диаграммой в системе Са0-Рг05 и равной 1720°С.

9. На основе ВРЭМ исследования и сравнительной характеризации разных образцов костной ткани предложен механизм деструктивных процессов, происходящих в кости, на фоне снижения минеральной плотности. Показано, что изменений в составе минеральной фазы не происходит. Образцы, как здоровой, так и патологически измененной костной ткани, включают нанокристаллы гидроксиапатита длиной до 15-20 нм, шириной до 15 нм и толщиной порядка 0.8-1.6 нм с характерной текстурой до ±30°. Причиной снижения минеральной плотности кости, а также развития остепороза может быть сильное разрастание органической ткани в виде пленок и волокон, которое является причиной искусственной пористости и хрупкости кости.

10. Экспериментально показано подобие образования и осаждения фосфатов кальция в низкотемпературных растворах и образования минеральных осадков на сердечных клапанах. Детально исследованы фазовый состав (гидроксиапатит и октакальций фосфат), размеры кристаллов НАР (длина и ширина - доли микрометра, толщина до одного-пяти параметров решетки вдоль направления [2110]) и микронные размеры кристаллов октакальций фосфата и морфология кристаллов. Развито новое представление механизма патологической минерализации мягких тканей в живых организмах.

11. Определена устойчивость нанокомпозитов на основе органических матриц с диспергированными наночастицами селена и серебра к агломерации и действию химических реагентов в окружающей среде. Предложен механизм бактерицидной активности и ее изменения для наночастиц серебра в растворах и тонких пленках.

12. Впервые обнаружено и исследовано влияние органических материалов на кристаллизацию уже образовавшихся и существующих в водных растворах рыхлых бесструктурных наночастиц селена. Присутствие бактериальной целлюлозы способствуют кристаллизации наночастиц с образованием дефектов и границ внутри моноклинного кристалла а-селена.

Таким образом, исследование структуры и морфологии нанофаз привело к заключению о необходимости пересмотра результатов, полученных много лет назад, и привести в соответствие модельные представления прошлого с современными методологическими возможностями. Исследование механизмов, протекающих на наноуровне, структура наноматериалов потребовали особого подхода, как в постановке эксперимента, так и в корректной интерпретации экспериментальных данных.

Данная работа была бы невозможна без поддержки значительного числа людей, вовлечённых в научный процесс.

Автор считает своим долгом поблагодарить технических сотрудников, помогавших в приготовлении образцов. Хороший образец в электронной микроскопии высокого разрешения - это половина успеха в исследовании. Даниэла Лауб и Фабьен Бобард, работающие в Центре электронной микроскопии (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) сделали всё возможное для получения хороших тонких образцов.

Работа по изучению фосфатов кальция, включая кристаллы из космоса, была начата в лаборатории А.А. Чернова и под его руководством. А.А. Чернов при поддержке швейцарских и датских коллег способствовал проведению исследований. Автор горячо благодарит финансовую поддержку X. Шнайтера из швейцарской компании Контравес Спейс (Contraves Space) и научное сотрудничество с проф. Э. Лундагером Мадсеном из Дании. Электронную микроскопию высокого разрешения, компьютерные премудрости, обработку ВРЭМ изображений и их моделирование автор изучал под руководством проф. Ф.А. Буффа и проф. П.А. Стадельманна, работающих в Центре электронной микроскопии (Centre Interdisciplinaire de Microscopie Electronique - Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцария). Автор сердечно благодарит за предоставленную возможность работать на современных электронных микроскопах, пользоваться компьютерами и программами, а также за научную, финансовую и моральную поддержку профессора Ф.А. Буффа, директора Центра. Все расчётные ВРЭМ-изображения и картины электронной дифракции получены с помощью программы JEMS. Её автором является П.А. Стадельманн, сотрудничество с которым привело к значительной модернизации программы, как в научной части, так и в чисто пользовательском подходе.

Образцы для исследования гидроксиапатит и биоматериалы на основе гидроксиапатита были получены в МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, в лаборатории под руководством член-корреспондента РАН Мелихова И.В. Автор благодарит Игоря Витальевича Мелихова и его сотрудников за помощь в работе и обсуждение результатов. Покрытия гидроксиапатита в результате плазменного осаждения на различных подложках были приготовлены в Институте технической акустики НАНБ, Витебск, Беларусь в лаборатории под руководством Юрия Дмитриевича Хамчукова. Композиты, представляющие собой наночастицы, внедрённые в органические матрицы, получали в Институте высокомолекулярных соединений РАН в Санкт-Петербурге. Автор благодарит за сотрудничество Виктора Васильевича Копейкина, Альберта Константиновича Хрипунова, Юлию Георгиевну Баклагину.

Моим со-руководителем в кандидатской диссертации, посвящённой выявлению и изучению примесной фазы в кристаллах дигидрофосфата калия, и консультантом настоящей работы была Вера Всеволодовна Клечковская. Основам электронографии автор учился у неё. Также автор научился у В.В. Клечковской «закрывать» некоторые сенсационные научные открытия, включая свои собственные, т.е. очень критически подходить к полученным результатам и отличать настоящий результат от артефакта из-за некорректного использования прибора или неправильной интерпретации. Автор с огромной благодарностью принимал все её замечания, рекомендации и, главное, всемерную поддержку своей научной работы.

Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (Проекты № 01-02-16176а , № 02-02-81009/Бела, 05-03-32842а).

Список литературы диссертационного исследования доктор физико-математических наук Суворова, Елена Игоревна, 2006 год

1. Characterization of nanophase materials. Ed. Zhong Lin Wang, Weinheim: Wiley VCH Verlag, 2000,406 p.

2. Нанотехнологии в полупроводниковой электронике. Отв. ред. ч.-корр. РАН А.Л. Асеев, Новосибирск, Издательство СО РАН, 2004 г.

3. Алферов Ж.И., Копьев П.С., Сурис Р.А., Асеев A.JL, Гапонов С.В., Панов В.И., Полторацкий Э.А., Сибельдин Н.Н. Наноматериалы и нанотехнологии. Микросистемная техника. 2003. №8. С. 3-13.

4. Аристов В.В. Исследования в области физики и технологии наноэлектроники в ИГГГМ РАН. Успехи соврем, радиоэлектроники. -2004.-N5-6.-С. 129-132.

5. Гусев А.И., Ремпель А.А. Нанокристаллические материалы. М.: Физматлит, 2000. 222 с.

6. М.В. Ковальчук Органические наноматериалы, наноструктуры и нанодиагностика. Вестник российской академии наук, 73 (2003) No 5, 405-412.

7. Штанский Д. В. Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения в нанотехнологических исследованиях. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), 2002, т. XLVI, № 5, 81 89.

8. Musatov A.L., Kiselev N.A., Kukovitskii E.F., Zakharov D.N., Zhbanov A.I., Izraelyants K.R., Chirkova E.G. Field electron emission from natotube carbon layers grown by CVD process. Applied Surface Science, 1-2 (2001) 111-119.

9. Dinelli F., Assender HE., Kirov K., Kolosov O.V. Surface morphology and crystallinity of biaxially stretched PET films on the nanoscale. POLYMER 41 (2000) No 11,4285-4289.

10. Choi, J., G. Sauer, К. Nielsch, R. B. Wehrspohn, and U. Gosele. Hexagonally arranged monodisperse silver nanowires with adjustable diameter and high aspect ratio, Chemistry of Materials 15 (2003), 776-779.

11. Wang, Z. К., M. H. Kuok, S. C. Ng, D. J. Lockwood, M. G. Cottam, K. Nielsch, R. B. Wehrspohn, and U. Gosele. Spin wave quantization in ferromagnetic nickel nanowires, Physical Review Letters 89 (2002). 027201/1-3

12. Cantor B. Nanocrystalline materials manufactured by advanced solidification processing methods. Advances in nanocrystallization 307 (1999) 143-151.

13. Электронные свойства дислокаций в полупроводниках. Осипьян Ю.А. (ред) Москва: УРСС, 2000, 320 с.

14. Spense J.C.H. Experimental high resolution electron microscopy. Oxford: Clarendon Press, 1981. Русский перевод: Спенс Дж. Экспериментальная электронная микроскопия высокого разрешения. Пер. С англ./Под ред. В.Н.Рожанского. Москва: Наука. 1986.

15. Tomas G., Goringe M.J. Transmission electron microscopy of materials. NY: John Wiley and Sons, 1979. Томас Г., Гориндж М.Дж. Просвечивающая электронная микроскопия материалов. Пер. с англ./ Под ред. Вайнштейна Б.К. Москва: Наука, 1983.

16. Cowley J.M. Diffraction physics. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1990 (Second revised edition, forth printing).

17. Horiuchi S. Fundamentals of high resolution transmission electron microscopy. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1994.

18. Williams D.B., Carter C.B. Transmission electron microscopy: a textbook for materials science. NY: Plenum Press, 1986.

19. Pratt W. K. Digital Image Processing (2nd edition), Wiley: New York, 1991.

20. Jain A.K. Fundamentals of Digital Image Processing. Prentice Hall: London, 1989.

21. Russ J.C. The image processing. Handbook, (2nd edition). CRC Press: Boca Raton, 1994.

22. Cooley J.W., Tukey J.W. An algorithm for the machine calculation of complex Fourier series. Mathematics Computation, 19 (1965) 297-301.

23. Hawkes P. Electron optics and electron microscopy. London; Naylor and Francis, 1972.

24. Metherell A.J.F. "Diffraction of electrons by perfect crystals" in Electron Microscopy in Materials. Science, Third course of Intern.school of Electron Microscopy, Ettore Majorana, 1973.

25. Cowley J.M., Moodie A.F. The scattering of Electrons by Atoms and Crystals. Acta Cryst. 10 (1957) 609-619, Acta Cryst. 12 (1959) 353-357.

26. Ishizuka K., Uyeda N. A new theoretical and practical approach to the multislice method. Acta Cryst. A33 (1977) 740-749.

27. Ishizuka K. Contrast Transfer of crystal images in TEM. Ultramicroscopy 5 (1980)55-65.

28. Hytch M.J., Snoeck E., Kilaas R. Quantitative measurement of displacement and strain fields from HREM micrographs. Ultramicroscopy 74 (1998) 131146.

