Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Феофанов, Алексей Валерьевич

• Феофанов, Алексей Валерьевич
• доктор биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор биологических наук Феофанов, Алексей Валерьевич

Введение

Глава I. Микроспектральные исследования БАС: Современное состояние проблемы

1.1. Методы исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции

1.2. Микроспектрофлуориметры

1.3. Развитие метода МСФ и его применения

1.3.1. Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ

1.3.1.1. МСФ-исследования полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)

1.3.1.2. МСФ в исследованиях лекарств против псориаза

1.3.1.3. МСФ в исследованиях противоопухолевых соединений

1.3.2. МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов 30 кальция и магния

1.3.3. Метод МСФ в исследованиях ФС

1.3.4. Анализ методом МСФ собственной флуоресценции клеток

1.3.5. Некоторые другие исследования с применением метода МСФ

Глава II. Приборное обеспечение и разработка метода КОМИРСИ 45 II. 1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии 45 II. 1.1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы Dilor 45 II. 1.1.1. Спектрометр 46 II. 1.1.2. Микроскоп 48 II. 1.1.3. Входная конфокальная камера и принцип линейного сканирования 49 II. 1.1.4. Программное обеспечение 52 II. 1.2. Разработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной 58 сканирующей микроспектроскопии

II.2. Разработка метода КОМИРСИ

11.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых 67 клетках методом КОМИРСИ

11.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и ее решение методом 73 КОМИРСИ

11.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом 77 КОМИРСИ

11.2.4. Применение метода КОМИРСИ для выявления органоидов, в которых 87 происходит преимущественное накопление исследуемых БАС

11.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ

II.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС

Глава III. Материалы и методики 102 II 1.1. Реактивы

III.2. Исследование молекулярных взаимодействий БАС в растворах 104 III. 3. Измерение генерации активных форм кислорода

111.4. Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ

111.5. Эксперименты на культуре клеток

111.6. Методики, применявшиеся при изучении внутриклеточной локализации БАС

111.7. Методики исследования цитотоксического воздействия БАС

111.8. Приготовление криостатных срезов тканей

111.9. Приборное и программное обеспечение экспериментов

Глава IV. Исследования БАС с применением метода КОМИРСИ 117 IV. 1. Исследования митоксантрона 118 IV. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий МИТО в растворах 118 IV. 1.2. Анализ внутриклеточных спектров МИТО 122 IV.1.3. Количественный анализ МИТО и его комплексов в клетках К562 125 IV. 1.4. Особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на 130 разных стадиях клеточного цикла

IV.1.5. Особенности накопления и распределения МИТО в клетках K562R с 136 множественной лекарственной устойчивостью

IV.2. Исследование сульфированного фталоцианина в живых клетках и срезах 140 тканей

IV.2.1. Молекулярные свойства сульфированного фталоцианина 141 IV.2.2. Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности

IV.2.3. Распределение H2PCS2.4 в опухолевых тканях

IV.2.3.1. Гистологический анализ особенностей роста опухолей

IV.2.3.2. Распределение H2PCS2.4 в срезах тканей

IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлоринового ряда

IV.3.1. Исследования З-дезвинил-З-формилхлорина рб

IV.3.1.1. Молекулярные свойства ФХрб

IV.3.1.2. Исследования ФХрб в живых клетках

IV.3.2. Циклоимидные производные хлорина рб (ЦИХЛ)

IV.3.2.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИХЛ

IV.3.2.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ в растворах

IV.3.2.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ

IV.3.2.4. Особенности внутриклеточных спектров флуоресценции ЦИХЛ

IV.3.2.5. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ

IV.3.2.6. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИХЛ

IV.3.2.7. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со 192 свойствами ЦИХЛ

IV.3.2.8. Механизмы ЦИХЛ-опосредованной фотоиндуцированной гибели клеток

IV.3.2.9. Распределение ЦИХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р

IV.3.2.10. ФДТ с использованием соединений 1 и

IV.3.2.11. Сравнительный анализ данных метода КОМИРСИ о распределении 205 ЦИХЛ в тканях и результатов ФДТ

IV.4. Исследование свойств фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных 207 производных бактериохлорина

IV.4.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИБХЛ

IV.4.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИБХЛ в растворах

IV.4.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИБХЛ

IV.4.4. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИБХЛ

IV.4.5. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИБХЛ

IV.4.6. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со 224 свойствами ЦИБХЛ

IV.4.7. Влияние ЦИБХЛ-опосредованного фотодинамического воздействия на 226 состояние митохондрий, лизосом и липидного транспорта

IV.4.8. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений»

Оптическая микроскопия уже более 300 лет является исследовательским инструментом, который все более разнообразно и широко используется в биологии, биофизике и медицине.

Анализ окрашенных срезов тканей и клеток в проходящем белом свете - наиболее простое на сегодняшний день, но весьма информативное применение оптической микроскопии - в современном виде сформировалось десятки лет назад и остается неотъемлемой частью клинических и медико-лабораторных исследований. Данный подход основан на использовании различий в интенсивности и цвете естественной или искусственной окраски определенных веществ в клетках и тканях, в комбинации с анализом морфологических признаков для выяснения присутствия, локализации, а во многих случаях и оценки количественных характеристик этих веществ, клеточных и тканевых структур, типирования клеток и микроорганизмов.

Разработка оптических систем для реализации методов дифференциального интерференционного контраста и фазового контраста открыла исследователям возможность уверенного наблюдения и исследования микроструктур в составе неокрашенных и слабоконтрастных биологических объектов, таких как живые клетки.

Создание микроскопов, позволяющих наблюдать флуоресценцию молекул в клетках и тканях, привело к развитию многообразия методов и подходов к изучению структуры и функции клеток, клеточных структур, биологических клеточных процессов, а также эндогенных и экзогенных (синтетических и природных) молекул и ионов металлов в клетках и срезах тканей.

До 60-х годов 20 века оптическая микроскопия являлась методом, который обеспечивал субмикронное разрешение только в фокальной плоскости объектива. Изобретение конфокальной системы фильтрации сигнала дало возможность измерения флуоресцентных сигналов с трехмерным субмикронным разрешением. Совпавший по времени прогресс в разработке лазерных систем и персональных компьютеров стимулировал наблюдаемое сейчас бурное развитие новых методов флуоресцентной микроскопии. Среди новых и развивающихся методов отметим лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (JICKM), двух- и мульти- фотонную микроскопию, микроскопию на основе измерения времени жизни флуоресценции, конфокальную микроспектроскопию, микроскопию с применением эффекта полного внутреннего отражения, а также методические подходы на основе анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и флуоресцентного переноса энергии. Помимо флуоресцентной в настоящее время идет активное развитие микроскопии ближнего поля и методов оптической микроскопии на основе колебательной спектроскопии, таких как инфракрасная микроскопия и микроскопия комбинационного рассеяния (КР).

Развитие новых методов оптической микроскопии полностью востребовано в современной клеточной биологии и биофизике. Достигнутый к настоящему времени уровень понимания взаимодействия и функционирования биологических молекул и их комплексов в бесклеточной среде, глубокое проникновение в основы процессов жизнедеятельности клетки, с одной стороны, и возрастающая потребность в более информативных методах исследования, с другой стороны, создают основу для быстрого внедрения новых методов оптической микроскопии в исследовательский процесс. Развитие генной инженерии, протеомики и биотехнологии ставит на повестку дня вопрос об углубленном изучении процессов синтеза, транспорта и взаимодействий биологических молекул в живой клетке, а также о практическом использовании этих знаний. Для решения этих задач также необходимо скорейшее совершенствование экспериментальных подходов на основе оптической микроскопии.

Одной из возможностей значительного увеличения информативности оптической микроскопии является применение в микроскопии спектрального анализа. В данной диссертации представлены результаты разработки метода конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ), а также результаты применения этого метода в исследованиях биологически активных соединений (БАС).

