Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Щербаков, Дмитрий Николаевич

• Щербаков, Дмитрий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щербаков, Дмитрий Николаевич

1. Список используемых сокращений.

2. Введение.б

3. Обзор литературы.

3.1. Патогенные для человека ортопоксвирусы.

3.1.1.Вирус оспы обезьян.

3.1.2.Вирус оспы коров.

3.1.3.Вирус осповакцины.

3.1.4.Вирус натуральной оспы.

3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР.

3.2.1.ПЦР в реальном времени.

3.2.1.1 .Использование интеркалирующих красителей.

3.2.1 ^.Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку ПЦР-продукта.

3.2.2. Мультиплексная ПЦР.

3.2.3.Практическая реализация мультиплексной ПЦР в реальном времени.

3.2.4. Место МПЦР в реальном времени в комплексе методов диагностики ортопоксвирусных инфекций человека.

4. Материалы и методы.

4.1. Материалы.

4.2. Препараты ДНК штаммов вирусов, использованные в работе.

4.3. Выделение ДНК вирусов оспы обезьян, оспы коров и осповакцины из инфицированной клеточной культуры.

4.4. Компьютерный анализ.

4.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick фирмы «QIAGEN», Германия.

4.6. Секвенирование ДНК.

4.7. Трансформация с применением хлористого кальция.

4.8. Выделение плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep фирмы «QIAGEN», Германия.

4.9. Выделение ДНК при помощи набора QIAamp DNA Mini Kit фирмы «QIAGEN», Германия.

4.10. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

4.11. Лигирование ДНК векторной плазмиды с встраиваемой ДНК амплификационного фрагмента.

4.12. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле.

4.13. Проведение ПЦР в реальном времени.

4.14. Получение клинических образцов вируса оспы обезьян.

4.15. Получение клинических образцов вируса оспы коров.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для видоспецифичной мультиплексной ПЦР в реальном времени.

5.2.Разработка метода видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени.

5.3.Разработка моноплексного варианта ПЦР в реальном времени.

5.4.Разработка мультиплексного варианта ПЦР в реальном времени.

5.5. Оценка специфичности метода МПЦР в реальном времени.

5.5. Оценка чувствительности метода МПЦР в реальном времени.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Щербаков, Дмитрий Николаевич

7. Выводы

1. В результате сравнительного компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК 85 штаммов шести видов ортопоксвирусов выявлены видоспецифичные районы VARV, MPXV, CPXV и VACV, перспективные для видоспецифичной ПЦР идентификации вирусных ДНК.

2. Впервые разработан метод видоспецифичной идентификации вируса оспы коров, на основе ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента (на приборе Applied Biosystems 7500) составили:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичные районы CPXV: 2-20 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата полноразмерной ДНК CPXV: 6-60 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100 %;

• диагностическая специфичность — 100 %.

3. Впервые разработан метод одновременной видоспецифичной диагностики вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента составили:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV:

VARV - 2-20 копий/реакции, MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов полноразмерной ДНК OPV:

CPXV - 2-20 копий/реакции, VACV - 9-90 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100 %;

• диагностическая специфичность - 100 %.

6. Заключение

Группа патогенных для человека ортопоксвирусов принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae и включает в себя такие вирусы, как вирус натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и вирус осповакцины. Благодаря усилиям мирового сообщества под эгидой Всемирной организации здравоохранения натуральная оспа была ликвидирована в 1977 г. (Маренникова и Щелкунов, 1998). В отличие от VARY, другие представители этой группы продолжают циркулировать в природной среде. В связи с этим, в последнее время вызывает беспокойство факт учащения сообщений о случаях заболевания человека, обусловленных этими ортопоксвирусами, прежде всего, вирусом оспы обезьян (Reed et al., 2004; Rimoin et al., 2010; Formenty et al., 2010), вирусом оспы коров (Campe et al., 2009; Ninove et al., 2009) и вирусами, близкими к вирусу осповакцины (Trindade et al., 2007; Singh et al., 2007; Trindade et al., 2006; Silva-Fernandes et al., 2009). Прекращение оспопрививания после ликвидации натуральной оспы стало причиной формирования прослойки людей, восприимчивых к OPV, причем с каждым годом эта прослойка растет. Глобальная восприимчивость населения к OPV стала причиной опасения использования VARV в качестве агента биотеррористических атак (Bray and Buller, 2004). Поэтому одним из важнейших направлений исследований является создание быстрого и надежного способа диагностики OPV, патогенных для человека.

