Механизмы актин-обусловленной подвижности бактерии Listeria Monocytogenes тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Самарин, Станислав Николаевич

• Самарин, Станислав Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самарин, Станислав Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Актин.

2.2. Тредмиллинг.

2.3. Динамика актина в клетке.

2.4. ADF/кофилины.

2.5. Профилин и Тр4.

2.6. Кэпирующие белки и гельзолин.

2.7. Комплекс Агр2/3.

2.8. Белки семейства WASP.

2.9. Listeria monocytogenes и белок ActA.

2.10. Белки семейства Ena/VASP.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Белки.

3.2. Исследование взаимодействия комплекса Агр2/3 и VASP in vitro.

3.3 Полимеризационные тесты.

3.4. Видеомикроскопия.

3.5. Listeria monocytogenes.

3.6. ActA-полистиреновые бусины.

3.7. Статистическая обработка данных.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Для создания новых филаментов комплексом Агр2/3 необходимы плюс-концы существующих актиновых филаментов.

4.2. Актиновые филаменты, растущие из одного узла разветвления, имеют равные длины.

4.3. Новые актиновые филаменты растут с плюс-концов филаментов-затравок.

4.4. Комплекс Агр2/3 не взаимодействует с VASP.

4.5. VASP не оказывает эффекта на кинетики полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, активированного растворимым ActA.

4.6. VASP увеличивает плотность ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3, но не меняет кинетики их деветвления.

4.7. ActA-микроеферы.

4.8. VASP необходим для движения ActA-микроефер.

4.9. VASP усиливает нуклеаторный эффект комплекса Агр2/3, активированного ActA на поверхности полистиреновых микросфер и Listeria monocytogenes.

4.10. VASP связывает актиновые филаменты с ActA на поверхности полистиреновых микросфер независимо от комплекса Агр2/3.

4.11. VASP не связывается с плюс-концами актиновых филаментов и не препятствует кэпированию плюс-концов филаментов кэпирующими белками.

4.12. VASP не участвует в регуляции процесса кэпирования плюс-концов филаментов кэпирующими белками при движении ActA-микроефер.

4.13. VASP уменьшает плотность ветвления актиновых филаментов

ActA-активированным комплексом Агр2/3, увеличивая расстояние между соседними точками ветвления.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы актин-обусловленной подвижности бактерии Listeria Monocytogenes»

Актиновый цитоскелет — основа клеточной морфологии и подвижности. Актин обнаружен практически во всех типах эукариотических клеток и может составлять более 20 % от всего клеточного белка. Из актиновых филаментов построен жёсткий, но в то же время подвижный и динамически изменяющийся каркас клетки - клеточный кортекс, -который придаёт механическую прочность поверхностному слою клетки и играет ведущую роль в таких важнейших для жизни клетки процессах, как локомоция, изменение формы и различные типы внутриклеточной реорганизации. Полимеризация актина также является движущей силой для внутриклеточного перемещения некоторых патогенных организмов, таких как Listeria и Shigella.

В настоящий момент одним из важнейших вопросов клеточной биологии является вопрос о том, каким образом клетка интегрирует сигналы, приходящие с различных рецепторов, и осуществляет направленную и строго регулируемую полимеризацию актина в ответ на внешнее раздражение. Открытый в 1994 году белковый комплекс Агр2/3 (Machesky et al., 1994) считается на сегодняшний день основным эффектором, инициирующим локальную полимеризацию актина в ответ на активацию сигнальными белками. Состоящий из 7 субъединиц, две из которых (Агр2 и АгрЗ) имеют структурную гомологию с актином, комплекс Агр2/3 локализован в примембранном пространстве переднего края движущейся клетки (ламеллоподии) и в актиновых бляшках, где под действием белков-активаторов он создаёт актиновые филаменты de novo. При этом комплекс Агр2/3 организует филаменты в дихотомически ветвящиеся структуры, придавая дополнительную жёсткость актиновой сетке в области выпячивания плазматической мембраны.

В клетках эукариотов активаторами комплекса Агр2/3 являются белки из семейства Scar-WASP. WASP выполняет функцию белка-адаптора, передающего сигналы с тирозинкиназных рецепторов и ГТФаз, таких как Cdc42, на Агр2/3 комплекс (Miki et al., 1998, *Miki et al., 1998). Таким образом, WASP работает как устройство, интегрирующее различные сигналы и инициирующее направленную полимеризацию актина за счет локальной активации комплекса Агр2/3.

Бактериальный мембранный белок ActA (Kocks et al., 1992) из Listeria monocytogenes имеет функциональную гомологию с WASP. Этот белок - единственный бактериальный белок, необходимый для движения Listeria внутри инфицированной клетки. ActA активирует Агр2/3 комплекс клетки-хозяина, позволяя, таким образом, использовать полимеризацию актина на поверхности бактерии для кометоподобного движения Listeria в цитоплазме инфицированной клетки. Благодаря тому, что Listeria обходит сигнальные пути клетки, а также из-за того, что ActA активирует комплекс Агр2/3 подобно WASP, Listeria используется многими исследователями как удобная модельная система для изучения процессов клеточной подвижности.

Не так давно в литературе появились данные о вовлеченности белков семейства Ena/VASP (Gertler et al., 1990) в регуляцию процессов клеточной подвижности. При этом показано, что во время движения Listeria VASP взаимодействует с ActA и остаётся на поверхности бактерии. Скорость движения Listeria в отсутствие VASP очень мала и возрастает в 10 раз, если в среде присутствует VASP (Loisel et al., 1999). Однако до настоящего времени остаётся непонятным ни механизм активации Агр2/3 комплекса белком ActA, ни роль VASP в этом процессе.

Цель и задачи работы.

Исходя из вышесказанного, целью данной работы было исследование механизма образования актиновых филаментов ActA-активированным комплексом Агр2/3 и роли VASP в этом процессе.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: >

1. Изучить процесс ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3, активированным ActA.

2. Изучить роль VASP в регуляции полимеризации актина ActA-активированным комплексом Агр2/3 в растворе.

3. Создать модельную систему для изучения процессов, происходящих на поверхности Listeria, и использовать её для определения функции VASP в регуляции движения бактерии.

Научная новизна.