29. Zhang F., Jin Q., Chan S-W. Ceria nanoparticles: size, size distribution, and shape. J. Appl Physics 95 (2004) 4319-4326.

30. Buffat P.A. et al., Crystallographic structure of small gold particles studied by high resolution electron microscopy, Faraday Discuss. 92 (1991) 173187.

31. Crozier P.A. et al., Factors affecting the accuracy of lattice spacing determination by HREM in nanometre-sized Pt particles. J. Electron Microscopy 48 (1999) 1015-1024;

32. Solliard C., Flueli M. Surface stress and size effect on the lattice parameter in small particles of gold and platinum, Surf. Sci. 156 (1985) pp.487-494;

33. Malm J.O., O'Keefe M.A. Deceptive "lattice spacings" in high resolution micrographs of metal nanoparticles, Ultramicroscopy 68 (1997) 13-23.

34. Buffat P.A. Identification of nano-phases: relative merit of local analysis techniques (HRTEM, nanodiffraction, EDS/EELS). Yearbook of Electron Microscopy Society, 78-91, Antwerpen, 2004.

35. G.MacLennan, C.A.Beevers, The crystal structure of dicalcium phosphate, CaHP04. Acta Cryst. 8 (1955) 579-583.

36. Beevers C.A. The crystal structure of dicalcium phosphate dihydrate, CaHP04 -2H20. Acta Cryst. 11(1958) 273-277.

37. Kay MI, Young RA, Posner AS Crystal structure of hydroxyapatite. Nature 204(1964) 1050-1052.

38. Elliot J.C., Mackie P.E, Young R.A. Monoclinic hydroxyapatite. Science 180(1973)1055-1057.

39. Morgan H., Wilson R.M., Eliot J.C., Dowker S.E.P., Anderson P. Preparation and characterization of monoclinic hydroxyapatite and its precipitated carbonate apatite intermediate. Biomaterials, 21(2000), 617627.

40. Brown W., Smith J., Lehr J., Frazier A.W. Octacalcium phosphate and hydroxyapatite. Nature 196 (1962) 1048-1055.

41. Brown W., Smith J., Lehr J., Frazier A.W. J. Crystallographic and Spectroscopic Research, 18 (1988) 235-250.

42. Dickens В, Schroeder LW, Brown WE Crystallographic studies of the role of Mg as a stabilizing impurity in beta-Ca3(P04)2. J. Solid State Chem. 10 (1974)232-248.

43. Mathew M, Schroeder LW, Dickens B, Brown WE The crystal structure of a-Ca3(P04)2. ActaCryst. 33(1977) 1325-1333.

44. Calvo С The crystal structure of alfa-Ca2P207. Inorganic Chemistry 7 (1968) 1345-1351.

45. Boudin S., Grandin A., Borel M.M., Leclaire A., Ravean B. Redermination of the beta-Ca2P207 structure. Acta Cryst. С 49 (1993) 2062-2064.

46. Eanes E.D., Gillessen I.H., Posner A.S. Intermediate states in the precipitation of hydroxyapatite. Nature 208 (1965) 365-367.

47. Posner A.S., Betts F. Synthetic amorphous calcium phosphate and its relation to bone mineral structure. Acc.Chem.Res. 8 (1975) 273

48. Onuma K., Ito A., Tateishi Т., Kameyama T. Growth kinetics of hydroxyapatite crystal revealed by atomic force microscopy. J. Crystal Growth 154 (1995) 118.

49. Onuma K., Ito A. Cluster Growth Model for Hydroxyapatite. Chem.Mater. 10(1998) 3346-3351.

50. Treboux G., Kanzaki N., Onuma K., Ito A. Energy-Preeminent Isomer of the Ca3(P04)2 Cluster. J.Phys.Chem. A. 103 (1999) 8118-8120.

51. Oyane A., Onuma K., Kokubo Т., Ito A. Clustering of Calcium Phosphate in the System CaCl2-H3P04-KCl-H20. J. Phys. Chem. В 103 (1999) 82308235.

52. Пинскер З.Г. Дифракция электронов. 1949. М.: Изд-во АН СССР.

53. Вайнштейн Б.К. Структурная электронография. 1956. Москва: Изд-во АН СССР.

54. Хейденрайх Р. Основы просвечивающей электронной микроскопии. Москва: Мир. 1966.

55. Nancollas G.H., Tomazic, J. Growth of calcium phosphate on hydroxyapatite crystals. Effect of supersaturation and ionic medium. Phys.Chem. 78 (1974) 2218-2225.

56. Boskey A.L., Posner A.S. Formation of hydroxyapatite at low supersaturation. J. Phys.Chem. 80 (1976) 40-45.

57. Graham S., Brown P.W. Reactions of octacalcium phosphate to form hydroxyapatite. J. Crystal Growth. 165 (1996) 106-115.

58. Christoffersen M. R., Christoffersen J. Possible mechanisms for the growth of the biomaterial, calcium hydroxyapatite microcrystals. J.Crystal Growth 121 (1992)617-630.

59. Elliot J.C. Structure and chemistry of the apatite and other calcium othophosphates. Amsterdam: Elsevier. 1994.

60. Moreno EC, Gregory TM, Brown WE. Preparation and solubility of hydroxyapatite. J Res Nat Bur Stand A. Physics and Chemistry 72(1968) 773-782.