Целью данного исследования было разработать метод видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) в реальном времени.

Для достижения поставленной цели провели выравнивание всех известных на сегодняшний день нуклеотидных последовательностей полных геномов патогенных для человека ортопоксвирусов, а также последовательностей других изученных представителей рода ортопоксвирусов. На основе анализа этих последовательностей были отобраны видоспецифичные районы. Внутри каждого района были подобраны олигонуклеотидные праймеры и видоспецифичные гибридизационные зонды. В состав каждого зонда были включены флуоресцентные красители. Проведение ряда экспериментов позволило нам из 24 олигонуклеотидов (таблица 5.1) отобрать по одной паре и зонду для каждого вида изучаемых вирусов для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени. Для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени использовали одновременно все четыре пары праймеров и соотвествующие гибридизационные зонды, различные флуоресцентные красители, обеспечивающие отдельную регистрацию амплификации вирусной ДНК каждого из четырех видов ортопоксвирусов на определенной длине волны.

При разработке метода, в связи с участившимися вспышками оспы коров у людей в Германии и Франции (Campe et al., 2009; Nino ve et al., 2009), приобрела актуальность работа по созданию метода видоспецифичной диагностики вируса оспы на основе ПЦР в реальном времени. Для разработки методы было решено взять найденные ранее олигонуклеотидные праймеры и соответствующий гибридизационный зонд, специфичные к ОРТ D11L CPXV (таблица 5.1). Для того, чтобы иметь возможность максимально полно контролировать работу и снизить долю ошибочных результатов, был сконструирован положительный контрольный образец (ПКО) для пары праймеров и гибридизационного зонда к ОРТ D11L вируса оспы коров. В качестве ПКО выступает рекомбинантная плазмида pCPXV-DUL, содержащая нуклеотидную последовательность видоспецифичного района, используемого для видовой идентификации CPXV. Положительный контрольный образец также был необходим для использования в качестве стандартного образца при определении аналитической чувствительности разработанного метода.

Определение характеристик метода проводили с использованием трех приборов: Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США), iQ 5 ("BioRad", США), RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). В работе использовали две различные Taq полимеразы: AmpliTaq Gold® DNA polymerase ("Applied Biosystems", США) (в комплекте с соответствующими реагентами) и Taq ДНК-полимераза («Fermentas», США). Проверку проводили с использованием панели ДНК (таблица 4.2).

Аналитическая специфичность разработанного нами метода в наших экспериментах составила 100 %.

Диагностическая специфичность, определенная на препаратах ДНК цельной крови здоровых людей, в наших экспериментах составила 100%.

Аналитическая чувствительность метода на рекомбинантной плазмиде составила для iQ 5 ("BioRad", США) 6 копий в реакции. Для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) - 6-60 копий в реакции. Для прибора Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 60-600 копий в реакции. Аналитическую чувствительность оценивали также с помощью препарата ДНК вируса оспы коров штамма GRI-90, выделенного из очищенного в градиенте сахарозы вируса. Для вируса были определены физический титр при помощи электронной микроскопии, составивший 7,5* 109 в.ч./мл, и биологический титр на монослое клеток Vero, составивший 2,8x108 БОЕ/мл. Для вируса оспы коров, штамм GRI-90, минимальное выявляемое

89 количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) и iQ 5 ("BioRad", США), для прибора RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 20-200 копий в реакции.

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры оценивали на экспериментальных образцах вируса оспы коров. Экспериментальные образцы были получены после интраназального заражения мышей препаратом CPXV, штамм GRI-90. У животных в течение 10 дней после инфицирования проводили забор крови, образцов печени, легких и селезенки. Во всех этих образцах на 3-10 дни эксперимента успешно был выявлен CPXV.

Главной задачей нашего исследования была разработка метода видоспецифичной идентификации VARV, MPXV, CPXV и VACV, используя мультиплексный вариант ПЦР в реальном времени. Поэтому на следующем этапе работы нами были сконструированы ПКО, представляющие собой рекомбинантные плазмиды pVARV-A38R, pMPXV-B7R, pVACV-B10R, содержащие последовательности патогенных для человека OPV.

