Метод микроспектроскопии комбинационного рассеяния для исследования свойств миелина нервных волокон тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Кутузов, Николай Павлович

• Кутузов, Николай Павлович
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Кутузов, Николай Павлович

Оглавление

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура миелина и современные методы исследования

1.2 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния

1.2.1 Основы метода I. Классическая теория

1.2.2 Особенности спектров КР липидов в диапазоне 2800-3000 см-1

1.2.3 Спектральные свойства каротиноидов в составе модельных мембранных систем и биологических объектов

1.3 Основы количественной теории ориентационной

упорядоченности молекул и методы ее исследования

1.3.1 Основные методы, используемые для исследования молекулярной ориентации

1.3.2 Использование ПКР для исследования ориентационной упорядоченности молекул в составе биологических объектов

1.3.3 Основы поляризационной КР спектроскопии

1.4 Использование оптических свойств биологических объектов как

инструмента для их исследования

1.4.1 Оптические методы исследования свойств нервных волокон

1.4.2 Эффект шепчущей галереи. Качественное описание

1.4.3 Использование эффекта шепчущей галереи в биологических исследованиях

1.5 Устройство пуринергической сигнализации в нервной системе

1.5.1 Основные компоненты пуринергической системы

1.5.2 Пуринергическая сигнализация и внутриклеточный кальций

1.5.3 Пуринергическая сигнализация и электрическая активность возбудимых клеток

1.5.4 Пуринергическая сигнализация и ноцицепция

1.5.5 Пуринергическая сигнализация в глиальных клетках

1.5.6 Взаимосвязь пуринергической и простаноидной систем регуляции

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Растворы и реактивы. Приготовление препаратов

2.1.1 Используемые реактивы

2.1.2 Процедура препаровки экспериментальных животных

2.1.3 Приготовление препарата нервного волокна для оптических измерений

2.1.4 Фиксация нервного волокна для масс-спектрометрии

2.1.5 Приготовление липидных пленок для модельных экспериментов

2.2 Методы исследования

2.2.1 Микроспектроскопия КР

2.2.2 Лазерная интерференционная микроскопия

2.2.3 Масс-спектрометрия

2.2.4 Регистрация потенциалов действия

2.2.5 Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Особенности КР спектроскопии одиночных нервных волокон

3.1.1 Интерпретация спектров КР миелина нервных волокон

3.1.2 Выделение полос каротиноидов и липидов из спектра КР миелина

3.1.3 Фокусировка лазера на нервном волокне

3.1.4 Время экспозиции и фотовыцветание

3.1.5 Пространственное распределение интенсивностей основных полос спектра КР миелина в различных

областях нервного волокна

3.2 Исследование микрогетерогенностей интернодальной области миелина

3.2.1 Особенности распространения монохроматического света

в нервных волокнах и модельных системах

3.2.2 Исследование микрогетерогенностей миелина с помощью

КР спектроскопии

3.2.3 Лазерная интерференционная микроскопия и микрогетерогенности миелина

3.2.4 Возможные области применения метода

3.3 Исследование ориентационной упорядоченности каротиноидов и липидов в мембранах миелина

3.3.1 Особенности измерений спектров КР

3.3.2 Анизотропия спектров КР миелина

3.3.3 Исследование молекулярной ориентации с помощью спектроскопии КР. Расчет коэффициентов упорядоченности и построение ОФР

3.3.4 Двумерная визуализация миелина нервных волокон с помощью конфокальной КР микроспектроскопии

3.3.5 Выбор оптимальных условий измерения спектров КР миелина, используя поляризованный возбуждающий свет

3.3.6 Расчет коэффициентов упорядоченности и основных отношений интенсивностей полос спектра КР миелина

при различных воздействиях на нервное волокно

3.4 Использование метода КР микроспектроскопии для исследования влияния пуринергической сигнализации на функциональное состояние мембран миелина

3.4.1 Экспериментальный протокол измерений

3.4.2 Результаты КР спектроскопии. Влияние АТФ и

аденозина на свойства мембран миелина

3.4.3 Результаты масс-спектрометрии. Влияние АТФ и аденозина на химический состав мембран миелина

3.4.4 Модельные эксперименты для исследования матричного эффекта

3.4.5 Сравнение результатов МС спектрометрии и КР спектроскопии на мембранах миелина с

экстрагированным холестерином

3.4.6 Возможный механизм перестройки мембран миелина под

действием АТФ и аденозина

ВЫВОДЫ

Список рисунков

Список таблиц

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КР — комбинационное рассеяние АТФ — аденозинтрифосфат АДФ — аденозиндифосфат АМФ — аденозинмонофосфат шЫ — милимоль на литр МЦД — метил-бета-циклодекстрин ФХ — фосфатидилхолин

ЛИМ — лазерная интеренференционная микроскопия

АСМ — атомно-силовой микроскоп

ГА — глутаровый альдегид

МС — масс-спектрометрия

ПД — потенциал действия

ФО — фокальный объем

ПС — пуринергическая сигнализация

ШК — Шванновская клетка

ОД — олигодендроцит

ЦНС — центральная нервная система

ПНС — периферическая нервная система

ОФР — ориентационная функция распределения

СОС — стандартная ошибка среднего

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метод микроспектроскопии комбинационного рассеяния для исследования свойств миелина нервных волокон»

ВВЕДЕНИЕ

Важным направлением современной биофизики является исследование изменений структуры и свойств миелина при проведении нервным волокном потенциалов действия (ПД). Известно, что миелин содержит большое количество липидов и шунтирует распространение мембранных токов из перехвата Ранвье (ПР) в паранодальную область волокна. В связи с этим миелину отводится важная роль в реализации сальтаторного механизма и обеспечении высокой скорости проведения ПД. Однако, и при проведении нервным волокном серии ПД или активации ряда рецепторов меняется как морфология миелина, так и содержание в нем некоторых ионов (калий и кальций), а также упорядоченность мембранных фосфолипидов [1].

Приоритетами в данной области являются работы, в которых использовали спектроскопию комбинационного рассеяния (КР) для исследования состояния некоторых липидов миелина нервных волокон [2], а также работы, в которых с помощью КР исследовали изменения состояния липидов миелина при проведении серии ПД [3, 4].

Однако, использование микроскопии показало, что при регистрации КР от различных отделов одиночного миелинового нервного волокна (миелин, перехват Ранвье, шванновская клетка (ШК)) исследователь сталкивается с целым рядом существенных проблем, требующих детального изучения.

Во-первых, размер фокального объема (объем пространства, в пределах которого регистрируется КР) становится сравнимым с размером самого объекта: если различные отделы волокна отличаются по спектру КР, то необходимо однозначным образом задать координаты измерения.

Во-вторых, наличие в миелине нервного волокна «природной метки» — молекул каротиноидов представляет собой не только научный интерес, но и возможность для создания новой методологии тестирования состояния липидного бислоя мембран миелина. Важно, что в зависимости от химической структуры молекулы каротиноидов, они могут быть различным образом ориентированы в липидных мембранах [5]: некоторые каротиноиды могут располагаться перпендикулярно к плоскости бислоя за счет взаимодействию концевых полярных групп с полярными головами фосфолипидов, другие (неполярные каротинои-

ды) могут быть ориентированы как перпендикулярно, так и параллельно бис-лою мембран миелина. Все это позволит разработать новый метод исследования состояния биологической мембраны.

В-третьих, ориентация молекул каротиноидов в липидном бислое может по-разному влиять на упорядоченность «хвостов» жирных кислот мембранных липидов и, наоборот, что регулирует электрическое сопротивление миелина и скорость проведения ПД [5]. В связи с этим, нами было проведено исследование роли локальной ориентации молекул каротиноидов и жирных кислот липидов в мембранах миелина при изменении функционального состояния нервного волокна (активация пуринергических рецепторов ШК).

Целью данной работы была разработка методологии исследования изменений локализации, ориентации и конформации молекул липидов и каротино-идов в миелине в покое и при изменении функционального состояния нервного волокна.

В связи с целью исследования было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методологию регистрации спектров КР от одиночных ми-елиновых нервных волокон (фокусировка, поляризации лазера, разделение сигналов КР и флуоресценции).

2. Зарегистрировать КР спектры в различных областях нервного волокна (перехват Ранвье, паранодальная и интернодальная области).

3. Разработать методологию регистрации и количественной оценки упорядоченности молекул каротиноидов и липидов в бислоях миелина.

4. Исследовать изменения локализации, ориентации и конформации молекул каротиноидов и липидов в миелине нервного волокна в норме и при изменении функционального состояния нервного волокна (действие экстраклеточного АТФ и аденозина).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Молекулы каротиноидов миелина находятся в упорядоченном состоянии и ориентированы преимущественно перпендикулярно к поверхности, а «хвосты» жирных кислот мембранных липидов — в среднем под углом 30° к нормали к поверхности мембраны.

2. Степень упорядоченности и насыщенности жирных кислот липидов варьирует в пределах интернодальной области миелина нервного волокна.

3. Активация пуринергических рецепторов, вызывает изменение содержания холестерина и фосфатидилхолина (ФХ), а также упорядоченности и степени насыщенности «хвостов» жирных кислот липидов в мембранах миелина.

Научная новизна:

1. Впервые разработана методология и проведен количественный анализ ориентации молекул каротиноидов и липидов миелина нервных волокон с помощью метода КР и доказано, что молекулы каротиноидов ориентированы преимущественно перпендикулярно, а «хвосты» жирных кислот в среднем под углом 30° к нормали к поверхности мембраны.

2. Впервые обнаружено явление распространения монохроматического излучения внутри миелина и предложен способ его использования для исследования упорядоченности липидов в различных участках вдоль миелина.

3. Доказано, что интернодальная область нервного волокна представляет собой совокупность участков миелина, обладающих различной степенью упорядоченности и насыщенности «хвостов» жирных кислот мембранных липидов.

