Механизмы токсического действия глутамата в нейронах коры головного мозга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Миронова, Елена Викторовна

• Миронова, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Миронова, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и функционирование глутаматергических синапсов.

1.1.1 Явление синаптической пластичности.

1.1.2. Дендритные шипики.

1.2. Классификация и молекулярно-структурная организация рецепторов глутамата.

1.3. Апоптоз и некроз - два варианта клеточной гибели.

1.3.1 Пути гибели клетки (морфологические различия).

4 1.3.2. Апоптоз.

1.3.2.1. Индукторы и ингибиторы апоптоза.

1.3.3. Молекулярные механизмы апоптоза.

1.4 Нейротоксическое действие глутамата.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ.

2.1. Получение животных с датированным сроком беременности.

2.2. Приготовление первичной культуры.

2.3. Идентификация нейронов.

2.4. Получение иммуноцитохимического материала.

2.5. Исследование нейродегенерации методом световой микроскопии.

2.6. Исследование нейродегенерации методом люминесцентной и конфокальной микроскопии.

2.7. Количественная оценка экспрессии синаптоподина.

2.8. Оборудование и обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Рецепторные механизмы нейродегенерации путем некроза при действии Глу и его агонистов при ТС тесте на нейронах.

3.2. Пути апоптоза индуцируемые активацией различных подтипов рецепторов Глу.

3.2.1. Выявление гибели по механизму некроза и апоптоза на живой культуре нейронов с использованием витального флуоресцентного кита.

3.2.2. Анализ механизмов апоптоза методом иммуноцитохимии при активации различных типов Глу-Р.

3.3. Исследование динамики экспресии синаптоподина при действии ЫМБА.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы токсического действия глутамата в нейронах коры головного мозга»

Актуальность проблемы.

В настоящее время сформировались представления о том, что глутамат (Глу) (анион глутаминовой кислоты), является основным возбуждающим медиатором в синапсах ЦНС млекопитающих (Ашмарин, Стукалов, 1996; Walkins, Evans, 1981; Fonnum 1984; Headley, Grillner, 1990; Collingridge, Singer, 1990; Nakanishi, 1992), а так же в нервно-мышечных синапсах членистоногих (Магазаник и др., 1984; Антонов, 1989; Lunt, Olsen, 1988). Вопреки нормальной функции, в условиях длительного действия Глу и чрезмерной активации его рецепторов могут развиваться патологические состояния, связанные с гибелью нейронов. Как нормальная медиаторная функция, так и запуск цепной реакции нейродегенеративных процессов осуществляется через активацию одних и тех же рецепторов глутамата. Знание этих процессов представляется важным как с точки зрения теоретической науки, так и практической медицины. Установлено, что гиперактивация глутаматных рецепторов, следствием которой является нейродегенерация, проявляется в таких острых патологических состояниях мозга, как инсульт и связанная с ним ишемия, аномальная активность возбуждающих связей (судорожные состояния и болезнь Паркинсона), при нарушении целостности клеток (черепно-мозговая травма), а также при хронических нейродегенеративных заболеваниях, например, болезнь Альцгеймера (Meldrum, 1993; Mitchell et al., 1994; Pollard et al., 1994; Pellegrini-Giampietro et al., 1997; Lipton, 1999; Yu et al., 1999).

Поскольку исследование механизмов патологических состояний на целом мозге, из-за его сложной структурной организации, затруднено, для анализа путей реализации токсического действия глутамата часто используют культуры нейронов. Проведение подобных исследований представляется весьма своевременным, современным, актуальным и позволяет, наряду с внутриклеточными механизмами, изучать изменения

• межнейронных взаимодействий в нейронной сети.

Нейродегенерация является заключительным этапом комплексной дисфункции нервной ткани. В ходе её развития происходят значительные нарушения в системе биосинтеза нейромедиаторов, их аккумуляции в синаптических пузырьках, захвате в нервные терминали и глиальные клетки. Эти процессы имеют пресинаптическую локализацию, так как происходят в пресинаптических нейронах и глиальных клетках, являющихся источником глутамата в ЦНС. Их нарушения вызывают существенное повышение свободной концентрации глутамата в межклеточном пространстве (ЬСЪоёогоу, 2004). К постсинаптическим факторам нейродегенерации относятся: активация различных типов рецепторов глутамата и деполяризация нейронов, нарушение мембранных ионных градиентов и вход значительного количества кальция в клетки, который запускает летальные процессы внутриклеточной сигнализации, приводящие к активизации апоптотических путей гибели нейрона.

Хотя многие из перечисленных процессов изучались на изолированных клетках, остается открытым вопрос, каким образом происходит их взаимодействие на уровне системы клеток и нейронных сетей в экстремальных условиях длительных воздействий глутамата. Исследованию рецепторных механизмов токсического действия глутамата, некротического и апоптотического путей гибели нейронов и вовлеченности синаптической пластичности в нейротоксическое действие посвящена эта работа.

Целью работы было исследование нейротоксического действия глутамата на нейроны коры, зависимости динамики нейродегенерации от концентраций глутамата, а также подтипов рецепторов, синаптических и внутриклеточных механизмов, вовлеченных в процессы индукции нейронной гибели по механизму некроза и апоптоза.

Конкретные задачи исследования. Настоящая работа была направлена на решение нескольких связанных между собой задач:

1. В опытах на первичной культуре ткани нейронов коры большого мозга крыс исследовать динамику и концентрационную зависимость нейродегенерации, вызываемой глутаматом, с использованием витального красителя на некроз - трипанового синего;

2. С применением избирательных агонистов (NMDA, АМРА и КА) рецепторов глутамата и их антагонистов (АФ5 и CNQX) исследовать рецепторные механизмы индукции некротических процессов при токсическом действии различных концентраций глутамата;

3. Разработать витальный флуоресцентный кит для автоматического анализа клеточных популяций на соотношение живых, погибших по механизму некроза и апоптотических клеток для конфокальной микроскопии;

4. Провести количественную оценку апоптоза на живой ткани с использованием витального флуоресцентного кита и с применением иммуноцитохимического метода. Исследовать возможные различия путей развития апоптоза, при его индукции избирательной активацией NMDA и АМРА/КА рецепторов;

5. Применяя моноклональные антитела на синаптоподин -белок шипикового аппарата, исследовать возможное изменение уровня его экспрессии при нейротоксическом эффекте глутамата и его агонистов.

Научная новизна:

- Разработан новый витальный кит для идентификации некроза и апоптоза, а также их автоматической количественной оценки, заключающийся в последовательном прокрашивании флуорохромами 7 акридиновым оранжевым и бромистым этидием (АО/БЭ-кит) живых нейронов коры в культуре ткани. Поскольку, пути гибели клеток различной тканевой принадлежности сходны, этот кит может широко применяться для анализа клеточных популяций в условиях патологии и нормального развития в любых живых тканях.

- Впервые продемонстрирована зависимость механизмов апоптоза от рецепторов глутамата: активация ЫМОА рецепторов вызывает апоптоз, развивающийся без участия каспаз, а АМРА/КА рецепторов - по каспазозависмому пути.

- Показано, что на начальном этапе развития нейродегенерации происходит существенное увеличение зон экспрессии синаптоподина, что может говорить о существенном изменении функционального состояния дендритов.

Научно-практическая ценность.

