Метод мультилокусного секвенирования-типирования N. meningitidis и H. influenzae серотипа b в эпидемиологическом надзоре за бактериальными менингитами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.30, кандидат медицинских наук Миронов, Константин Олегович

• Миронов, Константин Олегович
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Миронов, Константин Олегович

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Общая характеристика возбудителей.

3.1.1. Вид N. meningitidis.

3.1.2. Серотип b Н. influenzae.

3.2. Эпидемиология.

3.2.1. Особенности эпидемиологии менингококковой инфекции.

3.2.2. Особенности эпидемиологии Hib-менингита.

3.3. Метод МЛСТ.

3.3.1. Применение метода МЛСТ для N.meningitidis.

3.3.2. Применение метода МЛСТ для Н.influenzae.

4. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.

4.1. Штаммы Hib.

4.2. Штаммы N.meningitidis.

5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.1. Культивирование Н. influenzae и N. meningitidis.

5.2. Выделение ДНК.

5.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

5.4. Детекция результатов амплификации.

5.5. Определение нуклеотидной последовательности.

5.5.1. Очистка продуктов амплификации.

5.5.2. Секвенирующая амплификация.

5.5.3. Очистка от не встроившихся дидезоксинуклеотидтрифосфатов.

5.5.4. Детекция продуктов секвенирования.

5.6. Программное обеспечение.

5.7. Использованные инетернет-ресурсы.

6. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

6.1. Предложенные праймеры.

6.1.1. Праймеры для MJICT Hib.

6.1.2. Праймеры для MJICT N.meningitidis.

6.1.3. Праймеры для субтипирования N.meningitidis.

6.2. Результаты типирования Hib.

6.3. Результаты типирования N.meningitidis.

6.4. Результаты секвенирования, отправленные в базы данных.

7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

7.1. МЛСТ Hib.

7.1.1. Наблюдаемые аллели и СТ.

7.1.2. Генетические взаимоотношения российских штаммов Hib.

7.1.2.1. Результаты анализа методом BURST.

7.1.2.2. Филогенетическая связь штаммов.

7.1.3. Генетическая связь с иностранными штаммами.

7.2. МЛСТ N.meningitidis.

7.2.1. МЛСТ штаммов N.meningitidis серогруппы А.

7.2.2. МЛСТ штаммов N.meningitidis серогрупп В, С и W-135.

7.3. Субтипирование N. meningitidis.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метод мультилокусного секвенирования-типирования N. meningitidis и H. influenzae серотипа b в эпидемиологическом надзоре за бактериальными менингитами»

2.1. Актуальность проблемы Бактерии Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae серотипа b (Hib) наряду с Streptococcus pneumoniae являются самыми частыми возбудителями гнойных бактериальных менингитов (ГБМ). Результаты наблюдения за этиологической структурой ГБМ с 1981 по 2002 г. в Москве показывают, что наиболее часто ГБМ вызываются бактериями вида N.meningitidis (64,5%), S.pneumoniae (21,6%) и Hib (8,3%), реже остальными возбудителями (5,6%) [4]. Качественная этиологическая структура возбудителей ГБМ на территории Москвы в последние годы не изменяется, в то время как количественное соотношение изолированных штаммов, принадлежащих разным возбудителям, может варьировать в зависимости от эпидемической ситуации с менингококковой инфекцией. Для эффективного эпидемиологического мониторинга ГБМ необходимы данные, позволяющие анализировать популяцию возбудителя [12]. С целью характеристики патогенных штаммов, принадлежащих одному виду (серотипу, серогруппе), применяется широкий спектр микробиологических, биохимических, серологических и молекулярнобиологических методов типирования. Для полноценного и всестороннего наблюдения позволяющий за эпидемическим процессом необходим штаммы в инструмент, популяциях выявлять гипервирулентные патогенных бактерий, отслеживать их распространение и закономерности эволюции. Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий наиболее информативны, если они получены с помощью методов, позволяющих напрямую измерять генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, изолированных от разных источников. Охарактеризовать генетические и филогенетические взаимоотношения между штаммами можно с помощью молекулярно-биологических подходов, объектом которых является геном бактерии. Адекватная оценка эволюционных изменений и взаимосвязей в популяции бактерий может быть осуществлена только методами, в основе которых лежит определение нуклеотидной последовательности бактериальной ДНК. Наиболее впечатляющие результаты по идентификации гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) N.meningitidis и выявлению закономерностей их циркуляции были достигнуты с помощью метода мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) [64]. Метод МЛСТ был впервые применен в 1998 г. На протяжении последних лет МЛСТ активно внедряется в эпидемиологическую практику для типирования многих видов патогенных бактерий. Применение МЛСТ демонстрирует исключительную дискриминирующую способность, результаты МЛСТ часто согласуются с результатами типирования другими методами. МЛСТ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с серологическими и некоторыми молекулярно-биологическими методами. Основным преимуществом МЛСТ является абсолютная сопоставимость результатов, полученных разными исследователями, а также возможность объединения результатов в глобальную базу данных (БД) с помощью интернета, что существенно облегчает работу эпидемиолога. Метод МЛСТ позволил значительно расширить представления о клональной структуре бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae, сформулированные на основании результатов методами. Применение МЛСТ для N.meningitidis успешно зарекомендовало себя в ряде работ по характеристике и анализу локальных вспышек, эпидемий и пандемий менингококковой инфекции. Было выявлено типирования другими несколько гипервирулентных клональных комплексов и прослежены закономерности их распространения [19]. На сегодняшний день МЛСТ является популяции наиболее подходящим инструментом для характеристики за появлением штаммов N. Meningitidis, слежения (исчезновением) эпидемически значимых клональных комплексов и проведения глобального эпидемиологического анализа. Сотрудниками ГУ ЦНИИЭ, Института молекулярной генетики (Берлин), и университета Амстердама методом МЛСТ были проанализированы 103 штамма менингококков серогруппы А, выделенных в Москве в 1969-1996 гг., и показано совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выявлением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III [21]. На настоящий момент остается актуальным наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А и своевременное выявление штаммов, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего времени не проводилось наблюдение за циркуляцией на территории Москвы гипервирулентных штаммов серогрупп С и W-135, не была проведена характеристика популяции штаммов серогруппы В, которые ответственны за большинство случаев менингококковой инфекции на территории Москвы. Схема МЛСТ для H.influenzae разработано недавно, результаты применения МЛСТ для H.influenzae демонстрируют возможность детальной характеристики штаммов, принадлежащих разным серотипам, и эпидемиологическую обоснованность применения данного подхода [66]. На сегодняшний день существует возможность сравнительной характеристики российских и зарубежных штаммов Hib. Проведенное в 1999-2001 гг. исследование "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве", впервые позволило достоверно определить заболеваемость Hib- менингитами, которая составила 5,7 случаев в год на 100000 детей до 5 лет [9]. Это ниже, чем в большинстве европейских стран (порядка 10-25 случаев на 100000 в аналогичной популяции) и существенно ниже, чем в странах американского континента (порядка 20-50 случаев на 100000) до введения вакцинопрофилактики особенностями [26, 81]. Данная ситуация может общей объясняться московской популяции, эпидемиологической ситуацией на территории или с господством на территории других, отличных штаммов Hib. Отсюда от европейских, менее необходимость вирулентных прояснения вытекает эпидемиологической ситуации с эпидемиологическими особенностями Hib-инфекции в Москве. Для ответа на вопрос о генетической связи российских и зарубежных штаммов целесообразно провести характеристику штаммов Hib методом МЛСТ. Принципиальным московской исследования является вопрос об антигенной структуре популяции субтипов штаммов N.meningitidis N.Meningitidis. серологическим Предыдущие методом не позволили в полной мере охарактеризовать антигенную структуру менингококков, распространенных на территории Москвы [3], по причине отсутствия у исследователей полного набора моноклональных антител и невозможности дифференцировать эпитопы одного семейства с помощью серосубтипирования. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома бактерии, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты, позволяет избежать сложностей, связанных с типированием серологическим методом. Секвенирование дает возможность однозначно предсказать антигенную аминокислотную характеристику последовательность штамма за счет и расширить характеристики дополнительного эпитопа. Изучение антигенных свойств белков наружной мембраны менингококков может быть использовано в