4. Разработан комплексный подход (КР спектроскопии и масс-спектрометрии) исследования миелина и доказано, что холестерин накапливается в мембранах миелина в ответ на активацию Р2 пуринергических рецепторов.

Научная и практическая значимость В диссертации систематизированы экспериментальные подходы и реализована методология регистрации спектров КР для исследования миелина в нативных нервных волокнах. Доказана существенная роль локализации фокуса и направления плоскости поляризации лазера при измерении КР, а применение поляризованной спектроскопии КР существенно повышает эффективность исследования и интерпретации результатов. Впервые обнаружена способность миелина осуществлять распространение монохроматического света аналогично кольцевому микрорезонатору,

и предложен метод использования данного эффекта для тестирования упорядоченности липидов вдоль поверхности миелина.

Получены результаты, свидетельствующие о том, что изменение упорядоченности липидов и химического состава миелина может быть вызвано активацией Р2 пуринергических рецепторов. Доказано, что комплексное использование методов КР спектроскопии и масс-спектрометрии позволяет выявить не только изменения упорядоченности и конформации липидов и каротиноидов, но и изменения химического состава мембран миелина. Полученные данные указывают на то, что сопротивление миелина и, соответственно, скорость проведения ПД по аксону могут зависеть от ориентации и упорядоченности некоторых мембранных липидов миелина.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ, Российских и международных конференциях: «Ломоносов-2011», «Метрология в нанотех-нологиях» и «GLIA Bilbao 2015».

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 6-ти печатных изданиях, 4 из которых изданы в журналах, рекомендованных ВАК [6, 7, 8, 9], 2 — в тезисах докладов [10, 11].

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов и двух приложений. Полный объём диссертации составляет 172 страницы с 38 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 151 наименование.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Структура миелина и современные методы исследования.

Миелин представляет собой оболочку нервных волокон, образованную плазматической мембраной миелинизирующих глиальных клеток. В ЦНС такими клетками являются ОД, в ПНС — ШК. В процессе миелинизации мембрана этих клеток оборачивается вокруг аксона и формирует концентрическую слоистую структуру [12]. Структурной единицей миелина является ламелла, состоящая из двух, прилегающих друг к другу мембран ШК.

В то время как ОД могут участвовать в создании миелиновой оболочки сразу в нескольких нервных волокнах, ШК ассоциируются только с одним волокном и формируют единственную интернодальную область [13].

Структура миелина характеризуется несколькими важными особенностями. На изображениях, полученных с помощью электронной микроскопии (ЭМ), миелин выглядят как периодическая структура с чередующимися плотными (контрастными) и неплотными слоями [14] как показано на рис. 1.1. Используемые для контрастирования соли тяжелых металлов (используются в просвечивающей ЭМ) накапливаются преимущественно в цитоплазме, в результате чего ей соответствуют наиболее темные участки изображения. Светлые области соответствуют экстраклеточному межмембранному пространству и самим липидными бислоям [15]. Типичный период структуры миелина принимает значения порядка 16-18.5 нм в ПНС и 15-17 нм в ЦНС [15]. Типичная длина одного интернодального сегмента находится в диапазоне 150-200 мкм в ЦНС и может достигать 1 мм в ПНС [13].

Между двумя участками нервного волокна, покрытого миелином (интер-нодальные области), находятся свободные от миелина участки, называемые перехватом Ранвье (ПР). На границах между ПР и интернодальными областями формируется промежуточная паранодальная область. ПР играют ведущую роль в генерации возбуждения и проведении нервного импульса. Миелиновая оболочка позволила позвоночным значительно усовершенствовать систему проведения нервных импульсов. Ее состав, а именно, высокое содержание липи-

области низкой электронной плотности, соответствующие мембранам миелина

1Ш

150А

I

из

1

<

I

Т

области высокой электронной плотности, области средней электронной плотности, соответствующие межмембранной соответствующие экстраклеточному

цитоплазме межмембранному пространству

Рисунок 1.1 — Ультраструктура миелина на изображении, полученном с

помощью электронной микроскопии.

дов и низкое содержание воды обеспечивает электрическую изоляцию аксона, а уникальная сегментарная структура определяет высокую скорость проведения возбуждения за счет сальтаторного механизма [16].

Важность структуры миелина для нормального функционирования нервных волокон подтверждается большим количеством разнообразных патологий, связанных с дисфункцией миелина включающие в себя лейкодистрофии, рассеянный склероз в ЦНС и разнообразные периферические нейропатии в ПНС [17, 18].

Миелиновая оболочка нервных волокон исследуется с 1930-х годов с помощью разнообразных экспериментальных подходов, включающих поляризованную световую микроскопию, рентгеновскую дифрактометрию (РД) и ЭМ [19, 20, 21]. С помощью РД были исследованы распределения белков и липидов в мембранах миелина и их роль в поддержании его структуры и свойств.

Несмотря на многочисленные исследования, вопросы о трехмерной пространственной организации миелина, распределении органелл по его объему и его химическом составе остаются до сих пор открытыми. Для подобных исследований комбинация методов аналитической спектроскопии и высокоразрешающей микроскопии является наиболее подходящей. В наиболее общей формулировке химический анализ и распределение определенных элементов в нервных клетках и миелине представляет значительный интерес. Ducic и соавт. использовали метод мультимодальной рентгеновской микроскопии (МРМ) для элементного анализа различных участков миелина. В ПР было обнаружено значительное увеличение содержания натрия и фосфора. Большое количество натрия связано с высокой плотностью потенциал-зависимых Жа+-каналов и ионных обменников [15]. Высокое содержание фосфора, в свою очередь, может быть связано с более высоким содержание богатых фосфором ганглиозидов в составе паранодальных колец миелина. Другой причиной может служить высокая концентрация богатых фосфором соединений, таких как АТФ, АДФ, цАМФ и других.

Примерно 30% сухого веса миелина составляют белки, играющие важную роль в поддержании его структуры. В наибольшем количестве в миелине представлены Р0, МВР и MAG белки. С помощью метода инфракрасной спектроскопии (ИКС) Ducic и соавт. исследовали вторичную структуру белков миелина и продемонстрировали, что наиболее распространенной является конформация

типа бета-слой, а также то, что основная часть белков находится в области компактного миелина. Наконец, авторы применили метод рентгеновской дифракции (с размерами пучка порядка нм) для исследования пространственной структуры миелина и показали, что данный подход позволяет получать информацию о периодичности миелина, количестве и ориентации его отдельных слоев [15].

Детальное исследование микроорганизации различных областей миелина было выполнено 1поиуе и соавт. с применением сканирующей рентгеновской дифракционной микроскопией (СРДМ) [22]. В интернодальной области ламел-лы миелина обладали характерным периодом порядка 200 А. Полученные ди-фрактограммы с интернодальной области были разделены на 3 класса, каждый из которых обрабатывался независимо. Результаты анализа двух классов дифрактограмм находились в согласии с классическим представлением о концентрически симметричной организации миелина вокруг аксона. Последний тип дифрактограмм , однако, свидетельствовал о наличие микрогетерогенностей в структуре миелина, которые могли бы привести к нетипичным углам рассеяния [22]. Одной из причин этого могут являться различия в ориентации ламелл относительно друг друга на определенном участке нервного волокна. Авторы предположили, что данный эффект может быть связан с деформацией части миелиновых ламелл при близком контакте с НШЛ.

Период структуры миелина (расстояние между двумя ближайшими ла-меллами) измеренный для паранодальной области был выше по сравнению с интернодальной и находился в диапазоне от 205 до 208 А. Дифрактограммы, полученные для паранодальной области указывают на наличие ламелл миелина, ориентированных приблизительно перпендикулярно оси волокна, что соответствует изгибу слоев миелина в направлении аксона, за счет которого и формируется граница ПР. Для паранодальной области была также показана более высокая степень общей разупорядоченности ламелл относительно друг друга [22]. Суммарная интенсивность рассеяния была также ниже для парано-дальной области, что указывает на меньшее количество ламелл.

Важным результатом исследований 1поиуе и соавт. состоии в том, что они продемонстрировали наличие отклонений в углах рассеяния на дифрактограм-мах интернодальных областей миелина, свидетельствующих о том, что направление упаковки ламелл миелина не является точно радиальным, что предпо-

лагается из классических представлений о структуре миелина [22]. Наиболее известными структурами, приводящими к локальной дезорганизации миелина являются насечки Шмидта-Лантермана (НШЛ), в связи с чем естественным может считаться предположение о том, что именно их присутствие искажает концентрическую упаковку ламелл миелина. Однако, как отмечали 1поиуе и соавт. подобные дифрактограммы отличаются о таковых, записанных с участка нервного волокна, содержащего НШЛ. Данные электронной микроскопии указывают на то, что НШЛ приводят к нерегулярному расширению ципоплаз-мы между слоями миелина, в то время как данные полученные с помощью РД свидетельствуют, что деформации миелина имеют более сложную природу и, вероятно, не может быть объяснена наличием НШЛ [22]. С помощью метода РД было также показано, что основные белки миелина неоднородно распределены в пределах интернодальной области, в результате чего можно обнаружить участки миелина с высоким содержанием белков, формирование которых не может быть объяснено на базе представления о свободной диффузии белков и липидов в мембранах миелина. Согласно 1поиуе и соавт. возникновение таких богатых белками участков может быть связано с образованием липидных или белковых рафтов [23, 24]. В заключение отметим, что ряд современных исследований миелина указывают на высокую степень гетерогенности миелина в интернодальной области. Подобные результаты имеют большое значение для более детального исследования структуры миелинизированных нервных волокон и их функционирования.

1.2 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния.

Спектроскопия КР представляет собой распространенный метод исследования самых разнообразных объектов от неорганических материалов до живых клеток [25]. Данный метод позволяет исследовать колебательные энергетические спектры молекул, и благодаря тому, что они напрямую связаны с типом химических связей, становится возможным производить анализ химической структуры объекта. В последующих главах мы кратко рассмотрим под-

ходы к теоретическому описанию явления КР, которые нам будет необходимы при последующей интерпретации экспериментальных данных.