Метод КОМИРСИ базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта (живой клетки или среза ткани) полных спектров флуоресценции или КР исследуемого БАС. Это позволяет не только установить пространственное распределение БАС в сканируемом объекте, но и изучить по спектрам микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности, измерить концентрацию БАС и его молекулярных комплексов.

К разработке метода КОМИРСИ меня подтолкнуло участие в создании прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии КР и флуоресценции, проводившемся фирмой "Dilor" (Лиль, Франция) в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета (Реймс, Франция) в 1993-1994 гг. В процессе оптимизации конструкции прототипа прибора и тестировании программного обеспечения мной был выполнен ряд измерений и исследований разнообразных образцов, выявивший большой потенциал нового спектрального микроскопа в различных областях науки, включая минералогию, материаловедение, физику твердого тела, биофизику и клеточную биологию. В процессе исследований противоопухолевого препарата митоксантрона, проведенных мной в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета на приборной базе фирмы "Dilor" оформились первые две задачи настоящей работы:

1) Разработать основы метода КОМИРСИ для идентификации и изучения молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением;

2) с использованием метода КОМИРСИ разработать методики измерения концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, методики оценки средних концентраций БАС в органеллах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также методики проведения статистически достоверного анализа клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

Решение этих задач было продолжено в исследованиях новых отечественных фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии рака. ФС для исследований были предоставлены профессором Е. А. Лукьянец (НИОПИК) и профессором А. Ф. Мироновым (МГАТХТ им. М. В. Ломоносова). Исследования ФС на раковых клетках и в срезах тканей животных и пациентов проводились в тесном сотрудничестве со специалистами лаборатории модификаторов и протекторов МНИОИ им. П. А. Герцена (зав. лаборатории профессор Р.И. Якубовская). Проблема отсутствия необходимой приборной базы в России на первом этапе была решена благодаря установлению долгосрочного научного сотрудничества с Центром молекулярной биофизики Национального центра научных исследований Франции (г. Орлеан, Франция), который предоставил возможность использования в исследованиях прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии фирмы "Dilor". Для того, чтобы обеспечит возможность выполнения исследований методом КОМИРСИ в России, встала задача создать лабораторную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии.

Необходимость выяснения точной внутриклеточной локализации изучаемых ФС, а также понимание важности расширенного исследования с выполнением анализа на срезах тканей привели к появлению еще двух задач:

3) На основе метода КОМИРСИ разработать методики выявления органоидов, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС;

4) с использованием метода КОМИРСИ разработать методики исследования распределения БАС в срезах тканей и оценки относительной концентрации БАС в различных структурах тканей.

Во многих исследовательских задачах метод КОМИРСИ может служить альтернативой методам JICKM и проточной цитометрии. Чтобы эффективно развивать и адекватно использовать метод КОМИРСИ, было необходимо выявить преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС.

Одной из ключевых задач, которая решалась на протяжении всей работы, было:

5) применить разработанный метод КОМИРСИ и методики, созданные на его основе, в исследованиях БАС, для получения новой информации о механизмах функциональной активности изучаемых БАС, о взаимосвязях между структурой и активностью БАС, о мишенях действия БАС в клетках и тканях.

Основными объектами исследований служили противоопухолевый препарат митоксантрон, ФС на основе сульфированных производных фталоцианина, октакарбоксифталоцианин кобальта, З-девинил-З-формил хлорин рб, циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорина с различными заместителями введенными в пиррольные циклы A, D и в имидный цикл Е, флуоресцентно-меченные пробы лектинов, кардиотоксины из яда кобр Naja haja, Naja oxiana, Naja kaouthia, цитохром с и его генно-инженерные мутантные формы.

Предметом детальных исследований были: применимость метода КОМИРСИ в исследовании различных БАС и новые возможности связанные с использованием этого метода; внутриклеточное распределение и молекулярные взаимодействия митоксантрона в клетках эритролейкоза человека К562, и их изменения (особенности) на разных стадиях клеточного цикла и в клетках с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ); особенности накопления и распределения безметального сульфированного фталоцианина в различных раковых клетках в культуре и в опухолях на срезах тканей мышей; молекулярные и клеточные механизмы действия ФС; влияние структуры циклоимидных производных хлорина рб и бактериохлорина на ключевые характеристики, определяющие фотодинамический эффект ФС в раковых клетках.

Помимо метода КОМИРСИ и методик на его основе в данной работе широко применяли флуоресцентную микроскопию, а также методы спектрофотометрии, флуоресцентной и КР- спектроскопии молекул в растворах.

В Главе I данной работы рассмотрено современное состояние проблемы применения спектрального анализа в микроскопии для изучения БАС в клетках, а в Главах II-IV изложены полученные мной и под моим руководством результаты, которые сгруппированы следующим образом. В Главе II описано приборное обеспечение метода КОМИРСИ, включая конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы «Dilor» и созданную мной лабораторную экспериментальную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии, а также представлены результаты разработки метода КОМИРСИ. В Главе III описаны реактивы и экспериментальные методики, применявшихся в исследованиях, представленных в диссертации. В Главе IV изложены результаты исследований БАС с применением метода КОМИРСИ, включая исследования митоксантрона и отечественных ФС. В Заключении обобщены итоги разработки метода КОМИРСИ и исследований с применением этого метода и представлены выводы диссертационной работы. Используемые в работе сокращения и аббревиатуры приведены в виде отдельного списка в конце диссертации.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Феофанов, Алексей Валерьевич

выводы

1. Разработан метод КОМИРСИ, обеспечивающий на основе анализа полных спектров флуоресценции уникальную возможность идентификации и изучения молекулярных взаимодействий биологически активных соединений (БАС) в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением.

2. Метод КОМИРСИ позволяет измерять концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, оценивать средние концентраций БАС в органоидах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также проводить статистически достоверный анализ клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

3. Метод КОМИРСИ применим для решения широкого круга задач биофизики, молекулярной и клеточной биологии, включая изучение механизмов клеточного транспорта, внутриклеточной локализации и механизмов действия БАС. Метод позволяет идентифицировать и разделять в клетках перекрывающиеся сигналы нескольких введенных в клетку флуоресцирующих соединений, а также учитывать вклад эндогенной флуоресценции клетки, что существенно повышает надежность и точность анализа по сравнению с традиционной лазерной сканирующей конфокальной микроскопией.

4. Метод КОМИРСИ позволяет исследовать распределения БАС в срезах тканей и проводить оценку относительной концентрации БАС в различных структурах тканей. Метод дает уникальную возможность изучать БАС и сопоставлять результаты исследований, полученные одним и тем же методом, на разных уровнях структурной организации: молекулярном, клеточном, тканевом.

5. ДНК является важной мишенью действия митоксаптропа, который, образуя комплексы с ней, вызывает остановку клеточного цикла клеток на стадии анафазы.

6. Фотодинамическое действие безметального сульфированного фталоцианина H2PCS2.4 достигается за счет его накопления в плазматической мембране и цитоплазме раковых клеток в связанной с мембранными структурами мономерпой фотодинамически активной форме, способной под действием света инициировать образование гидроксил-радикалов и синглетного кислорода. Усиленное накопление H2PCS2.4 происходит как в опухолевых клетках, так и в прилежащих к опухоли тканях, что, по-видимому, и служит основой эффективной ФДТ рака с использованием H2PcS2.4.

7. Введение в структуру хлорина рб имидпого цикла и подходящих заместителей принципиально улучшает способность этого ФС проникать в раковые клетки и накапливаться в чувствительных к фотодинамическому воздействию цитоплазматических липидных структурах в виде активных мономеров. Оптимизация структуры боковых заместителей позволяет обеспечить быстрое накопление и сравнительно длительное удержание ЦИХЛ-производных в раковых клетках, что представляется важным для эффективной ФДТ. С помощью заместителей, можно изменять распределение ЦИХЛ-производных в цитоплазме, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, либо в липидиых каплях, что дает возможность изучить особенности и механизмы развития фотодинамического эффекта, инициализированного в этих структурах. Варьируя структуру и изучая свойства ЦИХЛ-производных в растворах и клетках, удается отбирать соединения, обладающие высокой избирательностью накопления в опухолях животных, что является основой для наблюдаемого противоопухолевого эффекта ФДТ.