Заключение диссертации по теме «Эпидемиология», Миронов, Константин Олегович

9. Выводы

1. Отработаны методика проведения MJICT бактерий видов N.meningitidis и Hib, и схема субтипирования N.meningitidis. Проведено типирование московской популяции этих микроорганизмов.

2. Клональная структура московской популяции штаммов Hib аналогична структуре популяции штаммов Hib, циркулирующих за рубежом. Штаммы Hib, циркулирующие на территории Москвы с 1984 г. не претерпели существенных генетических изменений. Более низкая заболеваемость Hib-менингитом в Москве, по сравнению с странами Европы и Америки (до введения программ по вакцинопрофилактики), не связана с особенностями популяции возбудителя, циркулирующей на территории.

3. Штаммы N.meningitidis генетической субгруппы III в период 1997-2002 г. в Москве на встречались, что согласуется с данными о невысоком показателе заболеваемости в эти годы. Подъем заболеваемости в начале 2003 г., сопровождавшийся увеличением доли выделяемых штаммов N.meningitidis серогруппы А возможно связан с измененными штаммами генетической субгруппы X.

4. Популяции московских штаммов N.meningitidis серогрупп В и С отличаются от зарубежных. Имеет место интенсивный рекомбинационный процесс, приводящий к изменению в популяциях штаммов N.meningitidis серогрупп В и С; большинство эволюционных изменений происходит в пределах известных клональных комплексов (клонального комплекса СТ-18 и клонального комплекса СТ-41/44).

5. На территории Москвы не обнаружено штаммов, принадлежащих некоторым гипервирулентным клональным комплексам, выявленным за рубежом (клональные комплексы СТ-8 и СТ-32). Московские штаммы серогруппы W-135 не принадлежат эпидемически значимому клональному комплексу СТ-11.

6. Субтипирование штаммов N.meningitidis с помощью секвенирования имеет ряд существенных преимуществ перед серологическим методом, основными из которых являются: возможность типирования практически любого штамма и расширение представлений об антигенном разнообразии бактериальной популяции путем классификации субтипов внутри семейств и типирования вариабельного фрагмента VR3.

7. Методы характеристики бактериальных популяций с помощью MJ1CT и субтипирования обеспечивают проведение всестороннего наблюдения за эпидемическим процессом и позволяют расширить представления об эволюции патогенных бактерий.

8. Заключение

Среди всего разнообразия методов типирования бактерий на протяжении последних лет в мировую эпидемиологическую практику активно внедряется метод МЛСТ. На сегодняшний день метод МЛСТ является простым и удобным эпидемиологическим инструментом для характеристики бактериальных популяций. Благодаря многочисленным исследованиям некоторых видов патогенных бактерий было показано, что дискриминирующая способность метода МЛСТ обеспечивает проведение детальной характеристики штаммов внутри видоа (серотипа, серогруппы), которая позволяет понять особенности клональной структуры популяции возбудителя, идентифицировать эпидемически значимые штаммы (клональные комплексы) и выявить закономерности их эволюции и распространения. В то время как другие методы типирования могут быть недоступны из-за повышенных лабораторных требований или не обеспечивать стабильной межлабораторной воспроизводимости результатов, исследование методом МЛСТ может быть проведено во многих молекулярно-биологических лабораториях. Поскольку стоимость проведения МЛСТ постоянно снижается, можно надеяться на то, что он войдет в широкую эпидемиологическую практику.

В основе применения метода МЛСТ лежит секвенирование определенных фрагментов бактериального генома, кодирующих метаболические ферменты. Использование методики секвенирования обеспечивает ряд существенных преимуществ метода МЛСТ перед серологическими методами и некоторыми молекулярно-биологическими методами. Основными преимуществами метода МЛСТ являются абсолютная межлабораторная сопоставимость результатов и возможность объединения данных в общедоступные интернет-БД, что дает возможность для проведения эпидемиологического анализа на любой территории.