В настоящей работе было доказано взаимодействие активированного комплекса Агр2/3 с плюс концом существующих актиновых филаментов для создания новых филаментов. Это разрешило давнюю полемику между сторонниками гипотезы о ветвлении актиновых филаментов комплексом Агр2/3 с плюс конца существующего филамента (Pantaloni et al., 2000) и гипотезы о ветвлении новых филаментов из произвольной точки на стороне актинового филамента (Amann, Pollard, 2001) в пользу первых. Впервые показано, что VASP способен изменять морфологию ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3 в актиновых хвостах Listeria monocytogenes, увеличивая расстояния между соседними точками ветвления филаментов, подобно тому, как это происходит в ламеллоподии эукариотической клетки (Bear et al., 2002). При этом VASP не регулирует процесс блокирования плюс-концов актиновых филаментов кэпирующими белками, как считалось ранее (Bear et al., 2002).

Практическое значение работы.

Результаты проведённых исследований расширяют представления о молекулярных механизмах актин-обусловленной подвижности как бактериальных клеток, так и клеток эукариотов. Разработана удобная модельная система для изучения подвижности Listeria monocytogenes, не обладающая патогенностью для исследователя. Разработан метод, позволяющий измерять активность белков, адсорбированных на твёрдой поверхности, с помощью стандартного флуориметра. Полученные в работе результаты могут быть использованы в клинической бактериологии при разработке способов защиты и лечения от Listeria monocytogenes, а также при чтении лекций и в лабораторной практике на кафедрах биохимии и биофизики биологических факультетов и медицинских институтов.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Актин.

Актин - основной компонент системы микрофиламентов клетки. Он обнаружен практически во всех типах клеток эукариотов и может составлять более 20% от всего клеточного белка (Cooper, 1991; Korn, 1982). Этот белок играет ведущую роль в поддержании постоянной формы клетки и различных типах клеточной подвижности: локомоции (перемещении), цитокинезе, внутриклеточном транспорте, различных процессах внутриклеточной реорганизации. Из актина построена жёсткая, но в то же время подвижная и динамически изменяющаяся густая сеть филаментов под плазматической мембраной клетки - клеточный кортекс, — который придаёт механическую прочность поверхностному слою клетки и позволяет ей изменять форму и двигаться (Албертс и др., 1994). Полимеризация актина также является движущей силой для внутриклеточного перемещения некоторых патогенных организмов, таких как Listeria, Shigella и вирус вакцины против натуральной оспы.

Актин был впервые выделен из мышц венгерским биохимиком Б. Штраубом в 1942 году. Актин может находиться как в мономерной, так называемой глобулярной форме (G-актин), так и в полимерной фибриллярной форме (F-актин) (Straub, 1942). Мономерный актин представляет собой небольшой белок с молекулярной массой около 42 кДа и изоэлектрической точкой при кислых значениях рН (Vandekerckhove, Weber, 1978; Korn, 1982). Большинство актинов состоит из 375 аминокислотных остатков, в том числе одного остатка необычной аминокислоты — 3-метилгистидина (His68), который образуется посттрансляционно. При анализе аминокислотной последовательности актина обращает на себя внимание большое количество отрицательно заряженных групп, особенно на N-конце цепи. Так, из пяти N-концевых аминокислотных остатков четыре содержат в боковых цепях карбоксильные группы, а среди первых 25 аминокислотных остатков отрицательно заряжены 7. Различия в аминокислотной последовательности у разных актинов, как в пределах одного вида, так и межвидовые, крайне незначительны. Они составляют не более 25 аминокислотных замен, таким образом, актин является одним из наиболее консервативных белков в эволюции эукариотов, ещё более консервативным, чем гистон Н4 (Vandekerckhove, Weber, 1984).

Структурные исследования актиновой молекулы показали, что G-актин представляет собой глобулярный белок слегка вытянутой формы с линейными размерами 5,5x5,5x3,5 нм, состоящий из двух доменов с глубокой выемкой между ними (Smith et al.,

1983;), Исторически домены называются большим и малым, хотя их размеры практически одинаковы. Каждый из доменов в свою очередь состоит из двух субдоменов. Малый домен состоит из субдомена 1 (остатки 1 - 32, 70 * 144 и 338 - 372) и субдомена 2 (остатки 33 - 69), а субдомен 3 (остатки 145 - 180 и 270 - 337) и субдомен 4 (остатки 18! - 26')) составляют большой домен. Как N-конец, так и С-конец полипептидной цепи находятся в малом домене актиновой глобулы. Вследствие того, что субдомен 2 имеет значительно меньшую массу, чем три остальных субдомена (т.е. 9.6% по сравнению с более чем 23% от общей массы глобулы), молекула актина обладает ярко выраженной полярностью в направлении впадины, разделяющей два домена (рис. 1 а). б

Рис. I. Ci рукту ра мо но Мер ною (а) н полимерного (Й) актина, (а) Трёхмерная структура молекулы глобулярного актина. В центральной выемке актиновон глобулы Изображены нуклеотид (ломаный многоугольник) и нон двухвалентного металла (шарик) {из Гусев, 2001 по Kabsch el al., 1990). (й) Модель строений фибриллярного актина (из Volkmams ei al., 2001). См. объяснения а тексте.

Все четыре субдомена расположены относительно компактно и стабилизированы в основном солевыми мостиками и водородными связями с фосфатными группами нековалентно связанного аденин-нуклеотида и с двухвалентным катионом, локализованным в центре молекулы актина (Kabsch et al., 1990). В условиях, близких к физиологическим, Mg2~ форма актина значительно преобладает над Са~' формой, и мономерный актин имеет в качестве лиганда либо Mg-АТФ. либо Mg-АДФ (Carlier, Pantalom, 1994).

Важным свойством мономерного актина является его способность к полимеризации с образованием линейного полимера - F-актина (рис. 16) (Straub. 1942). Электронная микроскопия показывает, что актиновый филамёнт представляет собой упорядоченную двухстартовую (двухтяжевую) спираль, каждый тяж которой является правосторонней спиралью с 13 молекулами актина на б поворотов вправо (то ссть поворот молекулы актина составляет 166") и шагом 71,5 им. Тяжи в свою очередь закручены один вокруг а

СрСяомиЫ

Субдомен 3

Суйаэмен I

СубдОмвнГ другого, образуя левую спираль с 13 молекулами актина на 6 левосторонних поворотов и с шагом 5,9 нм. Таким образом, большой домен каждой молекулы актина находится ближе к центру нити, а малый домен - на ее периферии (Egelman, 1985).

