Механизмы программируемой гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, доктор медицинских наук Иванчук, Игорь Иванович

• Иванчук, Игорь Иванович
• доктор медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Иванчук, Игорь Иванович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Формы клеточной гибели.

1.2. Механизмы программируеммой клеточной гибели

1.3. Эффекторы программируемой клеточной гибели

1.4. Митохондриальная система регуляции программируемой клеточной гибели.

1.5. Регуляторные белки ВСЬ-2 - семейства.

1.6. Рецептор-опосредованный механизм программируемой гибели клетки.

1.7. Системная роль белка р53 в регуляции программируемой гибели клетки.

1.8. Апоптоз в патогенезе бронхиальной астмы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Клинические исследования.

2.2. Лабораторные методы исследования пациентов

2.2.1. Исследование функции легких.

2.2.1.1. Пикфлоуметрия.

2.2.1.2. Оценка функции внешнего дыхания.

2.2.1.3. Бронхопровокационная проба с метахолином.

2.2.2. Получение периферической крови.

2.2.3. Определение абсолютного и относительного содержания эозинофилов в периферической крови.

2.2.4. Определение неспецифического

§Е в сыворотке крови.

2.2.5. Определение уровня ИЛ-5.

2.2.6. Определение уровня ГМ-КСФ.

2.2.7. Получение эозинофилов на градиенте плотности.

2.2.8. Культивирование эозинофилов.

2.2.9. Оценка апоптотической гибели клеток.

2.2.9.1. Оценка содержания фрагментированной ДНК эозинофилов периферической крови.

2.2.9.2. Электрофорез ДНК эозинофилов периферической крови (качественный анализ апоптотического типа гибели клеток).

2.2.9.3. Микроскопические методы оценки морфофунк-циональных параметров гибели клеток.

2.2.10. Получение обогащенной суспензии ядро-сод ержащих клеток из периферической крови.

2.2.11. Выделение тотальной рибонуклеиновой кислоты (РНК).

2.2.12. Анализ экспрессии мРНК.

2.2.13. Оценка ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов (ЕМЭА - анализ).

2.2.14. Трансмиссионная электронная микроскопия.

2.2.15. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика обследованных пациентов.

3.2. Характеристика функции внешнего дыхания у больных бронхиальной астмой до и после лечения

3.3. Характеристика апоптотической гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой.

3.4. Экспрессия мРНК экстраклеточных регуляторов апоптотической гибели эозинофилов у больных бронхиальной астмой.

3.5. Активность экспрессии мРНК про- и антиапоптотических эффекторов в эозинофилах у больных бронхиальной астмой.

3.6. Экспрессия мРНК регуляторов программируемой клеточной гибели в эозинофилах больных бронхиальной астмой.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Характеристика эозинофильного воспаления при бронхиальной астме.

4.2. Цито- и гистотоксические эффекты эозинофилов в тканях.

4.3. Активность апоптотичекой гибели эозинофилов у больных бронхиальной астмой.

4.4. Особенности внутриклеточной регуляции апоптоза эозинофилов у больных бронхиальной астмой

4.5. Особенности транскрипционной регуляции апоп-тоз-ассоциированных генов в эозинофилах больных бронхиальной астмой.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы программируемой гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме»

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям бронхиальная астма - заболевание, сопровождающееся хроническим аллергическим воспалением бронхов, обусловливающим повторяющиеся эпизоды бронхиальной обструкции и гиперреактивность дыхательных путей [GINA 2002]. Повсеместно отмечается увеличение распространенности атопических заболеваний, причем достоверные причины роста заболеваемости астмой остаются неизвестными [Чучалин А.Г. 2004; Огородова Л.М. 2002; King М.Е., 2004]. Последние годы отмечены тенденцией роста смертности от Б A [Chang, 2004; King М.Е., 2004].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении бронхиальной астмы за последнее десятилетие, благодаря пересмотру концепции патогенеза атопических заболеваний, созданию новых классификаций, методов оценки персистирующего воспаления, возможности терапевтических подходов все еще остаются ограниченными, по существу патогенетическими [Ре-вякина В.А. 1999; Krishna М.Т., 2002; Robinson D.S., 2003]. Во многом такая ситуация обусловлена отсутствием полной картины патогенеза атопических болезней и исчерпывающих данных о первичных наследуемых биологических дефектах, приводящих к возникновению и хронизации воспаления, хотя участие полигенных наследуемых факторов в механизмах формирования различных атопических заболеваний не вызывает сомнения [Федосеев Г.Б., 2001; Пузырев В.П., 2002; Cookson W., 2002; Gao P.S., 2004].

Атопия, как иммунобиологический феномен, чрезвычайно распространена в популяции. По данным последних исследований она встречается у 30% - 50% населения в разных странах [GINA 2002; King М.Е., 2004]. В то же время распространенность атопических заболеваний, то есть клиническая манифестация атопии, значительно ниже. Данный факт свидетельствует о наличии группы патогенетических факторов, помимо классического признака атопии - гиперпродукции IgE, приводящих к реализации иммунологических нарушений. В этой связи внимание многих исследователей привлечено к молекулярно-генетическим нарушениям, сопровождающим бронхиальную астму, в частности механизмам изменения программируемой гибели клетки.

Интерес к апоптозу обусловлен прежде всего тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом сигнал-проводящих систем изменение которых имеет большое патогенетическое значение и для астмы [Chilvers E.R., 1998; Letuve S., 2002; Duncan C.J., 2003; Simon H.U., 2003]. Кроме этого, сигналы, ингибирующие и, напротив, индуцирующие апоптоз, являются ключевыми в патогенезе бронхиальной астмы (интерлейкины, ростовые факторы, глюко-кортикостероиды и т.д.). Снижение апоптотической активности эозинофилов, ключевых эффекторных клеток воспаления при астме, обусловливает их пер-систенцию в очаге воспаления, что приводит к усилению инфильтрации стенки бронхов эозинофилами и повреждению эпителия дыхательных путей [Kieilman В., 1994; Desreumaux Р., 1996; Duncan С .J., 2003; Walsh G.M., 2003].

В работах, посвященных изучению молекулярно-генетических механизмов астмы, чаще всего рассматривается аспект регуляции активности провоспалительных медиаторов. Немного работ посвящено оценке апоптотической гибели эффекторных клеток, однако в большинстве случаев они сводятся к феноменологической оценке апоптоза или изучению активности ограниченного числа проксимальных эффекторов клеточной гибели [Jang A.S., 2000; Fine А., 2000]. Интегральная оценка значения пролиферативной, функциональной и апоптотической активности эффекторных клеток при бронхиальной астме практически отсутствует. В незначительном количестве имеющихся обзоров по данной теме прослеживается ряд противоречий. В частности, практически нет данных об участии продукта гена р53 в патогенезе бронхиальной астмы. В то же время известно, что транскрипционный фактор р53 является универсальным регулятором клеточного цикла, который способен влиять на пролиферацию, функциональную активность клетки, активировать проапоптотические гены, а также подавлять активность антиапопто-тических генов [Chang N.S., 2003].

Вышеизложенное определяет актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска в области молекулярных механизмов программируемой гибели клетки как возможного патогенетического фактора при бронхиальной астме.

Цель: установить особенности регуляции и реализации механизмов программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой.

Задачи:

1. Изучить активность апоптотической гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

2. Оценить экспрессию проапоптотических (ВАХ, BAD, BCLXS, AIF) и антиапоптотических (BCL2, BFL1, BCLXL, CIAP1, CIAP2) эффекторов в эо-зинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой различной тяжести до и после лечения.

3. Установить значение транскрипционных факторов в регуляции экспрессии про- и антиапоптотических эффекторов методом исследования экспрессии генов (NF-kB, р53) и их ДНК-связывающей способности.

4. Исследовать закономерности и механизмы влияния глюкокортикостеро-идной терапии на уровень про- и антиапоптотических эффекторов в эозино-филах периферической крови больных бронхиальной астмой.

5. Выявить особенности механизмов реализации программы апоптоза эозинофилов периферической крови у больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

Научная новизна

Впервые с использованием современных высокоинформативных моле-кулярно-биологических методов проведена комплексная оценка проапоптотических и антиапоптотических систем в эозинофилах периферической крови больных астмой в зависимости от степени тяжести, в разные периоды заболевания, включая оценку динамики этих эффекторов на фоне ингаляционной глюкокортикостероидной терапии.