Аналитическую специфичность оценивали на панели образцов ДНК 29 штаммов 6 различных видов ортопоксвирусов (таблица 4.2). Различные штаммы VARV, MPXV, CPXV и VACV были успешно идентифицированы в МПЦР в реальном времени. Все результаты амплификации соответствовали ожидаемым. Не было отмечено увеличение уровня флуоресценции при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов. Также не было отмечено возрастание флуоресценции при амплификации на ДНК таких возбудителей, как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вирус ветряной оспы (таблица 4.3). Таким образом, аналитическая специфичность МПЦР в реальном времени в наших экспериментах составила 100 % (рисунок 5.15).

Для проверки диагностической специфичности были взяты 20 препаратов цельной крови здоровых людей. После выделения, препараты суммарной ДНК крови анализировали в разработанной нами мультиплексной ПЦР в реальном времени. Ни один образец не дал положительного результата. Таким образом, диагностическая специфичность в наших экспериментах составила 100%.

Аналитическую чувствительность оценивали с помощью препаратов рекомбинантных плазмид pVARV-A38R, pMPXV-B7R, pCPXV-DllL, pVACV-B10R и препаратов ДНК, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы CPXV, штамм GRI-90, и VACV, штамм LIVP. Определение аналитической чувствительности проводили в два этапа. На первом этапе аналитическую чувствительность определяли для каждой пары праймеров и соответствующего гибридизационного зонда отдельно. На втором этапе проводили определение аналитической чувствительности для смеси праймеров и гибридизационных зондов. Для каждой из плазмид были приготовлены 10-кратные разведения в трех независимых повторах. Минимальная концентрация плазмиды, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 2-20 копий в реакции. Для MPXV минимальное выявляемое количество плазмиды составило 2-20 копий в реакции, для CPXV - 5-50 копий в реакции, для VACV - 7-70 копий в реакции (таблица 5.5). Пошаговое определение аналитической чувствительности позволило нам оценить влияние изменения состава реакционной смеси на чувствительность системы. Основываясь на полученных результатах (таблица 5.5), можно утверждать, что присутствие в ПЦР смеси всех пар праймеров и соответствующих зондов не влияет на аналитическую чувствительность праймеров и флуоресцентных зондов.

Аналитическую чувствительность оценивали также с помощью препаратов ДНК вирусов оспы коров и осповакцины, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы CPXV штамма GRI-90 и VACV, штамм LIVP. Для вирусов были определены физический титр при помощи электронной микроскопии и биологический титр на монослое клеток Vero (таблица 5.4). Минимальная концентрация вирусной ДНК VACV, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 9-90 копий в реакции. Для вируса оспы коров, штамм GRI-90, минимальное выявляемое количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции (таблица 5.5).

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры мультиплексной ПЦР в реальном времени определяли на препаратах ДНК VARV штаммов Aslam, India 387, Brazil 128, Nepal-89, India 164, Khateen, выделенных из корочек кожных поражений, полученных от больных оспой во время компании по искоренению натуральной оспы (1970-1975 гг.) и хранящихся в коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Увеличение уровня флуоресценции в мультиплексной ПЦР в реальном времени наблюдалось только для оптического * канала, регистрирующего сигнал красителя FAM, что однозначно подтвердило наличие в этих образцах ДНК VARV. Также разработанным методом МПЦР в реальном времени была идентифицирована ДНК, выделенная из корочек с кожного поражения двух человек, образовавшихся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.

Диагностическая чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких, печени, смыва рта и пустулы сурков, зараженных MPXV, штамм CDC#v79-I-005.

Во всех образцах была выявлена ДНК MPXV. Не наблюдалось увеличения уровня флуоресценции для оптических каналов, регистрирующих сигнал зондов, специфичных VARV, CPXV и VACV.

Кроме того, в сравнении с культуральным методом, чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких и печени мышей, зараженных интраназально CPXV штамма GRI-90. Вирус нарабатывали и анализировали в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1. Очищенные препараты CPXV получали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Образцы крови и органов были получены в динамике: каждые сутки до 14 дня эксперимента, а также на 17 и 22 сутки. ДНК CPXV была идентифицирована с 3 по 10 день в легких, селезенке, печени и крови животных, в то время как титрованием на культуре меток CV-1 CPXV выявляли только в легких. Ни в одном из этих анализов не наблюдали неспецифической детекции.

Таким образом, диагностическая чувствительность разработанного метода мультиплексной ПЦР в реальном времени в наших экспериментах составила 100 %.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щербаков, Дмитрий Николаевич, 2010 год

1. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. — Москва: Мир. — 1989. С. 368.