1.2.1 Основы метода I. Классическая теория.

Явление комбинационного рассеяния (КР) состоит в изменении длины волны света при его рассеянии на веществе. Существует несколько моделей позволяющих описать явление КР, и оценить, чем определяется интенсивность полос КР в спектре. Начнем рассмотрение с классической модели Рэлеевского рассеяния. Наиболее простую модель можно получить, рассматривая колеблющийся диполь Герца (модель излучающего диполя в вакууме). Известно, что полная интенсивность, излучаемая во всех направлениях электрическим диполем, представляется уравнением [26]:

2 4 2

р = (1.1)

0с3 1 ;

где ш—частота излучения, ж0—смещение заряда от положения равновесия, д—заряд. Допустим, что свет (напряженность электрического поля волны Е0) рассеивается колеблющимся электроном атома (массой т), смещение которого (ж0) выразим из уравнения движения для гармонического осциллятора [26]:

ЯеЕ0 (л 0\

жо = -^ (1.2)

т(ш02 — ш2)

Подставим это смещение в ур. 1.1, в результате получим:

р =( ^ )( ш4Ео2 ) (13)

412^ еос3те2)\(и2 — шо2)2/ 1 ;

При выводе данной формулы не учитывались затухание для электронного колебания и наличие многих собственных частот у атома. Как следует из ур. 1.3, полная интенсивность рассеяного света пропорциональна 4-ой степени его частоты и квадрату падающего на атом электрического поля. Аналогичная зависимость будет характерна и для процесса комбинационного рассеяния. Приведем краткое феноменологическое описание явления КР. Представим ур. 1.1 в следующем виде (интегрирование по всем направлениям не производилось):

дР

4 12

^4|РГ

вт О

(1.4)

дП 12^бос3

где О = О(#,0)—пространственный угол, с которого собирается сигнал, |р|2 — квадрат модуля дипольного момента. Световая волна, взаимодействующая с молекулой, поляризует ее и приводит в движение электроны. В результате молекула становится новым источником излучения той же частоты, что и исходная световая волна (Рэлеевское рассеяние). В случае КР происходит взаимодействие световой волны с колебанием молекулы, что приводит к излучению на других частотах. Для малых интенсивностей возбуждающего света, можно считать, что индуцируемый дипольный момент пропорционален электрической компоненте поля:

р = а(иь,и„ )Е

(1.5)

— частота падающего, — рассеяного света. Коэффициент пропорциональности а — поляризуемость молекулы.

Важно отметить, что при выводе данной формулы мы не учитывали ряд важных факторов. Во-первых, в общем случае вещество, рассеивающее свет, анизотропно, т.е. вектор индуцированного дипольного момента может быть не сонаправлен с вектором электрического поля световой волны. В таком случае а является тензором второго ранга (представляется матрицей 3 х 3).

{ Рх\

Ру

\р* )

(

ап «12 «13

\

/ Ех\

Еу

(1.6)

«21 «22 «23 V «31 «32 «33 )

В дальнейшем будет рассмотрена упрощенная изотропная модель, где поляризуемость постоянна.

Во-вторых, для конденсированных сред важно различать локальное поле, действующее на отдельные молекулы вещества, и среднее поле (макроскопическое) соответствующее электрическому полю световой волны. Эти поля различаются из-за возникновения поляризационных зарядов в веществе, чье поле также влияет на соседние молекулы. Существует несколько моделей пересчета макроскопического поля в локальное. Введем коэффициент пересчета, описан-

ный в [26]:

р = Ьм )Ё

1 пм 2 + 2

ЬМ1

где им — показатель преломления вещества. Если поместить излучающий диполь из вакуума в среду с показателем преломления им, то согласно [26] интенсивность излучения диполя можно представить в виде:

дР ш пму/Ьм|р|

2

до теосз ^ (Ь7)

Из этого уравнения видно, что интенсивность рассеяния для молекул будет выше в растворе, чем в воздухе.

В третьих, необходимо найти способ количественного описания собственных колебаний молекулы в рамках данной теории. В этом описании мы также будем следовать подходу, описанному в [26]. Представим, что излучение будет взаимодействовать только с определенным колебанием молекулы нормальной модой к с координатой ^. Нормальным колебанием можно назвать молекулярное движение, при котором колебания атомов (функциональных групп) в составе молекулы происходят с одинаковой частотой. Нормальные координаты связаны с естественными (длины конкретных связей, величины углов) линейным преобразованием. Причем коэффициенты при различных естественных координатах отражают долю участия данной связи (или угла) в нормальном колебании. Иногда один из коэффициентов может быть велик по отношению к остальным. В этом случае можно допустить, что нормальное колебание обусловлено колебанием определенной связи (или валентного угла) молекулы. В противном случае говорят, что колебания различных частей молекулы смешиваются в данном нормальном колебании.

Рассмотрим теперь, как учитывая собственные колебания молекулы, можно получить простейшее описание явления КР. Пусть на молекулу падает световая волна частоты ш^. Поляризуемость молекулы в равновесии — а^. Если полагать, что молекулярное колебание вносит малое возмущение в электронную структуру молекулы и в ее поляризуемость, можно считать ^ (координата нормальной моды) малым параметром в разложении аь в степенной ряд:

ЫЯк ) = аь(0) + () <2к + 2 (^) ЯI + ... (1.8)

\dQkJQk=о 2 4 Подобное выражение может быть записано для каждой из девяти компонент тензора поляризуемости. По аналогии с последним вводится тензор

Як(шь), состоящий из компонент (Т^г) . Оставляя линейные члены, мы

\°Чк/(Зк=о

можем получить следующее выражение для каждой из компонент матрицы поляризуемости:

аг3(Як) = ац(0) + Щ (иь)Як (1.9)

Пусть электрическое поле световой волны меняется гармонически: Е = Е0е-г. Тогда выражение для индуцируемого дипольного момента может быть представлено следующим образом:

р(*) = Яе[аь(иь,Як )Е(иь)е-г^ ] =

= Яе[аь(шь,0)Е(шь)е-ш^ ] + Як (г)Яе[Як (шь)Е(шь)е-ш^ ] =

= Яе[аь(шь,0)Е(шь)е-г^ ] +

^ ЩЯк (иь)Е(иь)е-г(^ ^+гф] + | Яе[Як (иь)Е(иь)е-г^+^-гф]

4-V-' 4-V-'

Антистоксова компонента Стоксова компонента

где Ф — произвольная фаза, возникающая в результате запаздывания ра-мановского излучения по сравнению с возбуждающей волной. Из последних двух выражений, а также из 1.5, следует, что

ак (шь) = ^ Як (иъ)

Необходимым условием для проявлении полосы КР в спектре является ненулевое значение производной поляризуемости молекулы по координате нормальной моды (также называемая приведенной поляризуемостью) ( ^тг) =

\°чЧ ок=о

0.

При этом связи с малой поляризуемостью, но с большим значением приведенной поляризуемости, будут легко различимы в спектре КР. Это относится, например, к углерод-углерод связям в составе большинства органических

соединений. В дополнении к этому, спектры КР значительно меньше (по сравнению с ИК спектроскопией) подвержены влиянию вкладу воды в спектр. Это

обусловлено тем, что, несмотря на высокое значение поляризуемости, величина,;,-

на

яп I мала для связей в молекуле воды, что значительно уменьшает Як =о

вклад воды в спектр КР. Другим преимуществом КР спектроскопии является то, что интенсивность сигнала линейно пропорциональна количеству связей в молекуле, в то время как для ИК спектроскопии поглощение является экспоненциальной функцией в соответствии с законом Ламберта-Бера.

Важно отметить, что некоторые важные особенности КР не могут быть объяснены в рамках классической теории. Например, интенсивность Стоксовой компоненты обычно превышает соответствующую ей анти-Стоксовую компоненту. Данный факт может показаться противоречащим известному из электромагнитной теории правилу о том, что интенсивность рассеяния света пропорциональна четвертой степени волнового числа (или обратно пропорциональна четвертой степени длины волны) [26]. Данное противоречие объясняется в рамках квантово-механического подхода.

♦

з,

I

Энергия колебательного уровня

4

Возбужденные подуровни

I

у = 3 у = 2 I V — 1 у = 0

Энергия электронного уровня

I

8п

Релеевское Стоксова анти-Стоксова

рассеяние компонента компонента

КР КР

Рисунок 1.2 — Диаграмма энергетических уровней молекулы со схематическими обозначениями различных процессов рассеяния света. Символы 50 и 5*1 обозначают невозбужденный и первый возбужденный

колебательные подуровни.

Согласно основным представлениям квантовой механики молекулы могут занимать дискретные колебательные энергетические уровни [25, 27] как показано на рис. 1.2. Энергия колебательного уровня (ею) для гармонического осциллятора может быть получена из решения уравнения Шредингера:

£v = ^ + 0 vm

где -и—колебательное квантовое число. В КР спектроскопии разрешенными являются переходы с Av = 1,2.... Что касается вероятности перехода, то наиболее вероятным является переход с Av = 1, что связано с тем, что энергия молекулы при этом изменяется меньше всего.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кутузов, Николай Павлович, 2016 год

Список литературы

[1] Study of the viscosity of excited membranes using combined dispersion spectroscopy / G. V. Maksimov, C. N. Radenovich, I. E. Borisova, M. K. Eremich // Biofizika. — 1996. — Vol. 41, no. 2. — Pp. 400-406.

[2] Larsson Kare. Conformation-dependent features in the raman spectra of simple lipids // Chemistry and Physics of Lipids. — 1973. — Vol. 10, no. 2.

— Pp.165 - 176. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ 0009308473900133.

[3] Szalontai B., Bagyinka Cs., Horvath L.I. Changes in the raman spectrum of frog sciatic nerve during action potential propagation // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1977. — Vol. 76, no. 3.