8. Оптимизированные по структуре боковых заместителей, ЦИБХЛ являются перспективными фотосенсибилизаторами для ФДТ рака, чему способствуют их свойства: интенсивное поглощение в области окна прозрачности тканей (778-830 нм); способность к проникновению и большому накоплению в цитоплазме раковых клеток; сохранение в цитоплазме мономерной формы за счет связывания с липидными структурами; высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода в липидном окружении; способность эффективно накапливаться в опухоли и окружающих опухоль тканях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарю за финансовую поддержку данных исследований Российский фонд фундаментальных исследований (гранты 96-04-48421, 01-04-49298, 02-04-22001), Московский комитет по пауке и технике (грант ГБ-24/00), фонд PICS (Франция), НАТО (грант LST.CLG.97770775), фонд INTAS (93-1829, 01-0461), научно-техническую программу Правительства Москвы, Миннауки РФ и РАН «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических заболеваний».

Я искренне благодарен проф. Р.И. Якубовской, к.б.н. Т.А Кармаковой и другим сотрудникам лаборатории проф. Р.И. Якубовской за длительное и плодотворное сотрудничество в исследованиях ФС. Это сотрудничество было и остается важной предпосылкой развития метода КОМИРСИ, источником новых задач и новых идей. Еще раз спасибо проф. Р.И. Якубовской, которая увидела в нашем методе инструмент перспективный для исследований ФС, рекомендовала и поддержала наше участие в НТП Правительства Москвы. Я благодарю проф. Е.А. Лукьянец и проф. О.Л. Калея за предоставленную возможность участвовать в разработке и исследованиях ФС на основе фталоцианинов.

Я искренне благодарю проф. А.Ф. Миронова, к.х.н. М.А. Грина, к.х.н. B.C. Лебедеву и других сотрудников лаборатории проф. А.Ф. Миронова за синтез уникальных ЦИХЛ и ЦИБХЛ, за предоставленную нам возможность исследовать эти интересные ФС.

Большое спасибо за результативное сотрудничество нашим французским коллегам проф. М. Manfait, проф. P. Vigny, проф. J.-C. Maurizot, доктору М. Egret-Charlier, доктору М. Refregiers, а также голландскому проф. С. Otto. Надеюсь, что это сотрудничество будет также успешно развиваться и дальше. Я искренне восхищен работой доктора С.Шаронова и доктора А. Кокота, которые создали удивительно удобное программное обеспечение для измерений методом КОМИРСИ и всегда очень внимательно откликались на любые просьбы и идеи по оптимизации этого программного продукта под конкретные задачи эксперимента.

Я глубоко признателен проф. И. Набиеву, который в тяжелейшие для научных исследований годы «перестройки» всемерно поддерживал меня и работу нашей группы, организовал международное сотрудничество и обеспечил необходимое для выживания нашей группы вхождение в систему международных грантов.

Развитие метода КОМИРСИ было бы не возможно без активного и заинтересованного участия в исследованиях сотрудников ИБХ РАН И.А. Куделиной, к.б.н. М.В. Астаповой, моих бывших студентов и аспирантов А. Януля, А. Гришина, А. Назаровой и Г. Шаронова - спасибо Вам. Я от всей души благодарю своего научного консультанта проф. А.С. Арсеньева за консультации, помощь и поддержку в моих исследованиях, за большой вклад в развитие нашей исследовательской группы. Спасибо директору ИБХ РАН академику В.Т. Иванову, который поверил в мои аргументы и обеспечил целевое финансирование под создание лабораторной экспериментальной установки для конфокальной микроспектроскопии. Спасибо за сотрудничество д.х.н. Ю.Н. Уткину, д.б.н. Д.А. Долгих и всем-всем сотрудникам ИБХ РАН, оказывавшим мне посильную помощь в решении научных, организационных и административных проблем.

От всей души спасибо моей маме, Тамаре Алексеевне, за моральную поддержку, любовь и веру в мои силы. Огромное спасибо моей жене, Ане, за любовь, заботу, бесконечное терпение, помощь и понимание.

Список использованных сокращений

2М двумерный

АО акридиновый оранжевый

БАС биологически активные соединения

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

КР комбинационное рассеяние

КОМИРСИ метод конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений

ЛСКМ лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

МСФ микроспектрофлуориметрия

МИТО митоксантрон

МЛУ множественная лекарственная устойчивость

МТТ 3-(4,5-димитилтиазол-2-ил)-2,5-бифенил тетразолий бромид

НДМА 4-нитрозо-М,Ы-диметиланилин

НИК нильский красный

НК нейтральный красный

НХМ нафтохиноксалиновый метаболит митоксантрона

ПАУ полициклические ароматические углеводороды п.о. пар оснований

РКР резонансное комбинационное рассеяние

Р6Ж родамин 6Ж

Р123 родамин 123

ТКТ конъюгат трансферрина с техасским красным топо II ДНК топоизомераза II

ФДТ фотодинамическая терапия

ФС фотосенсибилизатор(ы)

ФСБ фосфатно-солевой буфер (0,15 М NaCl, 50 мМ Na2HP04)

ЦИБХЛ циклоимидное(ые) производное(ые) бактериохлорина

ФХрб З-дезвинил-З-формилхлорин рб

ЦИХЛ циклоимидное(ые) производное(ые) хлорина рб

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

ЭБ этидий бромид

ЭР эндоплазматический ретикулум

ЭТС эмбриональная телячья сыворотка

A-ern длина волны максимума спектра испускания флуоресценции

Xgx длина волны возбуждения

B16 меланома В16

BaPyr бензо[а]пирен

BODIPY- ^-((4-(4,4-дифлуоро-5-(2-тионил)-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-ил) церамид фенокси)ацетил)сфингозина

CFP циановый флуоресцирующий белок

CT цитотоксин из яда кобр

DOX доксорубицин

EC карцинома молочной железы Эрлиха

FRET резонансный перенос энергии флуоресценции

GFP зеленый флуоресцирующий белок

LLC карцинома легкого Льюиса

NADH восстановленный никотинадениндинуклеотид

NADPH восстановленный никотинадениндинуклеотид фосфат

P388 лимфоидный лейкоз Р388

SDS додецилсульфат натрия

YFP желтый флуоресцирующий белок

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате решения поставленных в данной работе задач удалось, на мой взгляд, детально разработать метод КОМИРСИ и найти ему широкое применение, как в фундаментальных, так и в ориентированных на клинику исследованиях БАС.

Созданный на основе коммерчески-доступных блоков конфокальный сканирующий спектральный микроскоп обеспечил приборную базу для дальнейшего развития метода КОМИРСИ и реализации исследовательских программ с применением этого метода на базе ИБХ РАН. Этот прибор успешно использован в представленных в данной работе клеточных исследованиях ЦИХЛ [91, 93, 99] и ЦИБХЛ, в изучении распределения ЦИХЛ в срезах тканей мышей [105], в ориентированных на клинику исследованиях проб опухолевых тканей пациентов [106] и ряде других исследований [76, 77, 84]. На этом приборе проводились клеточные исследования механизма действия флуоресцентно-меченных цитотоксинов из яда кобр [81] и апоптозной функции генно-инжененерных мутантов цитохрома с [82]. В настоящее время конфокальный сканирующий спектральный микроскоп продолжает интенсивно использоваться в исследовательских проектах Федерального агентства по науке и инновациям, РФФИ, Научно-технической программы "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.