Нуклеотидные последовательности, полученные при проведении MJICT, могут быть использованы в дальнейшем для создания менее трудоемких методов скрининга популяций патогенных бактерий с целью выявления гипервирулентных штаммов.

Альтернативным подходом для типирования популяции патогенных бактерий является антигенная характеристика штаммов - субтипирование бактерий вида N.meningitidis. В то время как проведение MJICT направлено на выявление "внутренних" эволюционных закономерностей и характеристику клональной структуры вида (серотипа, серогруппы) бактерии, с целью наблюдения за эпидемически значимыми штаммами (клональными комплексами), субтипирование является дополнительным эпидемиологическим инструментом, позволяющим предсказывать иммунный ответ и выявлять особенности иммунитета разных групп населения. Проведенная на основании секвенирования антигенная характеристика популяции возбудителя обеспечивает необходимые данные при создании серологических и молекулярно-биологических тест-систем для характеристики штаммов, циркулирующих на конкретных территориях, а так же для разработки белковых и белково-полисахаридных вакцин.

В данной работе впервые в отечественной эпидемиологической практике применен метод MJICT. Показана эпидемиологическая обоснованность применения MJICT для характеристики московских штаммов и сравнения их с зарубежными на примере возбудителей ГБМ N.meningitidis и Hib. Проведена антигенная характеристика московских штаммов N.meningitidis на основании секвенировании фрагментов гена рог А, соответствующих поверхностным вариабельным петлям белка наружной мембраны 1 класса.

Интерес к типированию Hib обусловлен скудными и противоречивыми данными о распространенности и эпидемиологической значимости этой бактерии. После того, как в ходе выполнения исследования "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве" (1999-2001 гг.; ГУ ЦНИИЭ), впервые была достоверно определена заболеваемость Hib-менингитами [9], возникла необходимость прояснения эпидемиологической ситуации, поскольку, согласно результатам исследования, заболеваемость Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве оказалась ниже, чем в большинстве европейских и американских стран до введения вакцинопрофилактики.

До настоящей работы в мире была опубликована всего одна работа по характеристике бактерий вида Н. influenzae с помощью современной схемы MJ1CT [66], создана общедоступная интернет-БД по типированным штаммам. Интернет-БД для H.influenzae на завершающем этапе исследования (февраль 2004 г.) содержала 163 иностранных штамма, из них 57 штаммов принадлежали Hib, которым соответствовало 14 вариантов СТ.

При выполнении работы была отработана технология применения MJICT и проведено типирование штаммов Hib на материале, полученном от московских больных. Основная часть исследованных штаммов выделена от больных гнойным Hib-менингитом во время проведения популяционного исследования по оценке заболеваемости (1999-2001 гг.), также в работу было включено 2 изолята от больных из Екатеринбурга. С целью проведения ретроспективного анализа было исследовано 6 штаммов, изолированных на территории Москвы в 1984 г.

Результаты MJICT Hib показали, что все исследованные штаммы распределены по 10 СТ. Из десяти наблюдаемых СТ только один (СТ-6) выявлен ранее, остальные СТ описаны впервые. Большинство московских штаммов принадлежат СТ-6 (22, 45%), другие СТ наблюдаются значительно реже. При изучении взаимоотношений штаммов методом кластеризации BURST выяснилось, что подавляющее большинство исследованных штаммов входят в один клональный комплекс (клональный комплекс СТ-6), который объединяет 47 (96%) штаммов, распределенных по девяти СТ. Остальные штаммы (2, 4%) отличаются от штаммов клонального комплекса СТ-6 как минимум по 6 локусам. Результаты MJICT штаммов, изолированных в 1984 году, не позволили с уверенностью выделить преобладающий СТ, но поскольку большинство штаммов принадлежали тому же клональному комплексу (клональному комплексу СТ-6), было сделано предположение о том, что штаммы, циркулирующие на территории Москвы, с 1984 года не претерпели существенных генетических изменений. Отсутствие в 1984 году штаммов с СТ-6 и принадлежность трех (из шести) штаммов к СТ-79, позволяют предположить тенденцию к смене доминирующих СТ внутри одного клонального комплекса, у штаммов, изолированных в разные периоды времени на одной территории.

Анализ филогенетического родства типированных штаммов, проведенный на основании полученных нуклеотидных последовательностей и анализ по аминокислотной последовательности, в целом демонстрирует согласованность с результатами кластеризации данных MJICT и позволяет предположить, что штамм с СТ-95 является наиболее вероятным предком для штаммов с СТ-6, который в свою очередь является наиболее вероятным предшественником большинства остальных СТ клонального комплекса СТ-6. Филогенетический анализ указывает на то, что скорее всего большинство наблюдаемых СТ являются результатом дивергенции СТ-6, который возможно возник в результате рекомбинационного процесса от СТ-95.

Используя все имеющиеся на момент исследования данные о типированных штаммах H.influenzae, содержащиеся в интернет-БД, было проведено сравнение исследованных штаммов с зарубежными.

Выяснилось, что распределение российских штаммов Hib по клональным комплексам повторяет структуру клональных комплексов Hib, показанную при типировании выборки большего объема зарубежными коллегами [66]. Выделенному нами с помощью алгоритма BURST клональныму комплексу СТ-6 соответствует отмеченный иностранными авторами клональный комплексы А1/А2, 2 штаммам, не входящим в клональный комплекс СТ-6, соответствует клональный комплекс Bib. Клональные комплексы А1/А2 и Bib объединяют штаммы, принадлежащие только Hib, они заметно отделены от штаммов других серогрупп и бескапсульных штаммов. Несмотря на типичную для штаммов Hib клональную организацию, 9 из 10 СТ, выявленных у российских штаммов уникальны (не встречались ранее), что говорит об эпидемиологических особенностях штаммов Hib, циркулирующих в нашей стране, а также демонстрирует высокую дискриминирующую способность метода MJICT.