2. Костина Е.В., Гаврилова Е.В., Рябинин В.А., Щелкунов С. Н., Синяков А.Н. Методы ПЦР в реальном времени для идентификации патогенных для человека вирусов натуральной оспы и оспы обезьян. // Вопр. Вирусол. — 2009. — №6. С. 29 - 36.

3. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — Москва: Мир. 1984. - С. 480.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -Москва: КМК Scientific Press Ltd. 1998. - С. 386.

5. Маренникова С. С., Янова H. Н., Жукова O.A. Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями. // Журн. микробиол. 1990. -№ 8. - С.57-62.

6. Мацевич Г.Р., Радкж С.Н., Рыжов К.А., Анджапаридзе О.Г. Эволюция методов лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций. // Вопр. вирусол. 1996. -Т. 41. -№ 5. - С. 195-197.

7. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов C.B., Щелкунов C.B. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. // Журн. микробиол. 2000. - Т. 6. - С. 83-85.

8. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Москва: Наука. - 2004. - С. 526.

9. Щелкунов С.Н. Ортопоксвирусный геном. // Молекул, биол. 1996. - Т. 30. -№ 1. -С. 5-32.

10. Aitichou M., Javorschi S., Ibrahim M.S. Two-color multiplex assay for the identification of orthopox viruses with real-time LUX- PCR. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19. - № 5. -P. 323-328.

11. Aitichou M., Saleh S., Kyusung P., Huggins J., O'Guinn M., Jährling P., Ibrahim S. Dualprobe real-time PCR assay for detection of variola or other orthopoxviruses with dried reagents. // J. Virol. Methods. 2008. - V.153. - P. 190-195.

12. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. — 1998. Vol. 244. - P. 365-396.

13. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinia virus telomeres. // Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. - V. 47. - № 2. - P. 723-729.

14. Baxby D. Is cowpox misnamed? A review of 10 human cases. // Brit. Med. J. 1977. - V. l.-P. 1379-1381.

15. Baxby D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969-93: a review based on 54 cases. // Br. J. Dermatol. 1994. -V. 131. - P. 598-607.

16. Blackford S., Roberts D.L., Thomas P.D. Cowpox infection causing a generalized eruption in a patient with atopic dermatitis. // Br. J. Dermatol. 1993. - V. 129. V.628-629.

17. Bonnekoh B., Falk K., Reckling K., Kenklies S., Nitsche A., Ghebremedhin B., Pokrywka A., Franke I., Thriene B., König W., Pauli G., Gollnick H. Cowpox infection transmitted from a domestic cat. // JDDG 2008. - V.6. - P. 210-213.

18. Bray M., Buller M. Looking back at smallpox. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V. 38. - P. 882-889.

19. Breman J.G. Monkeypox: an emerging infection for humans? In: Scheid W.M., Craig W.A., Hughes J.M. (eds.). Emerging infections 4. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. - 2000. - P. 45-67.95

20. Breman J.G., Kalisa-Ruti., Steniowski M.V., Zanotto E., Gromyko A.I., Arita I. Human Monkeypox, 1970-79. // Bull. World Health Organ. 1980. - V. 58. - P. 165-182.

21. Breman J.G., Henderson D.A. Poxvirus dilemmas monkeypox, smallpox and biological terrorism. // N. Engl. J. Med. - 1998. - V. 339. - P. 556.

22. Breman J.G., Henderson D.A. Current concepts: diagnosis and management of smallpox. // N. Engl. J. Med. 2002. - V. 346. - P. 1300-1308.

23. Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., Graf P., Weber B.K., Meyer H., Btittner M., Busch U., Sing A. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. // Emerg. Infect. Dis. 2009. -V. 15. - P. 777-780.

24. Carletti F., Bordi L., Castilletti C., Di Caro A., Falasca L., Gioia C. Cat-to-human orthopoxvirus transmission northeastern Italy. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 499-500.

25. Chao D.Y., Davis B.S., Chang G.J. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. // J. Clin. Microbiol. 2007. - V. 45. - P. 584-589.

26. Chang H.W., Watson J.C., Jacobs B.L. The E3L gene of Vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - №11. - P. 4825-4829.

27. Claudy A.L., Gaudin O.G., Granouillet R. Pox virus infection in Darier's disease. // Clin. Exp. Dermatol. 1982. - V. 7. - P. 261-266.