Разработанный в процессе исследования кит может применяться для экспресс анализа клеточных состояний любых живых тканей.

Полученные данные расширяют представления о молекулярных механизмах нейротоксического действия глутамата, вызываемого комплексными нарушениями физико-химических условий функционирования нейронов при участии разнообразных транспортных и рецепторных систем плазматических мембран, а также многих каскадов внутриклеточной сигнализации, и являющегося неизбежным этапом патогенеза большого числа заболеваний ЦНС. Результаты проведенных исследований существенно дополняют представления о влиянии глутамата и его агонистов на синаптогенез нейронов.

Данные о механизмах нейродегенерации при активации глутаматных рецепторов, а также автоматический анализ с помощью разработанного в процессе исследования АО/БЭ кита, для оценки различных механизмов гибели клеток, могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс нормальной и патологической физиологии при рассмотрении вопросов гомеостаза, нарушений клеточной

• рецепции, механизмов апоптоза и некроза.

Положения выносимые на защиту.

На начальном этапе действия Глу гибель нейронов происходит по механизму некроза. Эффект пороговой концентрации Глу (1 мМ) реализуется через NMDA рецепторы. Повышение концентрации Глу (3 мМ) сопровождается вовлечением АМРА/КА рецепторов в индукцию некротических процессов.

При длительном воздействии (более 240 мин) Глу начинают проявляться апоптотические процессы. Причем, механизм развития апоптоза (каспазный и некаспазный) определяется типом активируемых рецепторов Глу.

На начальном этапе действия NMDA, происходит существенное увеличение экспресии белка шипикового аппарата - синаптоподина, что отражает значительное изменение функционального состояния дендритов.

Апробации работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004); I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005); XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2006).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 9 печатных работ.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Миронова, Елена Викторовна

выводы

1. В первичной культуре нейронов коры большого мозга крыс (7 суток in vitro) нейротоксическое действие 1 мМ Глу реализуется через NMDA рецепторы, а 3 мМ и 10 мМ Глу - через АМРА и КА рецепторы.

2. Использование акридина оранжевого и бромистого этидия (АО/БЭ-кит) наряду с некрозом позволяет анализировать апоптотические процессы на живой культуре нейронов, при этом количественная оценка, как некроза, так и апоптоза совпадает со стандартными методами идентификации по ТС-тесту и иммуноцитохимической реакции на Р53.

3. При обработке культуры нейронов коры агонистами Глу-Р гибель клеток на начальном этапе происходит по механизму некроза. В дальнейшем (более 240 мин) начинает выявляться апоптоз и гибель нейронов осуществляется по обоим механизмам.

4. Активация NMDA рецепторов вызывает апоптоз, развивающийся без участия каспаз. При активации АМРА и КА рецепторов апоптоз развивается по каспазному пути.

5. На начальном этапе (120 мин) действия NMDA на нейроны в дендритах происходит значительное повышение (в 5 раз и более) плотности зон экспрессии белка шипикового аппарата -синаптоподина. В дальнейшем плотность экспресии этого белка начинает падать.

Заключение.

В культуре нейронов в условиях, когда нейродегенерация вызывается действием NMDA, на начальном этапе происходит значительное увеличение (почти 5-кратное) плотности зон экспресии белка шипивого аппарата - синаптоподина. Это, вероятно, отражает значительные функциональные изменения дендритов нейронов. Позднее, начиная с 180 мин воздействия NMDA, плотность зон экспрессии синаптоподина на вторичных дендритах начинает падать. По-видимому, такая динамика является результатом того, что наиболее подвержены нейротоксическому действию дендриты и нейроны, обладающие наибольшим уровнем экспресии синаптоподина.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ

Для анализа процессов нейродегенерации в наших исследованиях идентификация гибели нейронов осуществлялась двумя методами. Применение световой микроскопии позволило выявить клетки с разрушенной плазматической мембраной. В качестве маркера погибших клеток в культуре использовался краситель - трипановый синий. Данный метод применялся ранее для изучения нейродегенерации (Uliasz, Hewett, 2000).

Обнаружено, что нейротоксический эффект Глу на нейронах является концентрационно зависимым. В отличие от Глу, нейротоксическое действие NMDA не зависело от концентрации. Это обстоятельство не кажется удивительным, поскольку NMDA активирует только один тип Глу-Р и 3 цМ NMDA является концентрацией, близкой к насыщающей, т.е. вызывающей ответ нейрона, близкий к максимальной амплитуде. Насыщающей концентрацией является 30 jliM NMDA (Gibb, Colquhoun, 1992; Kleckner, Pallotta, 1995). Эффект 1 мМ Глу потенциировался коагонистом NMDA-R - Гли, ингибировался конкурентным антагонистом NMDA-R - АФ5, и существенно ослаблялся в присутствии 2 мМ Mg2+ в физиологическом растворе так же, как и нейротоксический эффект NMDA. Такая фармакологическая чувствительность эффектов «низкой» концентрации Глу свидетельствует о ведущей роли NMDA-R в запуске нейродегенеративных процессов при этих экспериментальных условиях и согласуется с данными о том, что NMDA-R активируются Глу в существенно меньших концентрациях (микромолярном диапазоне) по сравнению с другими Глу-Р, которые • активируются в милимолярном диапазоне (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al., 1999). Резистентность эффектов 3 мМ Глу к NMDA-R-специфичным веществам, вероятно, предполагает участие других Глу-Р в реализации нейротоксического действия.

Действительно, активация АМРА-11 и КА-Л. вызывала нейродегенерацию. Это может объяснить резистентность эффектов «больших» концентраций Глу к фармакологическим агентам, избирательным по отношению к ИМОА-Я. Поскольку 30 цМ и 300 цМ КА являются концентрациями насыщающими (0^1есИпе е1 а1., 1999), концентрационной зависимости эффектов КА обнаружено не было. Это также может говорить об отсутствии побочного неспецифического действия больших концентраций КА на нейроны. Нейротоксическое действие АМРА, в отличие от КА, было выражено слабо и приводило к гибели около 20 % нейронов в культуре. Однако, совместное действие АМРА и циклотиазида, который, как известно, предотвращает десенситизацию АМРА-11 (Райт е1 а1., 1993), существенно усиливало нейротоксичность АМРА, и количество погибших нейронов становилось сопоставимым с таковым для КА. Исходя из этого, низкая нейротоксическая эффективность АМРА, по-видимому, может объясняться устойчивой десенситизацией АМРА-11 при активации этим агонистом (От§1ес1те е1 а1., 1999). Напротив, при активации АМРА-11 КА десенситизация рецепторов слабо выражена (Юэкш е1 а1., 1986), так как интегральный ток клетки, вызванный КА, на уровне равновесия существенно превышает ток, вызванный АМРА. Характерно то, что СИС)Х защищал нейроны от нейродегенерации как в случае АМРА, так и в случае КА.

Таким образом, на нейронах коры головного мозга крыс, находящихся в культуре на протяжении 7 дней, что соответствует стадии развивающихся нейронов, выявлены две компоненты нейротоксического действия Глу. Одна компонента связана с активацией №УГОА-11 и проявляется при «низкой» концентрации Глу. Другая связана с активацией АМРА-11 и проявляется, по-видимому, только при «высоких» концентрациях Глу. К сожалению, в результате того, что КА способен активировать также АМРА-Я, а СИС^Х ингибировать АМРА-11 и КА-Л

Antonov et al., 1991), т.е. оба этих вещества не являются избирательными по отношению к KA-R, трудно сделать однозначный вывод относительно вклада KA-R в нейродегенерацию.