Приоритетными являются данные, характеризующие механизм угнетения программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой, реализующийся через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов и их преобладание над проапоптотиче-скими. Степень нарушения программируемой гибели эозинофилов периферической крови ассоциирована с тяжестью заболевания и активностью воспаления при астме.

Впервые показано, что повышенная экспрессия гена ингибитора цик-линзависимых киназ р21У¥аП/Сф1, независимо от тяжести и периода заболевания, является маркером стабильного нарушения внутриклеточного метаболизма в эозинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой. Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р21ЧУаП/С1р1 с показателями апопто-тической гибели эозинофилов, сильная положительная корреляция с содержанием эозинофилов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспалительных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотическими эффекторами ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВБЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль р211Л?аП/Сф1 в реализации провоспалительных и антиапоптотических эффектов при бронхиальной астме.

Новыми являются данные о том, что в эозинофилах больных бронхиальной астмой в период ремиссии, на фоне снижения экспрессии МР-кВ-транскрипционно-зависимых провоспалительных и антиапоптотических эффекторов существенно повышена ДНК-связывающая способность нуклеар-ного фактора -кВ. Это свидетельствует о том, что фоне ингаляционной глюкокортикостероидной терапии формируется механизм селективной транскрипционной активности Т^-кВ в отношении провоспалительных и антиапоптотических генов-мишеней.

Приоритетными являются данные о том, что экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 снижена в эозинофилах периферической крови больных астмой. ДНК-связывающая активность нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию, коррелирует с тяжестью бронхиальной астмы.

Сформулирована новая концепция о роли экспрессии гена р53 и его транскрипционной активности в формировании апоптотического статуса эо-зинофилов периферической крови больных астмой и его значение в патогенезе бронхиальной астмы.

Впервые показано, что эозинофилы периферической крови больных бронхиальной астмой имеют высокий антиапоптотический статус, что может свидетельствовать о коммитированости антиапоптотического статуса на этапе дифференцировки эозинофилов в костном мозге. Формирование антиапоптотического статуса осуществляется путем селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоптотическим стимулам через механизм посттрансляционной модификации функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (№-кВ) и программы клеточной гибели (р53).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Результаты проведенного исследования дают возможность разрабатывать мероприятия первичной профилактики бронхиальной астмы, посредством раннего выявлением доклинических состояний у лиц с предрасположенностью к астме, и формировать индивидуальные рекомендации по предупреждению перехода скрытых биологических дефектов в состояние клинической манифестации болезни.

Проведенное комплексное изучение регуляции программируемой гибели эозинофилов больных бронхиальной астмой с выделением характерных апоптоз-ассоциированных синдромов создали весомые предпосылки для использования выявленных особенностей транскрипционной и пострансляци-онной регуляции непосредственно в клинической практике.

Установленные в исследовании новые патогенетически важные для астмы молекулярные маркеры могут стать фармакогенетическими мишенями для разработки новых терапевтических подходов в лечении бронхиальной астмы.

Результаты исследований могут быть использованы в процессе последипломного образования аллергологов, иммунологов, пульмонологов.

Положения, выносимые на защиту

1. Содержание эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза снижено у больных бронхиальной астмой. Степень снижения ассоциирована с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ, ИЛ-5) и с активностью воспаления.

2. Нарушение программы гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме реализуется через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов, что приводит к снижению апоптоза эозинофилов. Коммитированость антиапоптотического статуса эозинофилов больных астмой наблюдается на уровне периферической крови, что может быть следствием селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоп-тотическим стимулам на этапе дифференцировки в костном мозге.

3. Апоптозиндуцирующий эффект ингаляционной глюкокортикостероид-ной-терапии у больных легкой и среднетяжелой астмой реализуется путем увеличения экспрессии ВСЬХ8, ВАХ и снижения активности ингибиторов каспаз С1АР1, С1АР2, следствием чего является активация каспазного каскада апоптотической гибели. У больных тяжелой бронхиальной астмой ведущим проапоптотическим эффектом глюкокортикостероидов является повышение экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора (А1Р) и усиление альтернативного пути апоптоза.

4. Базисным механизмом изменения программируемой гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме является посттрансляционная модификация функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (ОТ-кВ) и программы гибели клетки (Р53).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН, г. Курск, 2002 г.; на конференции «Functional Genomics» г. Boston, Massachusetts, США, 2002 г.; на конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск, 2003, 2004 г.; на Европейском респираторном конгрессе, г. Вена, 2003 г., г. Глазго, 2004 г.; на XIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2003 г.; на конгрессе «З-rd Congress of Europian Region International Union against Tuberkulosis and Lung Diseases (IUATLD)» и 13 конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2004 г.; на IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!", г. Томск, 2004 г.

Внедрение результатов исследований

Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета и > кафедре биохимии и молекулярной биологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре патофизиологии Сибирского государственного медицинского университета и кафедре клинической аллергологии и иммунологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Методы РТ-ПЦР апоптотических факторов и метод оценки ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов адаптированы и внедрены в практику научных исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 11 журнальных статей, из которых 9 представлены в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 210 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, главы собственных наблюдений и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 48 рисунками и 36 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 199 работы, из которых 22 отечественных и 177 зарубежных авторов.

Работа выполнена на базе отдела биохимии (зав. отд.- к.м.н. А.Э. Сазонов) и отдела молекулярной биологии (зав. отд. - к.м.н. И.И. Иванчук) Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Бай-ков), научно-исследовательском учреждении «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук (директор института академик Власов В.В), кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф.- профессор, д.м.н. Л.М. Огородова), кабинета функциональной диагностики Областного детского центра клинической иммунологии-аллергологии областной детской больницы, г. Томск (зав. каб. - И.А. Деев), Астма-центра областной клинической больницы, г. Томск (гл. врач - к.м.н. Б.Т Серых).

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Иванчук, Игорь Иванович

выводы

1. Количество эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза значительно снижено при бронхиальной астме, независимо от тяжести заболевания, и ассоциировано с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ и ИЛ-5). На фоне терапии ингаляционными глюкокортикостероидами уровень эозинофилов с признаками апоптоза повышается, достигая значений контроля при легкой и среднетяжелой астме, и оставаясь достоверно ниже контроля при тяжелой форме заболевания.

2. Уровень мРНК антиапоптотических (BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2) и проапоптотических (BAD, AIF) эффекторов повышен в эозинофилах периферической крови больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой в период обострения. На фоне ингаляционной кортикостероидной терапии уровень мРНК BCL2, BFL1, BCLXL снижается, экспрессия генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) достигает контроля, а проапоптотических генов BCLXS и ВАХ увеличивается при легкой и среднетяжелой астме. При обострении тяжелой астмы увеличена экспрессия всех антиапоптотических эффекторов (BCL2, BFL1, BCLXL CIAP1, CIAP2) и снижена экспрессия гена BCLXS. Отличительной особенностью динамики данных показателей у больных тяжелой астмой на фоне лечения является сохранение высокого уровня экспрессии генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) и увеличение экспрессии апоптоз-идуцирующего фактора AIF.

3. Экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 в эозинофилах периферической крови снижены при обострении бронхиальной астмы, повышаются в период ремиссии, не достигая контрольных значений.

4. Выявлена обратная корреляционная зависимость между тяжестью бронхиальной астмы и ДНК-связывающей активностью нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию. Установлена сильная положительная корреляционная связь экспрессии р53 с матричной активностью ВАХ и ВСЬХБ и отрицательная - с группой антиапоптотических эффекторов ВСЬ2, ВИЛ, С1АР1, С1АР2 в период ремиссии бронхиальной астмы.

5. Экспрессия гена транскрипционного фактора №-кВ значительно повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой как в обострении так и в ремиссии. Ингаляционная глюкокортикостероидная терапия не сопровождается изменением экспрессии мРНК №"-кВ, однако на ее фоне существенно увеличивается ДНК-связывающая способность №ЧсВ.

6. Проапоптотический механизм ингаляционной глюкокортикостеро-идной терапии у больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой реализуется путем увеличения экспрессии ВСЬХБ, ВАХ и снижения активности ингибиторов каспаз С1АР1, С1АР2, у больных тяжелой астмой - путем повышения экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора АН7.