В 1990 году Holmes и др. путём совмещения атомной структуры актинового мономера с рентгенограммой ориентированных F-актиновых гелей была построена структурная модель актинового филамента с атомным разрешением. Согласно этой модели основное взаимодействие между мономерами актина вдоль двухстартовой спирали осуществляется за счет контакта между субдоменом 4 одного мономера и субдоменом 3 лежащего выше мономера: остатки 243 - 245 и 202 - 204 контактируют с остатками 322 - 325 и 286 - 289 соответственно. Кроме того, гидрофобная петля, состоящая из остатков 41 - 50, контактирует с большим доменом лежащего выше мономера (остатки 166 - 169) и с Phe-375. Наиболее удаленным от оси нити (25 ангстрем) является контакт петли 41 - 45 с остатками 166 - 169. В середине нить упакована неплотно. Контакты вдоль левой спирали образуются остатками 195 - 197 субдомена 4 и остатками 110 - 112 субдомена 1 . Кроме того, петля одного тяжа (266 - 269), по-видимому, внедряется в гидрофобный карман, образованный остатками 166, 169, 171, 285, 289, 63 - 64 и 40 - 45 другого тяжа. Предполагается, что мономеры удерживаются в полимере благодаря образованию гидрофобного ядра между соседними субъединицами вдоль двухстартовой спирали, в которое вклинивается "шпилька", состоящая из остатков 269 - 272, принадлежащих мономерам другого тяжа. Кроме того, взаимодействие между мономерами может поддерживаться и солевыми мостиками. Так, Arg-39 расположен между Asp-286 и Glu-270 двух других субъединиц. Arg-205 одной молекулы находится между Asp-244 и Glu-205 соседней субъединицы, Arg-62 находится около Asp-288 соседа. Существуют, вероятно, и водородные связи. Таким образом, в атомной модели актинового филамента 24 аминокислоты на субъединицу вовлечены в контакт внутри правосторонней спирали, и только 15 участвуют в более слабых контактах между двумя правыми спиралями. Максимальный диаметр такой модельной нити равен 90-95 ангстрем (Holmes et al., 1990).

Благодаря строго упорядоченному распределению асимметричных субъединиц внутри полимера, F-актин является полярной структурой. Мономер актина, расположенный на одном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими субдоменами 1 и 3, а мономер актина, расположенный на противоположном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими доменами 2 и 4. Конец актинового филамента, на котором находятся субдомены 2 и 4, называется острым или минус-концом филамента, а противоположный ему конец, на котором в контакте с растворителем находятся суб домены 1 и 3, называют тупым или плюс-концом. Структурно различить концы актинового филамента можно с помощью субфрагментов мышечного миозина, содержащих головку миозиновой молекулы (Ishikawa et al., 1969). Декорированный S-l фрагментами миозина актиновый филамент образует характерные стреловидные структуры: заострённый конец стрел соответствует минус-концу актинового филамента, а "оперенный" - плюс-концу.

2.2. Тредмиллинг.

Ещё Штраубом было показано, что увеличение ионной силы раствора, содержащего мономерный актин, ведёт к спонтанному образованию полимерной формы актина (Straub, 1942). Процесс полимеризации актина развивается нелинейно и включает в себя две стадии: нуклеацию и элонгацию. In vitro медленная лимитирующая стадия в полимеризации актина — нуклеация — спонтанное формирование нуклеусов (затравок) -димеров и тримеров актина (Cooper et al., 1983; Tobacman, Korn, 1983; Frieden, 1983). При этом минимальная длина затравки, по-видимому, тример (Wegner, Engel, 1975; Wegner, 1976; Wegner, Savko, 1982; Cooper et al., 1983; Tobacman, Korn, 1983). Вторая, более быстрая стадия — элонгация - заключается в присоединении новых мономеров к образовавшимся затравкам.

Показано, что Mg-G-актин формирует нуклеусы намного эффективнее, чем Ca-G-актин (Selden et al., 1983; Tobacman, Korn, 1983; Cooper et al., 1983; Carlier et al., 1986). При этом скорость элонгации не зависит от того, какой катион находится в центре молекулы актина (Selden et al., 1983; Selden et al., 1986; Carlier et al., 1986). АДФ-актин полимеризуется медленнее (Lai et al., 1984) и имеет более высокую критическую концентрацию (концентрация актина, при которой скорости ассоциации и диссоциации мономеров становятся равными) по сравнению с АТФ-актином (Carlier, Pantaloni, 1994).

Вследствие асимметрии актинового филамента два его противоположных конца различаются по скорости присоединения к ним новых субъединиц. Так, на минус-конце актинового филамента присоединение новых мономеров актина затруднено, и скорость элонгации на плюс-конце актинового филамента существенно выше скорости элонгации на его минус-конце (Pollard, Craig, 1982).

Так как полимеризация АДФ-актина является обратимым процессом, то, хотя константы скоростей больше на плюс-конце, чем на минус-конце, критические концентрации для обоих концов одинаковы, как это должно иметь место для равновесного полимера (Korn et al., 1987).

Полимеризация АТФ-актина не является истинно обратимым процессом, так как сопровождается необратимым гидролизом АТФ (Pardee, Spudich, 1982; Pollard, Weeds, 1984; Carlier et al., 1984). Было показано, что на плюс-конце филамента располагаются мономеры актина, содержащие в своем составе молекулу АТФ. После встраивания в состав филамента мономер актина приобретает способность гидролизовать АТФ до АДФ. Гидролиз происходит в две стадии: быстрое отщепление неорганического фосфата от АТФ с последующим более медленным его выбросом из центральной впадины актиновой глобулы. Таким образом, мономеры актина, расположенные в различных участках филамента, содержат в своем составе либо АТФ, либо АДФ-Pi, либо только АДФ. Прочность контакта соседних мономеров зависит от того, какой нуклеотид находится в активном центре актина. Так, быстрый гидролиз АТФ ведёт к формированию стабильного филамента со связанным АДФ-Pi, а выброс неорганического фосфата дестабилизирует филамент (Korn et al., 1987). Следствием этого является разница критических концентраций актина на двух концах актинового филамента: критическая концентрация на плюс-конце меньше, чем на минус конце (Pollard, Craig, 1982; Korn et al., 1987) (рис. 2a).