Изучение природы процессов и степени изменений, происходящих в клетках и клеточных структурах при различных физиологических состояниях, включая и патогенные, позволяет полнее понимать морфо-функциональные процессы в развития, при нормальном функционировании, и в условиях повреждения и регенерации ЦНС. В последнее время становятся доступными разнообразные красители (Noraberg et al., 1999), биохимические методы (Bergmeyer, Bernt, 1974, Koh, Choi, 1987; Uliasz, Hewett, 2000) и их сочетания для оценки динамики жизни и гибели клетки, многие из которых имеют свои достоинства и недостатки.

В данной работе мы используем экспериментальный подход, позволяющий быстро распознать механизм гибели нейронов (некроз или апоптоз) и провести количественный анализ. Данный метод анализа нейродегенерации с применением конфокальной микроскопии в сочетании с флуоресцентным зондом, не является тривиальным, и удобен тем, что оценка клеточного состояния не требует фиксации клеток, диссоциации клеток культуры и разрушения нейронной сети, а также какого-либо другого биохимического воздействия. В качестве кита для конфокальной микроскопии, позволяющего выявить гибель нейронов, мы применяли АО и БЭ. В наших экспериментах зеленый флуоресцентный краситель АО и красный флуоресцентный краситель БЭ применяли для окрашивания ядра, позволяя выявить состояние клеточных мембран и ядер нейронов.

При этом использовалась особенность АО проникать через мембрану и окрашивать ядра живых клеток, а также способность БЭ окрашивать ядра только клеток с дезинтегрированной мембраной (Pulliam et al., 1998). Более того, их спектральные свойства хорошо подходят к аргоновому лазеру, который имеется во многих конфокальных системах.

Культуру нейронов окрашивали последовательно, сначала АО потом БЭ. Эта последовательность окрашивания позволяет использовать спектральные характеристики АО и БЭ. Определение количества клеток, погибших по механизму некроза, с помощью этого метода совпадает с данными при использовании ТС, который, как правило, применяют для оценки жизнеспособности клеток (Patterson, 1979). Совпадение результатов двух методов оценки и изучения динамики и концентрационной зависимости нейротоксического действия Глу говорит об их адекватности, а также применимости использованного флуоресцентного кита для анализа нейродегенерации. Более того, применение конфокальной микроскопии значительно упрощает процесс подсчета клеток, поскольку он происходит автоматически и не зависит от особенностей восприятия при визуальном подсчете.

Данный метод, также позволяет различить апоптоз клеток, так как АО по-разному окрашивает апоптотические и живые ядра. Ранее этот метод был использован для идентификации апоптоза среди популяции клеток эмбрионов дрозофилы (Abrams et al., 1993; White et al., 1994), Tetrahymena, куриных хондроцитов (Mpoke, Wolfe, 1997). Этот метод, может быть использован даже для оценки различных стадий апоптотической гибели клетки, поскольку позволяет выявить интенсивность и цветовую гамму между желтым и красным свечением. АО/БЭ кит имеет некоторые преимущества по сравнению с методом TUNEL (метод определения разрывов в цепи ДНК) (Gavrieli et al., 1992). Во-первых, он может быть использован на живых клетках и дает возможность определения и разделения апоптотических клеток внутри популяции в процессе окрашивания. Во-вторых, АО позволяет различить апоптоз на ранних и поздних стадиях по желтой и оранжевой флуоресценции ядер.

Различие в окраске живых и апоптотических ядер объясняется свойством АО являться индикатором рН и изменять спектр флуоресценции при закислении ядра, которое сопровождает процесс апоптоза. Ряд исследований показал, что апоптоз сопровождается закислением клетки (Gottlieb et al., 1995; Li, Eastman, 1995). Оно проявляется при разрушении ядра и связано с уменьшением рН, возможно из-за слияния лизосом с ядром нейрона (Mpoke, Wolfe, 1997). Это было видно также в наших экспериментах, где наблюдалась кластеризация и равномерное распределение лизосом вокруг ядра (рис. 13А). С помощью этого метода можно проследить во времени постепенные изменения в апоптотической клетке по окраске ядра: чем больше лизосом вокруг ядра, тем больше закисление и сильнее эмиссия АО смещается от зеленой к оранжево-красной области спектра.

Таким образом, использование метода двойного окрашивание АО/БЭ с применением конфокальной микроскопии позволяет анализировать процессы гибели путем некроза и апоптоза в популяции нейронов.

Поскольку, применение флуоресцентного кита АО + БЭ позволяет выявить апоптоз только по изменению рН внутриклеточных компартментов, необходим более точный анализ механизмов апоптоза в клетках. Используя метод иммуноцитохимии, нами было выявлено количество клеток, экспрессирующих проапоптотические белки, участвующие в апоптозе при активации его разных путей - R53 и каспазы-3 на культуре нейронов при активации определенных типов Глу-Р. Известно, что Р53 является универсальным белком, участвующим при реализации любого из механизмов апоптоза, следовательно, при активации различных типов Глу-Р его уровень экспрессии будет одинаковым, что согласуется с данными других авторов (Miller et al., 2000). Аналогичный результат был получен в наших экспериментах. Количество нейронов, экспрессирующих Р53 в условиях одинакового воздействия совпадало с количественной оценкой клеток с применением витального АО/БЭ теста, который также является универсальным, так как закисление ядра не зависит от конкретного пути апоптоза. Кроме того, нами не было обнаружено различий в числе клеток, экспрессирующих Р53, когда апоптоз вызывался различными концентрациями агонистов Глу-Р (1 мМ Глу, 3 мМ Глу и 30 цМ К А и 30 цМ NMDA). Предполагается, что реакция нейронов на образование белка Р53 зависит от степени нарушения клеточного генома (Bates, Vousden, 1999). При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование. При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром С - зависимый апоптозные каскады активации каспаз. Первым доказательством участия каспаз в гибели нейрона было изучение действия их ингибитора — белка Р35 на культуре нейронов черной субстанции (Rabizadeh, 1993). В этих клетках Р35 блокировал каспазы и в результате ингибировал апоптоз, вызванный

2+ гипогликемией, избытком Са , депривацией нейротрофических факторов. Очевидно, что активация каспаз является одним из возможных механизмов реализации гибели нейрона при нейродегенеративных воздействиях.

Результатом активации ионотропных рецепторов (наиболее часто, NMDA-рецепторы) является повышенный вход кальция в клетку с последующей стимуляцией протеаз и разрушением клеточных структур (Hatanaka et al., 1996; Jonston, 1994). Этот процесс сопровождается также возрастанием перекисного окисления липидов и последующим развитием окислительного стресса (Tapia, 1992; Waters , 1996).

При взаимодействии Глу с ионотропными рецепторами ионы кальция входят внутрь клетки по нескольким механизмам, вызывая деполяризацию митохондрий и нарушение энергетического обмена. Возможно, что активация различных типов рецепторов Глу, обладающих разной проводимостью для ионов Са2+, запускает с разной скоростью разные пути апоптоза - каспазный и некаспазный. Об этом свидетельствуют данные экспериментов по анализу экспрессии каспазы 3.