28. Coras B., Essbauer S., Pfeffer M., Meyer H., Schroder J., Stolz W., Landthaler M., Vogt T. Cowpox and a cat. // Lancet. 2005. - V. 365. - P. 446.

29. Crouch A.C., Baxby D., McCracken C.M., Gaskella R. M., Bennett M. Serological evidence for the reservoir hosts of cowpox virus in British wildlife. // Epidemiol. Infect. -1995. -V. 115.-P. 185-191.

30. Damaso C.R., Reis S.A., Jesus D.M., Lima P.S., Moussatche N. A PCR-based assay for detection of emerging vaccinia-like viruses isolated in Brazil. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2007 - V. 57. - P. 39-46.

31. Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355. - № 9. - P. 962-963.

32. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. //Biotechniques. -2001. Y.31. -№.5. - P. 1106-1121.

33. Dieffenbach C.W., Lowe T.M.J., Dveksler G.S. General conception for PCR primer design. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

34. Douglass N.J., Richardson M., Dumbell K.R. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1303-1309.

35. Drumond B.P., Leite J.A., da Fonseca F.G., Bonjardima C.A., Ferreiraa P.C.P., Kroon E.G. Brazilian Vaccinia virus strains are genetically divergent and differ from the Lister vaccine strain. // Microb. Infect. 2008. - V. 10. - P. 185-197.

36. Dumbell K.R., Huq F. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with the geographic distribution and human virulence of variola isolates. // Amer. J. Epidemiol. 1986. -V. 123.-P. 403-415.

37. Dumbell K.R., Huq F. Epidemiological implications of the typing of variola isolates. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1975. - V. 69. ~ P. 303-306.

38. Eis-Hiibinger A.M., Gerritzen A., Schneweis K.E., Pfeiff B., Pullmann H., Mayr A., Czerny C.P. Fatal cowpox-like virus infection transmitted by cat. // Lancet. 1990. — V. 336.-P. 880.

39. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. //Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V. 13. - № 4. - P. 559-570.

40. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J. H. Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. // Virology. 1978. — V. 89.-P. 53-66.

41. Espy M.J., Cockerill F.R., Meyer R.F., Bowen M.D., Poland G.A., Hadfield T.L., Smith T.F. Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. -V. 40.-№ 6.-P. 1985-1988.

42. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. The Orthopoxviruses. San Diego, New York, Berkeley, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic Press, Inc. - 1989. - P. 432.

43. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. World Health Organization, 1988.

44. Gallwitz S., Schutzbank T., Heberling R.L., Katler S.S., Galpin J.E. Smallpox: residual antibody after vaccination. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - P. 4068-4070.

45. Giulio D.B., Eckburg P.B. Human Monkeypox: an emerging zoonosis. // Lancet. Infect. Dis.-2004.-V. 4.-P. 15-25.

46. Goebel S. J., Johnson G. P., Perkus M. E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - Vol. 179. - P. 247-266.

47. Haenssle H.A., Kiessling J., Kempf Y.A., Fuchs T., Neumann C., Emmert S. Orthopoxvirus infection transmitted by a domestic cat. // J. Am. Acad. Dermatol. 2006. -V. 54.-P. SI-4.

48. Heymann D.L., Szczeniowski M., Esteves K. Re-emergence of Monkeypox in Africa: a rewiew of the past six years. // Br. Med. Bull. 1998. - V. 54 - P. 693-702.

49. Honlinger B., Huemer H.P., Romani N., Czerny C-P., Eisendel K., Hopel R. Generalized cowpox infection probably transmitted from a rat. // Br. J. Dermatol. 2005. - V. 153. - P. 451-453.

50. Huemer II.P., Honlinger B., Hopfl R. A simple restriction fragment PCR approach for discrimination of humanpathogenic old world animal orthopoxvirus species. // Can. J. Microbiol. 2008. - V. 54. - P. 159-162.

51. Hutin Y.J., Williams R.J., Malfait P., Pebody R., Loparev V.N., Ropp S.L. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. -2001.-V. 7.-P. 434-438.

52. Ibrahim M.S., Esposito J.J., Jahrling P.B., Lofts R. S. The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in orthopoxvirus. // Mol. Cell. Probes. 1997. -V. 11.-P. 143-147.