— Pp.660 - 665. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ 0006291X77915510.

[4] Excitation profile of nerve carotenoids in stimulation and block / G. V. Maksimov, T. A. Chokharadze, A. A. Churin, V. Z. Pashchenko // Biofizika. — 1995. — Vol. 40, no. 1. — Pp. 122-125.

[5] Gruszecki W. I., Sielewiesiuk J. Orientation of xanthophylls in phosphatidylcholine multibilayers // BBA - Biomembranes. — 1990. — Vol. 1023, no. 3.

— Pp. 405-412.

[6] ATP-induced lipid membrane reordering in the myelinated nerve fiber identified using Raman spectroscopy / N.P. Kutuzov, A.R. Brazhe, A.I. Yusipovich et al. // Laser Phys. Lett. — 2013. — Vol. 10, no. 7. — P. 075606.

[7] Orientational Ordering of Carotenoids in Myelin Membranes Resolved by Polarized Raman Microspectroscopy / Nikolay P. Kutuzov, Alexey R. Brazhe, Georgy V. Maksimov et al. // Biophysical Journal. — 2014. — Vol. 107, no. 4.

— Pp.891 - 900. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S0006349514007140.

[8] Laser beam coupling into nerve fiber myelin allows one to assess its structural membrane properties / Nikolay P. Kutuzov, Alexey R. Brazhe,

Vladimir L. Lyaskovskiy, Georgy V. Maksimov // Journal of Biomedical Optics. — 2015. — Vol. 20, no. 5. — P. 050501. http://dx.doi.org/10.1117/ 1.JBO.20.5.050501.

[9] ATP-Mediated Compositional Change in Peripheral Myelin Membranes: A Comparative Raman Spectroscopy and Time-Of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry Study / Nikolay Kutuzov, Alexander Gulin, Vladimir Lyaskovskiy et al. // PLoS ONE. — 2015. — 11. — Vol. 10, no. 11.

— P. e0142084.

[10] Исследование ориентации молекул в мембранах живых клеток посредством Рамановской микроспектроскопии / Н Кутузов, Г Максимов, В Ляс-ковский, Ф Булыгин // Метрология в Нанотехнологиях-2014. — 2014.

[11] Role of Schwann cell in regulation of myelin sheath properties during nerve fiber excitation and activation of purinergic receptors / E Verdiyan, E Bib-ineyshvili, N Kutuzov, G Maksimov // GLIA Bilbao 2015: Abstracts Oral Presentations, Posters, Indexes. — 2015. — Vol. 63. — Pp. E76-E469. http://dx.doi.org/10.1002/glia.22870.

[12] Trapp Bruce D., Kidd Grahame J. Chapter 1 - Structure of the Myelinated Axon // Myelin Biology and Disorders / Ed. by Robert A. Lazzarini, John W. Griffin, Hans Lassman et al. — San Diego: Academic Press, 2004.

— Pp. 3 - 27. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ B9780124395107500541.

[13] Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular, and Medical Aspects. 7th ed. // American Journal of Neuroradiology. — 2006. — Vol. 27, no. 2. — Pp. 465-466. http://www.ajnr.org/content/27Z2/465.short.

[14] Kirschner D. A., Hollingshead C. J. Processing for electron microscopy alters membrane structure and packing in myelin // Journal of Ultrastructure Research. — 1980. — Vol. 73, no. 2. — Pp. 211-232. http://dx.doi.org/10. 1016/s0022-5320(80)90125-2.

[15] Structure and composition of myelinated axons: A multimodal synchrotron spectro-microscopy study / Tanja Ducic, Susanne Quintes, Klaus-Armin Nave et al. // Journal of Structural Biology. — 2011. — Vol. 173, no. 2. —

Pp. 202 - 212. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S1047847710002960.

[16] Baumann Nicole, Pham-Dinh Danielle. Biology of Oligodendrocyte and Myelin in the Mammalian Central Nervous System // Physiological Reviews.

— 2001. — Vol. 81, no. 2. — Pp. 871-927.

[17] Chance PF. Molecular basis of hereditary neuropathies // Physical medicine and rehabilitation clinics of North America. — 2001. — May. — Vol. 12, no. 2.

— P. 277—291. http://europepmc.org/abstract/MED/11345007.

[18] Suter Ueli, Nave Klaus-Armin. Transgenic Mouse Models of CMT1A and HNPP // Annals of the New York Academy of Sciences. — 1999. — Vol. 883, no. 1. — Pp. 247-253. http://dx.doi.Org/10.1111/j.1749-6632.1999. tb08586.x.

[19] Inoue Shinya. A method for measuring small retardations of structures in living cells // Experimental Cell Research. — 1951. — Vol. 2, no. 3. — Pp. 513 - 517. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ 0014482751900377.

[20] Schmitt Francis O., Bear Richard S., Palmer Kenneth J. X-ray diffraction studies on the structure of the nerve myelin sheath // Journal of Cellular and Comparative Physiology. — 1941. — Vol. 18, no. 1. — Pp. 31-42. http: //dx.doi.org/10.1002/jcp.1030180105.

[21] Fernandez-Moran H, Finean JB. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath // The Journal of biophysical and biochemical cytology. — 1957. — September. — Vol. 3, no. 5. — P. 725—748. http://europepmc.org/articles/PMC2224112.

[22] Myelin Organization in the Nodal, Paranodal, and Juxtaparanodal Regions Revealed by Scanning X-Ray Microdiffraction / Hideyo Inouye, Jiliang Liu, Lee Makowski et al. // PLoS ONE. — 2014. — 07. — Vol. 9, no. 7. — P. e100592. http://dx.doi.org/10.13712Fjournal.pone.0100592.

[23] van Meer G, Simons K. Viruses budding from either the apical or the baso-lateral plasma membrane domain of MDCK cells have unique phospholipid

compositions // The EMBO journal. — 1982. — Vol. 1, no. 7. — P. 847—852. http://europepmc.org/articles/PMC553120.

[24] Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton / Bjorn F. Lillemeier, Janet R. Pfeiffer, Zurab Surviladze et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2006. — Vol. 103, no. 50. — Pp. 18992-18997. http://www.pnas.org/content/103/50/ 18992.abstract.

[25] Laserna J. J. (Javier J.). Modern techniques in Raman spectroscopy. — Chichester ; New York : Wiley, 1996. — Includes bibliographical references and index.

[26] Vandenabeele Peter. Theoretical Aspects // Practical Raman Spectroscopy - An Introduction. — John Wiley & Sons, Ltd, 2013. — Pp. 1-38. http: //dx.doi.org/10.1002/9781119961284.ch1.

[27] Banwell C. N. Fundamentals of molecular spectroscopy. — 2nd ed. edition. — McGraw-Hill London, New York, 1972. — Pp. xii, 348 p.

[28] Rimai L., Heyde M. E., Gill D. Vibrational spectra of some carotenoids and related linear polyenes. Raman spectroscopic study // Journal of the American Chemical Society. — 1973. — Vol. 95, no. 14. — Pp. 4493-4501. — PMID: 4782645. http://dx.doi.org/10.1021/ja00795a005.

[29] Snyder R.G., Hsu S.L., Krimm S. Vibrational spectra in the C-H stretching region and the structure of the polymethylene chain // Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy. — 1978. — Vol. 34, no. 4. — Pp. 395 - 406. http: //www.sciencedirect.com/science/article/pii/0584853978801676.

[30] Snyder R. G., Scherer J. R. Band structure in the C-H stretching region of the Raman spectrum of the extended polymethylene chain: Influence of Fermi resonance // The Journal of Chemical Physics. — 1979. — Vol. 71, no. 8. — Pp. 3221-3228. http://scitation.aip.org/content/aip/ journal/jcp/71/8/10.1063/1.438751.

[31] Bulkin B. J., Krishnan K. Vibrational spectra of liquid crystals. III. Raman spectra of crystal, cholesteric, and isotropic cholesterol esters, 2800-3100-cm-

Iregion // Journal of the American Chemical Society. — 1971. — Vol. 93, no. 23. — Pp. 5998-6004. http://dx.doi.org/10.1021/ja00752a008.

[32] Brown Kenneth G., Peticolos Warner L., Brown Ellen. Raman studies of conformational changes in model membrane systems // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1973. — Vol. 54, no. 1. — Pp. 358 - 364. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ 0006291X73909303.

[33] Hinz Hans-Jurgen, Sturtevant Julian M. Calorimetric Studies of Dilute Aqueous Suspensions of Bilayers Formed from Synthetic l-Lecithins // Journal of Biological Chemistry. — 1972. — Vol. 247, no. 19. — Pp. 6071-6075. http://www.jbc.org/content/247/19/6071.abstract.

[34] Gaber Bruce P., Peticolas Warner L. On the quantitative interpretation of biomembrane structure by Raman spectroscopy // Biochimica et Bio-physica Acta (BBA) - Biomembranes. — 1977. — Vol. 465, no. 2. — Pp. 260 - 274. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ 0005273677900785.

[35] Snyder R. G., Strauss H. L., Elliger C. A. Carbon-hydrogen stretching modes and the structure of n-alkyl chains. 1. Long, disordered chains // The Journal of Physical Chemistry. — 1982. — Vol. 86, no. 26. — Pp. 5145-5150. http: //pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100223a018.

[36] Cho Yonghae, Kobayashi Masamichi, Tadokoro Hiroyuki. Raman band profiles and mobility of polymethylene chains // The Journal of Chemical Physics. — 1986. — Vol. 84, no. 8. — Pp. 4636-4642. http://scitation.aip.org/ content/aip/journal/jcp/84/8/10.1063/1.449989.

[37] Okabayashi Hirofumi, Kitagawa Teizo. Assignments of the CH stretching Raman lines of hydrocarbon chains. Raman spectra of normal Cn-1H2n-1COOK (n = 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18) and their specifically deuterated derivatives // The Journal of Physical Chemistry. — 1978. — Vol. 82, no. 16. — Pp. 1830-1836. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100505a010.