Отсюда становится возможным достижение такого состояния, при котором присоединение мономеров к филаменту происходит в основном на плюс-конце, а их отделение на минус-конце. В стационарном состоянии скорости этих двух процессов равны; таким образом, хотя общая длина полимера не изменяется, молекулы актина непрерывно перемещаются от минус-конца к плюс-концу. Описанный процесс называется тредмиллингом (Wegner, 1976) (рис. 2а, 26).

В растворе, при условии достаточного количества свободного АТФ, на мономерном АДФ-актине, диссоциирующем с минус-конца филамента, происходит пассивный обмен связанного АДФ на АТФ. Этот обмен вызван разницей в сродстве актина к различным нуклеотидам. Так, скорость диссоциации АДФ с субъединицы актина в 10 раз выше, чем скорость диссоциации АТФ (Nowak, Goody, 1988; Kinosian et al., 1993). Таким образом, после обмена АДФ на АТФ, мономеры актина, диссоциирующие с филамента, снова способны включаться в тредмиллинг.

Скорость тредмиллинга описывается уравнением

Г = +kB (Css Се ) = + к (Сс - Css), где г - скорость тредмиллинга, +кв + кр - константы скорости ассоциации актиновых

В Р субъединиц для плюс- и минус-конца филамента соответственно, Сс и Сс - кажущиеся критические концентрации для полимеризации актина на плюс-конце и минус-конце филамента соответственно, Css - стационарная концентрация АТФ-С-актнна. когда оба конца актинового филамента свободны (не кэпированы). In vitro +kH = 10 мкМ"'с"'. + кр= 0.5 mkMV, Ссв = 0,08 мкМ, Сср = 0,5 мкМ и Css = 0,1 мкМ (по Pollard, Cooper, 1986), соответственно, с использованием приведённых данных посчитанная скорость тредмиллинга г составляет 0,2 с"'. а

SSI

NSJ б

Концен Iрация (.-актина плюс-конеи минус-конеи

Ю ID }D IDID D Г t - АТФ-С-актнн g> - АДФ-С-актин v\ 5) сж= о.1 дм

Рис, 2. Трсдмнллннг актина, (а)

Зависимость скоростей роста актинового филамента на плюс- и минус-конце от концентрации мономерного актина в растворе. В случае чистого актина критическая концентрация равна Cssi» и скорость тредмиллинга равна г,. Добавка ADF увеличивает скорость деполимеризации актина на минус-конце филамента и таким образом смещает критическую концентрацию актина к значению CSS; и скорости тредмиллинга г2. Если 90% всех плюс-концов филаментов блокированы кэпкрующимн белками, то угол наклона кривой скорости роста филаментов на нлюс-конце уменьшится на 90% соответственно. Одновременное ирисутсвие ADF и кэпирующих белков ведёт к смещению критической концентрации актина и скорости тредмиллинга к значениям Сказ " Гз соответственно (см. объяснения в тексте), (б) Схема процесса тредмиллинга (см. объяснения в тексте) (по Pantaloni et al., 2001).

АДФ

АТФ

Таким образом, мри тредмиллинге концентрация Mg-G-актина остаётся на уровне немногим выше, чем критическая концентрация актина на плюс-конце, и намного ниже, чем Сс на минус-конце. Отсюда лимитирующей стадией тредмиллинга будет диссоциация субъединиц актина с минус-конца филамента (Carlier, Pantaloni, 1997).

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Самарин, Станислав Николаевич

VI. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. Комплекс Агр2/3, активированный ActA, создаёт новые актиновые филаменты за счёт взаимодействия с плюс-концами существующих филаментов.

2. VASP не активирует комплекс Агр2/3 и не оказывает никакого эффекта на процесс ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3, активированным ActA в растворе.

3. VASP не влияет на кинетики деветвления актиновых филаментов и не стабилизирует разветвлённые филаменты.

4. VASP не связывается с плюс-концами актиновых филаментов и не участвует в регуляции кэпирования плюс-концов филаментов кэпирующими белками.

5. VASP активирует Агр2/3-обусловленную полимеризацию актина на поверхности ActA-микроефер и выполняет роль линкера между актиновыми филаментами и ActA на поверхности микросфер независимо от комплекса Агр2/3.

6. VASP изменяет морфологию ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3 в актиновых хвостах ActA-микроефер, увеличивая расстояние между соседними точками ветвления.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает искреннюю признательность своим научным руководителям Фазоилу Инноятовичу Атауллаханову и Marie-France Carlier, без которых данная работа не была бы возможна, и которые многому его научили; Софье Ильиничне Бейлиной за неоценимую помощь в написании и обсуждении диссертации; Dominique Didry за спектрин, ADF, профилин и кэпирующие белки и обучение автора биохимическим методам выделения актина и комплекса Атр2/3; Christine Kocks за ActA; Dominique Pantaloni за помощь в написании статей, ценные советы и обсуждение полученных результатов; Sebastian Wiesner, оказавшему неоценимую помощь в проведении биохимических экспериментов, микроскопических исследованиях и написании программы BeadTracker, а также Екатерине Лобановой, Миле Галимовой, Геннадию Ермакову и всем сотрудникам Лаборатории Метаболического Моделирования и Биоинформатики Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики (ИТЭБ) РАН, Лаборатории Энзимологии и Структурной Биохимии (LEBS) Национального Центра Научных Исследований Франции (CNRS) и Лаборатории Физической Биохимии Системы Крови Гематологического Научного Центра (ГНЦ) РАМН за помощь и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Для выяснения механизма взаимодействия комплекса Агр2/3, активированного ActA, с существующими актиновыми филаментами для формирования новых филаментов был применён комплексный подход. Во-первых, в полимеризационных тестах, проводимых в присутствии комплекса Агр2/3 и ActA было показано уменьшение продолжительности лаг-фазы при добавлении преполимеризованных филаментов-затравок со свободными плюс-концами и отсутствие этого эффекта при использваниии филаментов-затравок, имеющих сайты связывания комплекса Агр2/3 только на стороне затравок, что свидетельствует о необходимости наличия свободных плюс-концов актиновых филаментов для проявления эффекта комплекса Агр2/3 на полимеризацию актина. Во-вторых, прямое измерение длин актиновых филаментов, растущих из одного узла разветвления, свидетельствует о том, что большинство пар материнский-дочерний филаменты имеют равные длины, а так как все филаменты в растворе растут с приблизительно равными скоростями, то сделанные наблюдения подтверждают гипотезу о ветвлении актиновых филаментов комплексом Агр2/3 с плюс-концов существующих филаментов. В-третьих, перекрёстное флуоресценное окрашивание филаментов-затравок и вновь сформированных актиновых филаментов в присутствии активированного комплекса Агр2/3 показывает, что большинство филаментов, образованных за счёт взаимодействия активированного комплекса Агр2/3 с преполимеризованными филаментами, растёт с плюс-концов филаментов-затравок. Таким образом, комплекс Агр2/3 формирует новые актиновые филаменты за счёт взаимодействия с плюс-концами (Pantaloni et al., 2000), а не с сайтами связывания на стороне существующих филаментов (Machesky et al., 1999).