На основании сравнения московских штаммов с зарубежными можно заключить, что клональная структура штаммов Hib на протяжении последних десятилетий не изменяется. Более низкую заболеваемость Hib-менингитами в Москве вряд ли можно объяснить циркуляцией на территории Москвы отличных от европейских и американских, менее вирулентных штаммов Hib, поскольку большинство (48%) московских штаммов принадлежат СТ-6, так же обнаруженному у штаммов, изолированных в Европе и США. Невысокая заболеваемость Hib-менингитами на территории Москвы скорее всего, связана с социально-биологическими и эпидемиологическими особенностями московской популяции.

Преложенная в 1998 г. схема MJICT для N.meningitidis, на сегодняшний день является основным методом типирования для менингококков, а также используется для характеристики некоторых других представителей рода Neisseria. Интенсивное изучение менингококковой инфекции зарубежными исследователями позволило выделить несколько гипервирулентных клональных комплексов в популяции бактерий вида N.meningitidis и проследить закономерности их распространения. Объединение результатов типирования в общедоступную интернет-БД позволяет существенно облегчить работу по характеристике популяции штаммов, циркулирующих на отдельных территориях, и своевременно обнаружить присутствие неизвестных или уже описанных гипервирулентных штаммов. Использованная в данном исследовании интернет-БД на момент окончания исследования (февраль 2004 г.) содержала информацию о 4663 типированных изолятах бактерий вида N.meningitidis, которым соответствовало 3222 варианта СТ и среди которых было обозначено 25 клональных комплексов.

Наибольший эпидемиологический интерес представляет наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А, которые были причиной многих случаев эпидемического неблагополучия на территории России во второй половине XX века. Популяция московских штаммов N.meningitidis серогруппы А была исследована ранее зарубежными исследователями методом MJICT [21]. Исследование M.Achtman и соавт. продемонстрировало совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выделением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего исследования вопрос о циркуляции на территории Москвы штаммов этой генетической субгруппы после 1996 г. был открыт, MJICT московских штаммов других серогрупп так же не проводилось.

При выполнении работы нами исследовано 60 штаммов бактерий вида N.meningitidis, принадлежащих серогруппам А (28 штаммов), В (16), С (14) и W-135 (2). Результаты типирования методом MJICT позволили охарактеризовать московские штаммы и выделить особенности клональной организации в популяциях менингококков разных серогрупп.

На основании результатов запроса в интернет-БД был определен СТ у большинства штаммов N.meningitidis серогруппы А (18), в то время как большинство штаммов серогрупп В, С и W-135 имели не описанный ранее СТ. Тем не менее, для большинства штаммов всех исследованных серогрупп, за исключением штаммов серогруппы W-135, удалось определить принадлежность к известным клональным комплексам.

Виду повышенного эпидемиологического интереса к штаммам N.meningitidis серогруппы А, а также на основании детального изучения клональной организации штаммов этой серогруппы ранее, в данной работе клональные комплексы обозначались согласно M.Achtman и соавт. [21]. Было выяснено, что на территории Москвы после 1997 г. штаммы эпидемически значимой генетической субгруппы III до 2003 г. не встречались. Отсутствие штаммов генетической субгруппы III после 1997 г. согласуется с умеренными показателями заболеваемости, зафиксированными до конца 2002 гг. В межэпидемический период преимущественно изолировались штаммы, принадлежащие генетическим субгруппам VI и X. Появление штамма генетической субгруппы III в начале 2003 г. скорее всего является исключением, на что указывает источник штамма (штамм изолирован от гражданина Узбекистана). Напряженная эпидемическая ситуация с менингококковой инфекцией на территории Москвы в первой половине 2003 г. может быть связана со сменой преобладающей генетической субгруппы в 2002-2003 гг. В указанный период наблюдалось появление новых не описанных в интернет-БД СТ, преимущественно внутри генетической субгруппы X, и увеличение частоты их выделения, что является свидетельством эволюционных изменений штаммов серогруппы А. Не исключено, что подъем заболеваемости был обусловлен измененными штаммами генетической субгруппы X.

Среди исследованых штаммов N.meningitidis серогруппы В описанный в предыдущих исследованиях СТ был найден только у 4 штаммов, все они принадлежали СТ-18. До настоящего исследования, СТ-18 были обнаружены у трех штаммов, один из которых был выделен в России (1989 г.). Московская популяция штаммов N.meningitidis серогруппы В распределена по трем клональным комплексам, большинство штаммов (12, 75%) входят в клональный комплекс СТ-18. Для двух штаммов клональный комплекс не определен.

Московские штаммы N. meningitidis серогруппы С распределены по 2 клональным комплексам: 6 (43%) штаммов входят в клональный комплекс СТ-41/44 и 2 (7%) штамма входят в клональный комплекс СТ-18. Все исследованные штаммы этой серогруппы имели СТ, не выявленные ранее.

По результатам MJICT московских штаммов N.meningitidis, Можно судить о динамике московской популяции штаммов серогруппы В, изолированных на протяжении 1995-2002 гг.: практически все штаммы, изолированные до 2001 г. принадлежат клональному комплексу СТ-18, начиная с 2001 г. только 1 штамм из четырех входит в этот клональный комплекс. Два московских штамма N.meningitidis серогруппы В, изолированные в 1988 и 1989 гг., так же входят в клональный комплекс СТ-18. Появление штаммов, принадлежащих клональным комплексам СТ-11 и СТ-41/44 говорит о наблюдаемой смене доминирующего клонального комплекса в московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы В.

Присутствие в московской популяции штаммов серогруппы В штамма, входящего в клональный комплекс СТ-11, который содержит штаммы преимущественно серогруппы С, а также присутствие в московской популяции штаммов серогруппы С штаммов, входящих в клональный комплекс СТ-18 (1 штамм) и клональный комплекс СТ-41/44 (6 штаммов), которые содержат штаммы преимущественно серогруппы В, может рассматриваться как свидетельство горизонтального переноса генетической информации между представителями двух серогрупп. Также нельзя исключить, что эволюционные изменения московских штаммов серогрупп В и С связаны с рекомбинационными процессами между "московской" популяцией штаммов и штаммов, занесенных с других территорий.