[38] Vibrational Polarization Spectroscopy of CH Stretching Modes of the Methylene Group at the Vapor/Liquid Interfaces with Sum Frequency Genera-

tion / Rong Lu, Wei Gan, Bao-hua Wu et al. // The Journal of Physical Chemistry B. — 2004. — Vol. 108, no. 22. — Pp. 7297-7306. http: //pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp036674o.

[39] C-H Stretching Vibrations of Methyl, Methylene and Methine Groups at the Vapor/Alcohol (n = 1-8) Interfaces / Rong Lu, Wei Gan, Bao-hua Wu et al. // The Journal of Physical Chemistry B. — 2005. — Vol. 109, no. 29. — Pp. 14118-14129. — PMID: 16852773. http://pubs.acs.org/doi/abs/10. 1021/jp051565q.

[40] Merlin J.C. Resonance Raman spectroscopy of carotenoids and carotenoid-containing systems // Pure & Appl. Chem. — 1985. — Vol. 57. — Pp. 785-792.

[41] Castiglioni C, Tommasini M, Zerbi G. Raman spectroscopy of polyconjugated molecules and materials: confinement effect in one or two dimensions // The Royal Society. — 2004. — Pp. 2425-2459.

[42] Pézolet M., Georgescauld D. Raman spectroscopy of nerve fibers. A study of membrane lipids under steady state conditions // Biophys. J. — 1985. — Vol. 47. — Pp. 367-372. http://www.cell.com/biophysj/abstract/ S0006-3495(85)83927-8.

[43] Different ways to insert carotenoids into liposomes affect structure and dynamics of the bilayer differently / Carmen Socaciu, Piotr Bojarski, Lisa Aberle, Horst A. Diehl // Biophysical Chemistry. — 2002. — Vol. 99. — Pp. 1 - 15.

[44] Wisniewska A., Widomska J., WK Subczynski. Carotenoid-membrane interactions in liposomes: effect of dipolar, monopolar, and nonpolar carotenoids // Acta Biochim Pol. — 2006. — Vol. 53. — Pp. 75-84.

[45] Study of the orientational ordering of carotenoids in lipid bilayers by resonance-Raman spectroscopy. / M. van de Ven, M. Kattenberg, G. van Ginkel, Y. K. Levine // Biophysical journal. — 1984. — Vol. 45, no. 6. — Pp. 1203-1209.

[46] Fox D. L. // Animal Biochromes and Structural Colours. — 1976.

[47] Vershinin A. Carotenoids in mollusca: Approaching the functions // Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology.

— 1996. — Vol. 113, no. 1. — Pp. 63-71.

[48] Effects of polar carotenoids on dimyristoylphosphatidylcholine membranes: a spin-label study / W. K. Subczynski, E. Markowska, W. I. Gruszecki, J. Sielewiesiuk // BBA - Biomembranes. — 1992. — Vol. 1105, no. 1. — Pp. 97-108.

[49] Carotenoid-related alteration of cell membrane fluidity impacts Staphylococcus aureus susceptibility to host defense peptides / N. N. Mishra, G. Y. Liu, M. R. Yeaman at al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — 2011. — Vol. 55, no. 2. — Pp. 526-531.

[50] Socaciu C, Jessel R., Diehl H. A. Competitive carotenoid and cholesterol incorporation into liposomes: Effects on membrane phase transition, fluidity, polarity and anisotropy // Chemistry and physics of lipids. — 2000. — Vol. 106, no. 1. — Pp. 79-88.

[51] The resonance Raman spectrum of carotenoids as an intrinsic probe for membrane potential Oscillatory changes in the spectrum of neurosporene in the chromatophores of Rhodopseudomonas sphaeroides / Y. Koyama, R. A. Long, W. G. Martin, P. R. Carey // BBA - Bioenergetics. — 1979. — Vol. 548, no. 1.

— Pp. 153-160.

[52] Raman spectroscopy of the 'potential sensor' of potential-dependent channels / G. V. Maksimov, A. A. Churin, V. Z. Paschenko, A. B. Rubin // General physiology and biophysics. — 1990. — Vol. 9, no. 4. — Pp. 353-360.

[53] Tanaka M., Young R. J. Review Polarised Raman spectroscopy for the study of molecular orientation distributions in polymers // Journal of Materials Science. — 2006. — Vol. 41, no. 3. — Pp. 963-991.

[54] Post Benjamin. X-ray diffraction methods in polymer science, Leroy E. Alexander, wiley-interscience, new york, 1970. xv + 582 pp. // Journal of Polymer Science Part B: Polymer Letters. — 1971. — Vol. 9, no. 8. — Pp. 635636. http://dx.doi.org/10.1002/pol.1971.110090816.

[55] de Vries Hendrik. A new approach to the continuum theory of birefringence of oriented polymers // Colloid and Polymer Science. — 1979. — Vol. 257, no. 3.— Pp. 226-238. http://dx.doi.org/10.1007/BF01382363.

[56] Molecular orientation in stretched poly(vinyl alcohol). I. NMR anisotropy and birefringence / P. Spegt, B. Meurer, C. Hornick, G. Weill // Journal of Polymer Science: Polymer Physics Edition. — 1985. — Vol. 23, no. 2. — Pp. 315325. http://dx.doi.org/10.1002/pol.1985.180230207.

[57] Orientation of Amorphous Chains in Polyamide-6 Fibers through 2H-NMR / M. Botev, P. Judeinstein, R. Neffati et al. // Macromolecules. — 1996. — Vol. 29, no. 26. — Pp. 8538-8540. http://dx.doi.org/10.1021/ma960436s.

[58] Robinson M. E. R, Bower D. I., Maddams W. F. Molecular orientation in poly(vinyl chloride) studied by Raman spectroscopy and birefringence measurements // Journal of Polymer Science: Polymer Physics Edition. — 1978.

— Vol. 16, no. 12. — Pp. 2115-2138. http://dx.doi.org/10.1002/pol. 1978.180161203.

[59] A study of the orientations of fluorescent molecules incorporated in uniax-ially oriented poly(ethylene terephthalate) tapes / J.H. Nobbs, D.I. Bower, I.M. Ward, D. Patterson // Polymer. — 1974. — Vol. 15, no. 5. — Pp. 287 - 300.

— The Polymer Physics Group Conference. http://www.sciencedirect. com/science/article/pii/0032386174901268.

[60] Nobbs J. H., Bower D. I., Ward I. M. Comparison of polarized fluorescence with polarized raman and infrared dichroism measures of orientation in uni-axially drawn poly(ethylene terephthalate) // Journal of Polymer Science: Polymer Physics Edition. — 1979. — Vol. 17, no. 2. — Pp. 259-272. http://dx.doi.org/10.1002/pol.1979.180170206.

[61] Bower D. I., Jarvis D. A., Ward I. M. Molecular orientation in biaxially oriented sheets of poly(ethylene terephthalate). I. Characterization of orientation and comparison with models // Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. — 1986. — Vol. 24, no. 7. — Pp. 1459-1479. http: //dx.doi.org/10.1002/polb.1986.090240706.

[62] Bower D. I. INVESTIGATION OF MOLECULAR ORIENTATION DISTRIBUTIONS BY POLARIZED RAMAN SCATTERING AND POLARIZED FLUORESCENCE. // J Polym Sot Part A-2 Polym Phys. — 1972. — Vol. 10, no. 11. — Pp. 2135-2153.

[63] NOMURA S, KAWAI H. General description of orientation factors in terms of expansion of orientation distribution function in a series of spherical harmonics // J Polym Soi Part A-2 Polym Phys. — 1970. — Vol. 8, no. 3. — Pp. 383-400.

[64] Everall N., Chalmers J., Mills P. Use of polarized resonance Raman spectroscopy of a polyene probe, and FT-IR dichroism, to probe amorphous-phase orientation in uniaxially drawn poly(ethylene) // Applied Spectroscopy. — 1996. — Vol. 50, no. 10. — Pp. 1229-1234.

[65] Lagugne Labarthet F., Buffeteau T., Sourisseau C. Orientation distribution functions in uniaxial systems centered perpendicularly to a constraint direction // Applied Spectroscopy. — 2000. — Vol. 54, no. 5. — Pp. 699-705.

[66] Polarised Raman imaging of living cells for chemical contrast manipulation / L. . Chiu, A. F. Palonpon, K. Hamada at al. // Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE. — Vol. 8587. — 2013.

[67] Agarwal U. P., Atalla R. H. In-situ Raman microprobe studies of plant cell walls: Macromolecular organization and compositional variability in the secondary wall of Picea mariana (Mill.) B.S.P. // Planta. — 1986. — Vol. 169, no. 3. — Pp. 325-332.

[68] Orientation of carotenoid molecules in the eyespot of alga: In situ polarized resonance Raman spectroscopy / Y. Kubo, T. Ikeda, S. . Yang, M. Tsuboi // Applied Spectroscopy. — 2000. — Vol. 54, no. 8. — Pp. 1114-1119.

[69] Study of protein conformation and orientation in silkworm and spider silk fibers using Raman microspectroscopy / M.. Rousseau, T. Lefevre, L. Beaulieu at al. // Biomacromolecules. — 2004. — Vol. 5, no. 6. — Pp. 2247-2257.

[70] Lefevre T, Rousseau M. ., Pezolet M. Protein secondary structure and orientation in silk as revealed by Raman spectromicroscopy // Biophysical journal.

— 2007. — Vol. 92, no. 8. — Pp. 2885-2895.

[71] Real-Time Sensing of Cell Morphology by Infrared Waveguide Spectroscopy / Victor Yashunsky, Tal Marciano, Vladislav Lirtsman et al. // PLoS ONE. — 2012. — 10. — Vol. 7, no. 10. — P. e48454. http://dx.doi.org/10.1371/ Fjournal.pone.0048454.