53. Ibrahim M.S., Lofts R.S., Jahrling P.B., Henchal E.A., Weedn V.W., Northrup M.A., Belgrader P. Real-time microchip PCR for detecting single-base differences in viral and humanDNA. //Anal. Chem. 1998. -V.70. - P. 2013-2017.

54. Ibrahim M.S., Kulesh D.A., Saleh S.S., Damon I.K., Esposito J.J., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Real-time PCR assay to detect smallpox virus. // J. Clin. Microbiol. 2003. -V. 41. -№ 8. - P. 3835-3839.

55. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. Optimization of PCRs. In PCR protocol. A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press. - 1990. - P. 3-13.

56. Jezek Z., Grab B., Szczeniowski M.Y., Paluku K.M., Mutombo M. Human Monkeypox: secondary attack rates. // Bull. World Health Organ. 1988. - V. 66. - P. 465-470.

57. Kaysser P., von Bomhard W., Dobrzykowski L., Meyer H. Genetic diversity of feline cowpox virus, Germany 2000-2008. //Vet. Microbiol. -2010. -V. 141. P. 282-288.

58. Kumar A., Yadav M.V., Chandra R., Garg S.K. Clinico-etiological features of a pox outbreak among buffaloes. // Ind. J. Med. Res. 1987. - Vol. 26. - P. 41-45.

59. Kurth A., Wibbelt, Gerber H, Petschaelis A, Pauli G, Nitsche A. Rat-to-elephant-to-human transmission of cowpox virus. // Emerg. Infect. Dis. 2008. - V. 14. - P. 670-671.

60. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. // J. Virol. Methods. 2003. - V. 112(1-2). - P. 67-78.

61. Lai S.M., Singh I.P. Buffalopox a review. // Trop. Anim. Hith. Prod. - 1997. - V. 9 - P. 107-112.

62. Li Y., Olson V.A., Laue T., Laker M.T., Damona I.K. Detection of monkeypox virus with real-time PCR assays. // J. Clin. Virol. 2006. - V. 36. - P. 194-203.

63. Li Y., Zhao H., Wilkins K., Hughes C.5 Damona I.K. Real-time PCR assay for the detection of monkeypox virus West African and Congo Basin strain DNA. // J. Virol. Meth. 2010. - V. 169. - P. 223-227.

64. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J. J., Meyer H. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. //J. Clin. Microbiol. -2001. -V. 39. -№ 1. P. 94-100.

65. Loveless B.M., Mucker E.M., Hartmann C., Craw P.D., Huggins J., Kulesh D.A. Differentiation of Variola major and Variola minor variants by MGB-Eclipse probe melt curves and genotyping analysis. // Mol. Cell. Probes. 2009. - V. 23. - P. 166-170.

66. Mack T.M., Thomas D.B., Khan M.M. Epidemiology of smallpox in West Pakistan. II. Determinants of intravillage spread other than acquired immunity. // Am. J. Epidemiol. -1972.-V. 95.-P. 169-177.

67. Mackett M., Archard L.C. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. // J. Gen. Virol. 1979. -V. 45. - P. 683-701.

68. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Efremova E.V. New outlook on the biology of cowpox virus. // Acta Virol. 1984. - V. 28. - P. 437-444.

69. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. // J. Clin. Lab. Anal. 2002. - V. 16. - P. 47-51.

70. Massung R. F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain bangladesh-1975. //Virology. 1994. - Vol. 201. - P. 215-240.101

71. Mathew T. Virus study of pock diseases among buffaloes. // Indian. Pathol. Bacteriol. -1967.-V. 10.-P. 101-102.

72. Mathew Z., Mathew T., Choudhury P.G., Nayak R.L., Menon M.N. Buffalo pox and its control. A report from India. // Asian Livestock. 1978. - V. 3. - P. 9.

73. Meyer H., Hanns-Joachim R. Characterization of the gene encoding the A-type inclusion protein of camelpox virus and sequence comparison with other orthopoxviruses. // J. Gen. Virol. 1993. - V.74. - P. 1679-1684.

74. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. Sequence alterations within and downstream of the Atype inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1975-1981.

75. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses. // J. Virol. Methods. -1997.-V. 64.-P. 217-221.

76. Meyer H., Totmenin A., Gavrilova E., Shchelkunov S. Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Res. 2005. - V. 108(1-2). - P. 39-43.

77. Michaeli D. Smallpox: A possible comeback. // IMAJ 2002. - V. 4. - P. 487-488.

78. Mutter G.L., Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. // Nucleic. Acids. Res. 1995. - V. 23. — P. 1411-1418.