Для выяснения механизма функциональной активности VASP при движении Listeria monocytogenes были проверены все потенциальные возможности участия этого белка в регуляции динамики актиновых филаментов на поверхности бактерии. Так, методом соосаждения комплекса Arp2/3 VASPom, иммобилизованным на Ni-агарозных микросферах, нами было показано отсутствие непосредсвенного взаимодействия между VASP и комплексом Агр2/3. Далее в полимеризационных тестах нами было продемонстрировано отсутствие эффекта VASP при концентрациях, не превышающих 0,2 мкМ, на процесс полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, активированного ActA в растворе. При этом визуализация филаментов, полученных полимеризацией актина в присутствии ActA-актиированного комплекса Агр2/3, показывает, что за одинаковое время полимеризации присутствие VASP несколько увеличивает плотность ветвления актиновых филаментов, создавая при этом разветвления второго и более высоких порядков, в отличие от ситуации, когда VASP отсутствует в растворе. Однако скорости спонтанной разборки актиновых ветвлений были одинаковы как в присутствии, так и в отсутствие VASP.

Далее, была создана модельная система для исследования механизмов актин-обусловленной подвижности Listeria monocytogenes, представляющая собой полистиреновые бусины с иммобилизованным на, них ActA. Преимуществами такой модельной системы перед Listeria является возможность создания микросфер с требуемой поверхностной плотностью ActA, а также то, что в отличие от бактерии, ActA-микроеферы не обладают патогенностью для исследователя. Разработанный протокол адсорбции ActA позволяет получать микросферы с поверхностной плотностью и удельной активностью белка близкими к таковым на поверхности Listeria monocytogenes, что свидетельствует об адекватности используемой модели для изучения процессов, происходящих на поверхности бактерии. Исследование подвижности ActA-микроефер в искусственных средах, состоящих из актина, комплекса Arp2/3, ADF, профилина и гельзолина, показало, что присутствие VASP является необходимым условием для нормального листериоподобного движения ActA-микроефер: в отсутсвие VASP микросферы либо не движутся вообще, либо прекращают своё движение после определённого промежутка времени, зависящего от плотности ActA на поверхности микросфер, в то время как в присутствии VASP ActA-микроеферы способны стабильно двигаться на протяжении часов. При этом процесс остановки ActА-микросфер является обратимым: добавка VASP восстанавливает нормальное движение микросфер.

Нами был разработан метод измерения функциональной активности ActA, как иммобилизованного на твёрдой поверхности, так и на поверхности Listeria monocytogenes. При этом, в отличие от ситуации с растворимым ActA, как в случае ActA-буеин, так и клеток Listeria VASP увеличивал эффективность полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, при этом связывая актиновые филаменты с ActA на поверхности бусин. Для выяснения роли комплекса Агр2/3 в связывании актиновых филаментов с ActA посредством VASP было исследовано взаимодействие актиновых филаментов с ActA-бусинами в присутствии и в отсутствие комплекса Агр2/3 и показано, что VASP способен связывать актиновые филаменты и ActA независимо от комплекса Агр2/3, скорее всего за счёт связывания F-актина с С-концевым EVH2-доменом VASP (Reinhard et al., 1992; Bachmann et al., 1999; Laurent et al., 1999), который, в свою очередь, взаимодействует с богатым пролином участком ActA своим EVH1-доменом (Niebuhr et al., 1997; Machner et al., 2001).

Так как возможная роль VASP в подвижности Listeria monocytogenes может заключаться в связывании VASP с плюс-концами актиновых филаментов и, таким образом, в контроле их взаимодействия с кэпирующими белками (Bear et al., 2002), то для выснения такой возможности нами был проведён эксперимент по конкурентному связыванию CapG и VASP с плюс-концами актиновых филаментов в полимеризационных тестах, который показал, что in vitro VASP не конкурирует с CapG за связывание с плюс-концами актиновых филаментов. Полученные данные были подтверждены в экспериментах по иммобилизации филаментов со свободными плюс-концами и плюс-концами, блокированными гельзолином, на ActA-буеинах в присутствии VASP, в ходе которых оба типа филаментов связывались с ActA на поверхности микросфер посредством VASP абсолютно одинаково, что свидетельствует о том, что VASP связывается не с плюс-концом (Bear et al., 2002), а со стороной актинового филамента (Laurent et al., 1999; Huttelmaier et al., 1999; Bachmann et al., 1999; Walders-Harbeck et al., 2002). И, наконец, нами было показано, что VASP не участвует в регуляции процесса кэпирования плюс-концов филаментов при движении ActA-микроефер в искусственных средах.

Количественная интенситометрия актиновых хвостов ActA-бусин, движущихся в искусственных средах, показала, что, во-первых, полимеризация актина на поверхности ActA-буеин идёт с большей эффективностью в присутствии VASP, что хорошо согласуется с данными, полученными в полимеризационных тестах, а во-вторых, VASP вызывает изменение морфологии ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3 в актиновых хвостах ActA-микроефер, увеличивая расстояние между соседними точками ветвления филаментов, подобно тому, как это происходит в ламеллоподии эукариотической клетки (Bear et al., 2002) и выравнивая плотность ветвления филаментов по всей длине актинового хвоста. Увеличение эффективной длины актиновых филаментов ведёт, в свою очередь, к повышению их гибкости и, как следствие, увеличению эффективности выталкивания ActA-микроефер, в результате чего движение ActA-микроефер характеризуется более высокой скоростью и стабильностью.

Таким образом, нами было показано, что механизм работы комплекса Агр2/3, активированного ActA, сводится к взаимодействию с плюс-концами уже существующих актиновых филаментов и созданию новых филаментов путём ветвления исходных. При этом функция VASP при движении Listeria monocytogenes заключается в увеличении расстояния между соседними точками ветвления филаментов и, таким образом, изменении морфологии ветвления актиновой сети в хвостах Listeria.