[72] Müller cells are living optical fibers in the vertebrate retina / Kristian Franze, Jens Grosche, Serguei N. Skatchkov et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 2007. — Vol. 104, no. 20. — Pp. 8287-8292.

[73] Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues / H. Wang, Y. Fu, P. Zickmund at al. // Biophysical journal. — 2005.

— Vol. 89, no. 1. — Pp. 581-591.

[74] In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy / M. J. Farrar, F. W. Wise, J. R. Fetcho,

C. B. Schaffer // Biophysical journal. — 2011. — Vol. 100, no. 5. — Pp. 13621371.

[75] Vollmer F., Stephen A. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. // Nat. Met. — 2008. — Vol. 5. — Pp. 591-596. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.1221.

[76] Protein detection by optical shift of a resonant microcavity / F. Vollmer,

D. Braun, A. Libchaber et al. // Applied Physics Letters. — 2002. — Vol. 80, no. 21. — Pp. 4057-4059. http://scitation.aip.org/content/ aip/journal/apl/80/21/10.1063/1.1482797.

[77] Label-Free, Single-Molecule Detection with Optical Microcavities / Andrea M. Armani, Rajan P. Kulkarni, Scott E. Fraser et al. // Science. — 2007. — Vol. 317, no. 5839. — Pp. 783-787. http://www.sciencemag.org/ content/317/5839/783.abstract.

[78] Purinergic signalling in the nervous system: an overview / M. Abbracchio, G. Burnstock, A. Verkhratsky, H. Zimmermann // Trends in Neurosciences.

— 2008. — Vol. 32. — Pp. 19-29.

[79] Burnstock Geoffrey. Purinergic signalling // British Journal of Pharmacology.

— 2006. — Vol. 147, no. 1. — Pp. 172-181. http://dx.doi.org/10.1038/ sj.bjp.0706429.

[80] Confocal calcium imaging reveals an ionotropic P2 nucleotide receptor in the paranodal membrane of rat Schwann cells / P. Grafe, C. Mayer, T. Takigawa at al. // Journal of Physiology. — 1999. — Vol. 515, no. 2. — Pp. 377-383.

[81] Grafe P., Schaffer V., Rucker F. Kinetics of ATP release following compression injury of a peripheral nerve trunk // Purinergic Signalling. — 2006. — Vol. 2, no. 3. — Pp. 527-536. http://dx.doi.org/10.1007/ s11302-006-9018-y.

[82] ATP affects both axons and Schwann cells of unmyelinated C fibres / D. Irnich, R. Burgstahler, H. Bostock, P. Grafe // Pain. — 2001. — Vol. 92, no. 3. — Pp. 343-350.

[83] Irnich D., Burgstahler R., Grafe P. P2 Nucleotide receptors in peripheral nerve trunk // Drug development research. — 2001. — Vol. 52. — Pp. 83-88.

[84] ATP stimulates peripheral axons in human, rat and mouse - defferential involv-ment of A2B adenosine and P2X purinergic receptors / D. Irnich, D. Tracey, J. Polten et al. // Neuroscience. — 2002. — Vol. 110. — Pp. 123-129.

[85] Distinct ATP receptors on pain-sensing and stretch-sensing neurons / S. Cook, L. Vulchanova, K. Hargreaves et al. // Nature. — 1997. — Vol. 387. — Pp. 505508.

[86] ATP Induces Long-Term Potentiation of C-Fiber-Evoked Field Potentials in Spinal Dorsal Horn: The Roles of P2X4 Receptors and p38 MAPK in Microglia / Qing-Juan Gong, Yu-Ying Li, Wen-Jun Xin et al. // GLIA. — 2009.

— Vol. 57. — Pp. 583-591.

[87] Burnstock G. Purine-mediated signalling in pain and visceral perception // Trends in Pharmacological Sciences. — 2001. — Vol. 22. — Pp. 182-188.

[88] Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain / Eugene V. Grishin, Ganna A. Savchenko, Alexander A. Vassilevski et al. // Annals of Neurology. — 2010. — Vol. 67. — Pp. 680-683.

[89] Purinergic signaling induces cyclooxygenase-1-dependent prostanoid synthesis in microglia: Roles in the outcome of excitotoxic brain injury / J. Anrather, E. F. Gallo, T. Kawano at al. // PLoS ONE. — 2011. — Vol. 6, no. 10.

[90] Goswami S. K., Gould R. M. Prostanoid synthesis in peripheral nerve // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. — 1985.

— Vol. 834, no. 2. — Pp. 263-266.

[91] Myers DonaldBurton, Pollock Martin, Calder ChristopherStewart. The analysis of collagen in glutaraldehyde-fixed, osmicated peripheral nerve // Acta Neuropathologica. — 1977. — Vol. 37, no. 1. — Pp. 7-12. http: //dx.doi.org/10.1007/BF00684533.

[92] Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration / Rahul Kasukurthi, Michael J. Brenner, Amy M. Moore et al. // Journal of Neuroscience Methods. — 2009. — Vol. 184, no. 2.

— Pp.303 - 309. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S0165027009004658.

[93] Boxer Steven G., Kraft Mary L., Weber Peter K. Advances in Imaging Secondary Ion Mass Spectrometry for Biological Samples // Annual Review of Biophysics. — 2009. — Vol. 38, no. 1. — Pp. 53-74. — PMID: 19086820. http://dx.doi.org/10.1146/annurev.biophys.050708.133634.

[94] Rosenblatt Murray. Remarks on Some Nonparametric Estimates of a Density Function // Ann. Math. Statist. — 1956. — 09. — Vol. 27, no. 3. — Pp. 832837. http://dx.doi.org/10.1214/aoms/1177728190.

[95] Parzen Emanuel. On Estimation of a Probability Density Function and Mode // Ann. Math. Statist. — 1962. — 09. — Vol. 33, no. 3. — Pp. 1065-1076. http://dx.doi.org/10.1214/aoms/1177704472.

[96] An Introduction to the Bootstrap / B Efron, RJ Tibshirani, Monica Th Markus, Patrick JF Groenen // Psychometrika. — 1998. — Vol. 63, no. 1. — Pp. 97-102.

[97] Resonance Raman spectroscopy for the detection of carotenoids in foodstuffs. Influence of the nutrition on the antioxidative potential of the skin / M. E. Darvin, I. Gersonde, H. Albrecht at al. // Laser Physics Letters. — 2007. — Vol. 4, no. 6. — Pp. 452-456.

[98] In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy / Huawen Wu, Joanne V. Volponi, Ann E. Oliver et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2011. — Vol. 108, no. 9. — Pp. 3809-3814. http://www.pnas.org/content/108/9Z3809.abstract.

[99] An intelligent background-correction algorithm for highly fluorescent samples in Raman spectroscopy / Zhi-Min Zhang, Shan Chen, Yi-Zeng Liang et al. // Journal of Raman Spectroscopy. — 2010. — Vol. 41, no. 6. — Pp. 659-669. http://dx.doi.org/10.1002/jrs.2500.

[100] Sun Qiang. The Raman {OH} stretching bands of liquid water // Vibrational Spectroscopy. — 2009. — Vol. 51, no. 2. — Pp. 213 - 217. http://www. sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203109000472.

[101] Single myelin fiber imaging in living rodents without labeling by deep optical coherence microscopy / Juliette Ben Arous, Jonas Binding, Jean-Francois Leger et al. // Journal of Biomedical Optics. — 2011. — Vol. 16, no. 11.— Pp. 116012-116012-9. http://dx.doi.org/10.1117/1.3650770.

[102] Non-invasive study of nerve fibres using laser interference microscopy / A.R Brazhe, N.A Brazhe, N.N Rodionova et al. // Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. — 2008. — Vol. 366, no. 1880. — Pp. 3463-3481. http://rsta. royalsocietypublishing.org/content/366/1880/3463.abstract.

[103] Matsko A.B., Ilchenko V.S. Optical resonators with whispering-gallery modespart I: basics // Selected Topics in Quantum Electronics, IEEE Journal of. — 2006. — Jan. — Vol. 12, no. 1. — Pp. 3-14.

[104] Hall Susan M., Williams P. L. Studies on the Incisures of Schmidt and Lanter-man // Journal of Cell Science. — 1970. — Vol. 6, no. 3. — Pp. 767-791. http://jcs.biologists.org/content/6/3/767.abstract.

[105] Gould R. M, Byrd A. L., Barbarese E. The number of Schmidt-Lanterman incisures is more than doubled inshiverer PNS myelin sheaths // Journal of Neurocytology. — 1995. — Vol. 24, no. 2. — Pp. 85-98. http://dx.doi.org/ 10.1007/BF01181552.

[106] Love S. Demyelinating diseases // Journal of Clinical Pathology. — 2006. — Vol. 59, no. 11. — Pp. 1151-1159. http://jcp.bmj.com/content/59/11/ 1151.abstract.

[107] Packer Adam M, Roska Botond, H??usser Michael. Targeting neurons and photons for optogenetics // Nature Neuroscience. — 2013. — Vol. 16, no. 7.

— Pp. 805-815. http://dx.doi.org/10.1038/nn.3427.

[108] Dependence of apparent diffusion coefficients on axonal spacing, membrane permeability, and diffusion time in spinal cord white matter / J. Chetley Ford, David B. Hackney, Ehud Lavi et al. // Journal of Magnetic Resonance Imaging. — 1998. — Vol. 8, no. 4. — Pp. 775-782. http://dx.doi.org/10.1002/ jmri.1880080405.

[109] Turrell G. Analysis of polarization measurements in Raman microspec-troscopy // J.Raman Spectrosc. — 1984. — Vol. 15, no. 2.

[110] Everall N. J. Modeling and measuring the effect of refraction on the depth resolution of confocal Raman microscopy // Applied Spectroscopy. — 2000. — Vol. 54, no. 6. — Pp. 773-782.