Разработанный нами метод КОМИРСИ дает возможность исследовать не только локализацию, но и молекулярные взаимодействия флуорофоров в живых клетках с ЗМ субмикронным пространственным разрешением. Метод основан на анализе спектров флуоресценции исследуемого соединения в клетках. Анализ внутриклеточных спектров флуоресценции позволяет охарактеризовать микроокружение и взаимодействия флуорофора, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности. Данный анализ проводится в каждой точке сканируемой клетки, что позволяет выявить полную картину состояния и взаимодействий соединения. Внутриклеточные концентрации изучаемых молекул определяются по интенсивности флуоресценции с учетом тушения/усиления сигнала, вызываемого образованием комплексов и влиянием других факторов. Это увеличивает точность измерений по сравнению с обычными методами оптической микроскопии и дает возможность установить реальное количественное распределение соединения и его комплексов в клеточных компартментах, изучить динамику их накопления и удержания в клетках. За счет этих своих преимуществ метод КОМИРСИ является хорошим дополнением к традиционным методам флуоресцентной микроскопии и ЛСКМ.

Разработаны основы применения метода КОМИРСИ для изучения локализации и молекулярных взаимодействий флуоресцирующих противоопухолевых соединений в живых раковых клетках. Метод предоставляет уникальную возможность идентификации по спектрам флуоресценции комплексов и микроокружения/состояпия противоопухолевого соединения в интактных клетках и измерения с ЗМ субмикронным пространственным разрешением количественных карт (спектральных изображений) распределения этого соединения и его комплексов в клетках.

Методом КОМИРСИ исследованы накопление, распределение и взаимодействия МИТО, эффективного противоопухолевого препарата, в эритроидных лейкозпых клетках человека К562, в синхронизованной культуре клеток К562 на различных фазах клеточного цикла, а также в клетках с множественной лекарственной устойчивостью K562R. С использованием модельных экспериментов по изучению влияния на спектры эмиссии флуоресценции МИТО взаимодействий с молекулярными мишенями, кислотности среды, гидрофобности микроокружения, концентрации и других факторов, моделирующих состояние МИТО в клетке, подобран набор модельных спектров, позволяющий описать внутриклеточные состояние и взаимодействия МТК. Обнаружен и по спектрам флуоресценции идентифицирован НХМ, метаболит, образующийся в результате окислительного действия ряда внутриклеточных ферментов.

Проведен количественный анализ накопления и дозо-зависимого внутриклеточного распределения МИТО, его комплексов с гидрофобными клеточными структурами, с нуклеиновыми кислотами, а также НХМ в живых клетках К562. Охарактеризованы области гетерогенного накопления этих комплексов и состояний МИТО в клетках. Изучены особенности взаимодействия МИТО в S-, G2- и М- клетках синхронизированной культуры клеток К562. Целыо этих экспериментов было выяснить, как внутриклеточные молекулярные взаимодействия МИТО, регистрируемые методом КОМИРСИ, зависят от стадии клеточного цикла: происходит ли фазо-зависимое изменение внутриклеточной концентрации МИТО, внутриклеточное перераспределение или предпочтительное накопление определенных комплексов МИТО-мишень. Обнаружено, что МИТО вызывает остановку клеточного цикла клеток в митозе на стадии анафазы. Охарактеризованы молекулярные взаимодействия МИТО, блокирующие завершение анафазы. Проведен сравнительный количественный анализ накопления и локализации МИТО и его комплексов в чувствительных К562 и резистентных K562R клетках. Выявлены и охарактеризованы факторы (уменьшение внутриклеточной концентрации МИТО, изменение его внутриклеточной локализации и резкое снижение содержания МИТО в комплексах с ДНК и другими мишенями), отвечающие за снижение цитотоксического эффекта в резистентных клетках. Проведено сопоставление полученных данных с данными других биохимических и цитологических методов и дан их анализ с точки зрения механизмов цитотоксичности МИТО.

Результаты, полученные для МИТО, демонстрируют уникальный потенциал метода КОМИРСИ применительно к разработке и изучению новых цитостатиков, а аналитические возможности метода способны обеспечить количественную оценку эффективности различных способов преодоления МЛУ и новых подходов к избирательной доставке противоопухолевых соединений в раковые клетки.

Метод КОМИРСИ интенсивно использовался в исследованиях безметалыюго сульфированного фталоцианина H2PCS2.4 в клетках и срезах тканей животных. В результате этих исследований удалось доказать ошибочность мнения о неэффективности безметального сульфированного фталоцианина, как ФС, и охарактеризовать молекулярные, клеточные и тканевые свойства H2PCS2.4, лежащие в основе противоопухолевого фотодинамического эффекта с использованием НгРсЗг^. В настоящее время препарат па основе этого ФС, разрабатываемый ФГУП ГНЦ НИОПИК под название Фталасенс, находится на стадии клинических исследований.

Исследованы свойства новой группы ФС с поглощением в ближней ИК-области (708-746 нм) - ЦИХЛ-производных. На примере пятнадцати производных с различными боковыми заместителями введенными в пиррольные кольца A, D и имидный цикл детально изучена возможность за счет изменения структуры заместителей варьировать ключевые параметры, определяющие фотодинамическую активность ФС в раковых клетках. Установлено, что наибольшего внутриклеточного проникновения и активности ЦИХЛ-производных удается достичь, обеспечив стабилизацию мономерной формы в водной среде с помощью 0,002-0,01 % эмульсии Кремофора. Показано, что внутриклеточное накопление ЦИХЛ-производных происходит в цитоплазме в мопомерпой форме связанной с липидными клеточными структурами. При облучении светом липид-связанные ЦИХЛ-производные не образуют гидроксил-радикалов, но характеризуются высокими квантовыми выходами генерации синглетного кислорода, которые варьируются от 0,73 до 0,35. Показано, что эффективность генерации синглетного кислорода не зависит от положения длинноволнового максимума поглощения в диапазоне 665-746 нм, а определяется влиянием боковых заместителей. Обнаружено, что, варьируя структуру заместителей, можно управлять внутриклеточной локализацией ЦИХЛ-производных, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и ЭР, либо в липидных каплях, клеточных органоидах, ответственные за хранение нейтральных липидов и стериновых эфиров. Оба типа клеточной локализации обеспечивают высокую фотоцитотоксичность, которая по данным МНИОИ им. П.А. Герцена для наиболее активных соединений в 50 раз выше, чем у хлорина рб, и в 150 раз выше, чем у применяемого в клинике препарата Фотогем. При неудачных комбинациях заместителей активность падает в сотни раз, главным образом, из-за неспособности этих производных проникать в раковые клетки.

Нами показано, что с помощью боковых заместителей можно в широком диапазоне варьировать скорость клеточного накопления и выведения ЦИХЛ, а также коэффициент их внутриклеточного накопления. Установлено, что такие механизмы проникновения в клетки, как активные (АТФ-зависимые) типы транспорта, кавеолярный и клатрин-опосредованный эндоцитоз, не играют существенной роли в интернализации ЦИХЛ-производпых, а вклад пассивной диффузии выявлен только для нейтральных гидрофобных соединений. Установлено, что для обоих типов клеточной локализации механизм фотоиндуцированной гибели клеток меняется в зависимости от дозы света и внутриклеточной концентрации ЦИХЛ-производных. При условиях вызывающих гибель около 50% клеток доминирует апоптоз, в то время как 100% гибель клеток сопровождается некрозом.

Продемонстрирована возможность создания на основе ЦИХЛ-производных высокоэффективных ФС. По данным МНИОИ им. П.А. Герцена ФДТ с 13,15-[N-(3-гидроксипропил)]циклоимидом хлорина рб (соединение 1) и метиловым эфиром 13,15-[Ы-(3-метокси)]циклоимида хлорина рб (соединение 5) обеспечивает значительный противоопухолевый эффект на мышах с привитой подкожно лимфомой Р388. Наибольший эффект достигнут при дозе 4 мкмоль/кг, когда облучение выполняли через 1,5 ч после инъекции ФС. Согласно анализу срезов ткани методом КОМИРСИ эта временная задержка соответствует максимальному накоплению 1 и 5 в опухолевых клетках (отношение накопления в опухоли к накоплению в коже — 8-10). Облучение опухоли через 15 мин после введения соединения 1 в дозе 1 мкмоль/кг обеспечивает эффективную сосудистую фотодинамическую терапию опухоли, тогда как соединение 5 не подходит для этого. Установлены взаимосвязи между тканевым распределением соединений 1 и 5 и эффективностью ФДТ при различных временных задержках между введением ФС и облучением опухоли светом.