На основании кластеризации аллельных профилей исследованных штаммов N.meningitidis серогрупп В и С методом BURST, было показано, что клональная структура московских штаммов серогрупп В и С различна. Среди 16 штаммов серогруппы В существует 5 групп штаммов (трем соответствуют известные клональные комплексы, для двух клональный комплекс не определен), 14 штаммов серогруппы С образуют 8 групп штаммов (2 и 6, соответственно). Можно сделать вывод о большей интенсивности рекомбинационных процессов в популяции штаммов серогруппы С, приводящих к более быстрому "размыванию" клональной структуры.

Скудность выборки штаммов серогруппы W-135 не позволяет с уверенностью говорить о динамике и уровне рекомбинационных процессов в популяции этих штаммов. Один из исследованных штаммов принадлежал СТ, выявленному ранее (США, 1994 г.), СТ другого штамма обнаружен впервые. Оба штамма не удается включить в какой-либо клональный комплекс.

Наличие в московских популяциях серогрупп В, С и W-135 штаммов с не определенным клональным комплексом может свидетельствовать с одной стороны, об особенностях московских штаммов по сравнению с зарубежными (в эпидемиологическом аспекте), с другой - об интенсивных рекомбинационных процессах, проходящих внутри одной серогруппы и между штаммами разных серогрупп (в биологическом аспекте).

На особенности московской популяции штаммов серогрупп В и С, указывает значительное количество впервые описанных СТ, не обнаруженных ранее на других территориях, в частности - Европе. Об уникальности московских штаммов говорит еще и тот факт, что у многих штаммов, встречаются ранее не выявленные аллели MJICT-локусов. Говоря об "уникальности" московской популяции штаммов, следует учитывать, что информация, представленная в интернет-БД, может быть неполной (данные о штаммах, циркулирующих в странах Восточной Европы и Средней Азии ограничены).

При типировании московских штаммов не было обнаружено представителей многих клональных комплексов, распространенных в странах Европы и Америки. В частности показано, что на территории Москвы не циркулируют штаммы принадлежащие гипервирулентным клональным комплексам СТ-8 (ST-8 complex/Cluster А4) и СТ-32 (ST-32 complex/ET-5 complex), только один московский штамм серогруппы В принадлежит клональному комплексу СТ-11. Среди штаммов серогруппы W-135, не было обнаружено представителей гипервирулентного клонального комплекса СТ-11, обеспечившего после хаджа мусульманских паломников в 2000 и 2001 гг. эпидемический подъем заболеваемости в странах Африки и экспорт инфекции на территорию Европы и Азии.

Для всех охарактеризованных методом МЛСТ московских штаммов N.meningitidis было проведено субтипирование на основании секвенирования фрагментов гена рог А. Применение секвенирования фрагментов гена рогА показало, что у изученной выборки московских штаммов N.meningitidis встречается 15 вариантов фрагмента VR1, 19 — фрагмента VR2 и 6 - фрагмента VR3. У одного штамма субтип определить не удалось, что, на наш взгляд, связано с отсутствием у этого штамма гена рог А.

Большинство штаммов серогруппы А (18, 64%) имеют субтип Р1.5-2,10,37-1. Штаммы с субтипом Р1.5-2,10,37-1 изолировались в Москве с 1998 в течение всего времени исследования, они распределены равномерно между генетическими субгруппами VI и X. Субтип Р 1.5,10,37-1 обнаружен у 3 (17%) штаммов; два штамма принадлежат СТ-68 (генетическая субгруппа VI), один - СТ-75 (генетическая субгруппа X). Все исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы А, принадлежащие генетической субгруппе III, имели субтип Р 1.20,9,35-1

При сопоставлении результатов субтипирования с данными серотипирования московских штаммов, изолированных в 1983-1997 гг., был сделан вывод о том, что антигенная структура штаммов N.meningitidis серогруппы А, циркулирующих на территории Москвы не претерпела принципиальных изменений.

Популяции штаммов N.meningitidis серогрупп В и С отличаются широким полиморфизмом антигенной структуры, субтипирование штаммов данных серогрупп не позволяет выделить преобладающий субтип. Субтипы штаммов N.meningitidis серогруппы В, встречающиеся неоднократно, распределены следующим образом: субтип Р 1.5-1,2-2,36-2 обнаружен у 3 (19%) штаммов, субтип Р 1.18-1,3,38 - у 2 (12,5%); все штаммы входят в клональный комплекс СТ-18. У 2 (12,5%) штаммов, не входящих в клональный комплекс СТ-18, также наблюдается субтип Р1.5-1,10-1,36-2. Исследованные штаммы N.meningitidis серогруппы С распределены по субтипам похожим образом. Максимальное количество штаммов одного субтипа (4 штамма, 28,5%) имели субтип Р1.17,16-4,36 и принадлежали клональному комплексу СТ-41/44; субтип Р 1.18-1,34,38 найден у 3 (21%) штаммов, 2 из которых входят в клональный комплекс СТ-41/44, а для одного штамма клональный комплекс не определен.

Сопоставление результатов настоящего исследования с результатам серосубтипирования московских штаммов серогрупп В и С, изолированных в 1983-1997 гг. показывает, что охарактеризованные популяции штаммов этих серогрупп имеют такую же гетерогенную структуру. Распределение субтипов у штаммов серогрупп В и С свидетельствует о высоком уровне рекомбинационных процессов в этих популяциях, приводящих к большему фенотипическому разнообразию по сравнению с популяцией штаммов серогруппы А.

Для всех исследованных штаммов, за исключением штаммов генетической субгруппы III, не представляется возможным обозначить какую-либо связь субтипа и клонального комплекса.

Результаты субтипирования демонстрируют выраженную гомогенность штаммов N.meningitidis серогруппы А: из 28 штаммов N.meningitidis серогруппы А только 4 (14%) штамма имеют однократно встречающийся субтип, в то время как у штаммов серогрупп В и С, исследованных в меньшем количестве, однократно встречающиеся субтипы присутствуют более чем у половины штаммов: 7 (67%) и 8 (57%), соответственно. Основанная на субтиповой характеристике клональная структура популяций штаммов N. meningitidis трех серогрупп согласуется с результатами распределения наблюдаемых СТ, которые также демонстрируют гомогенность московской популяции штаммов N.meningitidis серогруппы А и гетерогенность популяций штаммов серогрупп В и С, в которых большинство штаммов имеют неповторимый СТ.