Индукция апоптоза NMDA и 1 мМ Глу, который на нейронах вызывает нейродегенерацию за счет активации исключительно NMDA-R, не сопровождается увеличением количества клеток, экспрессирующих каспазу 3, хотя общая оценка уровня апоптоза по Р53 и с использованием АО/БЭ теста дают высокие значения. Индукция апоптоза КА и 3 мМ Глу, которая вызывает нейродегенерацию за счет активации всех Глу-Р, приводит к значительному увеличению числа клеток, экспрессирующих каспазу 3, по сравнению с контролем.

По-видимому, при гиперактивации Глу рецепторов не NMDA типа, слабо проницаемых для кальция, происходит нарушение энергетического обмена и комплексное нарушение функций митохондрий и саркоплазматического ретикулума (Khodorov, 2004). При комплексном нарушении проницаемости митохондриальной мембраны происходит высвобождение ряда апоптогенных факторов: цитохрома С, прокаспаз 2, 3 и 9. Дальнейшее участие цитохрома С связано с активацией каспазы 3 и, следовательно, каспазного пути апоптоза. Очевидно что, увеличение каспазы 3 в экспериментах с 3 мМ Глу и 30 ¡iM К А свидетельствует о запуске гибели нейронов каспазным путем.

Другой механизм регуляции апоптотической гибели реализуется при активации NMDA-R. При данном механизме происходит высвобождение апоптоз индуцируемого фактора (AIF), который перемещается из митохондриальной мембраны в ядро, вызывая расщепление ряда ядерных белков каспазонезависимым путем (Yu et al., 2002), о чем свидетельствует отсутствие увеличения уровня каспазы-3 в экспериментах с использованием 1 мМ Глу и 30 рМ NMDA. Наши результаты подтвеждаются данными авторов, которые показывают, что NMDA-R-индуцируемый апоптоз не блокируется ингиботорами казпаз, но предотвращается при гиперэкспрессии Вс12 (Wang et al., 2004).

Таким образом, наши данные и анализ литературы позволили говорить о том, что апоптоз при активации NMDA-R развивается без участия каспазы-3, а при активации AMPA/KA-R - с участием каспазы-3.

Морфологические изменения дендритных шипиков играют важную роль в развитии, пластичности и синаптической передаче, и их ассоциируют со структурным проявлением явлений обучения и памяти в целом мозге (Hering, Sheng, 2001; Yuste, Bonhoeffer, 2001). Хотя изучению явлений синаптической пластичности уделяется большое внимание, остается много вопросов относительно молекулярных механизмов их регуляции. До сих пор остается неисследованным, происходят ли подобные явления при развитии нейродегенеративных процессов.

Нами были проведены иммуноцитохимческие эксперименты, выявляющие количество зон экспрессии синаптоподина на единицу длины дендрита. Данный белок был использован с целью идентификации дендритных шипиков в ряде работ по изучению механизмов синаптогенеза (Mündel et al., 1997; Deller et al., 2000). Синаптоподин, являясь белком шипикового аппарата, связан с актином и участвует в морфологических изменениях шипика, происходящих в процессах синаптогенеза (Deller et al., 2000). Синаптическая активность ведет к увеличению синтеза этого белка, поэтому по его накоплению можно судить о степени активации постсинаптического окончания и о процессе синаптической пластичности в целом (Yamazaki et al., 2001; Fukazawa et al., 2003).

В наших опытах на культурах нейронов было обнаружено наличие синаптоподина в дендритах. Это может говорить о наличии и нормальном функциональном состоянии дендритных шипиков, морфо-функциональные изменения, которых определяют явления синаптической пластичности. Необходимо отметить, что данные анализа плотности зон экспрессии синаптоподина, примененные для обработки наших экспериментов, практически не отличались, а контрольные данные, совпадали с результатами других авторов (Zhong et al., 2005). В течение

120 мин воздействия NMDA происходило значительное увеличение (до 5 раз) плотности зон экспрессии синаптоподина на вторичных дендритах, что может отражать активацию синаптогенеза на начальных этапах некроза и вовлеченность синаптической пластичности в гибель нейронов. Можно предположить, что NMDA вызывает тоническую деполяризацию нейронов, приводя к увеличению частоты разрядов потенциалов действия, а, следовательно, к увеличению частоты генерации ВПСП. Роль активации синапсов и освобождения эндогенного глутамата доказывается экспериментами с CNQX. В присутствии NMDA, добавленный CNQX -антагонист AMPA/KA-R снимал увеличение экспресии синаптоподина на начальном этапе действия NMDA.

Если в дальнейшем удастся показать возможную корреляцию между экспрессией синаптоподина и шипиками, то можно будет говорить об изменениях плотности шипиков по экспрессии этого белка на вторичных дендритах. В настоящее время такие данные существуют для культур нейронов гиппокампа (Kremerskothen et al., 2005). Это позволяет предполагать важную роль активации рецепторов нейромедиатором не только при синаптогенезе и явлениях синаптической пластичности, но также и при нейродегенерации нейронов.

Известно, что NMDA-рецепторы ответственны за молекулярные механизмы памяти, а метаботропные рецепторы вовлечены в процессы нейропластичности (Carpenter, 2002). Показано, что у взрослых животных изменения постсинаптических структур являются отражением нейрональной пластичности механизмов обучения и памяти (Yuste, Bonhoeffer, 2001). Например, долговременная потенциация СА1 синапсов в результате высокочастотной стимуляции приводит к возникновению новых синапсов или перестройки уже имеющихся (Engert, Bonhoeffer, 1999; Maletic-Savatic et al., 1999; Toni et al., 1999; Nagerl et al., 2004). С процессами нейропластичности связана долговременная потенциация и гл 2+ критическим моментом ее развития является вход в клетку ионов Са через ЫМОА-рецепторы, приводящий к запуску различных Са-зависимых процессов, которые фосфорилируют и дефосфорилируют мембранные и цитоскелетные белки, тем самым изменяя их конформацию и функциональные свойства. С этими событиями связан начальный период развития долговременной потенциации (до 120 мин.), в течение которого происходит встраивание в мембрану рецепторов Глу, что может объяснять увеличение плотности шипиков на единицу длины дендрита в наших экспериментах.

Обнаружено, что шипиковый аппарат связан с ЫМБА-рецепторами (Лаоса, 2000) посредством цитоскелетного мостика, который образуется актином и а-актинином (\Vyszynski е1 а1., 1999) и может быть вовлечен в процесс высвобождения кальция из внутриклеточных депо при активации ИМОА-рецепторов (Emptage е1 а1., 1999). Полученные в наших экспериментах данные относительно экспресии синаптоподина при действии ЫМЭА не противоречат основному феномену долговременной синаптической потенциации, что может говорить о сходстве механизмов вовлеченных в нейротоксическое действие ЫМЕ)А с механизмами, участвующими в синаптогенезе и синаптической пластичности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Миронова, Елена Викторовна, 2007 год

1. Антонов С.М., Шупляков О. В., Магазаник Л.Г., Веселкин Н.П., Волкова Т.М., Гришин Е.В. Аргиопин как антагонист действия глутамата на спинальные мотонейроны лягушки // ДАН СССР. -1988. Т. 298, № 2.-С: 505-508

2. Антонов С.М, Механизмы удаления глутамата как факторы, ограничивающие его постсинаптическое действие // Физиология и биохимия глутаматергических синапсов,- Ред. Мандельштам Ю. Е.-Л.-Наука.-1989.-С: 110-121

3. Антонов С.М., Магазаник Л. Г. Неквантовое освобождение и активный захват глутамата в нервных окончаниях насекомого Calliophora Vicina // ДАН СССР. -1989. Т. 304, № 2. - С: 483-486

4. Антонов С.М. Переносчики нейромедиаторов: рецепторная, транспортная и канальная функция // Журн. эвол. биохим. и физиол,- 2001. Т. 37, №4.-С: 248-252

5. Детлаф Т.А. Объекты биологии развития // М.- Изд. «Наука». 1975. - Под ред. Детлаф Т.А.