7. Экспрессия гена ингибитора циклинзависимых киназ р21ЧУаП/с,р1 повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой, независимо от тяжести и периода заболевания. Уровень мРНК р21у/аП/С|р1 отрицательно коррелирует с количеством апоптотических эозинофилов, и положительно с уровнем эозинофилов периферической крови, с экспрессией мРНК ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотическими эффекторами ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВРЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия).

8. Механизм клеточной гибели эозинофилов у больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой реализуется в период обострения через активацию апоптоз-индуцирующего фактора А№, в период ремиссии за счет снижения экспрессии ингибиторов каспаз (С1АР1, С1АР2). Особенностью тяжелой бронхиальной астмы является более значимое повышение экспрессии антиапоптотических эффекторов (ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВРЫ, С1АР1, С1АР2) в сравнении с легкой и среднетяжелой астмой, отсутствие нормализации экспрессии ингибиторов каспаз (С1АР1, С1АР2) и активация альтернативного пути апоптоза в период ремиссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивность исследований проблемы апоптоза в последние годы связана с рядом обстоятельств. Прежде всего, появились методические возможности регистрации различных проявлений апоптоза и анализа его молекулярных механизмов, которые тесно связаны с механизмами других важных процессов (например, активация клеток и связанная с ней биологическая сигнализация). Кроме того, изучение апоптоза оказалось очень продуктивным для понимания ряда важнейших процессов, включая иммунный гомео-стаз и онкогенез. Наконец, в связи с апоптозом возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ патофизиологии. Вместо прежних представлений о гибели клеток многоклеточного организма как отрицательном по значимости явлении, идентифицируемом с некрозом, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым процессом, и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций. Менее очевидной представляется роль апоптоза в развитии патологических процессов. Создается впечатление, что эта форма гибели клеток (в отличие от некроза) не является обязательной составляющей типовых патологических процессов; скорее можно говорить о нарушениях самого апоптоза как основе ряда заболеваний.

В обзоре [Fine А., 2000], подводящем итог 10-летних исследований роли апоптоза в патогенезе заболеваний легких, однозначным является только констатация факта изменения активности апоптотической гибели различных типов клеток при легочной патологии. Однако патогенетическое значение нарушения апоптоза тех или иных клеток остается вопросом открытым до сегодняшнего дня.

По результатам наших исследований можно сделать заключение, что в эозинофилах больных БА увеличена активность антиапоптотических проксимальных эффекторов, способных ингибировать апоптоз как митохондриального так и рецепторного пути, и не изменена активность проапоптотических эффекторов. Подобный дисбаланс в системе апоптоза может быть связан либо с генетическим дефектом в регуляторных и/или эффекторных генах, либо с особенностями коммитирования механизмов апоптоза на этапе дифференцировки эозинофилов.

Повышение апоптотической активности эозинофилов периферической крови больных легкой и среднетяжелой БА в период ремиссии на фоне существенного дисбаланса апоптотических факторов в сторону антиапоптотических эффекторов по всей видимости связан с ГКС-опосредованным увеличением экспрессии BCLXS, ВАХ и снижением активности ингибиторов кас-паз (CIAP1, CIAP2). Повышение апоптотической гибели эозинофилов у больных тяжелой БА на фоне повышенной активности антиапоптотических эффекторов связано с высоким уровнем экспрессии апоптоз-активирующего фактора (AIF) и запуском механизма параптотического типа гибели клетки.

В условиях многофакторности воспалительного ответа важно разделять эффекторы, изменение активности которых является патогенетически важным, от эффекторов, которые являются сопутствующими основному процессу и косвенно связаны с реальным механизмом конкретного нарушения. В случае такой патологии как БА изменение в балансе про- и антиапоптотических факторов в клетке и, в целом, снижение апоптотической активности, в частности эозинофилов, на наш взгляд является сопутствующим эффектом, отражающим более серьезную системную молекулярную патологию.

В настоящее время БА рассматривается как полиэтиологическое хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей с наследственной компонентой. БА может быть вызвана воздействием на организм аллергенов инфекционного происхождения (вирусы, микоплазмы, бактерии, грибы), атопической природы (пыльца растений, пыль, шерсть животных, пищевые продукты), а также химических, механических, физических и метеорологических факторов. При этом, все этиологические факторы являются опосредованными пусковыми механизмами развития и хронизации Б А, и каждый класс факторов формирует свою индивидуальную систему механизмов реализации патологического процесса. Совершено очевидно, что при столь разнообразной природе этиологических факторов, имеющих совершенно различные молекулярные и физико-химические механизмы влияния на живые системы, но в конечном итоге приводящих к типичной при БА патоморфоло-гической и клинической картине, в организме должна быть общая критическая мишень для их воздействия.

На наш взгляд такой мишенью может быть транскрипционный фактор р53, контролирующий широкий спектр регуляторных и эффекторных генов через регуляцию транскрипции и прямое (белок-белковое) взаимодействие. При этом допустимо предположение, что у больных БА существует, ряд незначительных генетических и, как следствие, функциональных дефектов в самом гене р53, и в генах регуляторной группы, которые при благоприятных условиях могут быть компенсированными. Так, например, установленное нами снижение матричной и функциональной активности (возможно в результате мутации) транскрипционного фактора р53, может привести к сужению нормы реакции периферических контролируемых им функциональных систем, в частности к ослаблению контроля пролиферации, роста и диффе-ренцировки клетки, к некомпетентности антиоксидантной системы в условиях оксидативного стресса и т.д. Как показали полученные в работе результаты, важное влияние на снижение активности р53 может оказывать повышенная экспрессия ингибитора циклинзависимых киназ р21¥/аП/с,р1. Высокая экспрессия гена р21^п/Сф1, независимо от тяжести и периода заболевания, является маркером стабильного нарушения внутриклеточного метаболизма в эо-зинофилах больных бронхиальной астмой, характеризующего хроническое воспаление при БА. Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р2^УаП/С1р1 с показателями апоптотической гибели эозинофилов, сильная положительная корреляция с содержанием эозинофилов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспалительных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотических эффекторов ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВБЬ1, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль р21ШаП/Сф1 в реализации провоспа-лительных и антиапоптотических эффектов при бронхиальной астме.

Использование в терапии больных астмой ингаляционных глюкокор-тикостероидов, исключающее их прямое действие на эозинофилы периферической крови, предполагает, что наблюдаемые нами на фоне лечения изменения в значениях исследуемых параметров связаны с продукцией дистантных медиаторов воспаления. По всей видимости, наблюдаемые нами стабильные изменения в экспрессии апоптотических и апоптоз-ассоциированных генов у больных БА как до, так и после лечения являются следствием системной ошибки в регуляции клеточного ответа. Высокий ба-зальный уровень экспрессии антиапоптотических эффекторов при низкой функциональной активности р53 и слабом, в ряде случаев неадекватном, ответе на ИГКС терапию (повышение ДГЖ-связывающей активности №ЧсВ) свидетельствует о том, что клетка находится в состоянии рефрактерности как к экстраклеточным так и внутриклеточным апоптотическим сигналам. Поскольку изменения регуляторно-эффекторных механизмов апоптоза установлены нами в эозинофилах периферической крови, следовательно, формирование рефрактерного состояния происходит, по всей видимости, на этапе роста и дифференцировки эозинофилов по механизму, схожему с формированием иммунной системы в эмбриогенезе. Мы предполагаем, что в процессе деления, роста и особенно дифференцировки эозинофилов на фоне высокой оксидативной и цитокиновой нагрузки, происходит селекция эозинофилов с высоким антиапоптотическим статусом эффекторного и регуляторного звена апоптоза. Возможно, что подобный механизм селекции может быть общим для всех эффекторных клеток воспаления при БА. Необходимо отметить, что эффекты выявленных нами нарушений в системе внутриклеточной регуляции не ограничены исключительно механизмами апоптоза и могут иметь проявления во всех системах клеточного метаболизма.