Результаты применения двух альтернативных методов типирования в полной мере позволили охарактеризовать московскую популяцию возбудителей ГБМ. На примере типирования N.meningitidis и Hib показано, что метод MJICT пригоден для характеристики бактериальных популяций и выявления эпидемически значимых штаммов (клональных комплексов). Также следует отметить, что проведение данной работы позволило дополнить и расширить представления о генетическом разнообразии и эволюционном потенциале популяций бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae. Все результаты типирования и дополнительные данные о штаммах занесены в соответствующие интернет-БД и доступны для будущих исследований. Особенно следует отметить вклад в недавно созданную интернет-БД для H.influenzae, поскольку наши результаты существенно дополнили имеющиеся на момент исследования данные о штаммах, принадлежащих серотипу Ь.

Применение метода MJICT является удобным инструментом для осуществления всестороннего эпидемиологического надзора и наблюдения за эволюцией патогенных бактерий. Благодаря использованию методики секвенирования, существует возможность для прямой оценки генетических и филогенетических взаимосвязей между штаммами и проводить сравнение с штаммами, типированными другими исследователями. Применение секвенирования для субтипирования бактерий вида N.meningitidis продемонстрировало ряд существенных преимуществ перед серотипированием и позволило расширить представления об антигенной структуре московских штаммов N.meningitidis. Использование методов, основанных на секвенировании, позволяет проводить быстрый и удобный анализ результатов и объединять данные всех лабораторий, проводящих аналогичные исследования.

Применение метода MJICT и антигенной характеристики на основании секвенирования позволяет следить за эволюцией популяции возбудителя, своевременно выявлять наиболее опасные штаммы (клональные комплексы) и отслеживать закономерности их циркуляции, что необходимо для более полного и всестороннего эпидемиологического надзора за патогенными бактериями, циркулирующими на территории России.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Миронов, Константин Олегович, 2004 год

1. Богданович Т.М., Стецюк, О.У., Кречикова О.И. и др. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae. // Клин, микробиол. и антимикробная химиотерапия. 2000. - Т. 2, № 2. - С. 93-109.

2. Венгеров Ю. Я., Платонов А. Е., Воейкова М. В. и др. Hib-менингит: клиника, диагностика и лечение. // Лечащий Врач. 2002. - Т. 2, №1. - С. 72-77.

3. Королева И.С. Микробиологический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за гнойными бактериальными менингитами: Дис.докт. мед. наук. Москва, 2000. - 193 с.

4. Королева И.С., Демина A.A., Платонов А.Е. и др. Эпидемиологический надзор за гнойными бактериальными менингитами: материалы 20-летних наблюдений. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2003. -№5.-С. 10-13.

5. Костинов М.П., Малеев В.В. Hib-инфекция: вопросы вакцинопрофилактики. М.: Медицина для всех, 1998. - 90 с.

6. Медицинская микробиология / Под ред. Покровского В.И., Поздеева O.K. М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. - 1200 с.

7. Общий протокол для набллюдения за Haemophilus influenzae типа b среди населения. // Бюллетень ВОЗ. 1995. - С. 1-25.

8. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П. и др. М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 432 с.

9. Платонов А.Е., Королева И.С., Платонова О.В и др. // VIII Всероссийский съезд эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Тез. докл. М., 2002. - Т. 1. - С. 88-89.

10. Ю.Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С. и др. Перспективы диагностики бактериальных менингитов. // Ж. микробиол. 1999. -№2.-С. 71-76.

11. П.Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Платонова О.В. Мультилокусное секвенирование новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения. // Генетика. - 2000. - Т. 36, №5 - С. 597605.

12. Платонов А.Е., Шипулин Г. А., Тютюнник E.H. и др. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. М., 2001. - 43 с.

13. Покровский В.И., Фаворова J1.A., Костюкова H.H. Менингококковая инфекция. М.: Медицина, 1976. - 275 с.

14. Приказ МЗ РФ №375 от 23.12.98. О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. М., 1998. - 76 с.

15. Приказ МЗ РФ №535 от 22.05.85. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. М., 1989. - С. 119-120.

16. Родионова E.H., Венгеров Ю.Я., Платонов А.Е. и др. Генодиагностика гнойных и серозных менингитов. // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Тез. докл. науч-практ. конф. М., 2002. - С. 244-249.

17. Тютюнник E.H. Использование полимеразной цепной реакции для диагностики и прогнозирования течения менингитов: Дис.канд. мед. наук М., 2001. - 143 с.

18. Тютюнник E.H., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации серогрупповой принадлежности менингококков. // XXI Итоговаямежвузовская научная конференция молодых ученых: Сб. науч. тр.-М., 1999.-С. 77-78.

19. Achtman М. Global epidemiology of meningococcal disease. // Meningococcal disease / edited by Cartwright K. John Wiley & Sons Ltd, 1995.-P. 159-175.

20. Achtman M., Kusecek В., Morelli G. et al. A comparison of the variable antigens expressed by clone IV-1 and subgroup III of Neisseria meningitidis serogroup A. // J. Infect. Dis. 1992. - V. 165., N 1. - P. 5368.

21. Achtman M., van der Ende A., Zhu P., Koroleva I.S. et al. Molecular epidemiology of serogroup a meningitis in Moscow, 1969 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V. 7, N 3. - P. 420-427.

22. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215, N 3. - P. 403-410.

23. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, N 17. - P. 3389-3402.

24. Bennett D.E., Cafferkey M.T. Multilocus restriction typing: a tool for Neisseria meningitidis strain discrimination. // J. Med. Microbiol. 2003. -N 52, Pt 9. - P. 781-787.