Полученные данные также позволяют сделать предположение о том, что функция VASP может заключаться в удерживании актиновых филаментов на поверхности Listeria monocytogenes и направлении быстрорастущих плюс-концов актиновых филаментов в сторону приложения механического усилия на стенку бактерии, а также в "упорядочивании" морфологии актиновых хвостов Listeria monocytogenes за счёт взаимодействия EVH2-flOMeHa VASP с F-актином (Reinhard et al., 1992; Bachmann et al., 1999; Laurent et al., 1999) и, как следствие, организации актиновых филаментов в параллельные пучки (Huttelmaier et al., 1999). Для уточнения этого факта и раскрытия точного механизма изменения морфологии ветвления актиновых филаментов белком VASP требуются дальнейшие исследования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Самарин, Станислав Николаевич, 2004 год

1. Албертс А., Брей Д., Льюис Р., Рафф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, (в 3 томах) пер. с англ. М. Мир. 1994, том 2: 274.

2. Блиох Ж.Л., Смолянинов В.В., Кинематика распластывания фибробластов. 2 Индивидуальная локомоторная активность. Биофизика. 1977,22(4): 631-639.

3. Гусев Н.Б. Движение немышечных клеток и реорганизация актиновых микрофиламентов. Сорос. Образоват. Журнал. 2001, 7(7): 9-16.

4. Самарин С.Н. Роль белков семейства Ena/VASP в регуляции динамики актиновых филаментов в клетках эукариотов и на поверхности бактерии Listeria monocytogenes. Биол. Мембраны. 2004,1: 5-14.

5. Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., Комиссарчик Я.Ю. Динамика актиновых филаментов при инвазии эукариотических клеток бактериями. Биол. Мембраны. 2003,1:33-39.

6. Adami R., Choquet D., Grazi E. Rhodamine phalloidin F-actin: critical concentration versus tensile strength. Eur. J. Biochem. 1999,263(1): 270-275.

7. Agnew B.J., Minamide L.S., Bamburg J.R. Reactivation of phosphorylated actin depolymerizing factor and identification of the regulatory site. J. Biol. Chem. 1995, 270(29): 17582-17587.

8. Aizawa H., Sutoh K., Yahara I. Overexpression of cofilin stimulates bundling of actin filaments, membrane ruffling, and cell movement in Dictyostelium. J. Cell Biol. 1996, 132(3): 335-344.

9. Allen P.G., Janmey P.A. Gelsolin displaces phalloidin from actin filaments. A new fluorescence method shows that both Ca2+ and Mg2+ affect the rate at which gelsolin severs F-actin. J. Biol. Chem. 1994, 269(52): 32916-32923.

10. Allen W.E., Jones G.E., Pollard J.W., Ridley A.J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. J. Cell Sci. 1997, 110 (Pt 6): 707-720.

11. Amann K.J., Pollard T.D. Cellular regulation of actin network assembly. Curr. Biol. 2000, 10(20): R728-R730.

12. Amann K.J., Pollard T.D. The Arp2/3 complex nucleates actin filament branches from the sides of pre-existing filaments. Nat. Cell Biol. 2001, 3(3): 306-310.

13. Andrianantoandro E., Blanchoin L., Sept D., McCammon J.A., Pollard T.D. Kinetic mechanism of end-to-end annealing of actin filaments. J. Mol. Biol. 2001, 312(4): 721730.

14. Aspenstrom P., Lindberg U., Hall A. Two GTPases, Cdc42 and Rac, bind directly to a protein implicated in the immunodeficiency disorder Wiskott-Aldrich syndrome. Curr. Biol. 1996, 6(1): 70-75.

15. Bachmann C., Fischer L., Walter U., Reinhard M. The EVH2 domain of the vasodilator-stimulated phosphoprotein mediates tetramerization, F-actin binding, and actin bundle formation. J. Biol. Chem. 1999, 274: 23549-23557.

16. Balasubramanian M.K., Feoktistova A., McCollum D., Gould K.L. Fission yeast Sop2p: a novel and evolutionarily conserved protein that interacts with АгрЗр and modulates profilin function. EMBO J. 1996, 15(23): 6426-6437.

17. Bamburg J.R. Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 1999,15: 185-230.

18. Bamburg J.R., Bray D. Distribution and cellular localization of actin depolymerizing factor. J. Cell Biol. 1987, 105(6 Pt 1): 2817-2825.

19. Bashaw G.J., Kidd Т., Murray D., Pawson Т., Goodman C.S. Repulsive axon guidance: Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor. Cell. 2000, 101(7): 703-715.

20. Bear J.E., Krause M., Gertler F.B. Regulating cellular actin assembly. Curr. Opin. Cell Biol. 2001, 13(2): 158-166.

21. Bear J.E., Loureiro J.J., Libova I., Fassler R., Wehland J., Gertler FB. Negative regulation of fibroblast motility by Ena/VASP proteins. Cell. 2000, 107: 717-728.

22. Bear J.E., Rawls J.F., Saxe C.L.3rd. SCAR, a WASP-related protein, isolated as a suppressor of receptor defects in late Dictyostelium development. J. Cell Biol. 1998, 142(5): 1325-1335.

23. Bi E., Zigmond S.H. Actin polymerization: Where the WASP stings. Curr. Biol. 1999, 9(5): R160-R163.

24. Blanchoin L., Pollard T.D. Mechanism of interaction of Acanthamoeba actophorin (ADF/Cofilin) with actin filaments. J. Biol. Chem. 1999, 274(22): 15538-15546.

25. Blanchoin L., Pollard T.D., Mullins R.D. Interactions of ADF/cofilin, Arp2/3 complex, capping protein and profilin in remodeling of branched actin filament networks. Curr. Biol. 2000, 10(20): 1273-1282.

26. Bray D., White J.G. Cortical flow in animal cells. Science. 1988,239(4842): 883-888.

27. Brindle N.P., Holt M.R., Davies J.E., Price C.J., Critchley D.R. The focal-adhesion vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) binds to the proline-rich domain in vinculin. Biochem. J. 1996, 318: 753-757.

28. Brundage R.A., Smith G.A., Camilli A., Theriot J.A., Portnoy D.A. Expression and phosphorylation of the Listeria monocytogenes ActA protein in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993,90(24): 11890-11894.