79. Nalca A., Rimoin A., Bavari S., Whitehouse C. Reemergence of monkeypox: prevalence, diagnostics, and countermeasures. // CID. -2005. V. 41. -P. 1765-1771.

80. Nedunchelliyan S., Reddy D.S., Venkataraman K.S. Buffalo pox infection in man. // Ind. J. Pub. Health. 1992. - V. 36. - P. 57.

81. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. //Lab. Anim. 1997. -V. 31. -№ 3. - P. 201-205.

82. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf H., Meyer H. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 74. - № 2.-P. 201-207.

83. Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D., Meyer H., Capek I., Zandotti C., Charre R.N. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 781-784.

84. Nitsche A., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of orthopoxvirus DNA by real-time PCR and identification of variola virus DNA by melting analysis. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. —№ 3. - P. 1207-1213.

85. Nitsche A., Steger B., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of vaccinia virus DNA on the LightCycler by fluorescence melting curve analysis. // J. Virol. Methods. 2005. - V. 126. -P. 187-195.

86. Nitsche A., Stern D., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of infectious poxvirus particles. // Emerg. Infect. Dis. 2006. - V. 12. - P. 1139-1141.

87. Nitsche A., Kurth A., Pauli G. Viremia in human Cowpox virus infection. // J. Clin. Virol. 2007. - V.40. - P. 160-162.

88. Oliveira D.C., Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2002. - V. 46. P. 2155-2161.

89. Pahlitzsch R., Hammarin A., Widell A. A case of facial cellulitis and necrotizing lymphadenitis due to cowpox virus infection. // Clin. Infect. Diseases. 2006. - V. 43. - P. 737-742.

90. Panning M., Asper M., Kramme S., Schmitz H., Drosten C. Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - № 4. - P. 702-708.

91. Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynninen A., Kallio E.R.K., Henttonen H., Palva A., Vaheri A., Vapalahti O. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. // Emerg. Infect. Dis. -2003.-V. 9. -№ 11.-P. 1458-1461.

92. Putkuri N., H. Piiparinen, A. Vaheri, O. Vapalahti. Detection of human orthopoxvirus infections and differentiation of smallpox virus with real-time PCR, // J. Med. Virol. -2009.-V. 81.-P. 146-152.

93. Qiagen, artus Orthopox LC PCR Kit RUO, http://www.qiagen.com/products/artus/artusorthopoxpcrkitruo.aspx.

94. Ramanan Ch., Ghorpade A., Kalra Kalra S., Mann S. Buffalopox. // Intern. J. Dermatol. -1996.-Vol. 35.-No. 2.-P. 128-130.

95. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. // Comput. Appl. Biosci. 1995. — V. 11. - №1.-P. 7-11.

96. Rivas C., Gil J., Melkova Z., Esteban M., Diaz-Guerra M. Vaccinia virus E3L protein is an inhibitor of the interferon (i.f.n)-induced 2-5 A synthetase enzyme. // Virology. 1998. - V. 243.-№2.-P. 406-414.

97. Ropp S.L., Jin Q.I., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. Polymerase chain reaction strategy for identification and differentiation of smallpox and other ortopoxviruses. // J. Clin. Microbiol. 1995. -V. 33. P. 2069-2076.

98. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights: Connecticut - 2000.

99. Ryabinin V.A., Shundrin L.A., Kostina E.B., Laassri M., Chizhikov V., Shchelkunov S.N., Chumakov K., Sinyakov A.N. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. // J. Med. Virol. 2006. - V. 78(10). - P. 1325-1340.

100. Sale T.A., Melski J.W., Stratman E.J. Monkepox: an epidemiologic and clinical comparison of African and Us disease. // J. Am. Acad. Dermatol. 2006. - V. 55. - P. 478481.

101. Scaramozzino N., Ferrier-Rembert A., Favier A., Rothlisberger C., Richard S., Crance J., Meyer H., Garin D. Real-time PCR to identify variola virus or other human pathogenic orthopox viruses. // Clin. Chem. 2007. - V.53. - №4. - P. 606-613.

102. Schmidt M., Roth K.W., Meyer H., Seifried E., Hourfar M.K. Nucleic acid test screening of blood donors for orthopoxviruses can potentially prevent dispersion of viral agents in case of bioterrorism. // Transfusion. 2005. - V. 45. - P. 399-403.