25. Bennett J.V., Platonov A.E., Slack M.P.E. et al. Haemophilus influenzae type b (Hib) meningitis in the pre-vaccine era: a global review of incidence, age distribution, and case-fatality rates. World Health Organization, 2002. - P. 1-92.

26. Boom R., Sol CJ.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. // J. Clin. Microboil. 1990. - V. 28. - P. 495-503.

27. Campos J., Aracil B., Roman F. et al. Molecular epidemiology of Haemophilus influenzae type b isolated from children with clinical cases of conjugate vaccine failures. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41, N 8. -P. 3915-3918.

28. Caugant D.A., Froholm L.O., Bovre K. et al. Intercontinental spread of a genetically distinctive complex of clones of Neisseria meningitidis causing epidemic disease. //PNAS. 1986. - V.83, N 13. -P. 4927-4931.

29. Chan M.S., Maiden M.C., Spratt B.G. Database-driven multi locus sequence typing (MLST) of bacterial pathogens. // Bioinformatics. -2001.-V. 17, N 11. P. 1077-1083.

30. Clarke S.C., Diggle M.A., Edwards G.F. Semiautomation of multilocus sequence typing for the characterization of clinical isolates of Neisseria meningitidis. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V.39, N 9. - P. 3066-3071.

31. Clarke S.C., Diggle M.A., Moiling P. et al. Analysis of PorA variable region 3 in meningococci: implications for vaccine policy? // Vaccine. -2003.-V. 21,N 19-20.-P. 2468-2473.

32. Derrick J.P., Urwin R., Suker J. et al. Structural and evolutionary inference from molecular variation in Neisseria porins. // Infect. Immun. -1999. V. 67, N 5. - P. 2406-2413.

33. Diggle M.A., Clarke S.C. A novel method for preparing single-stranded DNA for pyrosequencing. // Mol. Biotechnol. 2003. - V. 24, N 2. - P. 221-224.

34. Diggle M.A., Clarke S.C. What a load of old sequence!!! // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40, N 7. - P. 2707.

35. Dingle K.E., Colles F.M., Wareing D.R.A. et al. Multilocus Sequence Typing System for Campylobacter jejuni. // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39, N 1. - P. 14-23.

36. Djibo S., Nicolas P., Alonso J.M. et al. Outbreaks of serogroup X meningococcal meningitis in Niger 1995-2000. // Trop. Med. Int. Health. 2003. - V. 8, N 12. - P. 1118-1123.

37. Dodgson A.R., Pujol C., Denning D.W. et al. Multilocus sequence typing of Candida glabrata reveals geographically enriched clades. // J. Clin. Microbiol. -2003. -V. 41, N 12. P. 5709-5717.

38. Dyet K.H., Simmonds R.S., Martin D.R. Multilocus restriction typing method to predict the sequence type of meningococci. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42, N 4. - P. 1742-1745.

39. Edward J. Feil, Edward C. et al. Recombination within natural populations of pathogenic bacteria: Short-term empirical estimates and long-term phylogenetic consequences. // PNAS. 2001. - V. 98, N 1. - P. 182-187.

40. Edwards U., Muller A., Hammerschmidt S. et al. Molecular analysis of the biosynthesis pathway of the alpha-2,8 polysialic acid capsule by Neisseria meningitidis serogroup B. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14, N 1. -P. 141-149.

41. Enright M.C., Day N.P., Davies C.E. et al. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38, N 3. - P. 1008-1015.

42. Enright M.C., Spratt B.G. Multilocus sequence typing. // Trends Microbiol. 1999. - V. 7, N 12. - P. 482-487.

43. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A. et al. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 4. - P. 2416-2427.

44. Feavers I.M., Fox A.J., Gray S. et al. Antigenic diversity of meningococcal outer membrane protein PorA has implications for epidemiological analysis and vaccine design. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1996. - V. 3, N 4. - P. 444-450.

45. Feil E.J., Holmes E.C., Bessen D.E. et al. Recombination within natural populations of pathogenic bacteria: short-term empirical estimates and long-term phylogenetic consequences. // PNAS. 2001. - V. 98, N 1. - P. 182-187.

46. Feil E.J., Li B.C., Aanensen D.M. et al. eBURST: Inferring Patterns of Evolutionary Descent among Clusters of Related Bacterial Genotypes from Multilocus Sequence Typing Data. // J. Bacteriol. 2004. - V. 186, N5.-P. 1518-1530.

47. Feil E.J., Maiden M.C., Achtman M. et al. The relative contributions of recombination and mutation to the divergence of clones of Neisseria meningitidis. // Mol. Biol. Evol. 1999. - V. 16, N 11. - P. 1496-1502.

48. Fry A.M., Lurie P., Gidley M. et al. Haemophilus influenzae Type b disease among Amish children in Pennsylvania: reasons for persistent disease. // Pediatrics. 2001. - V. 108, N 4. - E 60.

49. Gagneux S., Wirth T., Hodgson A. et al. Clonal groupings in serogroup X Neisseria meningitidis. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8, N 5. - P. 462-466.

50. Gratten M. Haemophilus influenzae biotype VII. // J. Clin. Microbiol. -1983. V. 18, N 4. - P. 1015-1016.

51. Homan W.L., Tribe D., Poznanski S. et al. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecium. // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40, N6.-P. 1963-1971

52. Kilian M. A taxonomic study of the genus Haemophilus, with the proposal of a new species. // J. Gen. Microbiol. 1976. - V. 93, N 1. - P. 9-62.

53. Kroll J.S., Hopkins I., Moxon E.R. Capsule loss in H. influenzae type b occurs by recombination-mediated disruption of a gene essential for polysaccharide export. // Cell. 1988. - V. 53, N 3. - P. 347-356.

54. Kroll J.S., Wilks K.E., Farrant J.L. et al. Natural genetic exchange between Haemophilus and Neisseria: intergeneric transfer of chromosomal genes between major human pathogens. // PNAS. 1998. -V. 95,N21.-P. 12381-12385.

55. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B. et al. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software. // Bioinformatics. 2001. - V. 17, N12.-P. 1244-1245.

56. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software for microcomputers. // Comput. Appl. Biosci. 1994. -V. 10, N2.-P. 189-191.