Таким образом, нами установлены серьезные нарушения в системе регуляции активности транскрипционных факторов Т^ПЧсВ и р53 и, возможно, связанное с ним конститутивное доминирование экспрессии антиапоптоти-ческих эффекторов над проапоптотическими в эозинофилах больных БА. Из полученных нами результатов также следует, что в эозинофилах больных БА, в первую очередь, нарушен механизм посттрансляционной функциональной активации транскрипционных факторов. Следствием этого являются инвариантный ответ транскрипционно-зависимых генов-мишеней и изменение в экспрессии самих нуклеарных факторов. Возможно установленные нарушения генетически детерминированы компенсированные мутации в основных функциональных и регуляторных доменах) или являются эффектом экзогенного (экстраклеточного) воздействия каких-либо факторов, например, повышения цитокиновой и/или оксидативной нагрузки. Не исключен вариант кооперативного проявления описанных выше механизмов. Из полученных данных следует, что формирование нарушений в системе регуляции активности транскрипционных факторов 1ЧР-кВ, р53 и апоптотического статуса очевидно происходит в эозинофилах на этапе роста и дифференцировки в костнЯрвиювгаеским использованием полученных в работе результатов, на наш взгляд, является возможность применения у больных БА современных молекулярных методов ген-направленной регуляции (рис. 48).

Акцент ген-направленного воздействия должен быть сделан на модуляции экспрессии и функции гена р53 (как фактора транскрипции так и ци-тозольного регуляторного эффектора). В настоящее время, в связи активным и многолетним исследованием участия р53 в процессе онкогенеза, разработан широкий спектр методов и терапевтических подходов в регуляции и компенсации функциональной недостаточности р53, включая технологию з11ША-модулирования активности ингибиторных генов и направленной активации транскрипции генов-гомологов р53 (рбЗ, р73).

Рис. 48. Схема направленной терапевтической коррекции внутриклеточной дисфункции транскрипционных факторов р53 и ИР-кВ

Вторым важным звеном направленной модуляции эффектов как р53 так и ИР-кВ является регуляция киназных каскадов передачи сигнала (р21у/аП/Сф1, СОК), модулирование этапа транслокациии транскрипционного фактора в ядро и внутриядерная активация ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов. Для этого могут быть использованы как общие подходы, например, антиоксидантная терапия для нормализации оксидатив-ного статуса клетки, так и целевые, направленные на конкретные звенья воспалительного процесса, например, цитокиновой регуляции клеточного ответа (анти - ИЛ-5, ГМ-КСФ и т.д.).

На наш взгляд использование современных геномных и постгеномных подходов в лечении БА является актуальным и целесообразным, а с учетом полученных данных о возможных фармакогенетических мишенях, может стать значительно более эффективной в сравнении с традиционными терапевтическими подходами в лечении бронхиальной астмы.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Иванчук, Игорь Иванович, 2005 год

1. Аббасова С.Г. Система Fas-FasL в норме и при патологии /С.Г. Аббасова, В.М. Липкин, H.H. Трапезников, Н.Е. Кушлинский // Вопросы биол. мед. и фарм. Химии. 1999. - №3. - С. 3 - 16.

2. Белушкина H.H. Молекулярные основы апоптоза / H.H. Белушкина, Х.Х. Али, С.Е. Северин // Вопросы биол. мед. и фарм. Химии. 1998. - №4. - С. 15-23.

3. Берестецкий А. Б. Изменение свойств эозинофилов под влиянием сыворотки крови больных бронхиальной астмой / А.Б. Берестецкий, И.В. Лещенко, И.А. Кардашина // Пульмонология. 1997. - №2. - С. 57-60.

4. Борисова Е.А. Молекулярные механизмы интерфазной гибели лимфоидных клеток / Е.А. Борисова, К.П. Хансон // Радиобиология. -1984. -№ 6. -С. 723 727.

5. Карупу В.Я. Электронная микроскопия.-К.: Вища школа. Головное изд-во. 1984,.- С. 24 (208 с.)

6. Ковальчук Л.В. Апопто генные механизмы возникновения иммунодефицитных заболеваний / Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев // Ж. Микробиологии. 1999. - № 5. - С. 47 - 52.

7. Невзорова В.А. Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме / В.А. Невзорова, Т.Н. Суворенко, E.H. Коновалова // Терапевтический архив. 2001. - № 12. - С. 92 - 96.

8. Новиков B.C. Программируемая клеточная гибель. / B.C. Новиков. СП.: Наука. 1996.-276 с.

9. Новицкий. В.В. Руководство к практическим занятиям по гематологии / В.В. Новицкий, О.М. Евтушенко. Томск. - 1999. - 160 с.

10. Огородова JI.M. Роль интерлейкина-5 в патогенезе бронхиальной астмы / JI.M. Огородова, О.С. Кобякова, М.Б. Фрейдин и др. // Аллергология. 1999. - № 4. - С. 32 - 36.

11. Сазонов А.Э. Экспрессия интерлейкина-5 (IL-5) в мокроте больных бронхиальной астмой / А.Э. Сазонов, Ф.И. Петровский, Е.А. Геренг, Л.М. Огородова // Бюл. экспер. биол. и медицины. -2003. Т. 135, № 4. с. 437 - 440.

12. Соловьев A.C. Корреляция цитотоксической активности мутантных форм фактора некроза опухолей- а с изменением уровня свободного сфингозина в печени мышей / A.C. Соловьев, В.Г. Коробко и др. // Биохимия. 1995. - Т. 60, № 8. - С. 1283 -4291-.

13. Трофимов В.И. Роль глюкокортикоидных гормонов в развитии аллергического воспаления / В.И. Трофимов, Н.Л. Шапорова // Аллергология. 2001. - № 1. - С. 25 - 29.

14. Уикли И.Б. Электронная микроскопия для начинающих.- М.: Мир, 1975. -324 с.

15. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы / С.Р. Уманский // Молекулярная биология. 1996. - Т. 30, № 3. - С. 487 -502.

16. Фрейдин М.Б. Полиморфизм генов интерлейкинов и их рецепторов: популяционная» распространенность и связь с атопической бронхиальной астмой / М.Б. Фрейдин, В.П. Пузырев, Л.М. Огородоваи др. //Генетика. -2002. -Т. 38, № 12.-С. 1710- 1718.

17. Хансон К.П. Молекулярные механизмы интерфазной гибели лимфоидных клеток / К.П. Хансон // Радиобиология. 1979. - Т. 19, № 6.-С. 814-820.

18. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма / А.Г. Чучалин. М.: Издательский дом «Русский врач». 2001. - 144 с.

19. Шварц Г.Я. Сальбутамол и м-холинолитические средства. Сальбутамол. Под ред. А.Г.Чучалина, И. Хамида / Шварц Г.Я. М.-ФАРМЕДИНФО. 1992. - С. 214 - 221.

20. Abastado J.-P. Apoptosis: function and regulation of cell death / J.-P. Abastado // Res. Immunol. 1996. - Vol. 147. - P. 443 - 456.

21. Adachi M. Targeted mutation in the Fas gene causes hyperplasia in peripheral lymphoid organs and liver / M. Adachi, S. Suematsu, T. Kondo et al. // SO-Nat Genet. 1995. - Vol. 11. - P. 294 - 300.

22. Adams J.M. The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival / J.M. Adams, S. Cory // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol. 160, № 5. -P. 5 - 11.

23. Afford S. Apoptosis / S. Afford, S. Randhawa // J. Clin. Pathol. 2000. -№53. - P. 55-63.

24. Albina J.E. Detection of reactive oxygen intermediate production by macrophages / J.E. Albina, J.S. Reichner // Methods Mol Med. 2003. -Vol. 78.-P. 369-376.

25. Almawi W.Y. On the link between BCL2 family proteins and glucocorticoid-induced apoptosis / W.Y. Almawi, O.K. Melemedjian, M.M. Abou Jaoude // Journal of Leukocyte Biology. 2004. - Vol. 76. -P. 7- 14.

26. Antonsson B. The BCL2 Protein family / B. Antonsson, J.-C. Martinou // Exp. Cell Res. 2000. - Vol. 256. - P. 50 - 57.

27. Arai Y. Glucocorticoid-induced apoptotic pathways in eosinophils: comparison with glucocorticoid-sensitive leukemia cells / Y. Arai, Y.

28. Nakamura, F. Inoue et al. // Int. J. Hematol. 2000. - Vol. 71. - P. 340.

29. Aravind L. Apoptotic Molecular Machinery: Vastly Increased Complexity in Vertebrates Revealed by Genome Comparisons / L. Aravind, V.M. Dixit, E. V.Koonin //

30. Asada M. Brap2 functions as a cytoplasmic retention protein for p21 during monocyte differentiation / M. Asada, K. Ohmi, D. Delia et al. // Molec. Cell. Biol. 2004. - Vol. 24. - P. 8236 - 8243.