[111] Friede R. L, Bardosi A., Wegener G. Effects of cold adaptation and starvation on sciatic nerve fibers in the frog // Experimental neurology. — 1985. — Vol. 90, no. 2. — Pp. 434-443.

[112] Role of lipid interactions in autoimmune demyelination / B. Ohler, K. Graf, R. Bragg at al. // Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease.

— 2004. — Vol. 1688, no. 1. — Pp. 10-17.

[113] Anisotropic properties of the myelin sheath / B. De Campos Vidal, M. L. Sil-veira Mello, A. C. Caseiro-Filho, C. Godo // Acta Histochemica. — 1980. — Vol. 66, no. 1. — Pp. 32-39.

[114] DE ROBERTIS E, THORNBURG W. Polarization and electron microscope study of frog nerve axoplasm. // The Journal of biophysical and biochemical cytology. — 1956. — Vol. 2, no. 4. — Pp. 475-482.

[115] Margulies L., Stockburger M. Polarized resonance Raman spectra of an oriented diphenylpolyene // J.Raman Spectrosc. — 1979. — Vol. 8.

[116] Lee C, Bain C. D. Raman spectra of planar supported lipid bilayers // Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. — 2005. — Vol. 1711, no. 1.

— Pp. 59-71.

[117] Smith M. E, Curtis B. M. Frog sciatic nerve myelin: A chemical characterization // Journal of neurochemistry. — 1979. — Vol. 33, no. 2. — Pp. 447-452.

[118] Op den Kamp J. A. Lipid asymmetry in membranes. // Annual Review of Biochemistry. — 1979. — Vol. 48. — Pp. 47-71.

[119] Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein / Y. Min, K. Kristiansen, J. M. Boggs at al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

— 2009. — Vol. 106, no. 9. — Pp. 3154-3159.

[120] Linear dichroism and the transition dipole moment orientation of the carotenoid in the LH2 antenna complex in membranes of Rhodopseudomonas acidophila strain 10050 / P. M. Dolan, D. Miller, R. J. Cogdell at al. // Journal of Physical Chemistry B. — 2001. — Vol. 105, no. 48. — Pp. 12134-12142.

[121] Birge R. R. Transition dipole orientation of linear polyenes: Semiempirical models and extrapolation to the infinite chain limit // Journal of Physical Chemistry A. — 1999. — Vol. 103, no. 14. — Pp. 2251-2255.

[122] Castelli F., Caruso S., Giuffrida N. Different effects of two structurally similar carotenoids, lutein and /3-carotene, on the thermotropic behaviour of phos-phatidylcholine liposomes. Calorimetric evidence of their hindered transport

through biomembranes // Thermochimica Acta. — 1999. — Vol. 327, no. 1-2.

— Pp. 125-131.

[123] Dr. Rodolfo Llinas Dr. Wolfgang Precht (auth.). Frog Neurobiology: A Handbook. — 1 edition. — Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1976. http://gen. lib.rus.ec/book/index.php?md5=fc804d066c226abb4479e8c6e52d6001.

[124] Imaging mass spectrometry for lipidomics / Naoko Goto-Inoue, Takahi-ro Hayasaka, Nobuhiro Zaima, Mitsutoshi Setou // Biochim. Biophys. Acta.

— 2011. — Vol. 1811, no. 11. — Pp. 961 - 969. http://www.sciencedirect. com/science/article/pii/S1388198111000345.

[125] Touboul David, Laprevote Olivier, Brunelle Alain. Micrometric molecular histology of lipids by mass spectrometry imaging // Current Opinion in Chemical Biology. — 2011. — Vol. 15, no. 5. — Pp. 725 - 732. http: //www.sciencedirect.com/science/article/pii/S136759311100069X.

[126] Non-targeted profiling of lipids during kainate-induced neuronal injury / Xue Li Guan, Xin He, Wei-Yi Ong et al. // The FASEB Journal. — 2006. — Vol. 20, no. 8. — Pp. 1152-1161. http://www.fasebj.org/content/20/8/ 1152.abstract.

[127] Visualization by mass spectrometry of 2-dimensional changes in rat brain lipids, including N-acylphosphatidylethanolamines, during neonatal brain ischemia / Christian Janfelt, Niels Wellner, Pierre-Louis Leger et al. // The FASEB Journal. — 2012. — Vol. 26, no. 6. — Pp. 2667-2673. http: //www.fasebj.org/content/26/6/2667.abstract.

[128] Secondary ion mass spectrometric signal enhancement of phosphatidylcholine dioleoyl on enlarged nanoparticles surface / A. Gulin, M. Mochalova, N. Denisov, V. Nadtochenko // Applied Surface Science. — 2014. — Vol. 316, no. 0. — Pp. 36 - 41. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0169433214016304.

[129] Lipid metabolism in myelinating glial cells: lessons from human inherited disorders and mouse models / Roman Chrast, Gesine Saher, Klaus-Armin Nave, Mark H. G. Verheijen // Journal of Lipid Research. — 2011. — Vol. 52, no. 3.

— Pp. 419-434. http://www.jlr.org/content/52/3/419.abstract.

[130] Zimmermann Herbert. Signalling via ATP in the nervous system // Trends in Neurosciences. — 1994. — Vol. 17, no. 10. — Pp. 420 - 426. http: //www.sciencedirect.com/science/article/pii/0166223694900167.

[131] Latini Serena, Pedata Felicita. Adenosine in the central nervous system: release mechanisms and extracellular concentrations // Journal of Neurochem-istry. — 2001. — Vol. 79, no. 3. — Pp. 463-484. http://dx.doi.org/10. 1046/j.1471-4159.2001.00607.x.

[132] Extracellular ATP does not induce P2X7 receptor-dependent responses in cultured renal- and liver-derived swine macrophages / Takato Takenouchi, Shu-nichi Suzuki, Hiroki Shinkai et al. // Results in Immunology. — 2014. — Vol. 4, no. 0. — Pp. 62 - 67. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S2211283914000094.

[133] Adenosine 5-Triphosphate (ATP) Inhibits Schwann Cell Demyelination During Wallerian Degeneration / YounHo Shin, Hyung-Joo Chung, Chan Park at al. // Cellular and Molecular Neurobiology. — 2014. — Vol. 34, no. 3. — Pp. 361-368. http://dx.doi.org/10.1007/s10571-013-0020-y.

[134] Wewers MarkD., Sarkar Anasuya. P2X7 receptor and macrophage function // Purinergic Signalling. — 2009. — Vol. 5, no. 2. — Pp. 189-195. http: //dx.doi.org/10.1007/s11302-009-9131-9.

[135] Beaulieu Christian. The basis of anisotropic water diffusion in the nervous system — a technical review // NMR in Biomedicine. — 2002. — Vol. 15, no. 7-8. — Pp. 435-455. http://dx.doi.org/10.1002/nbm.782.

[136] Tuck Elizabeth, Cavalli Valeria. Roles of membrane trafficking in nerve repair and regeneration // Commun. Integr. Biol. — 2010. — Vol. 3, no. 3. — Pp. 209-214. http://dx.doi.org/10.4161/cib.3-3.11555.

[137] AMP Is an Adenosine A1 Receptor Agonist / Joseph E. Rittiner, Ilia Kor-boukh, Emily A. Hull-Ryde et al. // Journal of Biological Chemistry. — 2012. — Vol. 287, no. 8. — Pp. 5301-5309. http://www.jbc.org/content/287/87 5301.abstract.

[138] Adenosine receptors and brain diseases: Neuroprotection and neurodegeneration / Catarina V. Gomes, Manuella P. Kaster, Angelo R. Tome et al. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. — 2011. — Vol. 1808, no. 5. — Pp. 1380 - 1399. — Adenosine Receptors. http://www. sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273610004232.

[139] Cunha Rodrigo A. Neuroprotection by adenosine in the brain: From A1 receptor activation to A2a receptor blockade // Purinergic Signalling. — 2005. — Vol. 1, no. 2. — Pp. 111-134. http://dx.doi.org/10.1007/ s11302-005-0649-1.

[140] Robson Simon C, Sévigny Jean, Zimmermann Herbert. The E-NTPDase family of ectonucleotidases: Structure function relationships and pathophysiological significance // Purinergic Signalling. — 2006. — Vol. 2, no. 2. — Pp. 409430. http://dx.doi.org/10.1007/s11302-006-9003-5.

[141] Fletcher John S., Vickerman John C. Secondary Ion Mass Spectrometry: Characterizing Complex Samples in Two and Three Dimensions // Analytical Chemistry. — 2013. — Vol. 85, no. 2. — Pp. 610-639. — PMID: 23094968. http://dx.doi.org/10.1021/ac303088m.

[142] Time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS) imaging reveals cholesterol overload in the cerebral cortex of Alzheimer disease patients / Adina N. Lazar, Claudia Bich, Ma Panchal at al. // Acta Neuropathologica. — 2013. — Vol. 125, no. 1. — Pp. 133-144. http://dx.doi.org/10.1007/ s00401-012-1041-1.

[143] Cholesterol-dependent Localization of NAP-22 on a Neuronal Membrane Microdomain (Raft) / Shohei Maekawa, Chihiro Sato, Ken Kitajima et al. // Journal of Biological Chemistry. — 1999. — Vol. 274, no. 30. — Pp. 2136921374. http://www.jbc.org/content/274/30/21369.abstract.

[144] Soccio Raymond E., Breslow Jan L. Intracellular Cholesterol Transport // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. — 2004. — Vol. 24, no. 7. — Pp. 1150-1160. http://atvb.ahajournals.org/content/24/7Z 1150.abstract.

[145] Maxfield Frederick R., Wustner Daniel. Intracellular cholesterol transport // The Journal of Clinical Investigation. — 2002. — 10. — Vol. 110, no. 7. — Pp. 891-898. http://www.jci.org/articles/view/16500.