Детально, с акцентом на взаимосвязи между структурой и активностью исследованы 10 новых ИК-ФС, циклоимидных производных бактериохлорипа

ЦИБХЛ) с различными 13,15-N- заместителями и заместителями 3-ацетил группы. Исследованные ЦИБХЛ поглощают свет в области окна прозрачности биологических тканей (780-830 им) и обладают высокой фотостабилыюстью при длительном облучении светом. Наиболее активные производные в 300 раз более фотоцитотоксичны в отношении клеток А549 и HeLa, чем применяемый в клинике Фотогем (данные МНИОИ им. П.А. Герцена), благодаря заместителям, которые, как показано нами, улучшают внутриклеточное накопление (коэффициент накопления 8-13) и обеспечивают эффективную фотоиндуцированную генерацию синглетного кислорода (квантовый выход 0,54-0,57). Заместители предопределяют усиленное накопление ЦИБХЛ во внутриклеточных липидных каплях, аппарате Гольджи или обеспечивают смешанное накопление в липидных каплях и аппарате Гольджи раковых клеток. Липидные капли и аппарат Гольджи - критические мишени, высокочувствительные в ЦИБХЛ-опосредованному фотоиндуцированному повреждению. Конфокальный флуоресцентный анализ срезов опухолевых тканей мышей выявил особенности тканевого распределения ЦИБХЛ и, в частности, их способность накапливаться в опухоли и окружающей соединительной ткани. Учитывая короткодействие синглетного кислорода, эти свойства ЦИБХЛ являются предпосылкой для эффективной противоопухолевой ФДТ и надежным основанием для разработки препарата.

Врачи МНИОИ им. П. А. Герцена, применяющие ФДТ для лечения рака, считают целесообразным проведение исследования методом КОМИРСИ накопления и распределения ФС в пробах тканей пациентов для повышения эффективности терапии. Эти исследования ведутся в настоящее время.

Результаты разработки метода КОМИРСИ находят широкое применение в исследованиях БАС в ИБХ РАН и успешно используются в совместных научных исследованиях с МНИОИ им. П. А. Герцена, ФГУП ГНЦ «НИОПИК», МГАТХТ им. М.В. Ломоносова и Институтом иммунологии.

Исследования с применением метода КОМИРСИ, проведенные под моим научным руководством, стали основой для двух магистрских и двух кандидатских диссертаций; готовится к защите третья кандидатская диссертация.

Изложенные в диссертации результаты могут быть использованы в работе лабораторий, занимающихся исследованиями БАС с применением методов оптической микроскопии и ЛСКМ, а также представляют интерес для лабораторий и фирм, разрабатывающих ФС.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Феофанов, Алексей Валерьевич, 2006 год

1. Taylor D. L., Wang Y.-L. Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture. Part B. San Diego:1. Acad. Press, 1989.

2. Pawley J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Plenum Publishing, 1990.

3. McLean Grogan W., Collins J. M. Guide to flow cytometry methods. Marcel Dekker, 1990.

4. Andrews P. D., Harper I. S., Swedlow J. R. To 5D and Beyond: Quantitative Fluorescence

5. Microscopy in the Postgenomic Era. Traffic 2002, 3,29-36.

6. Kohler A. Mikrophotographische untersuchungen mit ultraviolettem Iicht. Z. wiss. Mikroskop.1904,21, 129-165.

7. Murphy D.B. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Wiley-Liss.

8. Swedlow J.R., Sedat J.W., Agard D.A. Deconvolution in optical microscopy. In: Jansson PA, editor.

9. Deconvolution of Images and Spectra, 2nd edn. New York: Academic Press, 1997, 284-309.

10. McNally J.G., Karpova Т., Cooper J., Conchello J.A. Three-dimensional imaging by deconvolutionmicroscopy. Methods 1999, 19, 373-385.

11. Shaw P.J. Computer reconstruction in three-dimensional fluorescence microscopy. In: Shotton D.,editor. Electronic Light Microscopy. New York: Wiley-Liss, Inc., 1993.

12. Агроскип JI.C., Королев H.B. Микроскоп-спектрофлуориметр для ультрафиолетовой области. Биофизика 1961, 6, №1, 478-485.

13. Максимовский Л.Ф. Схема микроскопа спектрофлуориметра. Цитология 1964, 6, №2, 255-256.

14. Ягупов А.С., Прокофьев А.Я. Установка для изучения спектров флуоресценции отдельных клеток. Цитология 1966, 8, №4, 569-572.

15. Камипир Л.Б., Хруст Ю.Р., Емельянова Л.А., Долгов А.И. Микроспектрофлуориметр для регистрации люминесценции в видимой области. Вестник АН СССР, 1966, 8, 127.

16. Морозов Ю.Е., Фукс Б.Б. Простой цитоспектрофлуориметр. Архив патологии 1968, №4, 8687.

17. Розанов Ю.М., Селиванов Г.В., Боровиков Ю.С. Установка для исследования спектров флуоресценции биологических микрообъектов. Цитология 1969, 11, №7, 910-915.

18. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. Москва: Наука 1978.

19. Olson R.A. Rapid scanning microspectrofluorimeter. Rev. Scient. Instrum. 1960, 31, 844.

20. Loeser C.N., West S.S. Cytochemical studies and quantitative television fluorescence and absorption spectroscopy. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1962, 97, 346.

21. Runge A. A recording microfluorospectrophotometer. Science 1966, 156, 1499.

22. Pearse A.G.E., Rost F.W.D. A microspectrofluorimeter with epi-illumination and photocounting. J. Microsc. 1969, 89,312-328.

23. Kohen E., Kohen C., Thorell B. Rapid automatic microspectrofluorometric study of intracellular energy metabolism. Exper. Cell. Res. 1976, 101,47-54.

24. Blais J., Amirand C., Ballini J.P, Debey P., Foultier M.T, Patrice T. Photofrin-induced fluorescence in progressive and regressive murine colonic cancer cells: correlation with cell photosensitivity. J. Photochem. Photobiol. B. 1995,27,225-231.

25. Reyftmann J.P., Kohen E., Morliere P., Santus R., Kohen C., Mangel W.F., Dubertret L., Hirschberg J.G. A microspectrofluorometric study of porphyrin-photosensitized single living cells I. Membrane alterations. Photochem. Photobiol. 1986, 44, 461-469.

26. Shah К., Gadella T.W. J.r, van Erp H., Hecht V., de Vries S.C. Subcellular localization and oligomerization of the Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor kinase 1 protein. J. Mol.Biol. 2001,309,641-655.

27. Feofanov A., Sharonov S., Valisa P., Da Silva E., Nabiev I., Manfait M. A new confocal stigmatic spectrometer for micro-Raman and micro-fluorescence spectral imaging analysis. Design and applications. Rev. Sci. Instrum. 1995, 66, 3146-3158.

28. Sharonov S., Chourpa I., Valisa P., Fleury F., Feofanov A., Manfait M. Confocal spectral imaging analysis. European Microscopy and Analysis. 1994,11,23-25.

29. Sharonov S., Nabiev I., Chourpa I., Feofanov A., Valisa P., Manfait M. Confocal 3D- scanning laser Raman/SERS/ fluorescence microprobe. Spectral imaging and high- resolution applications. J.Raman Spectroscopy. 1994,25,699-707.