61. Suchanek W., Yoshimura M., Processing and properties of HA-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants, J. Mater. Res. Soc., 1998, vol. 13, no. 1, pp. 94-103.

62. Suchanek W., Yashima M., Kakihana M. Yoshimura M. Hydroxyapatite ceramics with selected sintering additives. Biomaterials 18 (1997) 923-933.

63. Royer A., Viguie J. C., Heughebaert M., Heughebaert J. C. Stoichiometry of hydroxyapatite: influence on the flexural strength. Journal of Materials science: Materials in Medicine 4 (1993) 76-82.

64. Hech, L.L., Bioceramics. J. Am. Ceram. Soc., 1998, vol. 82, no. 7, pp. 1705-1733.

65. Paul W., Sharma C.P., Development of Porous Spherical Hydroxyapatite Granules: Application towards Protein Delivery, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 1999, vol. 10, no. 7, pp. 383-388.

66. Krajewski A., Ravaglioli A., Roncan E., et al., Porous Ceramic Bodies for Drug, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 2000, vol. 11, no. 12, pp. 763-772.

67. Vaz L., Lopes A.B., Almeida M., Porosity Control of Hydroxyapatite Implants, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 1999, vol. 10, no. 10/11, pp. 239-242.

68. Северин А. В.,. Комаров В. Ф,. Божевольнов В. Е, Мелихов И. В. Морфологический отбор в суспензии нанокристаллического гидроксиапатита, приводящий к сфероидным агрегатам. Ж. неорг. химии. 2005. V. 50, Р. 76.

69. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов В.Е., Северин А.В. ДАН. 2000. Т. 373. С. 355.

70. Орловский В.П., Ежова Ж.А., Родичева Г.В., и др. Структурные превращения гидроксиапатита в интервале температур 100-1600°С. Журнал неорг. химии. 1990. V. 34. Р. 1337.

71. Cihlár J., Buchal A., Trunec М. Kinetics of thermal decomposition of hydroxyapatite bioceramics. J. Materials Science 34 (1999) 6121-6131.

72. Sz-Chian Liou, San-Yuan Chen. Transformation mechanism of different chemically precipitated apatitic precursors into b-tricalcium phosphate upon calcinations. Biomaterials 23 (2002) 4541^547.

73. Kreidler E.R., Hummel F.A. Inorg.Chem. 1967. V. 6. P. 884.

74. Driessens F. С. M., Boltong M. G., Bermúdez O., Planell J. A., Ginebra M. P., Fernández E. Effective formulations for the preparation of calcium phosphate bone cements. J. Materials Science: Materials in Medicine 5 (1994) 164-170

75. Riman R.E., Suchanek W. L., Byrappa K., Chun-Wei Chen, Shuk P., Oakes C.S. Solution synthesis of hydroxyapatite designer particulates. Solid State Ionics 151 (2002) 393-402.

76. Hench L. L. Bioceramics, from concept to clinic. J. Am. CeramSoc. 74 (1991) 1482-1510.

77. Sampathkumaran U., De Guire M. R., Wang R. Hydroxyapatite coatings on Titanium. Advanced Engineering Materials. 3 (2001) No 6,401-405.

78. Dhert W. J. A. Retrieval studies on calcium phosphate-coated implants. Med. Prog. Technol., 20 (1994) 143-154.

79. Manley M. T. Calcium phosphate biomaterials: A review of the literature,' in Hydroxylapatite Coatings in Orthopaedic Surgery, R. G. T. Geesink and M. T. Manley (eds.), Raven Press, New York, 1993, P. 1-23.

80. Wen H. B., de Wijn J. R., Cui F. Z., de Groot K. Preparation of calcium phosphate coatings on titanium implant materials by simple chemistry. J Biomed Mater Res, 41 (1998) 227-236.

81. Peltola T., Patsi M., Rahiala H., Kangasniemi I., Yli-Urpo A. Calcium phosphate induction by sol-gel-derived titania coatings on titanium substrates in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (1998) 504-510.

82. Mao C., Li H., Cui F., Ma C., Feng Q. Oriented growth of phosphates on polycrystalline titanium in a process mimicking biomineralization. J.Crystal Growth 206 (1999) 308-321.

83. Schreckenbach J.P., Marx G., Schlottig F., Textor M., Spencer N.D. Characterization of anodic spark-converted titanium surfaces for biomedical applications. J.Materials Science: Materials in Medicine 10 (1999) No 8, 453-457.

84. Cotell C.M., Chrisey D.B., Grabowski K. S., Spregue J. A. J. Appl. Biomater 3 (1992) 87.

85. Wolke J. G. C., de Groot K., Jansen J. A. In vivo dissolution behavior of various RF magnetron sputtered Ca-P coatings. J Biomed. Mater. Res. 391998)524-530.

86. Park E., Condrate R.A., Lee D., Kociba K., Gallagher P.K. Characterization of hydroxyapatite before and after plasma spraying. J.Materials Science: Materials in medicine 13 (2002) 211-218.