103. Schroeder K., Nitsche A. Multicolour, multiplex real-time PCR assay for the detection of human-pathogenic poxviruses.// Mol. Cell. Probes. — 2009. V. 24. P. 1-4.

104. Schupp P., Pfeffer M., Meyer H., Burck G., Kolmel K., Neumann C. Cowpox virus in a 12-year-old boy: rapid identification by an orthopoxvirus-specific polymerase chain reaction. // Br. J. Dermatol. 2001. - V. 145. - P. 146-150.

105. Skottman T., Piiparinen H., Hyytiainen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersiniapestis. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - V. 26. - P. 207-211.

106. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. - V. 327. - P. 321-324.

107. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung J.M., Esposito J.J. Alastrim smallpox variola minor virus genome DNA sequences. // Virology. 2000. — V. 266. - P. 361-386.

108. Shchelkunov S.N., Gavrilova E.V., Babkin I.V. Multiplex PCR detection and species differentiation of orthopoxviruses pathogenic to humans. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19.-P. 1-8.

109. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer Science + Business Media, Inc. - 2005. - P. 425.

110. Singh R.K., Hosamani M., Balamurugan V., Bhanuprakasha V., Rasoola T.J., Yadav M.P. Buffalopox: an emerging and re-emerging zoonosis. // Animal. Helth. Research. Reviews. -2007. V.8. — P. 105-114.

111. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J. Infect. -2001.-V. 43.-P. 104-110.

112. Stewart A., Satterfield B., Cohen M., O'Neill K., Robison R. A quadruplex real-time PCR assay for the detection of Yersinia pestis and its plasmids. // J. Med. Microbiol. 2008. -V. 57.-P. 324-331.

113. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 625-630.

114. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. //Nucleic Acids Research. 1997. -V. 24. - P. 4876-4882.

115. Trindade G.S., Emerson G.L., Carroll D.S., Kroon E.G., Damon I.K. Brazilian Vaccinia virus and their origins. // Emerg. Infect. Dis. 2007. - V. 13. - No. 7. - P. 965-972.

116. Tryland M., Myrmel H., Holtet L., Haukenes G., Traavik T. Clinical cowpox cases in Norway. // Scand. J. Infect. Dis. 1998a. -V. 30. - P. 301-303.

117. Tryland M., Sandvik T., Arnemo J.M., Stuve G., Olsvik G., Traavik T. Antibodies against orthopoxviruses in wild carnivores from Fennoscandia. // J. Wild. Dis. 1998b. - V. 34. -P. 443-450.

118. Tryland M., Sandvik T., Mehl R., Bennett M., Traavik T., Olsvik O. Serosurvey for orthopoxviruses in rodents and shrews from Norway. // J. Wild. Dis. 1998c. - V. 34. - P. 240-250.

119. Vorou R.M., Papavassiliou V.G., Pierroutsakos I.N. Cowpox virus infection: an emerging health threat. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2008. - V. 21. - P. 153-156.

120. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof B., Snow P., Wagner G.P., Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. 1994. - V. 43. - P. 250-261.

121. Wang Y., Ma W.L., Mao X.M., Wu Q.H., Li L., Wang H.M., Xiao W.W., Zheng W.L. Design and preparation of oligonucleotide microarray for vaccinia virus detection. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004. - V. 24(2). - P. 180-183.

122. Wenli M., Yan W., Hongmin W., Wenling Z. An oligonucleotide microarray for the detection of vaccinia virus. // Br. J. Biomed. Sci. 2004. - V. 61(3). - P. 142-145.

123. Wilson W.J., Erler A.M., Nasarabadi S.L., Skowronski E.W., Imbro P.M. A multiplexed PCR-coupled liquid bead array for the simultaneous detection of four biothreat agents. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V.19. P. 137-144.

124. White D.O., Fenner F.J. Medical virology. San Diego, Academic Press. - 1994. - P. 584.

125. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Gundry C.N., Elenitoba-Johnson K.S. Real-time multiplex PCR assays. // Methods. 2001. - V. 25. - P. 430-442.

126. Wolfs T.F., Wagenaar J.A., Niesters H.G., Osterhaus A.D. Rat-to-human transmission of cowpox infection. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - № 12. - P. 1495-1496.

127. Zdenek J., Fenner F. Human monkeypox. In: Monographs in Virology. Karger. - 1988. -P. 140.