30. Sharonov S., Chourpa I., Morjani H., Nabiev I., Manfait M. and Feofanov A. Confocal spectral imaging analysis: a new concept for studies of spatial distribution of antitumor drugs within living cancer cell. Anal. Chim. Acta. 1994, 290, 40-47.

31. Millot J.M., Pingret L., Angiboust J.F., Bonhomme A., Pinon J.M., Manfait M. Quantitative determination of free calcium in subcellular compartments, as probed by Indo-1 and confocal microspectrofluorometry. Cell. Calcium. 1995, 17,354-366.

32. Berg R.H. Evaluation of spectral imaging for plant cell analysis. J. Microscopy 2004, 214, 174181.

33. Mellors R.C., Hlinka J. The cellular localization of material after administration of the carcinogen P-naphthylamine: fluorescence microscopy of epithelial cells of bladder. Cancer. 1952, 5, 242248.

34. Kohen E., Kohen C., Hirschberg J.G. Microspectrofluorometry of carcinogens in living cells. Histochemistry. 1983,79,31-52.

35. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. The effect of intracellular oxygen on the metabolization of benzo(a)pyrene and benzo(k)fluoranthene. A microspectrofluorometric analysis in single living cells. Histochemistry. 1974, 42, 75-84.

36. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. Microspectrofluorometric study of benzo(a)pyrene metabolization in benzo(a)pyrene-grown single living cells. Histochemistry. 1974, 42, 85-98.

37. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. A microspectrofluorometric approach for the study of benzo(a)pyrene and dibenzo(a, h)anthracene metabolization in single living cells. Histochemistry. 1974,42,61-74.

38. Lahmy S., Salmon J.M., Viallet P. Microspectrofluorometric comparison of benzo(a)pyrene and dibenzo(c,h)acridine metabolism in single living 3T3 fibroblasts. J. Histochem. Cytochem. 1987, 35, 197-201.

39. Moreno G., Salet C., Kohen C., Kohen E. Penetration and localization of furocoumarins in single living cells studied by microspectrofluorometry. Biochim. Biophys. Acta. 1982, 721, 109-11.

40. Gigli M., Doglia S.M., Millot J.M., Valentini L., Manfait M. Quantitative study of doxorubicin in living cell nuclei by microspectrofluorometry. Biochim. Biophys. Acta. 1988, 950,13-20.

41. Millot J.M., Rasoanaivo T.D., Morjani H., Manfait M. Role of the aclacinomycin A-doxorubicin association in reversal of doxorubicin resistance in K562 tumour cells. Br. J. Cancer. 1989, 60, 678-684.

42. Abdellaoui K., Boustta M., Vert M., Morjani H., and Manfait M. Metabolite-derived artificial polymers designed for drug targeting, cell penetration and bioresorption. Eur. J. Pharmac. Sciencies. 1998, 6, 61-73.

43. Millot J.-M., Sharonov S., Manfait M. Scanning microspectrofluorometry of rhodamine 123 in multidrug-resistant cells. Cytometry. 1994, 17, 50-58.

44. Jacquot J., Maizieres M., Spilmont C., Millot J.M., Sebille S., Merten M., Kammouni W., Manfait M. Intracellular free Ca2+ dynamic changes to histamine are reduced in cystic fibrosis human tracheal gland cells. FEBS Lett. 1996, 386, 123-127.

45. Maizieres M., Kaplan H., Millot J.M., Bonnet N., Manfait M., Puchelle E., Jacquot J. Neutrophil elastase promotes rapid exocytosis in human airway gland cells by producing cytosolic Ca2+ oscillations. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998, 18, 32-42.

46. Sebille S., Millot J.M., Maizieres M., Arnaud M., Delabroise A.M., Jacquot J., Manfait M. Spatial and temporal Mg2+ signaling in single human tracheal gland cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996,227,743-749.

47. Thomas J., Millot J.M., Sebille S., Delabroise A.M., Thomas E., Manfait M., Arnaud M.J. Free and total magnesium in lymphocytes of migraine patients effect of magnesium-rich mineral water intake. Clin. Chim. Acta. 2000, 295, 63-75.

48. Pereira M., Millot J.M., Sebille S., Manfait M. Inhibitory effects of extracellular Mg2+ on intracellular Ca2+ dynamic changes and thapsigargin-induced apoptosis in human cancer MCF7 cells. Mol. Cell. Biochem. 2002, 229, 163-171.

49. Kohen E., Kohen C., Reyftmann J.P., Morliere P., Santus R. Microspectrofluorometry of fluorescent photoproducts in photosensitized cells. Relationship to cellular quiescence and senescence in culture. Biochim. Biophys. Acta. 1984, 805, 332-336.

50. Chernyaeva E.B., Vardanyan A.G., Koroteev N.I., Kamalov V.F., Lobanov O.V., Mironov A.F., Rumyanzeva V.D. Laser picosecond microspectrofluorometry of haematoporphyrin in cells and liposomes. J. Photochem. Photobiol. B. 1991, 10, 239-248.

51. Morlet L., Vonarx V., Foultier M.T., Gouyette A., Stewart C., Lenz P., Patrice T. In vitro and in vivo spectrofluorometry of a water -soluble meta-(tetrahydroxyphenyl)chlorin (m-THPC) derivative. J. Photochem. Photobiol. B. 1997, 39, 249-257.

52. Rousset N., Vonarx V., Eleoue S., Carre J., Bourre L., Lajat Y., Patrice T. Cellular distribution and phototoxicity of benzoporphyrin derivative and Photofrin. Res. Exp. Med. 2000, 199, 341-357.

53. Jacobson I. W., Simpson D.M. The fluorescence spectra of pterins and their possible use in the elucidation of the antipernicious anemia factor. Biochem. J. (London) 1946, 40, 3-14.

54. Kohen E., Thorell B. Kohen C., Salmon J.M. Studies on metabolic events in localized compartments of the living cell by rapid microspectrofluorimetry. In: Advances in biological and medical physics. Acad. Press, 1974, 15, 271-297.

55. Kohen E., Kohen C., Hirschberg J.G., Wouters A.W., Thorell В., Westerhoff H.V., Charyulu K.K. Metabolic control and compartmentation in single living cells. Cell. Biochem. Funct. 1983, 1, 316.

56. Bondza-Kibangou P., Millot C., Dufer J., Millot J.M. Microspectrofluorometry of autofluorescence emission from human leukemic living cells under oxidative stress. Biol. Cell. 2001,93,273-280.

57. Millot C., Bondza-Kibangou P., Millot J.M., Lallemand A., Manfait M. Autofluorescence spectroscopy of malpighian epithelial cells, as a new tool for analysis of cervical cancer precursors. Histol. Histopathol. 2003, 18, 479-485.

58. Верболович H.A. Миоглобип и его роль в физиологии и патологии животных и человека. Москва: Медгиз, 1961.

59. Peng, Q., Berg, К., Moan, J., Kongshaug, M., and Nesland, J. M. 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principles and experimental research. Photochem. Photobiol. 65, 235-251, 1997.

60. Карнаухов B.H. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. Москва, Наука, 2001.

61. Rabaste F., Sancelme M., Delort A.-M., Blais J., Bolard J. Intracellular pH of Candida albicans blastospores as measured by laser microsectrofluorimetery and 31P-NMR. Biochem. Biophys. Acta. 1995, 1268,41-49.

62. Brigui I., Djavanbakht-Samani Т., Jolles В., Pigaglio S., Laigle A. Minimally modified phosphodiester antisense oligodeoxyribonucleotide directed against the multidrug resistance gene mdrl. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 747-754.

63. Zimmermann Т., Rietdorf J., Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Let. 2003, 546, 87 -92.

64. Filatov A.V., Shmigol I.В., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Volkov Y. Direct and indirect antibody-induced TX-100 resistance of cell surface antigens. Immunol. Lett. 2003, 85, №3, 287295.

65. Feofanov A., Grichine A., Shitova L., Karmakova Т., Yakubovskaya R., Egret-Charlier M., Vigny P. Confocal Raman microspectroscopy and imaging study of theraphthal in living cancer cells. Biophys. J. 2000, 78, 1, 499-512.