6. Долго-Сабуров Б.А. Нейронная теория основа современных представлений о строении и функции нервной системы. Л. - 1956.

7. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Оксидантный стресс — общий механизм повреждения при заболеваниях центральной нервной системы // Ж. Неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1996, № 2. - С: 111114

8. Зефиров А. Л. Везикулярная гипотеза освобождения медиатора в синапсе // Соросовский образовательный журн. 2000. - Т. 6, № 9. - С: 10-16

9. Кабак Я.М. Практикум по эндокринологии. Основные методики экспериментально-эндокринологических исследований // М.- МГУ. 2-е изд. 1968.-27 с.

10. Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Шупляков О.В. и др. Гетерогенность возбуждающих синаптических входов в спинальных мотонейронахлягушки RANA RIDIBUNDA // Жури. Эвол. Биохим. Физиол. -1989.-Т. 25, №6. -С: 755-762

11. Колосов Н.Г. Иннервация пищеварительного тракта человека // M.JI. -1962

12. Коршунов A.M., Преображенская И.С. Программированная смерть клеток. Апоптоз (Обзор) // Неврологический журнал. 1998. - №1

13. Куприянов В.В. Проблемы морфологической адаптации нервных структур. В кн.: Исследования обратимости острых и хронических изменений внутренних органов. 1962. Сб. тр. Ин-та им. A.B. Вишневского. М.-158-187

14. Куффлер С., Николе Дж. От нейрона к мозгу // М.: Мир. 1979.

15. Лаврентьев Б.И. История клеточных теорий. В.кн.: Маркс, Энгельс, Ленин о биологии. М.: 3-7. 1936

16. Лаврентьев Б.И. Морфология антагонистической иннервации в автономной нервной системе и методы ее исследования. В кн.: Морфология автономной нервной системы. М. Л.: 13-83. - 1939

17. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Гмиро В.Е. Механизмы активации и блокирования постсинаптической мембраны, чувствительной к гдутамату // Биологические мембраны. -1984. Т. 1, № 2. - С: 130140

18. Магазаник Л.Г. Синаптические рецепторы молекулярная основа коммуникации нервных клеток // Вестник молодых ученых. - 2004. - Т. 2.- Серия: науки о жизни. - 2004. - Т. 1. - С: 100-112

19. Майоров В.Н. Морфология реактивных состояний вегетативного межнейронного синапса. Л. 1969.

20. Миронова Е.В., Евстратова A.A., Антонов С.М. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». С-Пб, 2006.

21. Николлс Дж. Г., Мартин А. Р., Валлас Б. Дж., Фукс П. А. От нейрона к мозгу//М.-2003.- 671 с.

22. Ноздрачев А. Д., Баженов Ю. И., Баранникова И. А. Начала физиологии // Спб- 2001.-1088 с.

23. Abrams J.M., White К., Fessier L.I., Steller H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis // Development. 1993. - V. 117. - P: 29-43

24. Adams J.M., Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival // Science. 1998.- V. 281, N 5381.-P: 1322-1326

25. Antonov S.M., Magazanik L.G. Intense non-quantal release of glutamate in an insect neuromuscular junction // Neurosci. Lett. 1988. - V. 93. - P: 204-208

26. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. Binding sites for permeant ions in the channel of NMD A receptors and their effects on channel block. // Nature Neurosci. 1998. - V. 1, N 6. -P: 451-461

27. Antonov S.M., Johnson J.W. Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channel block by Mg2+ // PNAS. 1999. - V. 96, N 25. - P: 14571-14576

28. Arends M.J., Wyllie A.H. Apoptosis. Mechanism and role in patology // Intern.Rev.Exp.Pathol. 1991. - V. 32. -P: 223-254

29. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation // Science. 1998.-V. 281.-P: 1305-1308

30. Bailey C.H., Gimtetto M., Huang Y.Y., Hawkins R.D., Kandel E.R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory? // Nature Rev. Neurosci. 2000. - V. 1, N 1. - P: 11-20

31. Bailey C.H., Kandel E.R. Structural changes accompanying memory storage // Annu. Rev. Physiol. 1993. - V. 55. - R. 397-426

32. Bates S., Vousden K.H. Mechanisms of p53-mediated apoptosis // Cell. Mol. Life. Sci. 1999. - V. 55, N 1. - P: 28-37

33. Beaulieu C., Colonnier M. A laminar analysis of the number of round-asymmetrical and flat-symmetrical synapses on spines, dendritic trunks,and cell bodies in area 17 of the cat // J. Comp. Neurol. 1985. - V. 231, N2.-P: 180-189

34. Bergmeyer H.U., Bernt E. Lactate dehydrogenase UV assay with pyruvate and NADH // In:Bergmeyer HU, editor. Methods of enzymatic analysis, New York: Academic Press. 1974. - V. 2. - R: 574-579

35. Bernardi P., Colonna R., Costantini P., Eriksson O., Fontaine E., Ichas F., Massari S., Nicolli A., Petronilli V., Scorrano L.The mitochondrial permeability transition // Biofactors. 1998. - V. 8, N. 3-4. - P: 273281

36. Bindokas V.P., Miller R.J. Excitotoxic degeneration is initiated at non-random sites in cultured rat cerebellar neurons // J. Neurosci. 1995. -V. 15, N. ll.-P: 6999-7011

37. Bittner G.D., Degeneration and regeneration in crustacean neuromuscular systems // Am. Zoo 1. 1973. - V. 13. - P: 379-408

38. Bochet P., Audinat E., Lambolez B., Crepel F., Rossier J., lino M., Tsuzuki K., Ozawa S. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel // Neuron. 1994. -V. 12, N. 2.-P: 383-388

39. Brauner-Osborne H., Egebjerg J., Nielsen E.O., Madsen U., Krogsgaard-Larsen P. Ligands for glutamate receptors: design and therapeutic prospects // J. Med. Chem. 2000. - V. 43, N 14. - P: 2609-2645

40. Brustovetsky N., Dubinsky J.M. Limitations of cyclosporin A inhibition of the permeability transition in CNS mitochondria // J. Neurosci. 2000. - V. 20, N. 22.-P: 8229-8237

41. Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells // J. Neurochem. -1996. V.67, N. 6. - P: 2282-2291

42. Burnashev N., Zhou Z., Neher E., Sakmann B. Fractional calcium currents throught recombinant Glu R channels of the NMDA, AMPA and kainite receptor subtypes // J. Physiol. 1995. - V. 485. - P: 403-418

43. Cafforio P., Romito A., Grizzuii M. A., Silvestris F. Methods for assessing programmed cell death // Recent Prog. Med. 1996. - Vol. 87, N 7-8. -R. 366-373

44. Cajal, S. R. Histology of the Nervous System of Man and Vertebrate (Oxford Univ. Press, 1995; first published 1899) (trans. Swanson, N & Swanson, L. W.)).