31. Attardi L.D. PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family / L.D. Attardi, E.E. Reczek, C. Cosmas et al. // Genes Dev. 2000. - Vol. 14, № 6. - P. 704 - 718.

32. Baldwin G.C. The biology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: effects on hematopoietic and nonhematopoietic cells / G.C. Baldwin//Dev Biol. 1992.-Vol. 151, №2.-P. 352-367.

33. Bal-Price A. Mitochondria mediate nitric oxide-induced cell death / A. Bal-Price, V. Borutaite, G.C.-Brown // Ann N Y Acad Sci. 1999. - Vol. 893.-P. 376-378.

34. Barnes P.J. Inflammatory mediators of asthma: an update / P.J. Barnes, K.F. Chung, C.P. Page // Pharmacol Rev. 1998. - Vol. 50. - P. 515 -596.

35. Basyigit I. Inhaled corticosteroid effects both eosinophilic and non-eosinophilic inflammation in asthmatic patients / I. Basyigit, F. Yildiz, S.K. Ozkara et al. // Mediators Inflamm. 2004. - Vol. 13, № 4. - P. 285 -291.

36. Beaulaton J. The relation of programmed cell death to development and reproduction: comparative studies and attempt at classification / J.

37. Beaulaton // Int. Rev. Cytol. 1982. - Vol. 79. - P. 215 - 232.

38. Bedi A. Biological significance and molecular mechanisms of p53-induced apoptosis / A. Bedi, B. Mookerjee // Apoptosis. 1998. - Vol. 3, № 4. - P. 237 - 244.

39. Beitran B. Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: a critical step in Fas signaling / B. Beitran, M. Quintero, E. GarciaZaragoza et al. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2002. - Vol. 99, № 13. - P. 8892 - 8897.

40. Benedict C.A. Death and survival: viral regulation of TNF signaling pathways / C.A. Benedict, T.A. Banks, C.F. Ware // Curr.Opin.Immunol. -2003. -Vol. 15, № l.-P. 59-65.

41. Bochner B.S. Advances in mechanisms of allergy / B.S. Bochner, W.W. Busse //J. Allergy Clin.Immunol.- 2004. -Vol. 113, № 5. P. 868 - 875.

42. Bohrer H. Role of NFkappaB in the mortality of sepsis / H. Bohrer, F. Qiu, T. Zimmermann et al. // J.Clin.Invest. 1997. - Vol. 100, № 5. - P. 972 - 985.

43. Bowler R.P. Oxidative stress in allergic respiratory diseases / R.P. Bowler, J.D. Crapo // J.Allergy Clin. Immunol. 2002. - Vol. 110. - P. 349 - 356.

44. Breckenridge D.G. Regulation of mitochondrial membrane permeabilization by BCL2 family proteins and caspases / D.G. Breckenridge, D. Xue // Curr.Opin. Cell Biol. 2004. - Vol. 16, № 6. - P. 647 - 652.

45. Brutsche M.H. Apoptosis signals in atopy and asthma measured with cDNA arrays / M.H. Brutsche, I.C. Brutsche, P. Wood et al. // Clinical & Experimental Immunology. 2001. - Vol. 123, № 2. - P. 181.

46. Bucchieri F. Asthmatic Bronchial Epithelium Is More Susceptible to Oxidant-Induced Apoptosis / F. Bucchieri, S.M. Puddicombe, J.L. Lordan et al. // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. -2002.-Vol. 27.-P. 179- 185.

47. Busse W.W. Mechanisms of asthma / W.W. Busse, L.J. Rosenwasser //

48. J.Allergy Clin. Immunol. 2003. - Vol. 111, № 3. - P. 799 - 804.

49. Chao D.T. BCL2 family: regulators of cell death / D.T. Chao, S.J. Korsmeyer// Annu.Rev.Immunol. 1998. - Vol. 16. - P. 395 - 419.

50. Chilvers E.R. Regulation of granulocyte apoptosis and implications for anti-inflammatiry / E.R. Chilvers // Thorax. 1998. - Vol. 53, № 7. - P. 533 - 534.

51. Chiou S.K. BCL2 blocks p53-dependent apoptosis / S.K. Chiou, L. Rao, E. White // Mol.Cell Biol. 1994. - Vol. 14, № 4. - P. 2556 - 2563.

52. Chunn J.L. Adenosine-dependent airway inflammation and hyperresponsiveness in partially adenosine deaminase-deficient mice / J.L. Chunn, H.W. Young, S.K. Banerjee et al. // J.Immunol. 2001. - Vol. 167, №8.-P. 4676-4685.

53. Cregan S.P. Role of AIF in caspase-dependent and caspase-independent cell death / S.P. Cregan, V.L. Dawson, R.S. Slack // Oncogene. 2004. -Vol. 23, № 16. - P. 2785 - 2796.

54. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death / M. Crompton // J. Biochem. 1999. - Vol. 15. - P. 233 -249.

55. Debbas M. Wild-type p53 mediates apoptosis by El A / M. Debbas, E. White // Genes Dev. 1993. - Vol. 7. - P.546 - 554.

56. Desreumaux P. Eosinophils in allergic reactions / P. Desreumaux, M. Carpon // Current Opinion in Immunology. 1996. - Vol. 8. - P. 790 -795.

57. Deveraux Q.L. IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspases / Q.L. Deveraux, H.R. Roy, T. Stennicke et al. // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 2215 -2223.

58. Dewson G. Interleukin-5 inhibits translocation of BAX to the mitochondria, cytochromecrelease, and activation of caspases in human eosinophils / G. Dewson, G.M. Cohen, A.J. Wardlaw // Blood. 2001. -Vol. 98, № 7. - P. 2239 - 2247.

59. Dibbert B. Role for BCLXLin Delayed Eosinophil Apoptosis Mediated by Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and Interleukin-5 / B. Dibbert, I. Daigle, D. Braun et al. // Blood. 1998. - Vol. 92, № 3. - P. 778-783.

60. Druilhe A. Glucocorticoid-induced apoptosis in human eosinophils: mechanisms of action / A. Druilhe, S. Letuve, M. Pretolani // Apoptosis. -2003.-Vol. 8, №5.-P. 481 -495.

61. Druilhe A. Human eosinophils express BCL2 family proteins: modulation of Mcl-1 expression by IFN / A. Druilhe, M. Arock, L. Le Goff, M. Pretolani // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol 1998. - Vol. 18. - P. 315 - 322.

62. Dumaz N. Serine 15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2 / N. Dumaz, D.W Meek//EMBO J. 1999. -Vol. 18.-P. 7002-7010.

63. Duncan C.J. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity / C.J. Duncan, A. Lawrie, M.G. Blaylock et al. // Eur. Respir. J. 2003. - Vol. 22, № 3. p. 484 - 490.

64. Dworski R. Oxidant stress in asthma / R. Dworski // Thorax. 2000. -Vol. 55, №2.-P. 51-53.

65. Dziedziczko A. Eosinophil apoptosis and asthma / A. Dziedziczko, K.

66. Palgan // Pol. Merkuriusz Lek. 2004. - Vol. 17, № 97. - P. 73 - 75.

67. Earnshaw W.C. Apoptosis: lessons from in vitro systems / W.C. Earnshaw // Trends Cell Biol. 1995. - Vol. 5, № 6. - P. 217 - 220.

68. Eliasson M.J.L. Exhaled nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease: relationship to pulmonary function / M.J.L. Eliasson // Am J Respir Crit Care Med. 2000. - Vol. 160. - P. 940-943.

69. Exhaled nitric oxide and exercise-induced bronchoconstriction in asthmatic children / M. Scollo, S. Zanconato, R. Ongaro et all // Am J Respir Crit Care Med. 2000. - Vol. 161. №3.-P. 1047-1050.

70. Feder LS. Role of nitric oxide on eosinophilic lung inflammation in allergic mice / LS Feder, D Stelts, RW Chapman, et all // Am J Respir Cell Mol Biol 1997.-Vol.17.-P. 430-436.

71. Ferreira H.H. Nitric oxide modulates eosinophil infiltration in antigen-induced airway inflammation in rats./ H.H. Ferreira, E. Bevilacqua, S.M. Gagioti // Eur J Pharmacol. 1998. - Vol. 358. - P. 253-259.