87. Gross K. A., Berndt С. C., Herman H. Amorphous phase formation in plasma-sprayed hydroxyapatite coatings. J Biomed. Mater. Res. 39 (1998) 407-414.

88. Willmann G. Coating of Implants with Hydroxyapatite Material Connections between Bone and Metal. Advanced Engineering Materials. 11999) No 2,95-105.

89. ASTM F 1609-95, Standard Specification for Calcium Phosphate Coatings for Implanteable materials 1995.

90. ASTM F 1185-88, Standard Specification for Composition of ceramic hydroxyapatite for Surgical Implants 1988.

91. Ogiso M., Yamashita Y., Matsumoto T. Microstructural changes in bone of HA-coated implants. J.Biomed.Mater.Res. 39 (1998) 23-31.

92. Cowin S.C., van Buskirk W.C., Ashman R.B. in Handbook of Bioengineering. Eds.: Skalak R., Chien S. New York: McGrow-Hill, p.2.1, 1987.

93. Шубникова E.A. Функциональная морфология тканей. M.: Издательство Московского университета, 1981.

94. Landis W.J., Glimcher M.J. Electron diffraction and electron probe microanalysis of the mineral phase of bone tissue prepared by anhydrous technique. J. Ultrastructural Research 63 (1978) 188-223.

95. Harrigan T.P., Reuben J.D. Mechanical model for critical strain in mineralizing biological tissues: application to bobe formation in biomaterials. Biomaterials 18 (1997) 877 883.

96. Boskey A.L., Posner A.S. Conversion of amorphous calcium phosphate to microcrystalline hydroxyapatite, a pH-dependent, solution-mediated, solidsolid conversion. J. Phys. Chem. 77 (1973) 2313-2317.

97. De Grauw C.J., de Bruijn J.D., Otto C., Greve J. Investigation of bone an dcalcium phosphate coatings and crystallinity determination using Raman microspectroscopy. Cells and materials. 6 N1-3 (1996) 57-62.

98. Bacon G.E. The study of bones by neutron diffraction. J. Appl. Cryst. 10 (1977) 124-126.

99. Walsh W.R., Christiansen D.L. Demineralized bone matrix as a template for mineral organic composites. Biomaterials 16 (1995) 1363- 1371.

100. Su X., Sun K., Cui F.Z., Landis W.J. Organization of apatite crystals in human woven bone. Bone 32 (2003) 150 162.

101. Heaney R.P., Abrams S., Dawson-Hughes B., Looker A., Marcus R., Matkovic V., Weaver C. Peak Bone Mass. Osteoporos Int (2000) 11: 9851009.

102. Kanis J. A., Oden A., Johnell O., Caulin F., Bone H., Alexandre J.-M., Abadie E., Lekkerkerker F. Uncertain Future of Trials in Osteoporosis. Osteoporos Int 13 (2002) 443^49.

103. Ganong WF. Review of medical physiology. 21 ed. New York: McGraw-Hill, 2003; 385-390.

104. Russell R. G. G., Rogers M. J. Bisphosphonates: From the Laboratory to the Clinic and Back Again. Bone 25 (1999) 97-106.

105. Zieba A., Sethuraman G., Perez F., Nancollas G. H., Cameron D. Influence of Organic Phosphonates on Hydroxyapatite Crystal Growth Kinetics. Langmuir 1996, 12,2853-2858.

106. Fleisch, H. Bisphosphonates in Bone Disease. From the Laboratory to the Patient, Third Edition. New York: The Parthenon Publishing Group; 1997.

107. Glatt M., Pataki A., Evans G. P., Hornby S.B., Green J. R. Loss of vertebral bone and mechanical strength in estrogen-deficient rats is prevented by long-term administration of zoledronic acid. Osteoporos Int (2004) 15: 707-715

108. Li C.Y., Majeska R. J., Laudier D. M., Mann R., Schaffler M. B. High-dose risedronate treatment partially preserves cancellous bone mass and microarchitecture during long-term disuse. Bone 37 (2005) 287 295.

109. Schoen F, Levy R. Tissue heart valves: Current challenges and future research perspectives. J Biomed Mater Res. 1999; 47(4): 439-65.

110. Wallin R, Wajih N, Greenwood GT, Sane DC. Arterial calcification: A review of mechanisms, animal models, and the prospects for therapy. Med Res Rev. 21 (2001) No 4,274-301.

111. Wexler L, Brundage B, Crouse J, Detrano R, Fuster V, Maddahi J, Rumberger J, Stanford W, White R, Taubert K. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, epidemiology, imaging methods, and clinical implications. Circulation 1996; 94(5): 1175-1192.

112. Kapolos J, Mavrilas D, Missirlis Y, Koutsoukos PG. Model Experimental system for investigation of heart valve calcification in vitro. J Biomed Mater Res. 1997; 38(3): 183-90.

113. Shanahan CM, Proudfoot D, Tyson KL, Cary NRB, Edmonds M, Weissberg PL. Expression of mineralization-regulating proteins in association with human vascular calcification. Z Kardiol. 2000; 89 Suppl 2: 63-8.

114. Moreno ES, Zahradnic RT, Glazman A, Hwu R. Precipitation of hydroxyapatite from dilute solutions upon seeding Calcif Tiss Int. 24 (1977) 47-57.