66. Feofanov A., Grichine A., Shitova L., Karmakova Т., Yakubovskaya R. Intracellular distribution and states of a new anticancer agent teraftal as investigated with confocal Raman imaging technique. Asian J. Spectrosc. 1999, 3, 23-31.

67. Водовозова E. Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко P.B., Пазыпина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Ю.Г. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы человека. Биологические мембраны. 2004, 21, №1, 5364.

68. Feofanov A.V., Sharonov G.V., Astapova M.V., Rodionov D.I., Utkin Yu.N., Arseniev A.S. Cancer cell injury by cytotoxins from cobra venom is mediated through lysosomal damage. Biochem. J. 2005 ,390 (Pt 1), 11-18.

69. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "Kindling Fluorescent Protein" riddle. J. Biol. Chem. 2003, 278, №9, 7215-7219.

70. Feofanov A., Charonov S., Kudelina I., Fleury F., and Nabiev I. Localization and molecular interactions of mitoxantrone within living K562 cells as probed by confocal spectral imaging analysis. Biophys. J. 1997, 73, 3317-3327.

71. Filyasova A., Kudelina I.A., Feofanov A.V. A spectroscopic study of interaction of tetrasulfonated aluminum phthalocyanine with human serum albumin. J. Mol. Struct. 2001, 565-566, 173-176.

72. Feofanov A., Charonov S., Fleury F., Kudelina I., Nabiev I. Confocal spectral imaging analysis of intracellular interactions of mitoxantrone at the different phases of cell cycle. Anticancer Res. 1999, 19,5341-5348.

73. Mewes K., Blanz J., Ehninger G., Gebhard R., Zeller K.-P. Cytochrome Р-450-induced cytotoxicity of mitoxantrone by formation of electrophilic intermediates. Cancer Res. 1993, 53, 5135-5142.

74. Galanina О., Feofanov A., Tuzikov А.В., Rapoport Е., Crocker P.R., Grichine A., Egret-Charlier М., Vigny P., Le Pendu J., Bovin N. Fluorescent carbohydrate probes for cell lectins. Spectrochimica Acta. 2001, 57, 2285-2296.

75. Forouhar F., Huang W.N., Liu J.H., Chien K.Y., Wu W.G., Hsiao C.D. Structural basis of membrane-induced cardiotoxin A3 oligomerization. J. Biol. Chem. 2003, 278, 21980-21988.

76. Wang L.H., Rothberg K.G., Anderson R.G. Mis-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pit formation. J. Cell. Biol. 1993, 123, 1107-1117.

77. Haugland R.P. Handbook of fluorescence probes and research products. Edition 8. 2001 Molecular Probes Inc., Eugene, USA

78. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M. R. Interaction of a new antitumor agent, l-4-dihydroxy-5,8-bis-[2-(2-hydroxyethyl)-amino.ethyl]amino]-9,10-anthracenedione, with nucleic acids. Biochem. Pharmacol. 1981,30,231-240.

79. Reszka K., Kolodziejczyk P., Lown J.W. Horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of mitoxantrone: spectrophotometric and electron paramagnetic resonance studies. J. Free Rad. Biol. Med. 1986, 2,25-32.

80. Bors W., Saran M., Lengfelder E., Michel C., Fuchs C., Frenzel C. Detection of oxygen radicals in biological reactions. Photochem. Photobiol. 1978, 28, 629-638.

81. Blum A. Grossweiner L.I. Singlet oxygen generation by hematoporphyrin IX, uroporphyrin I and hematoporphyrin derivative at 546 nm in phosphate buffer and in the presence of egg phosphatidylcholine liposomes. Photochem. Photobiol. 1985, 41, 27-32.

82. Usui Y., Kamogawa K. A standard system to determine the quantum yield of singlet oxygen formation in aqueous solution. Photochem. Photobiol. 1974,19, 245-247.

83. Petyaev I.M., James V.H. Micellar acceleration of oxigen-dependent reactions and its potential use in the study of human low density lipoprotein. Biochimica. et Biophysica Acta. 1997, 1345, 293-305.

84. Weng M., Zhang M.-H., Shen T. Electron transfer interaction between hypocrellin A and biological substrates and quantitative analysis of superoxide anion radicals. J Chem. Soc., Perkin Trans. 1997, 2, 2393-2397.

85. Takahashi M., Furukawa Т., Nikkuni K., Aoki A., Nomoto N. Efficient introduction of a gene into hematopoietic cells in S-phase by electroporation. Exp. Hematol. 1991,19,343-348,

86. Ehninger G., Schuler U., Proksch В., Zeller K.-P., Blanz J. Pharmacokinetics and metabolism of mitoxantrone. A review. Clin. Pharmacokinet. 1990, 18, 365-380.

87. Faulds D., Balfour J.A., Chrisp P., Langtry H.D. Mitoxantrone. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic potential in the chemotherapy of cancer. Drugs. 1991, 41, 400-449.

88. Smith P. J., Morgan S. A., Fox M. E., Watson J. V. Mitoxantrone-DNA binding and the induction of topoisomerase II associated DNA damage in multi-drug resistant small cell lung cancer cells. Biochem. Pharmacol. 1990,40, 2069-2078.

89. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z. Interactions of antitumor agents ametatrone and mitoxantrone (Novatrone) with double-stranded DNA. Clinical Pharmacol. 1985, 34, 4203-4213.

90. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z. Relationship between the pharmacological activity of the antitumor drugs ametantrone and mitoxantrone and their ability to condense nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, 83, 6302-6306.

91. Roberts R. A., Cress A. E., Dalton W. S. Persistent intracellular binding of mitoxantrone in a human colon carcinoma cell line. Biochem. Pharmacol. 1989, 38, 4283-4290.

92. Но С. K., Law S. L., Chiang H., Hsu M. L., Wang С. C., Wang S.Y. Innhibition of microtubule assembly is a possible mechanism of action of mitoxantrone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 180,118-123.

93. Бурштейн E.A. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования). Серия Биофизика . 1976, Т.6. Под ред. Ю.А. Владимирова, ВИНИТИ, Москва.

94. Reszka К., Hartley J.A., Kolodziejczyk P., Lown J. W. Interaction of the peroxidase-derived metabolite of mitoxantrone with nucleic acids. Evidence for covalent binding of I4C-IabeIed drug. Biochem. Pharmacol. 1989, 38,4253-4260.

95. Saenger W. Principles of Nucleic Acid Structure. Springer-Verlag, New York. 1984.

96. Bhalla K., Ibrado A.M., Tourkina E., Tang C., Grant S., Bullock G., Huang Y., Ponnathpur V., Mahoney M.E. High-dose mitoxantrone induces programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukaemia cells. Blood. 1993, 82, 3133-3140.

97. Sumner A.T. Inhibitors of topoisomerase II delay progress through mitosis and induce a doubling of the DNA content in CHO cells. Exp. Cell. Res. 1995, 217, 440-447.

98. Downes C.S., Mullinger A.M., Johnson R.T. Inhibitors of DNA topoisomerase II prevent chromatid separation in mammalian cells but do not prevent exit from mitosis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1991,88,8895-8899.

99. Dougherty T. J., Gomer C. J., Henderson B. W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1998,90,889-905.

100. Brasseur N., All Н., Langlois R., Wagner J. R., Rousseau J., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines-V. Photodynamic therapy of EMT-6 mammary tumors in mice with sulfonated phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 581-586.

101. Sonoda M., Krishna С. M., Riesz P. The role of singlet oxygen in the photohemolysis of red blood cells sensitized by phthalocyanine sulfonates. Photochem. Photobiol. 1987, 46, 625-631.

102. Evensen J. F., Moan J. A test of different photosensitizers for photodynamic treatment of cancer in a murine tumor model. Photochem. Photobiol. 1987, 46, 859-865.