45. Carpenter D. NMDA receptors and the molecular mechanisms of excitotoxicity, in Oxidative Stress at Molecular, Cellular and Organ Levels // Eds P.Johnson, A.Boldyrev. Research Signpost, Trivandrum. 2002. - P: 77-88

46. Carroll R.C., Lissin D. V., von Zastrow M., Nicoll R.A., Malenka R.C. Rapid redistribution of glutamate receptors contributes to long-term depression in hippocampal cultures // Nature Neurosci. 1999. - V. 2, N 5. - R: 454-460

47. Cheah K.S., Watkins J.C. Further syntheses in the study of structure-activity relationships of neuropharmacologically active amino acids // J. Med Chem. 1965. - V. 8, N 6. - P: 821-824

48. Choi D. W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent // Neurosci Lett. 1985. - V. 58, N 3. - P: 293-297

49. Choi D. W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity // J. Neurosci. 1987. -V.7.-P: 369-379

50. Choi D. W. Excitotoxic cell death // J. Neurobiol. 1992. - V.23. -P: 1261-1276

51. Choi D. W. Calcium: still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death // Trends Neurosci. 1995 . - V. 18, N 2. - P: 58-60

52. Christine C.W., Choi D.W. Effects of zinc on NMDA receptor mediated channel currents in cortical neurons // J. Neurosci. 1990. - V.10, N 1.- R: 108116

53. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J. 1997. - V. 326.-P: 1-16

54. Collingridge G.L., Singer W. Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity // Trends Pharmacol Sci. 1990. - V. 11, N 7. - P: 290-296

55. Curtis D. R., Johnston G. R. Amino acid transmitters in the mammalian central nervous system // Ergebn. Physiol.- 1974.- V. 69.- R: 97-188

56. Danysz W., Zajaczkowski W., Parsons C.G. Modulation of learning processes by ionotropic glutamate receptor ligands // Behav Pharmacol. 1995. -V. 6, N 5-6.-P: 455-474

57. Eimerl S., Schramm M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death // J. Neurochem. 1994. - V. 62, N 3. - P: 1223-1226

58. Emptage N., Bliss T.V., Fine A. Single synaptic events evoke NMDA receptor-mediated release of calcium from internal stores in hippocampal dendritic spines // Neuron. 1999. - V. 22, N 1. - P: 115-24

59. Engert F., Bonhoeffer T. Dendritic spine changes associated with hippocampal long-term synaptic plasticity // Nature. 1999. - V. 399, N 6731. - P: 66-70

60. Ernmshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis // Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68. - P: 383-424

61. Fatt P., Katz B. Some observations on biological noise // Nature, Lond., 1950. -V. 166. -P: 567-598

62. Feldman R. S., Quenzer L. F. Fundamentals of Neuropsychopharmacology // 1984. Amsterdam: Excerpta Medica, P: 689-714

63. Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain // J. Neurochem.- 1984.- V. 42, N l.-P: 1-11

64. Fukazawa Y., Saitoh Y., Ozawa F., Ohta Y., Mizuno K., Inokuchi K. Hippocampal LTP is accompanied by enhanced F-actin content within the dendritic spine that is essential for late LTP maintenance in vivo // Neuron. 2003. - V. 38, N 3. - R: 447-460

65. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation // J. Cell Biol. 1992.-V. 119.-P: 493-501

66. Gibb A. J., Colquhoun D. Activation of N-methyl-D-aspartate receptors by L-glutamate in cells dissociated from adult rat hippocampus // J. Physiol. -1992.-V. 456.-P: 143-179

67. Golstein P. Cell death: TRAIL and its receptors // Curr Biol. 1997. - V. 7, N 12.-P: 750-753

68. Green D.R. Apoptosis. Death deceiver // Nature. 1998. - V. 396, N 6712. - P: 629-630

69. Green D. R. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. 1998. - V. 94, N 6. -P: 695-698

70. Green D.R., Reed J. Mitochondria and apoptosis // Science. 1998. - V. 281, N 5381.-P: 1309-1312

71. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes and Dev. 1999. - V. 13. - P: 18991911

72. Harris K.M., Kater S.B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function // Annu. Rev. Neurosci. -1994,-V. 17.-P: 341-371

73. Harrison R.G. Observations on the living developing nerve fiber // Anat. Rec. -1907.-V. l.-P: 116-118

74. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration // J. Neurosci. 1993. - V. 13, N 5.-P: 1993-2000

75. Hatanaka Y., Suwkl K., Kawasaki Y. et al. A role of peroxides in Ca2+ ionophore-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons // Biochem. biophys. Res. Commun. 1996. - V. 227, N 2. - P: 513-518

76. Hauser H.P., Bardroff M., Pyrowolakis G., Jentsch S. A giant ubiquitin-conjugating enzyme related to IAP apoptosis inhibitors // J.Cell Biol. -1998.-V. 141.-P: 1415-1422

77. Headley P.M., Grillner S. Excitatory amino acids and synaptic transmission: the evidence for a physiological function // Trends Pharmacol Sci. 1990. -V. 11, N 5. -P: 205-211

78. Hering H., Sheng M. Dendritic spines: structure, dynamics and regulation // Nat Rev Neurosci. 2001. - V. 2, N 12. - P: 880-888

79. Johnson J.W., Ascher P. Clycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons // Nature. 1987. - V. 325. - P: 529-531

80. Jones M.V., Westbrook G.L. The impact of receptor desensitization on fast synaptic transmission // Trends Neurosci. 1996. - V. 19, N 3. - P: 96101

81. Jonston N.V. Neuronal death in development, aging and disease // Neurobiol. Aging. 1994. - V. 15, N 2. - P: 235-236

82. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons // Progr. Biophys. Molec. Boil. 2004. - V. 86, N 2. -P: 279-351

83. Kidd V.J. Proteolytic activities that mediate apoptosis // Annu Rev Physiol. -1998.-V. 60.-P : 533-573

84. Kiskin N.I., Krishtal O.A., Tsyndrenko A.Ya. Excitatory amino acid receptors in hippocampal neurons: kainate fails to desensitize them // Neurosci. Lett. 1986.-V. 63.-P: 225-230

85. Kleckner N.W., Pallotta B.S. Burst kinetics of single NMDA receptor currents in cell-attached patches from rat brain cortical neurons in culture // J. Physiol. 1995.-V. 486.-P: 411-426

86. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. 1997. - V. 275. -P: 1132-1136

87. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today. 1997. - V. 18, N 1. - P: 44-51

88. Man H.Y., Lin J.W., Ju W.H., Ahmadian G., Liu L., Becker L.E., Sheng M., Wang Y.T. Regulation of AMPA receptor-mediated synaptic transmission by clathrin-dependent receptor internalization // Neuron.2000.-V. 25, N 3. -P: 649-662

89. Mancini M., Nicholson D. W., Roy S., Thornberry N.F., Peterson E.P., Casciola-Rosen L.A., Rosen A // J. Cell. Biol. 1998.-V. 140. -P: 1485-1495

90. Marrs G.S., Green S.H., Dailey M.E. Rapid formation and remodeling of postsynaptic densities in developing dendrites //Nat. Neurosci. 2001. -V. 4, N 10. - P: 1006-1013