115. Moreno E.S., Varughese K. Crystal growth of calcium apatites from dilute solutions. J Cryst Growth 53 (1981) 20-30.

116. Begun P.I, Schukeilo Y.A. Biomechanics. S-Petersburg: Politehnika, 2000; 5-211.

117. Yoganathan A.P. Fluid mechanics of aortic stenosis. Eur Heart J 9 (1988) SupplE: 13-17.

118. Salusky .IB, Goodman W.G. Cardiovascular calcification in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant. 17 (2002) No 2, 336-339.

119. Raggi P., Boulay A., Chasan-Taber S., Amin N., Dillon M., Burke S.K., Chertow G.M. Cardiac calcification in adult hemodialysis patients. A link between end-stage renal disease and cardiovascular disease? J Am Coll Cardiol. 39 (2002) No 4,695-701.

120. Ventura J.E., Tavella N., Romero C., Petraglia A., Báez A., Mufioz L. Aortic valve calcification is an independent factor of left ventricular hypertrophy in patients on maintenance hemodialysis. Nephrol Dial Transplant. 17 (2002) No 10,1795-1801.

121. Guérin A.P, London G.M, Marchais S.J, Metivier F. Arterial stiffening and vascular calcifications in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant. 15 (2000) No7, 1014-1021.

122. Chertow G.M, Slowing the progression of vascular calcification in hemodialysis. J Am Soc Nephrol. 14 (2003) No9, Suppl 4, S310-S314.

123. Shen M, Marie P, Farge D, Carpentier S, Pollak C, Hott M, Chen L, Martinet B, Carpentier A. Osteopontin is associated with bioprosthetic heart valve calcification in humans. C R Acad Sci III. 1997; 320(1): 49-57.

124. Piuz F., Borel J.P., Phys. Status Solidi A 14 (1972) 129.

125. Buffat P. A., Borel J. P. Size effect on the melting temperature of gold particles. Phys.Rev. A13 (1976) 2287.

126. Ajayan P.M., Marks L.D. Quasimelting and phases of small particles. Phys. Rev. Lett. 60 (1988) 585-587.

127. Ino S. Epitaxial growth of metals on rocksalt faces cleaved in vacuum. II. Orientation and structure of gold particles formed in ultrahigh vacuum. J. Phys. Soc. Jpn 21 (1966) 346.

128. Solliard C., Buffat P. A., Faes, F. Equilibrium structure of small gold crystals. J. Cryst. Growth 32 (1976) 123.

129. Ajayan P. M., Marks, L. D. Experimental evidence for quasimelting in small particles. Phys. Rev. Lett. 63 (1989) 279.

130. Marks L. D. Experimental studies of small particle structure. Rep. Prog. Phys. 57(1994) 603.

131. Narayanaswamy D., Marks L. D. Transformations in quasimelting. Z. Phys. D26 (1993) S70.

132. Ajayan P. M., Marks L. D. Phase instabilities in small particles. Phase Transitions 24-26 (1990) 229.

133. Buffat P. A. Dynamical behaviour of nanocrystals in transmission electron microscopy: size, temperature or irradiation effects. Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 361 (2003) 291-295.

134. Bulushev D.A., Kiwi-Minsker L., Yuranov I., Suvorova E. I., Buffat P.A., Renken A. Structured Au/FeOx/C Catalysts for Low-Temperature CO Oxidation. Journal of Catalysis 210 (2002) 149-159.

135. Kiwi J., DenisovN., GakY., OvanesyanN., Buffat P. A., Suvorova E., Gostev F., Titov A., Sarkisov O., Albers P., Nadtochenko V. Catalytic Fe3+ Clusters and Complexes in Nafion Active in Photo-Fenton Processes. High

136. Resolution Electron Microscopy and Femtosecond Studies. Langmuir 182002) 9054-9066.

137. Yuranov I., Moeckli P., Suvorova E., Buffat P., Kiwi-Minsker L., Renken A. Pd/Si02 catalysts: synthesis of Pd nanoparticles with the controlled size in mesoporous silicas. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 1922003) 239-251.

138. Herron N., Thorn D. Nanoparticles: Uses and Relationships to Molecular Cluster Compounds. Adv. Mater. 10 (1998) №15,1173-1184.

139. Bradly J.S. In Clusters and Colloids. From Theory to Applications, Schmidt D. (ed). VCH: Weinheim, 1994.

140. Selenium in biology and human health. Ed. R.F. Burk. New York: Springer-Verlag, 1994,221 p.

141. Gao X., Zhang J., Zhang L. Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect. Adv. Mater. 14 (2002) 290-293.

142. Копейкин B.B., Панарин И.Ф. Водно-растворимые нанокомпозиты нуль-валентного серебра с высокой антимикробной активностью. Докл. Акад. Наук. 380 (2001) №4,497-500.

143. Mayer A.B.R. Colloidal metal nanoparticles Dispersed in Amphiphilic Polymers. Polymers for Advanced Technologies. 12 (2001) 93-106.

144. Ершов Б.Г. Ионы металлов в необычных и неустойчивых состояниях окисления в водных растворах: получение и свойства. Успехи химии, 66 (1997) №2,103-116.