103. Abernatey C.D., Anderson R.E., Kooistra K.L., Laws E.R. (Jr) Activity of phthalocyanine photosensitizers agains human glioblastoma in vitro. Neurosurgery. 1987, 21, 468-473.

104. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol. 1991, 53, 859870.

105. Brasseur N., Ali Н., Autenrieth D., Langlois R., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines- III. Photoinactivation of V-79 Chinese hamster cells by tetrasulfophthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1985,45, 515-521.

106. Langlois R., Ali H., Brasseur N., Wagner J.R., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines-IV. Type II sensitized photooxidation of L-tryptophan and cholesterol by sulfonated metallo phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1986,44, 117-123.

107. Spikes J. D. Phthalocyanines as photosensitizers in biological systems and for the photodynamic therapy of tumors. Photochem. Photobiol. 1986,43, 691-699.

108. Kraljic I., El Mohsni S. A new method for the detection of singlet oxygen in aqueous solutions. Photochem. Photobiol. 1978, 28, 577-581.

109. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol. 1996, 64, 469-485.

110. Margaron P., Gregoire M.-J., Scasnar V., Ali H., van Lier J. E. Structure-photodynamic activity relationships of a series of 4-substituted zinc phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1996, 63, 217-223.

111. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов. Росс. хим. журн. 1998, 42, №5, 23-35.

112. Sternberg E.D., Dolphin D., Bruckner C. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron. 1998, 54,4151-4202.

113. Лукьянец E.A. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Росс. хим. журн. 1998, 42, №5, 9-16.

114. Oseroff A.R., Ohuoha D., Hasan Т., Bommer J. C., Yarmush M. L. Antibody-targeted photolysis: selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, 83, 8744-8748.

115. Borland C. F., McGarvey D. J., Morgan A. R., Truscott T. G. Laser flash photolysis of purpurins: novel potential photosensitizers of interest in photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B. 1988,2,427-434.

116. Morgan A. R., Garbo G. M., Truscott T.G. Photophysical and photochemical properties of purpurins. Proc. Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1988, 847, 172-179.

117. Zweytick D., Athenstaedt K., Daum G. Biochim. Biophys. Acta. 2000,1469, 101-120.

118. Gederaas O.A., Holroyd A., Brown S. В., Vernon D., Moan J., Berg K. 5-Aminolaevulinic acid methyl ester transport on amino acid carriers in a human colon adenocarcinoma cell line. Photochem. Photobiol. 2001, 73, 164-169

119. Peklmans L., Helenius A. Endocytosis via caveolae. Traffic. 2002, 3, 311-320.

120. Rothberg K.G., Heuser J. E., Donzell W.C., Ying Y.S., Glenney J.R., Anderson R.G. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 1992, 68, 673-682.

121. Rodal S.K., Skretting G., Garred O., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. Extraction of cholesterol with methyl-beta-cyclodextrin perturbs formation of clathrin-coated endocytic vesicles. Mol. Biol. Cell. 1999, 10, 961-974.

122. Subtil A., Gaidarov I., Kobylarz K., Lampson M. A., Keen J. H., McGraw Т. E. Acute cholesterol depletion inhibits clathrin-coated pit budding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 6775-6780.

123. Sofer A., Futerman A.H. Cationic amphiphilic drugs inhibit the internalization of cholera toxin to the Golgi apparatus and the subsequent elevation of cyclic AMP. J. Biol. Chem. 1995, 270, 1211712122.

124. Liscovitch M., Lavie Y. Sphingoid bases as endogenous cationic amphiphilic "drugs". Biochem. Pharmacol. 1991,42, 2071-2075.

125. Marzo I., Susin S.A., Petit P.X., Ravagnan L., Brenner C., Zamzami N., Kroener G. Caspases disrupt mitochondrial membrane barrier function. FEBS Lett. 1998, 427, 198-202.

126. Skulachev V. P. Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades. FEBS Lett. 1998, 423, 275-280.

127. Kramer B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 2001, 21, 4271-4277.

128. Cramer P., Ruevekamp M., Oppelaar H., Dalesio O., Baas P., Stewart F.A. Foscan uptake and tissue distribution in relation to photodynamic efficacy. Br. J. Cancer. 2003, 88, 283-290.

129. Kelleher D. K., Thews O., Scherz A., Salomon Y., Vaupel P. Perfusion, oxygenation status and growth of experimental tumors upon photodynamic therapy with Pd-bacteriopheophorbide. Int. J. Oncol. 2004,24, 1505-1511.

130. Rovers J. P., de Jode M. L., Rezzoug H., Grahn M. F. In vivo photodynamic characteristics of the near-infrared photosensitizer 5,10,15,20-tetrakis(m-hydroxyphenyl) bacteriochlorin. Photochem. Photobiol. 2000, 72, 358-364.

131. Mironov A. F., Grin M. A., Tsiprovskiy A. G., Kachala V. V., Karmakova T. A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R. I. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring. J. Porphyr. Phthalocya. 2003, 7, 725-730.

132. Mironov A. F., Grin M. A., Tsyprovskiy A. G. Synthesis of the first N-hydroxy cycloimide in the bacteriochlorophyll a series. J. Porphyr. Phthalocya. 2002, 6, 358-361.

133. Mironov A.F., Kozyrev A. F., Brandis A. N. A. S. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives. Proc. SPIE. 1922,204-208.

134. Chen Y., Grahm A., Potter W., Morgan J., Vaughan L., Bellnier D. A., Henderson B.W., Oseroff A., Dougherty T. J., Pandey R. K. Bacteriopurpurinimides: highly stable and potent photosensitisers for photodynamic therapy. J. Med. Chem. 2002, 45, 255-258.

135. Chen Y., Sumlin A., Morgan J., Gryshuk A., Oseroff A., Henderson B.W., Dougherty T. J., Pandey R.K. Synthesis and photosensitizing efficacy of isomerically pure bacteriopurpurinimides. J.Med. Chem. 2004,47,4814-4817.

136. Baumler W., Abels C., Karrer S., WeiB Т., Messmann H., Landthaler M., Szeimies R.M. Photo-oxidative killing of human colonic cancer cells using indocyanine green and infrared light. Brit. J. Cancer. 1999, 80, 360-363.

137. Woodburn K.W., Fan Q., Kessel D., Luo Y., Young S.W. Photodynamic therapy of B16F10 murine melanoma with lutetium texaphyrin. J. Invest. Dermatol. 1998, 110, 746-751.

138. Mito K. Photodynamic efficiency of macrophage activity using a photosensitizer, lumin, with near-IR laser light for photoimmunotherapy of a cancer. Front. Med. Biol. 1996, 7, 81-92.

139. Soncin M., Busetti A., Biolo R., Jori G., Kwag G., Li Y.S., Kenney M.E., Rodgers M.A. Photoinactivation of amelanotic and melanotic melanoma cells sensitized by axially substituted Si-naphthalocyanines. J. Photochem. Photobiol. Biol. 1998,42,202-210.

140. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G., Kachala V.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring. J. Porphyr. Phthalocya. 2003, 7,725-730.

141. Nichols M. G., Foster Т. H. Oxygen diffusion and reaction-kinetics in the photodynamic therapy ofmulticell tumor spheroids. Phys. Med. Biol. 1994,39,2161-2181.

142. Pogue B.W., Ortel В., Chen N., Redmond R.W., Hasan T. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorins. Cancer Res. 2001,61,717-724.

143. Georgakoudi I., Nichols M. G., Foster Т. H. The mechanism of Photofrin photobleaching and its consequences for photodynamic dosimetry. Photochem. Photobiol. 1997,65, 135-144.

144. Chen L.B. Fluorescent labeling of mitochondria. In: Wang Y.-L., Lansing TD, eds. Fluorescent microscopy of living cells in culture. Part A. San Diego: Academic Press, Inc. 1989, 103- 123.

145. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta. 1998, 1363, 100-124.