91. Masson J., Sagne C., Hamon M., Mestikawy S. A. Neurotransmitter transporters in the central nervous system // Pharmacol. Rev. 1999. - V. 51, N 3. -p: 439-464

92. Matus A. Actin-based plasticity in dendritic spines // Science. 2000. - V. 290, N 5492. - P: 754-758

93. Mayer M. L., Westbrook G. L., Guthrie P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMD A response in spinal chord neurons // Nature. 1984. - V. 309. -P: 261-263

94. Mayer M.L., Westbrook G.L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones // J. Physiol. 1987. - V. 394. - P: 501-527

95. McBain C.J., Mayer M.L. N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function // Physiol. Rev. 1994. - V. 74. - P: 723-760

96. McCarthy N.J., Whyte M.K.B., Gilbert C.S., Evan G.L Inhibition of Ced-3/ICE-related proteases does not prevent cell death induced by oncogenes, DNA damage, or the Bcl-2 homologue Bak // J. Cell. Biol. 1997. - V. 136.-P: 215-227

97. McConkey D.J., Hartzell P., Nicotera P., Orrenius S. Calcium-activated DNA fragmentation kills immature thymocytes // FASEB J. 1989. - V. 3, N 7.-P: 1843-1849

98. Mehmet H. Caspases find a new place to hide // Nature. 2000. - V. 403, N 6765. - P: 29-30

99. Meldrum B. S. Excitatory amino acid receptors and disease // Current opinion in neurology and neurosurgery. 1992. - V. 5. -P: 508-513

100. Meldrum B. Amino acids as dietary excitotoxins: a contribution to understanding neurodegenerative disorders // Brain Res. 1993. - V. 18. -P: 293-314

101. Miller F.D., Pozniak C.D., Walsh G.S. Neuronal life and death: an essential role for the p53 family // Cell Death Differ. 2000. - V. 7, N 10. - P: 880888

102. Mitchell S.J., Silver R.A. Shunting Inhibition Modulates Neuronal Gain during Synaptic Excitation // Neuron. 2003. - V. 38. - P: 433-445

103. Mpoke S., Wolfe J. Differential staining of apoptotic nuclei in living cells: application to macronuclear elimination in Tetrahymena // J. Histochem. Cytochem. 1997. - V. 45. - P: 675-683

104. Mundel P., Heid H.W., Mundel T.M., Kruger M, Reiser J., Kriz W. Synaptopodin: an actin-associated protein in telencephalic dendrites and renal podocytes // J. Cell. Biol. 1997. - V. 139,N1.-P: 193-204

105. Mundel P., Gilbert P., Kriz W. Podocytes in glomerulus of rat kidney express a characteristic 44 KD protein // J. Histochem. Cytochem. 1991. - V. 39, N8.-P: 1047-56

106. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. 1997. - V. 88, N 3. - P: 355-365

107. Nagerl U.V., Eberhorn N., Cambridge S.B., Bonhoeffer T. Bidirectional activity-dependent morphological plasticity in hippocampal neurons // Neuron. 2004. - V. 44, N 5. - P: 759-767

108. Nakagawa T., Zhu H., Morishima N., Li E., Xu J.,Yankner B.A., Yuan J. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta // Nature. 2000. - V. 403. - P: 98-103

109. Nicholls D.G., Scott I.D. The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport. The role of ATP in the discrimination between kinetic and membrane-potential-dependent calcium-ion efflux mechanisms // Biochem J. 1980 . - V. 186, N 3. - P: 833-839

110. Nicotera P., Leist M. Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells // Cell Death Differ. 1997. - V. 4, N. 6. - P: 435-442

111. Noraberg J., Kristensen B.W., Zimmer J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures // Brain. Res. Protoc. 1999. - V. 3. - P: 278290

112. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P., Herbet A., Prochiantz A. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurons // Nature. -1984,-V. 307.-P: 462-465

113. Oiney J. W. Excitatory transmitter neurotoxicity // Neurobiol. Aging. 1994. -V. 15, N 2.-P: 259-260

114. Oliver F.J., Menissier-de Murcia J., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular response to DNA damage, apoptosis, and disease // Am J Hum Genet. -1999. V. 64, N 5. -P: 1282-1288

115. Paoletti P., Neyton J., Ascher P. Glycine-independent and subunit-specific potentiation of NMDA responses by extracellular Mg2+ // Neuron. -1995.-V. 15.-P: 1109-1120

116. Parsons C.G., Dunysz W., Quack G. Glutamate in CNS disoders as a target for drug development: an uptake // Drug news perspect. 1998. - V. 11, N. 9.-P: 523-569

117. Parsons C.G, Danysz W., Quack G. Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist a review of preclinical data // Neuropharmacology. - 1999. - V. 38, N 6. - P: 735767

118. Partin K.M., Fleck M.W., Mayer M.L. AMPA receptor flip/flop mutants affecting deactivation, desensitization and modulation by cyclothiazide, aniracetam and thiocyanate // J. Neurosci. 1996. - V. 16. - P: 66346647

119. Partin K.M., Patneau D.K., Winters C.A., Mayer M.L., Buonanno A. Selective modulation of desensitization at AMPA versus kainate receptors bycyclothiazide and concanavalin A // Neuron. 1993. - V. 11, N 6. - P: 1069-1082

120. Patterson M.K.Jr. Measurement of growth and viability of cells in culture // Methods Enzymol. 1979. - V. 58.-P: 141-152

121. Pellegrini-Giampietro D.E., Gorter J.A., Bennett M.V., Zukin R.S. The GluR2 (GluR-B) hypothesis: Ca(2+)-permeable AMPA receptors in neurological disorders // Trends Neurosci. 1997. - V. 20, N 10. - P: 464-470

122. Peter M. E., Heufelder A. E., Hengartner M. O. Advances in apoptosis research // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. -P: 12736-12737

123. Peters A., Jones E.G. Cerebellar Cortex. Volume 1: Cellular Components of the Cerebral Cortex / By eds. N.Y.: Plenum Press, 1984.

124. Philpott K. L., Me Carthy M. J., Backer D., Gatchalian C., Rubin L. L. Morphological and biochemical changes in neurons: apoptosis versus mitosis // Eur. J. Neurosci. 1996. - V. 8, N. 9. -P: 1906-1915

125. Pulliam L., Stubblebine M., Hyun W. Quantification of neurotoxicity and identification of cellular subsets in a three-dimensional brain model // Cytometry. 1998. - V. 32, N 1. - P: 66-69

126. Qian A., Antonov S.M., Johnson J.W. Modulation by permeant ions of Mg(2+) inhibition of NMDA-activated whole-cell currents in rat cortical neurons // J. Physiol. 2002. - V. 538, N 1. - P: 65-77

127. Qin Z. H., Wang K, Chase T. N. Stimulation of N-methyl-D-aspartate receptors induces apoptosis in rat brain // Brain Res. 1996. - V. 725, N. 2. - P: 166-176

128. Rabizadeh S., Oh J., Zhong L.T., Yang J., Bitler C.M., Butcher L.L., Bredesen D.E. Induction ofapoptosis by the low-affinity NGF receptor // Science. 1993.-V. 261.-P: 345-348

129. Racca C., Stephenson F.A., Streit P., Roberts J.D., Somogyi P. NMDA receptor content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area // J. Neurosci. 2000. - V. 20, N 7. - P: 2512-2522i