72. Fine A. Apoptosis in lung pathophysiology / A. Fine, Y. Janssen-Heininger, R.P. Soultanakis et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. - Vol. 279, № 3. - P. 423 - 427.

73. Folkerts G. Airway epithelium: more than just a barrier! / G. Folkerts, F.P. Nijkamp // Trends Pharmacol Sci. 1998. - Vol.19. - P. 334-341.

74. Forstermann U. Expressional control of the "constitutive' isoforms of nitric oxide synthase (NOS I and NOS III) / Ulrich Forstermann, Jean-paul Boissel, Hartmut Kleinert. // FASEB Journal. 1998. - Vol.12. - P. 773790.

75. Franklin PJ. A community study of exhaled nitric oxide in healthy children / PJ Franklin, R Taplin, SM Stick // Am J Respir Crit Care Med. -1999.-Vol.159.-P. 63-69.

76. Frayling I.M. Metods of molecular analysis: mutation detection in solid tumours. / I.M. Frayling // J of Clinical Pathology. 2002. - Vol.55. -P.73-79.

77. Fridman J.S. Control of apoptosis by p53 / J.S. Fridman, S.W. Lowe // Oncogene. 2003. - Vol. 22, № 56. - P. 9030 - 9040.

78. Fu M. Acetylation of nuclear receptors in cellular growth and apoptosis / M. Fu, C. Wang, X. Zhang, R.G. Pestell // Biochem. Pharmacol. 2004. -Vol. 68, №6. -P. 1199- 1208.

79. Gaston B. Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure / B. Gaston, S. Sears, J. Woods, et all // Lancet. 1998. - Vol.35, №1.-P.1317-1320.

80. Gaston B. Distribution of nitric oxide synthase in the lung. In: Zapol W, Bloch K, editors. Nitric oxide and the lung / B. Gaston, L. Kobzik, JS. Stamler // New York: Marcel Dekker; 1997. p 75-86.

81. Gaston B. High ammonia and low nitric oxide levels in the cystic fibrosis airway: adverse effects of Pseudomonas? / B. Gaston, R. Canady, J. Hunt, et all // Am J Respir Crit Care Med. 1999. - Vol.159. - P. 306-309.

82. Gaston B. Nitric oxide and thiol groups / B. Gaston // Biochim Biophys Acta. 1999. -Vol. 46. -P.1411-1417.

83. Geller DA. Molecular biology of nitric oxide synthases / DA. Geller, TR. Billiar // Cancer Metastasis Rev. 1998. -Vol. 24. - P.17-19.

84. Genome-wide screen for atopy susceptibility alleles in the Hutterites / C Ober, A Tsalenko, S Willadsen, D Newman, X Daniel et all. // Clin Exp Allergy. 1999. - Vol. 29. - P.l 1-15.

85. Genome-wide search for asthma susceptibility loci in a founder population / Carole Ober, Nancy J. Cox, Mark Abney et all // Hum. Mol. Genet. -1998. Vol. 7, № 9. -P.1393-1398.

86. Gleich G.J. The eosinophil leukocyte: structure and function / G.J. Gleich, C.R. Adolphson // Adv. Immunol. 1996. - Vol. 39. - P. 177 - 253.

87. Global Initiative for Asthma Workshop Report Электронный ресурс. -Электрон. дан. 2002. - Режим доступа: http://www.ginasthma.com/workshop.pdf.

88. Global Initiative for asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention Электронный ресурс. Электрон, дан. - 2002. - Режим доступа: www.ginasthma.com.

89. Gottlieb R.A. Programmed cell death / R.A. Gottlieb // Drug News Perspect. 2000. - Vol. 13, №8.-P. 471 -476.

90. Gottschalk A.R. Apoptosis in В lymphocytes: the WEHI-231 perspective / A.R. Gottschalk, J. Quintans // Immunol. Cell Biol. 1995. - Vol. 73, № 1. -P. 8-16.

91. Grant R. D.Transcriptional and Posttranscriptional Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Expression by Hydrogen Peroxide / R. Grant, Hua Cai, Michael E. Davis et all // American Heart Association, Inc.- 2000. Vol.86. - P.347-349.

92. Grasermann H. Airway Nitric Oxide Levels in Cystic Fibrosis Patients Are Related to a Polymorphism in the Neuronal Nitric Oxide Synthase Gene. / H. Grasemann // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol.162, № 6. -P.2172-2176.

93. Grasermann H. Different subgroups of difficult asthma in children / H. Grasermann, F. Ratjen et all // Thorax. 2001. - Vol. 56, №11. - P. 856:859.

94. Green D.R. Mitochondria and apoptosis / D.R. Green, J.C. Reed // Science.- 1998.-Vol. 281.-P. 1309- 1312.

95. Gustafsson L.E. Exhaled nitric oxide as a marker in asthma. / L.E.

96. Gustafsson // Eur Respir J Suppl. 1998. - Vol. 26. - P. 49S-52S.

97. Harris C. Structure and function of the p53 tumor supressor gene: Clues for rational cancer therapeutic strategies / C. Harris // J. Nat. Cancer. Inst. 1996. - Vol. 88. - P. 1442- 1455.

98. Harris M.H. Role of oxidative phosphorylation in BAX toxicity / M.H. Harris, M.G. Vander Heiden, S.J. Kron, C.B. Thompson // Mol. Cell Biol. -2000. Vol. 20, № 10. - P. 3590 - 3596.

99. Haunstetter A. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease / A. Haunstetter, S. Izumo // Circ. Res. 1998. -Vol. 82, № 11.-P. 1111 - 1129.

100. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis / M.O. Hengartner // Nature. 2000. - Vol. 407, № 6805. - P. 770 - 776.

101. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis / M.O. Hengartner // Nature. 2000. - Vol. 407, № 6805. - P. 770 - 776.

102. Henricks P.A. Reactive oxygen species as mediators in asthma / P.A. Henricks, F.P. Nijkamp // Pulm. Pharmacol. Ther. 2001. - Vol. 14. - P. 409 - 420.

103. Horvitz H.R. Nobel lecture. Worms, life and death / H.R. Horvitz // Biosci. Rep. 2003. - Vol. 23, № 5 - 6. - P. 239 - 303.

104. Humbles A.A. A critical role for eosinophils in allergic airways remodeling / A.A. Humbles, C.M. Lloyd, S.J. McMillan et al. // Science. -2004. -Vol. 305, № 5691. P. 1776 - 1779.

105. Ito A. p300/CBP mediated-p53 acetylation is commonly induced by p53 activating agents and inhibited by MDM2 / A. Ito, C.-H. Lai, X. Zhao etal. 11EMBO J. 2001. - Vol. 20.-P. 1331 - 1340.

106. Jang A.S. BCL2 expression in sputum eosinophils in patients with acute asthma / A.S. Jang, I.S. Choi, S. Lee. // Thorax. 2000. - Vol. 16, № 5. -P. 370 - 374.

107. Javelaud D. Inactivation of p21 WAF1 Sensitizes Cells to Apoptosis via an Increase of Both pl4ARF and p53 Levels and an Alteration of the BAX/BCL2 Ratio / D. Javelaud, F. Besancon // Biol. Chem. 2002. - Vol. 277.-P. 37949-37954.

108. Jurisicova A. Deadly decisions: the role of genes regulating programmed cell death in human preimplantation embryo development / A. Jurisicova, B.M. Acton // Reproduction. 2004. - Vol. 128. - P. 281 - 291.

109. Kagan V.E. Oxidative lipidomics of apoptosis: redox catalytic interactions of cytochrome с with cardiolipin and phosphatidylserine / V.E. Kagan, G.G. Borisenko, Y.Y. Tyurina et al. // Free Radic. Biol. Med. 2004. -Vol. 37, № 12.-P. 1963 - 1985.

110. Kankaanranta H. Delaied eosinophil apoptosis in asthma / H. Kankaanranta, M.A. Lindsay, M.A. Giembycz et al. // J. Allergy clin. Immunol. 2000. - Vol. 106, № 1.- P. 77 - 83.

111. Kasama T.R. Regulation of neutrophil-derived chemokine expression by IL-10 / T.R. Kasama, M. Strieter, N.W. Lukacs // J. Immunol. 1994. -Vol. 152.-P. 3559-3569.