29. Buss F., Temm-Grove C., Henning S., Jockusch B.M. Distribution of profilin in fibroblasts correlates with the presence of highly dynamic actin filaments. Cell Motil. Cytoskeleton. 1992, 22(1): 51-61.

30. Cameron L.A., Svitkina T.M., Vignjevic D., Theriot J.A., Borisy G.G. Dendritic organization of actin comet tails. Curr. Biol. 2001, 11(2): 130-135.

31. Cao L.G., Babcock G.G., Rubenstein P. A., Wang Y.L. Effects of profilin and profilactin on actin structure and function in living cells. J. Cell. Biol. 1992,117(5): 1023-1029.

32. Carl U.D., Pollmann M., Orr E., Gertler F.B., Chakraborty Т., Wehland J. Aromatic and basic residues within the EVH1 domain of VASP specify its interaction with proline-rich ligands. Curr. Biol. 1999, 9(13): 715-718.

33. Carlier M.-F., Pantaloni D. Actin assembly in response to extracellular signals: role of capping proteins, thymosin beta 4 and profilin. Semin. Cell. Biol. 1994, 5(3): 183-191.

34. Carlier M.-F., Pantaloni D. Binding of phosphate to F-ADP-actin and role of F-ADP-Pi-actin in ATP-actin polymerization. J. Biol. Chem. 1988,263(2): 817-825.

35. Carlier M.-F., Pantaloni D. Control of actin dynamics in cell motility. J. Mol. Biol. 1997, 269(4): 459-467.

36. Carlier M.-F., Pantaloni D., Korn E.D. Evidence for an ATP cap at the ends of actin filaments and its regulation of the F-actin steady state. J. Biol. Chem. 1984, 259(16): 9983-9986.

37. Carlier M.-F., Pantaloni D., Korn E.D. The effects of Mg2+ at the high-affinity and low-affinity sites on the polymerization of actin and associated ATP hydrolysis. J. Biol. Chem. 1986, 261(23): 10785-10792.

38. Carlier M.-F., Ressad F., Pantaloni D. Control of actin dynamics in cell motility. Role of ADF/cofilin. J. Biol. Chem. 1999, 274(48): 33827-33830.

39. Carlsson L., Nystrom L.E., Sundkvist I., Markey F., Lindberg U. Actin polymerizability is influenced by profilin, a low molecular weight protein in non-muscle cells. J. Mol. Biol. 1977, 115(3): 465-483.

40. Casella J.F., Maack D.J., Lin S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. J. Biol. Chem. 1986,261(23): 10915-10921.

41. Cassimeris L., Safer D., Nachmias V.T., Zigmond S.H. Thymosin beta 4 sequesters the majority of G-actin in resting human polymorphonuclear leukocytes. J. Cell Biol. 1992, 119(5): 1261-1270.

42. Castellano F., Montcourrier P., Guillemot J.C., Gouin E., Machesky L., Cossart P., Chavrier P. Inducible recruitment of Cdc42 or WASP to a cell-surface receptor triggers actin polymerization and filopodium formation. Curr. Biol. 1999, 9(7): 351-360.

43. Cooley L., Verheyen E., Ayers K. chickadee encodes a profilin required for intercellular cytoplasm transport during Drosophila oogenesis. Cell. 1992, 69(1): 173-184.

44. Cooper J.A, Buhle E.L. Jr., Walker S.B., Tsong T.Y., Pollard T.D. Kinetic evidence for a monomer activation step in actin polymerization. Biochemistry. 1983, 22(9): 2193-2202.

45. Cooper J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J. Cell Biol. 1987, 105(4): 1473-1478.

46. Cooper J.A. The role of actin polymerization in cell motility. Annu Rev. Physiol. 1991, 53: 585-605.

47. Cossart P., Bierne H. The use of host cell machinery in the pathogenesis of Listeria monocytogenes. Curr. Opin. Immunol. 2001, 13(1): 96-103.

48. Cossart P., Lecuit M. Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBO J. 1998, 17(14): 3797-3806.

49. Coutu M.D., Simon D.J., Brown A.E., Craig S.W. cDNA cloning and characterization of vinculin mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 147(2): 637-643.

50. Cramer L.P. Ena/Vasp: solving a cell motility paradox. Curr. Biol. 2002, 12(12): R417-R419.

51. Dabiri G.A., Sanger J.M., Portnoy D.A., Southwick F.S. Listeria monocytogenes moves rapidly through the host-cell cytoplasm by inducing directional actin assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990, 87(16): 6068-6072.

52. Derry J.M., Ochs H.D., Francke U. Isolation of a novel gene mutated in Wiskott-Aldrich syndrome. Cell. 1994, 78(4): 635-644.

53. Didry D., Carlier M.-F., Pantaloni D. Synergy between actin depolymerizing factor/cofilin and profilin in increasing actin filament turnover. J. Biol. Chem. 1998, 273(40): 25602-25611.

54. Drees В., Friederich E., Fradelizi J., Louvard D., Beckerle M.C., Golsteyn R.M. Characterization of the interaction between zyxin and members of the Ena/vasodilator-stimulated phosphoprotein family of proteins. J. Biol. Chem. 2000, 275: 22503-22511.

55. Dufort P. A., Lumsden C.J. How profilin/barbed-end synergy controls actin polymerization: a kinetic model of the ATP hydrolysis circuit. Cell Motil. Cytoskeleton. 1996, 35(4): 309-330.

56. Egelman E.H. The structure ofF-actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 1985, 6(2): 129-51.

57. Ermekova K.S., Zambrano N., Linn H., Minopoli G., Gertler F.B., Russo Т., Sudol M. The WW domain of neural protein FE65 interacts with proline-rich motifs in Mena, the mammalian homolog of Drosophila enabled. J. Biol. Chem. 1997, 272(52): 32869-32877.

58. Estes J.E., Selden L.A., Gershman L.C. Mechanism of action of phalloidin on the polymerization of muscle actin. Biochemistry. 1981, 20(4): 708-712.

59. Fawcett J., Pawson T. Signal transduction. N-WASP regulation—the sting in the tail. Science. 2000,290(5492): 725-726.

60. Fedorov A.A., Fedorov E., Gertler F.B., Almo S.C. Structure of EVH1, a novel proline-rich ligand-binding module involved in cytoskeletal dynamics and neural function. Nature Struct. Biol. 1999, 6(7): 661-665.