[146] Schulze Heike, Kolter Thomas, Sandhoff Konrad. Principles of lysosomal membrane degradation: Cellular topology and biochemistry of lysosomal lipid degradation // Biochim. Biophys. Acta. — 2009. — Vol. 1793, no. 4. — Pp. 674 - 683. — Lysosomes. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0167488908003455.

[147] Lysosomal exocytosis in Schwann cells contributes to axon remyelination / Gang Chen, Zhijun Zhang, Zhongya Wei et al. // Glia. — 2012. — Vol. 60, no. 2.— Pp. 295-305. http://dx.doi.org/10.1002/glia.21263.

[148] Maxfield Frederick R, van Meer Gerrit. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells // Current Opinion in Cell Biology. — 2010. — Vol. 22, no. 4. — Pp. 422 - 429. — Membranes and organelles. http://www.sciencedirect. com/science/article/pii/S0955067410000670.

[149] Winterstein Christine, Trotter Jacqueline, Kramer-Albers Eva-Maria. Distinct endocytic recycling of myelin proteins promotes oligodendroglial membrane remodeling // Journal of Cell Science. — 2008. — Vol. 121, no. 6. — Pp. 834-842. http://jcs.biologists.org/content/12V6/834.abstract.

[150] Organ Louise E., Raphael Robert M. Lipid Lateral Mobility in Cochlear Outer Hair Cells: Regional Differences and Regulation by Cholesterol // Journal of the Association for Research in Otolaryngology. — 2009. — Vol. 10, no. 3. — Pp. 383-396. http://dx.doi.org/10.1007/s10162-009-0171-1.

[151] Schaeffer E. L., Bassi Jr. F., Gattaz W. F. Inhibition of phospholipase A2 activity reduces membrane fluidity in rat hippocampus // Journal of neural transmission. — 2005. — Vol. 112, no. 5. — Pp. 641-647.

Список рисунков

1.1 Ультраструктура миелина на изображении, полученном с помощью электронной микроскопии.................. 12

1.2 Диаграмма энергетических уровней молекулы со схематическими обозначениями различных процессов рассеяния света. Символы 5о и 51 обозначают невозбужденный и первый возбужденный колебательные подуровни............... 20

1.3 Схематическое представление молекулы ориентированной в

определенном направлении относительно лабораторной системы координат (а). Физическая интерпретация ОФР для осесимметричной системы (б). Экспериментальная установка для исследования молекулярной ориентации с помощью ПКР

(в). Модифицированные изображения заимствованы из [53]. ... 33

1.4 Различные типы симметрии тензора поляризуемости КР (а-в). Измерения интенсивностей полосы КР при различных ориентациях поляризатора и анализатора.............. 35

1.5 Диаграмма допустимых значений коэффициентов упорядоченности и соответствующие им виды ОФР......... 38

2.1 Схематическая диаграмма типичного ТОР-ЗШБ спектрометра. Схема адаптирована из [93]....................... 60

2.2 Примеры распределений измеряемый параметров упорядоченности для разных полос спектра КР и основных соотношений интенсивностей...................... 62

2.3 р-р диаграммы для основных соотношений интенсивностей (левый столбец). Распределения выборочных средних (гистограмма) и кривая плотности вероятности нормального распределения, построенная с использованием выборочного среднего и дисперсии (правый столбец)................ 63

2.4 Р-Р диаграммы для параметров упорядоченностей, рассчитанных на основе интенсивностей 3х основных полос спектра КР................................ 64

2.5 Распределения выборочных средних (гистограмма) для параметров упорядоченностей, рассчитанных на основе интенсивностей 3х основных полос спектра КР, и кривая плотности вероятности нормального распределения, построенная с использованием выборочного среднего и дисперсии........ 65

3.1 Типичные КР спектры каротиноидов (а), липидов (б) и миелина

(в) .................................... 68

3.2 Спектры КР миелина области 900-1700 см-1 при различных ориентациях поляризатора и анализатора (комментарии в

тексте) относительно нервного волокна................ 70

3.3 Спектры КР миелина области 2800-3000 см-1 при различных ориентациях поляризатора и анализатора (комментарии в

тексте) относительно нервного волокна................ 72

3.4 Вычитание базовой линии спектра КР в области 900-1700

см-1 (а) и оценка вклада аутофлуоресценции в спектр (б).....74

3.5 Вычитание базовой линии спектра КР в области 2800-3000 см-1. 75

3.6 Влияние положения лазерного пучка относительно нервного на измеряемые соотношения интенсивностей..............................77

3.7 Вычитание базовой линии спектра КР в области 2800-3000 см-1. 79

3.8 Пространственное распределение спектров КР в перехвате

Ранвье, интернодальной и паранодальной областях......... 80

3.9 Распределение интенсивностей основных полос КР в интернодальной области........................ 82

3.10 Распределение интенсивностей основных полос КР в паранодальной области......................... 83

3.11 Схематическое преставление нервного волокна с цифрами, соответствующими показателям преломления нерва и окружающего раствора (а). Распространение лазерного света внутри бокового выпячивания миелина (б) и в микрокапле

масла (в)................................. 84

3.12 Различия в распространении света в разных областях миелина (а,б). Профиль распределения интенсивности фокального дублета по длине волокна (в). Черные стрелки и квадраты обозначают место фокусировки лазера, серые стрелки и белые квадраты — ожидаемое место возникновения ФД.......... 86

3.13 Сравнение отношений интенсивностей основных полос спектра

КР для участков ФД- и ФД+ типов.................. 89

3.14 Интерпретация различий в структуре мембран миелина ФД+ и

ФД- участков............................... 90

3.15 Профиль ОРХ по длине волокна.................... 92

3.16 Спектры КР миелина, полученные при использовании различной ориентации поляризатора (сплошная двойная стрелка) и анализатора (пунктирная линия). Нервное волокно схематично представлено справа от каждого из спектров...... 97

3.17 Схематическая диаграмма фокусировки лазера на нервном волокне, где * соответствуют различным упрощающим допущения, обсуждаемым в тексте (а). Сечение нервного волокна поперечной плоскостью (б). Схема мембраны миелина,

используемая для построения модели (с). Молекулярная система координат (д). Интенсивность прошедшего внутрь волокна света поляризованного по оси Z (пунктир) и в первендикулярной плоскости (точки) и уменьшение интенсивности Z-компоненты

интенсивности вследствие рефракции (сплошная линия) (е). . . . 99

3.18 Ориентационные функции распределения для каротиноидов (а) и липидов (б) миелина. Серым фоном обозначен диапазон изменения ОФР при варьировании параметров упорядоченности

в пределах СОС.............................109

3.19 Относительная ориентация плоскости сканирования и поляризации лазера для визуализации каротиноидов (а) и липидов (б). КР изображения каротиноидов (слева) и липидов (справа). Изображения (в,г) получены используя пинхол диаметром 100 мкм, (д,е) — с пинхолом 50 мкм...........113

3.20 Влияние взаимной ориентации поляризатора, анализатора и

нервного волокна на интенсивность полос спектра. Приведенные значения интенсивностей являются примерными и могут отличаться для различных объектов. Продольное сечение нервного волокна изображено в виде прямоугольника с темными

краями, соответствующими миелину..................115

3.21 Изменения в параметрах упорядоченности при воздействиях (а). Увеличение в области полос каротиноидов (б) и липидов (в). Разбросы рассчитаны как 95% доверительные интервалы.....118

3.22 Первые серии экспериметов по измерению спектров КР при воздействии экстраклеточного АТФ (7 мМ) на нервные волокна в паранодальной и интернодальных областях. Символ * обозначает значение р < 0.05......................122

3.23 Спектр КР нервного волокна в экспериментах по исследованию действия АТФ и аденозина на мембраны миелина..........126

3.24 Сравнение соотношений интенсивностей полос спектра КР после инкубации клеток с АТФ, аденозином и МЦД. Используемые концентрации обозначены на гистограмме. Символы ** и * соответствуют случаям р < 0.05 и р < 0.001.............128

3.25 TOF-SIMS МС спектр миелина в области положительных ионов. Стрелками обозначены основные полосы, используемые в последующем анализе.......................... 131

3.26 Различия в выходе ионов ФХ и холестерина в нервных волокнах, обработанных МЦД, АТФ и аденозином (а). Оценка вклада матричного эффекта, посредством измерений выхода холестерина и ФХ с липидных пленок различного химического состава (б). Символы * и ** соответствуют значениям р < 0.05 и

р < 0.001 ................................133

3.27 Возможный механизм структурной перестройки миелина под действием АТФ, основанный на процессах везикулярного транспорта ...............................138

3.28 Основные особенности измерений спектров КР с одиночных нервных волокон (а-в, комментарии в тексте). Изменения в представлении миелинизированного нервного волокна в соответствие с полученными данными (г). Новая модель структуры миелина (д).........................143

Список таблиц

3.1 Значения основных соотношений интенсивностей и коэффициентов упорядоченности (Р2) и (Р4) спектров КР нервных волокон участков ФД- и ФД+ типов. Символ * обозначает статистически достоверное различие (р < 0.05)..... 89

3.2 Значения основных соотношений интенсивностей и коэффициентов упорядоченности (Р2) и (Р4) спектров КР нервных волокон при инкубации с 50 мМ раствором KCl (калиевая деполяризация — КД), 30 мМ раствором арахидоновой кислоты (АК) и 0.1 мМ МЦД (К — контроль). Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Символ * обозначает статистически достоверное различие (р < 0.05)...........................117

3.3 Значения отношений интенсивностей полос и коэффициентов упорядоченности (Р2) и (Р4) спектров КР нервных волокон при добавлении 1 мМ АТФ и 1 мМ аденозина и 0.1. Контроль обозначен буквой К...........................127

3.4 Значения отношений интенсивностей полос и коэффициентов упорядоченности (Р2) и (Р4) спектров КР нервных волокон при добавлении 0.25 мМ АТФ и 0.25 мМ аденозина. Контроль обозначен буквой К...........................127