112. Kay A.B. A role for eosinophils in airway remodelling in asthma / A.B. Kay, S. Phipps, D.S. Robinson // Trends Immunol. 2004. - Vol. 25, № 9.-P. 477-482.

113. Kerr J.F. The molecular basis of cell death / J.F. Kerr, A.H. Wyllie // Br. J. Cancer. 1972. - Vol. 26. - P. 239 - 257.

114. Kidd V.J. Proteolytic regulation of apoptosis / V.J. Kidd, J.M. Lahti, T. Teitz // Semin Cell Dev. Biol. 2000. - Vol. 11, № 3. - P. 191 - 201.

115. Kieilman B. Prognosis of asthma in children. A cohort study in to adulthood / B. Kieilman, B. Hesselmar // Jnt. J.Pediatr. 1994. - Vol. 83,8.-P. 854 861.

116. Koc E.C. Identification of four proteins from the small subunit of the mammalian mitochondrial ribosome using a proteomics approach / E.C. Koc, W. Burkhart, K. Blackburn et al. // Protein Sei. 2001. - Vol. 10, № 3.-P. 471 -481.

117. Komarova E.A. Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53 / E.A. Komarova, L. Diatchenko, O.W. Rokhlin et al. // Oncogene. 1998. - Vol. 17, № 9. - P. 1089 - 1096.

118. Kowaltowski A.J. BCL2 family proteins regulate mitochondrial reactive oxygen production and protect against oxidative stress / A.J. Kowaltowski, R.G. Fenton, G. Fiskum // Free Radic. Biol. Med. 2004. -Vol. 37, № 11.-P. 1845 - 1853.

119. Kroegel C. The role of eosinophils in asthma / C. Kroegel // Lung. 1990. -Vol. 168.-P. 5- 17.

120. Kroemer G. Introduction: mitochondrial control of apoptosis / G. Kroemer // Biochimie. 2002. - Vol. 84, № 2 -3. - P. 103 - 104.

121. Kroemer G. The mitochondrial permeability transition pore complex as a pharmacological target / G. Kroemer // An introduction.Curr. Med. Chem. -2003.-Vol. 10, № 16.-P. 1469- 1472.

122. Lee C.K. A mouse thymic stromal cell line producing macrophage-colony stimulating factor and interleukin-6 / C.K. Lee, J.K. Kim, K. Kim, S.S. Han // Arch. Pharm. Res. 2000. - Vol. 23, № 3. - P. 252 - 256.

123. Leist M. Evolution of cell death principles / M. Leist // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001. - № 2. - P. 589 - 598.

124. Letuve S. Critical Role of Mitochondria, but Not Caspases, during

125. Glucocorticosteroid-Induced Human Eosinophil Apoptosis / S. Letuve, A. Druilhe, M. Grandsaigne et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002. -Vol. 26, №5.-P. 565-571.

126. Linderholm B. Thrombospondin-1 expression in relation to p53 status and VEGF expression in human breast cancers / B. Linderholm, E. Karlsson, S. Klaar et al. // Eur. J. Cancer. 2004. - Vol. 40, № 16. - P. 2417 - 2423.

127. Lotem J. Cytokines as suppressors of apoptosis / J. Lotem, L. Sachs // Apoptosis. 1999. - Vol. 4, № 3. - P. 187 - 196.

128. Lu C.X. Apoptosis-inducing factor and apoptosis / C.X. Lu, T.J. Fan, G.B. Hu, R.S. Cong // Sheng Wu Flua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). -2003. -Vol. 35, № 10.-P. 881 -885.

129. Marmur J. Electrophoresis DNA on a agarose gel / J. Marmur // J. Molec. Biol. 1961. - Vol. 3.-P. 208 -218.

130. Mendoza-Rodriguez C.A. Tumor suppressor gene p53: mechanisms of action in cell proliferation and death / C.A. Mendoza-Rodriguez, M.A. Cerbon // Rev. Invest. Clin. 2001. - Vol. 53, № 3. - P. 266 - 273.

131. Minsky N. The RING Domain of Mdm2 Mediates Histone Ubiquitylation and Transcriptional Repression / N. Minsky, M. Oren // Mol. Cell. 2004. -Vol. 16, №4.-P. 631 - 639.

132. Miyashita T. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human BAX gene / T. Miyashita, J.C. Reed // Cell. 1995. - Vol. 80. -P. 293-299.

133. Nakano K. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53 / K. Nakano, K.H. Wousden // Mol. Cell. 2001. - Vol. 7. - P. 683 - 694.

134. Nicod L.P. Pulmonary hypertension / L.P. Nicod // Swiss. Med. Wkly.2003. — Vol.133, № 6 7. - P.103 - 110.

135. MO.Ochiai K. IL-5 but not interferon-gamma (IFN-) inhibits eosinophil apoptosis by up-regulation of BCL2 expression. / K. Ochiai, M. Kagami, R. Matsuraura, and H. Tomioka / K. Ochiai // Clin. Exp. Immunol 1997. -Vol. 107.-P. 198 -204.

136. Oda K. p53AIPl, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by ser-46-phosphorylated p53 / K. Oda, H. Arakawa, T. Tanaka et al. // Cell. 2000. - Vol. 102. -P. 849 - 862.

137. O'Farrell T.J. Comparison of the effect of mutant and wild-type p53 on global gene expression / T.J. O'Farrell, P. Ghosh, N. Dobashi et al. // Cancer Res. 2004. - Vol. 64, № 22. - P. 8199 - 8207.

138. Pan H. Apoptosis and cancer mechanisms / H. Pan, C. Yin, T.V. Dyke // Cancer Surveys. -1997. Vol. 29. - P. 305 - 327.

139. Perkins N.D. Regulation of NF-B by cyclin-dependent kinases associated with the p300 coactivator / N.D. Perkins, L.K.Felzien, J.C. Betts et al. // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 523 - 527.

140. Perreault J. Earlyhe detection of apoptosis in defined lymphocyte populations in vivo / J. Perreault, R.J. Lemieux // Cell. Physiol. 1993. -Vol. 156.-P. 286 -293.

141. Polyak K. A model for p53-induced apoptosis / K. Polyak, Y. Xia, J.L. Zweier et al. //Nature. 1997. - Vol. 389. - P. 300 - 305.

142. Powers J.T. E2F1 uses the ATM signaling pathway to induce p53 and Chk2 phosphorylation and apoptosis / J.T. Powers, S. Hong, C.N. Mayhew et al. // Mol. Cancer Res. 2004. - Vol. 2, № 4. - P. 203 - 214.

143. Prives C. The p53 pathway / C. Prives, P.A. Hall // J. Pathol. 1999. -Vol. 187.-P. 112-126.

144. Puddicombe S.M. Increased Expression of p21wafCyclin-Dependent Kinase Inhibitor in Asthmatic Bronchial Epithelium /S.M. Puddicombe, C. Torres-Lozano, A. Richter // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology.-2003. Vol. 28.-P. 61-68.

145. Rahman I, MacNee W. Reactive oxygen species / In: Barnes P.J., Drazen J, Rennard S, et al, eds Asthma and COPD.London: Academic Press. -2002.-P. 243-254.

146. Ravi R. p53-mediated repression of nuclear factor-B RelA via the transcriptional integrator p300 / R. Ravi, B.Mookerjee, Y. van Hensbergen et al. // Cancer Res. 1998. - Vol. 58. -P. 4531 - 4536.

147. Reczek E.E. Multiple response elements and differential p53 binding control Perp expression during apoptosis / E.E. Reczek, E.R. Flores, A.S. Tsay et al.//Mol. Cancer Res.-2003.-Vol. 1, № 14. P. 1048 - 1057.

148. Reddien P.W. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans / P.W. Reddien, S. Cameron, H.R. Horvitz // Nature. 2001. -Vol. 412, №6843.-P. 198-202.

149. Reddien P.W. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans / P.W. Reddien, S. Cameron, H.R. Horvitz // Nature. 2001. -Vol. 412, №6843. -P. 198-202.

150. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biology. 1963. - №17. - P. 208212.

151. Robinson D.S. New therapies for asthma: where-next? / D.S. Robinson // Pediatr. Pulmonol. 2003. - Vol. 36, № 5. - P. 369 - 375.