145. Ершов Б.Г. Изв. АН. Сер. хим., 1999, № 1, с. 1.15.

146. Janata Е., Henglein A., Ershov B.G. J. Phys. Chem., 98 (1994) № 42, 10888-10891.

147. Ершов Б. Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2001, т. XLV, № 3,20-30.

148. Gao X., Zhang J., Zhang L. Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect. Adv. Mater. 14 (2002) 290-293.

149. Digital Micrograph, Gatan, Pleasonton, CA. http://gatan.com.

150. Stadelmann P.A. EMS a software package for electron diffraction analysisand HREM image simulation in materials science. Ultramicroscopy 21 (1987)131.146.

151. Stadelmann P. JEMS. http://cimewww.epfl.ch/people/Stadelmann/iemsWebSite/iems.html

152. Суворова Е.И., Буффа Ф.А. Проявление размерного эффекта на картинах рентгеновской и электронной дифракции от частиц гидроксиапатита. Кристаллография 46 (2001) №5, 796-804.

153. Суворова Е.И., Стадельманн П.А., Буффа Ф.А. Применение ВРЭМ-моделирования для измерения толщины кристаллов гидроксиапатита и определения разориентации зерен. Кристаллография 49 (2004) №3, 407-417.

154. Lundager Madsen Н.Е., Christensson F., Chernov A.A., Polyak L.E., SuvorovaE.I. Crystallization of Calcium Phosphate in Microgravity. Adv.Space Res. 16 (1995) 65-68.

155. Lundager Madsen H.E., Christensson F., Polyak L.E., Suvorova E.I., Kliya M.O., Chernov A.A. Calcium phosphate crystallization under terrestrial and microgravity conditions. J. Crystal Growth 152 (1995) 191 202.

156. Suvorova E.I., Christensson F., Lundager Madsen H.E. & Chernov A.A. Terrestrial and space-grown HAP and OCP crystals: effect of growth conditions on perfection and morphology. J. Crystal Growth 186 (1998) 262 274.

157. Суворова Е.И., Поляк JI.E., Комаров В.Ф., Мелихов И.В. Исследование синтетического гидроксиапатита методом высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии: морфология и направление роста. Кристаллография 45 (2000) 930-934.

158. Baldyga J, Bourne Ж. Turbulent mixing and chemical reactions. Chichester: John Wiley &Sons Ltd, 1999; 810-840.

159. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов B.E., Северин А.В. ДАН. 373 (2000) С. 355.

160. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Комаров В.Ф., Северин А.В., Мелихов И.В., Буффа Ф.А. Электронная микроскопия биоматериалов на основе гидроксиапатита. Кристаллография 2006, т. 51, № 5, с.218-225.

161. Суворова Е.И., Клечковская В.В., Бобровский В.В., Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В. Наноструктура покрытия, полученного плазменным распылением гидроксиапатита. Кристаллография 48 (2003), №5,928-934.

162. Хамчуков Ю.Д., Клубович В.В., Бобровский В.В., Сычев И.Ю., Суворова Е.И., Клечковская В.В. Тонкие покрытия из карбонат-гидроксилапатита на поверхности металлов и монокристаллических диэлектриков. Физика и химия обработки материалов 2006, №2,с.38-43.

163. Kitamura М, Ohtsuki С, Ogata S, Kamitakahara М, Tanihara М Fabrication of a-Tricalcium Phosphate Porous Body Having a Uniform Pore Size Distribution. Key Engineering Materials 254-256 (2004) 965-968.

164. Суворова Е.И. Высокоразрешающая просвечивающая электронная микроскопия и электронная дифракция в исследовании минерального осадка на сердечном клапане. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2001, № 8,74-78.

165. Suvorova E.I., Buffat P.A. Model of the Mechanism of Ca-loss by Bones under Microgravity and Earth Conditions. J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater) 63 (2002) 424-432.

166. Suvorova E.I., Buffat PA. Pathological Mineralization of Cardiac Valves: Causes and Mechanism. Journal of Long-Term Effects of Medical Implants. 15 (2005) №4,361-374.

167. Копейкин В.В., Валуева C.B., Киппер А.И., Филлипов А.П., Хлебосолова Е.Н., Боровикова JI.H., Лаврентьев В.К. Исследование формирования наночастиц Se0 в водном растворе катионного полиэлектролита. Журнал прикладной химии, 76 (2003) №5,847-850.

168. Suvorova Е. I., Klechkovskaya V.V., Kopeikin V.V., Buffat P.A. Stability of Ag nanoparticles dispersed in amphiphilic organic matrix. J. Crystal Growth 275 (2005) 2351 -2356.

169. Suvorova E.I., Lundager Madsen H.E. Observation by HRTEM the Hydroxyapatite Octacalcium Phosphate Interface in Crystals Grown from Aqueous Solutions. J.Crystal Growth 198/199 (1999) Part 1,677-681.

170. Suvorova E.I., Buffat P.A. Electron Diffraction from Micro- and Nanoparticles of Hydroxyapatite. J.Microscopy 196 (1999) Parti, 46-58.

171. Iijima M., Moradian-Oldak J. Control of octacalcium phosphate and apatite crystal growth by amelogenin matrices. J. Mater . Chem. 14 (2004), 2189 — 2199.