130. Rae M.G., Martin D.J., Collingridge G.L., Irving A.J. Role of Ca stores in metabotropic L-glutamate receptor-mediated supralinear Ca signaling in rat hippocampal neurons // J. Neurosci. 2000 . - V. 20, N 23. - P: 8628-8636

131. Rathmell J.C., Thompson C.B. The central effectors of cell death in the immune system //Annu. Rev. Immunol. 1999. - V. 17. - P: 781-828

132. Reed J.C., Jurgensmeier J.M., Matsuyama S. Bcl-2 family proteins and mitochondria // Biochim Biophys Acta. 1998. - V. 1366, N 1-2. - P: 127-137

133. Rossi D.J., Oshima T., Attwell D. Glutamate release in sever brain ischemia is mainly by reversed uptake // Nature. 2000. - V. 403. - P : 316-325

134. Ruoslahti E., Reed J. New way to activate caspases // Nature. 1999. - V. 397,- P: 479-480

135. Schoepp D.D., Sacaan A.I. Metabotrohic Glutamate receptors and neuronal degenerative disorders // Neurobiol. Aging. 1994. - V. 15, N 2. - P: 261-263

136. Segal M., Andersen P. Dendritic spines shaped by synaptic activity // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - V. 10, N 5. -P: 582-586

137. Segal M. Dendritic spines and long-term plasticity // Nat Rev Neurosci. 2005.- V. 6, N4,-P: 277-284

138. Sheng M. Molecular organization of the postsynaptic specialization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98, N 13. -P: 7058-7061

139. Sheng M., Kim M.J. Postsynaptic signaling and plasticity mechanisms // Science. 2002. - V. 298, N 5594. - P: 776-780

140. Shinozaki H. Pharmacology of the glutamate receptor // Prog. Neurobiol. 1988.- V. 30, N5.-P: 399-435

141. Sladeczek F., Pin J.P., Recasens M., Bockaert J., Weiss S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurons // Nature. 1985. - V. 317, N 6039.-P: 717-719

142. Sobolevsky A.K. Channel block of glutamate receptors // Recent. Research, developments of physiology.- Editor Pandalai S. G. 2003. - Kerala, India.- Research signpost.- P: 1-38

143. Stennicke H.R., Salvesen G.S., Caspases controlling intracellular signals by protease zymogen activation// Biochim.Biophys.Acta. -2000. V.1477.- P: 299-306

144. Stout A.K., Raphael H.M., Kanterewicz B.I., Klann E., Reynolds I.J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake // Nat. Neurosci.- 1998.-V. 1,N5.-P: 366-373

145. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Brenner C., Larochette N., Prevost M.C., Alzari P.M., and Kroemer G. Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process // J. Exp. Med. 1999. -V. 189.-P: 381-394

146. Szatkowski M., Barbour B., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake // Nature. 1990. -V. 348.-P: 443-446

147. Tanaka K. Functions of glutamate transporters in the brain // Neuroscience. research. 2000. - V. 37. - P: 15-19

148. Tanzi E. // Riv. Sper. Freniatr. 1893. V. 19. P: 419-472

149. Tapia A. NMDA-receptor activation stimulates phospholipase A2 and somatostatin release from rat cortical neurons in primary cultures // Eur. J. Pharmacol. 1992. - V. 225, N 2. - P: 253-262

150. Thornberry N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within // Science. 1998. -V. 281.-P: 1312-1316

151. Toni N., Buchs P.A., Nikonenko 1., Bron C.R., Muller D. LTP promotes formation of multiple spine synapses between a single axon terminal and a dendrite // Nature. 1999. - V. 402, N 6760. - P: 421-425

152. Trussell L.O., Fischbach G.D. Glutamate receptor desensitization and its role in synaptic transmission // Neuron. 1989. - V. 3, N 3. - P: 209-218

153. Tsujimoto Y. Apoptosis and necrosis: intracellular ATP level as a determinant for cell death modes // Cell. Death. Differ. 1997. - V. 4, N 6. - P: 429434

154. Uliasz T.F., Hewett S.J. A microtiter trypan blue absorbance assay for the quantitative determination of excitotoxic neuronal injury in cell culture

155. J. Neurosci. Methods. 2000. - V. 100, N 1-2. -P: 157-163

156. Vaux D.L., Korsmeyer S. J. Cell death in development // Cell. 1999. - V. 96. -P: 245-254

157. Walczak H., Krammer P.H. The CD95 (APO-l/Fas) and the TRAIL (APO-2L) Apoptosis Systems // Exp. Cell Res. -2000. V. 256. -P: 58-66

158. Wang L.Y., MacDonald J.F. Modulation by magnesium of the affinity of NMDA receptors for glycine in murine hippocampal neurones // J. Physiol. 1995. - V. 486. - P: 83-95

159. Wang X., Yang C., Chai J., Shi Y., Xue D. Mechanisms of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans // Science. -2002.-V. 298, N 5598. P: 1587-1592

160. Waters C. M. Mechanisms of neuronal cell death. An overview // Mol. Chem. Neuropathol. 1996. - V. 28, N 1-3. - P: 145-151

161. Watkins J.C., Evans R.H. Exitatory amino acid transmitters // Ann. Rev. Pharmacol. 1981. - V. 21. - P: 165-204

162. Weismann A. Nervenneubildung in einem Neuron // Schmidts Jahrbuch. 1860. -V. 105.-P: 14-16

163. White K., Grether M.E., Abrams J.M., Young L., Farrell K., Steller H. Genetic control of programmed cell death in Drosophila // Science. 1994. - V. 264.-P: 677-683

164. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondria and Na /Ca exchange buffer glutamate-induced calcium loads in cultured cortical neurons // J. Neurosci.- 1995.-V. 15,N2.-P: 1318-1328

165. Wolf B.B., Green D.R. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases // J.Biol.Chem. -1999. V. 274, N 29. - P: 2004920052

166. Wyszynski M., Valtschanoff J.G., Naisbitt S., Dunah A.W., Kim E., Standaert D.G., Weinberg R., Sheng M. Association of AMPA receptors with a subset of glutamate receptor-interacting protein in vivo // J. Neurosci. -1999. V. 19, N 15. - P: 6528-6537

167. Xiang J., Chao D. T., Korsmeyer S. J. BAX-induced cell death may not require interleukin 1 beta-converting enzyme-like proteases // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. - P: 14559-14563

168. Yamakura T., Shimoji K. Subunit- and site-specific pharmacology of the NMDA receptor channel // Prog Neurobiol. 1999. - V. 59, N 3. - P: 279-298

169. Yamazaki M., Matsuo R., Fukazawa Y., Ozawa F., Inokuchi K. Regulated expression of an actin-associated protein, synaptopodin, during long-term potentiation // J. Neurochem. 2001. - V. 79, N 1. - P: 192-199

170. Yu S.W., Wang H., Poitras M.F., Coombs C., Bowers W.J, Federoff H.J., Poirier G.G., Dawson T.M., Dawson V.L. Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell death by apoptosis-inducing factor // Science. 2002. - V. 297, N 5579. - P: 259-63

171. Yuste R., Bonhoeffer T. Morphological changes in dendritic spines associated with long-term synaptic plasticity // Annu Rev Neurosci. 2001. - V. 24.-P: 1071-89