57. Lowe C.A., Diggle M.A., Clarke S.C. A single nucleotide polymorphism identification assay for the genotypic characterisation of Neisseriameningitidis using MALDI-TOF mass spectrometry. // Br. J. Biomed. Sci. -2004. -V. 61, N1. -P. 8-10.

58. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. // PNAS. 1998. - N 95. - P. 3140-3145.

59. Maiden M.C., Russell J., Suker J. et al. Neisseria meningitidis subtype nomenclature. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - V. 6, N 5. - P. 771-772.

60. Meats E., Feil E J., Stringer S. et al. Characterization of encapsulated and noncapsulated Haemophilus influenzae and determination of phylogenetic relationships by multilocus sequence typing. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41, N4. -P. 1623-1636.

61. Meningococcal disease / edited by Cartwright K. John Wiley & Sons Ltd, 1995.-316 p.

62. Meningococcal disease: methods and protocols / edited by Andrew J. Pollard and Martin C. J. Maiden. Humana Press Inc., 2001. - 721 p.

63. Mitsuda T., Kuroki H., Ishikawa N. et al. Molecular epidemiological study of Haemophilus influenzae serotype b strains obtained from children with meningitis in Japan. // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, N 8.-P. 2548-2552.

64. Molling P., Backman A., Olcen P. et al. Comparison of serogroup W-135 meningococci isolated in Sweden during a 23-year period and those associated with a recent hajj pilgrimage. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39,N7.-P. 2695-2699.

65. Moiling P., Unemo M., Backman A. et al. Genosubtyping by sequencing group A, B and C meningococci; a tool for epidemiological studies of epidemics, clusters and sporadic cases. // APMIS. 2000. - V. 108, N 7-8.-P. 509-516.

66. Moore P.S., Harrison L.H., Telzak E.E. et al. Group A meningococcal carriage in travelers returning from Saudi Arabia. // JAMA. 1988. - V. 260,N18.-P. 2686-2689.

67. Musser J.M, Kroll J.S, Granoff D.M. et al. Global genetic structure and molecular epidemiology of encapsulated Haemophilus influenzae. // Rev. Infect. Dis. 1990. - V. 12, N 1. - P. 75-111.

68. Musser J.M., Barenkamp S.J., Granoff D.M. et al. Genetic relationships of serologically nontypable and serotype b strains of Haemophilus influenzae. // Infect. Immun. 1986. - V. 52, N 1. - P. 183-191.

69. Musser J.M., Kroll J.S., Moxon E.R. et al. Clonal population structure of encapsulated Haemophilus influenzae. // Infect. Immun. 1988. - V. 56, N8.-P. 1837-1845.

70. Peltola H. Meningococcal disease: still with us. // Rev. Infect. Dis. -1983.-V. 5,N. 1.-P. 71-91.

71. Peltola H. Prophylaxis of bacterial meningitis. // Infect. Dis. Clin. North Am. 1999. - V. 13, N. 3. - P. 685-710.

72. Porras O., Caugant D.A., Gray B. et al. Difference in structure between type b and nontypable Haemophilus influenzae populations. // Infect. Immun. 1986. - V. 53, N 1. - P. 79-89.

73. Russell J.E. PorA Variable Regions of Neisseria meningitidis. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - V. 10, N 4. - P. 674-678.

74. Sacchi C.T., Lemos A.P., Brandt M.E. et al. Proposed standardization of Neisseria meningitidis PorA variable-region typing nomenclature. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. - V. 5, N 6. - P. 845-855.

75. Saito M., Umeda A., Yoshida S. Subtyping of Haemophilus influenzae strains by pulsed-field gel electrophoresis. // J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37, N7.-P. 2142-2147.

76. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // PNAS. 1977. - V. 74, N 12. - P. 5463-5467.

77. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H. et al. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51, N 5. - P. 873-884.

78. Sottnek F.O., Albritton W.L. Haemophilus influenzae biotype VIII. // J. Clin. Microbiol. 1984. - V. 20, N 4. - P. 815-816.

79. Swartley J.S., Marfin A.A., Edupuganti S. et al. Capsule switching of Neisseria meningitidis. // PNAS. 1997. - V. 94, N 1. - P. 271-276.

80. Tikhomirov E., Santamaria M., Esteves K. Meningococcal disease: public health burden and control. // World Health Stat. Q. 1997. - V. 50, N 3-4. -P. 170-177.

81. Urwin R., Jolley K.A., Maiden M.C.J. The role of integrated databases in meningococcal epidemiology and vaccine development. // Abstract of 13th International Pathogenic Neisseria Conference. Oslo, Norway, 2002.-P. 45.

82. Van der Ende A., Hopman C.T., Dankert J. Deletion of porA by recombination between clusters of repetitive extragenic palindromic sequences in Neisseria meningitidis. // Infect. Immun. 1999. - V. 67, N 6.-P. 2928-2934.

83. Van der Ende A., Hopman C.T., Dankert J. Multiple mechanisms of phase variation of PorA in Neisseria meningitidis. // Infect. Immun. 2000. - V. 68,N 12.-P. 6685-6690.

84. Van der Ley P., Heckeis J.E., Viiji M. et al. Topology of outer membrane porins in pathogenic Neisseria spp. // Infect. Immun. 1991. - V. 59, N 9. -P. 2963-2971.

85. Wang J.F., Caugant D.A., Li X. et al. Clonal and antigenic analysis of serogroup A Neisseria meningitidis with particular reference to epidemiological features of epidemic meningitis in China. // Infect. Immun. 1992. -N 60. - 5267-82.

86. Zhou J., Enright M.C., Spratt B.G. Identification of the major Spanish clones of penicillin-resistant pneumococci via the Internet usingmultilocus sequence typing. // J. Clin. Microbiol. 2000. - N 38. - 977986.

87. Zhu P., van der Ende A., Falush D. et al. Fit genotypes and escape variants of subgroup III Neisseria meningitidis during three pandemics of epidemic meningitis. // PNAS. 2001. - V. 98, N 9. - 5234-5239.