172. Iijima M., Moriwaki Y., Wen H.B., Fincham A.G., Moradian-Oldak J. Elongated Growth of Octacalcium Phosphate Crystals in Recombinant Amelogenin Gels under Controlled Ionic Flow. J.Dent.Res. 81 (2002) № 1, 69-73.

173. E.I. Suvorova, V.V. Bobrovsky, Yu.D. Khamchukov, P.A.Buffat. Nanostructure of Hydroxyapatite Coatings Sprayed In Argon Plasma. Key Engineering Materials, 254-256 (2004) 891-894.

174. Knowles JC, Gibson IR, Abrahams I High temperature phase transition in Ca3(P04)2 measured by neutron diffraction. Bioceramics 1999, 341-344.

175. Roux P, Loner D, Bonel G Su rune novel form crystalline du phosphate tricalcique. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances del'Academie des Sciences, Serie C, Sciences Chimiques. 286 (1978) 549-551.

176. Jay AH, Andrews KW Note on oxide systems pertaining to steel making furnace slags: FeO-MnO, FeO-MgO, CaO-MnO, MgO-MnO. J.Iron and Steel Institute (London) 152 (1946) 15-18.

177. Rubin MA, Jasiuk I, Taylor J, Rubin J, Ganey T, Apkarianb RP. TEM analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone. Bone 2003; 33: 270-282.

178. Rubin MA, Rubin J, Jasiuk I. SEM and TEM study of the hierarchical structure of C57BL/6J and C3H/HeJ mice trabecular bone. Bone 2004; 35: 11-20.

179. Hassenkama T, Jgirgensen HL, Pedersenc MB, Kourakisc AH, Simonsend L, Lauritzen JB. Atomic force microscopy on human trabecular bone from an old woman with osteoporotic fractures. Micron 2005; 36: 681-687.

180. Moreno ES, Zahradnic RT, Glazman A, Hwu R. Precipitation of hydroxyapatite from dilute solutions upon seeding Calcif Tiss Int. 24 (1977) 47-57.

181. Moreno E.S., Varughese K. Crystal growth of calcium apatites from dilute solutions. J Cryst Growth 53 (1981) 20-30.

182. Chernov A.A. Modern Crystallography III. Crystal growth. Berlin: Springer-Verlag, 1984; 279-297.

183. Titov A.T, Larionov P.M, Shchukin V.S, Zaikovskii V.I. Possible formation of hydroxyapatite in blood. Doklady Biochemistry. 373 (2000) 132-134.

184. Moreno E.C, Brown W.E, Osborn G. Stability of dicalcium phosphate dehydrate in aqueous solutions and solubility product of octacalcium phosphate. Soil Sci Soc AmProc. 24 (1960) 99-102.

185. Owen E.A., Yates E.L. Precision measurements of crystal parameters. J. Chemical Physics 3 (1935) 605-616.

186. Cava R.J., Reidinger F., Wuensch B.J. Single-crystal neutron diffraction study of the fast-ion conductor beta-Ag2S between 186 and 325 C. J.Solid State Chemistry 31 (1980) 69-80.

187. Sadanaga R., Sueno S. X-Ray study on the alpha beta transition of Ag20. Mineralogical Journal (Japan) 5 (1967) 124-148.

188. Larsson, L.O. The crystal structure of silver sulphite. Acta Chemica Scandinavica 23 (1969) 2261-2269.

189. Mehrotra B.N., Hahn, T., Eysel W., Roepke H., Illguth A. Crystal chemistry of compounds with thenardite (Na2S04V) structure. Neues Jahrbuch fuer Mineralogie. Monatshefte (1978), 1978, 408-421. Phase Transition 38 (1992) 127-220.

190. Cherin P., Unger P. Refinement of the crystal structure of alpha-monoclinic Se. Acta Crystallographica B, 28 (1972) 313-317.

191. Cherin, P., Unger P. The crystal structure of trigonal selenium. Inorganic Chemistry (1967), 6,1589-1591. Acta Crystallographica 21 (1966) 46-46.

192. Burbank R.D. The crystal structure of beta-monoclinic selenium. Acta Crystallographica 5 (1952) 236-246.

193. Foss O., Janickis V. Crystal structure of gamma-monoclinic Selenium. J.Chemical Society. Dalton Transactions, Inorganic Chemistiy 1980 (1980) 624-627.

194. McCullough J.D. The Crystal Structure of Selenium Dioxide. Journal of the American Chemical Society 59 (1937) 789-794.314201. Mijlhoff F.C. The crystal structure of tetragonal selenium trioxide. Acta Crystallographica 18 (1965) 795-798.

195. Zak Z. Crystal structure of diselenium pentoxide Se205. Zeitschrift fuer Anorganische und Allgemeine Chemie 460 (1980) 81-85.

196. Larsen F.K., Lehmann, M.S.; Sotofte, I. A Neutron Diffraction Study of Selenious Acid, H2Se03. Acta Chemica Scandinavica 25 (1971) 1233-1240.

197. Erfany-Far H., Fuess H., Gregson, D. Single-crystal neutron diffraction study of hydrogen bonding in selenic acid. Acta Crystallographica C 43 (1987)395-397.