152. Robinson D.S. The Thl and Th2 concept in atopic allergic disease / D.S. Robinson // Chem. Immunol. 2000. - Vol. 78. - P. 50 - 61.

153. Roselli F. p53 dependent pathway of radio - induced apoptosis is alteted in Fanconi anemia / F. Roselli, A. Ridet, T. Soussi et al. // Oncogene. -1995.-Vol. 5.-P. 9-17.

154. Rotenberg M.E. Cytokines regulate eosinophil production and differentiation / M.E. Rotenberg, W.F. Owen // Allergy Today. 1989. -Vol. 3.-P. 8- 12.

155. Ryan K.M. Role of NF-kappaB in p53-mediated programmed cell death / K.M. Ryan, M.K. Ernst, N.R. Rice, K.H. Vousden // Nature. 2000.

156. Vol. 404, № 6780. P. 892 - 897.

157. Saeed W. Eosinophils and eosinophil products in asthma / W. Saeed, A. BADar, M.M. Hussain, M. Aslam // J. Ayub. Med. Coll. AbbottaBAD. -2002. Vol. 14, № 4. - P. 49 - 55.

158. Salvioli S. Opposite role of changes in mitochondrial membrane potential in different apoptotic processes / S. Salvioli, C. Barbi, J. Dobrucki et al. // FEBS Lett. 2000. - Vol. 469,№2-3.-P. 186- 190.

159. Sanna M.G. IAP Suppression of Apoptosis Involves Distinct Mechanisms: the TAK1/JNK1 Signaling Cascade and Caspase Inhibition / M.G. Sanna, J.S. Correia, O. Ducrey et al. // Molecular and Cellular Biology. 2002. -Vol. 22, №6.-P. 1754- 1766.

160. Saunders J.W. Cell death in morfoginesis / J.W. Saunders, J.F. Fallon In: Major problems in development biology Acad. Press. 1967. - P. 289 -314.

161. Saunders R.A. Death in embrionic systems / R.A. Saunders // Science. -1966. Vol. 154.-P. 604-612.

162. Savill J. Phagocytic docking without shocking / J. Savill // Nature. 1998. -Vol. 392.-P. 442-443.

163. Sengupta S. Physiological and pathological consequences of the interactions of the p53 tumor suppressor with the glucocorticoid, androgen, and estrogen receptors / S. Sengupta, B. Wasylyk // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. - Vol. 1024. - P. 54 - 71.

164. Simon H.U. Direct demonstration of delayed eosinophil apoptosis as a mechanism causing tissue eosinophilia / H.U. Simon, S. Yousefi, C. Schranz et al. // J. Immunol. 1997. - Vol. 158. - P. 3902 - 3908.

165. Simon H.U. Targeting apoptosis in the control of inflammation / H.U. Simon // Eur. Respir. J. Suppl. 2003. - Vol. 44. - P. 20 - 21.

166. Skulachev V.P. Programmed death phenomena: from organelle to organism / V.P. Skulachev // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. - Vol. 959. -P. 214-237.

167. Sperandio S. An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death / S. Sperandio, J. de Bell, D.E. Bredesen // PNAS. 2000. - Vol. 97, № 26.- 14376- 14381.

168. Strasser A. BCL2 and thermotolerance cooperate in cell survival / A. Strasser, R.L. Anderson // Cell Growth Differ. 1995. - Vol. 6. - P. 799 -805.

169. Sumay C.V. Serological testing for Epstein-Barr virus-development in interpretation / C.V. Sumay // J. Infec. Diseases. 1985. - Vol. 151, № 6. -P. 984 - 987.

170. Suzuki H. p 19ARF-induced p53-independent apoptosis largely occurs through BAX / H. Suzuki, M. Kurita, K. Mizumoto et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 312, № 4. - P. 1273 - 1277.

171. Takahashi R. / R. Takahashi, Q. Deveraux, I. Tamm et al. // J. Biol. Chem.- 1998. Vol. 273. - P. 7787 - 7790.

172. Takata M. Requirement of phospholipase C-gamma 2 activation in surface immunoglobulin M-induced B cell apoptosis / M. Takata, Y. Homma, T. Kurosaki // Comment in: J Exp Med. 1995. - Vol. 182. - P. 903 - 906.

173. Trump B.F. Cell membranes and disease processes. In: Pathobiology and cell membranes / B.F. Trump, A.U. Arstila // Acad, press. - 1975. - Vol. 1.- P. 1 52.

174. Tsujimoto Y. Cell death regulation by the BCL2 protein family in the mitochondria / Y. Tsujimoto // J. Cell Physiol. 2003. - Vol. 195, № 2. -P. 158- 167.

175. Uller L. Lung Tissue Eosinophils May Be Cleared Through Luminal Entry Rather Than Apoptosis / L. Uller, C.G.A. Persson, L. Kallstrom, J.S. Erjefalt // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. - Vol. 164, № io. - P. 1948- 1956.

176. Urban G. Identification of a Functional Link for the p53 Tumor Suppressor Protein in Dexamethasone-induced Growth Suppression / G. Urban, T. Golden, I.V. Aragon et al. // Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 11.-P. 9747-9753.

177. Venot C. The requirement for the p53 proline-rich functional domain for mediation of apoptosis is correlated with specific PIG3 gene transactivation and with transcriptional repression / C. Venot, M. Maratrat,

178. C. Dureuil et al. // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 4668 - 4679.

179. Verma I.M. Rel/NF-B/IB family: intimate tales of association and dissociation / I.M. Verma, J.K. Stevenson, E.M. Schwarz et al. // Genes Dev. 1995. - Vol. 9. - P. 2723 - 2735.

180. Walsh G.M. Corticosteroids, eosinophils and bronchial epithelial cells: new insights into the resolution of inflammation in asthma / G.M. Walsh,

181. D.W. Sexton, M.G. Blaylock // J. Endocrinol. 2003. - Vol. 178, № 1. -P. 37-43.

182. Webster G.A. Transcriptional Cross Talk between NF-kB and p53 / G.A. Webster, N.D. Perkins // Molecular and Cellular Biology. 1999. - Vol. 19, №5.-P. 3485-3495.

183. White S.R. Corticosteroid-induced apoptosis of airway epithelium: a potential mechanism for chronic airway epithelial damage in asthma / S.R. White, D.R. Dorscheid // Chest. 2002. - Vol. 122, № 6. - P. 278 - 284.

184. White S.R. Corticosteroid-induced apoptosis of airway epithelium: a potential mechanism for chronic airway epithelial damage in asthma / S.R. White, D.R. Dorscheid // Chest. 2002. - Vol. 122, № 6. - P. 278 - 284.

185. White S.R. Corticosteroid-induced apoptosis of airway epithelium: a potential mechanism for chronic airway epithelial damage in asthma / S.R. White, D.R. Dorscheid // Chest. 2002. - Vol. 122, № 6. - P. 278 - 284.

186. Wu G.S. KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene / G.S. Wu, T.F. Burns, E.R. McDonald et al. // Nat. Genet. -1997.-Vol. 17.-P. 141 143.

187. Xiong W. An experimental study on the regulation of expression of Th2 cytokines from T lymphocytes by protein kinase C in asthma / W. Xiong, Y. Xu, Z. Zhang et al. // J. Tongji Med. Univ. 2001. - Vol. 21, № 4. - P. 292 - 296.

188. Yamanishi Y. Regional analysis of p53 mutations in rheumatoid arthritis synovium / Y. Yamanishi, D.L. Boyle, S. Rosengren et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-2002.-Vol. 99, № 15.-P. 10025 10030.

189. Yoichiro Y. p53 Physically Interacts with Mitochondrial Transcription Factor A and Differentially Regulates Binding to Damaged DNA / Y. Yoichiro, H. Izumi, T. Torigoe et al. // Cancer Research. 2003. - Vol. 63. -P. 3729 - 3734.

190. Zangrilli J. Effect of IL-5, glucocorticoid, and Fas ligation on BCL2 homologue expression and caspase activation in circulating human eosinophils / J. Zangrilli, N. Robertson, A. Shetty et al. // Clin. Exp.1.munol. 2000. - Vol. 120. - P. 12.

191. Zhai D. Characterization of the anti-apoptotic mechanism of Bcl-B / D. Zhai, N. Ke, H. Zhang et al. // Biochem. J. 2003. - Vol. 376. - P. 229 -236.