61. Finkel Т., Theriot J.A., Dise K.R., Tomaselli G.F., Goldschmidt-Clermont P.J. Dynamic actin structures stabilized by profilin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91(4): 15101514.

62. Frieden С. Polymerization of actin: mechanism of the Mg2+-induced process at pH 8 and 20 degrees C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80(21): 6513-6517.

63. Gedde M.M., Higgins D.E., Tilney L.G., Portnoy D.A. Role of listeriolysin О in cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 2000, 68(2): 999-1003.

64. Gertler F.B., Doctor J.S., Hoffmann F.M. Genetic suppression of mutations in the Drosophila abl proto-oncogene homolog. Science. 1990, 248(4957): 857-860.

65. Gertler F.B., Niebuhr K., Reinhard M., Wehland J., Soriano P. Mena, a relative of VASP and Drosophila Enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics. Cell. 1996, 87(2): 227-239.

66. Goldschmidt-Clermont P.J., Machesky L.M., Baldassare J.J., Pollard T.D. The actin-binding protein profilin binds to PIP2 and inhibits its hydrolysis by phospholipase C. Science. 1990,247(4950): 1575-1578.

67. Goldschmidt-Clermont P.J., Machesky L.M., Doberstein S.K., Pollard T.D. Mechanism of the interaction of human platelet profilin with actin. J. Cell Biol. 1991, 113(5): 10811089.

68. Goossens P.L., Milon G. Induction of protective CD8+ T lymphocytes by an attenuated Listeria monocytogenes actA mutant. Int. Immunol. 1992, 4(12): 1413-1418.

69. Gray M.L., Killinger A.H. Listeria monocytogenes and listeric infections. Bacteriol. Rev. 1966, 30(2): 309-382.

70. Guerini D., Klee C.B. Cloning of human calcineurin A: evidence for two isozymes and identification of a polyproline structural domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, 86(23): 9183-9187.

71. Gunsalus K.C., Bonaccorsi S., Williams E., Verni F., Gatti M., Goldberg M.L. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 1995, 131(5): 1243-1259.

72. Haarer B.K., Lillie S.H., Adams A.E., Magdolen V., Bandlow W., Brown S.S. Purification of profilin from Saccharomyces cerevisiae and analysis of profilin-deficient cells. J. Cell. Biol. 1990,110(1): 105-114.

73. Haffner C., Jarchau Т., Reinhard M., Hoppe J., Lohmann S.M., Walter U. Molecular cloning, structural analysis and functional expression of the proline-rich focal adhesion and microfilament-associated protein VASP. EMBO J. 1995, 14: 19-27.

74. Hahne P., Sechi A., Benesch S., Small J.V. Scar/WAVE is localised at the tips of protruding lamellipodia in living cells. FEBS Lett. 2001, 492(3): 215-220.

75. Halbrugge M., Friedrich C., Eigenthaler M., Schanzenbacher P., Walter U. Stoichiometric and reversible phosphorylation of a 46-kDa protein in human platelets in response to cGMP- and cAMP-elevating vasodilators. J. Biol. Chem. 1990, 265(6): 30883093.

76. Halbrugge M., Walter U. Analysis, purification and properties of a 50,000-dalton membrane-associated phosphoprotein from human platelets. J. Chromatogr. 1990, 521(2): 335-343.

77. Halbrugge M., Walter U. Purification of a vasodilator-regulated phosphoprotein from human platelets. Eur. J. Biochem. 1989, 185(1): 41-50.

78. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science. 1998,279(5350): 509-514.

79. Harbeck В., Huttelmaier S., Schluter K., Jockusch B.M., Illenberger S. Phosphorylation of the vasodilator-stimulated phosphoprotein regulates its interaction with actin. J. Biol. Chem. 2000, 275(40): 30817-30825.

80. Hartwig J.H. Mechanisms of actin rearrangements mediating platelet activation. J. Cell Biol. 1992, 118(6): 1421-1442.

81. Hatanaka H., Ogura K., Moriyama K., Ichikawa S., Yahara I., Inagaki F. Tertiary structure of destrin and structural similarity between two actin-regulating protein families. Cell. 1996, 85(7): 1047-1055.

82. Haugwitz M., Noegel A.A., Karakesisoglou J., Schleicher M. Dictyostelium amoebae that lack G-actin-sequestering profllins show defects in F-actin content, cytokinesis, and development. Cell. 1994, 79(2): 303-314.

83. Higgs H.N, Pollard T.D. Activation by Cdc42 and PIP(2) of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) stimulates actin nucleation by Arp2/3 complex. J. Cell Biol. 2000, 150(6): 1311-1320.

84. Higgs H.N., Blanchoin L., Pollard T.D. Influence of the С terminus of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) and the Arp2/3 complex on actin polymerization. Biochemistry. 1999, 38(46): 15212-15222.

85. Higgs H.N., Pollard T.D. Regulation of actin polymerization by Arp2/3 complex and WASp/Scar proteins. J. Biol. Chem. 1999, 274(46): 32531-32534.

86. Holmes K.C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. Atomic model of the actin filament. Nature. 1990, 347(6288): 44-49.

87. Hug C., Jay P.Y., Reddy I., McNally J.G., Bridgman P.C., Elson E.L., Cooper J.A. Capping protein levels influence actin assembly and cell motility in dictyostelium. Cell. 1995, 81(4): 591-600.

88. Huttelmaier S., Harbeck В., Steffens O., Messerschmidt Т., Illenberger S., Jockusch B.M. Characterization of the actin binding properties of the vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP. FEBS Lett. 1999, 451(1): 68-74.

89. Ireton K., Cossart P. Host-pathogen interactions during entry and actin-based movement of Listeria monocytogenes. Annu. Rev. Genet. 1997, 31: 113-138.

90. Isenberg G. Actin-binding proteins lipid interactions. J. Muscle Res. Cell Motil. 1991, 12: 136-144.

91. Ishikawa H., Bischoff R., Holtzer H. Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types. J. Cell. Biol. 1969,43(2): 312-28.

92. Janmey P.A. Polyproline affinity method for purification of platelet profilin and modification with pyrene-maleimide. Methods Enzymol. 1991, 196: 92-99.

93. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F., Holmes K.C. Atomic structure of the actin:DNase I complex. Nature. 1990, 347(6288): 37-44.

94. Kaiser D.A., Goldschmidt-Clermont P.J., Levine B.A., Pollard T.D. Characterization of renatured profilin purified by urea elution from poly-L-proline agarose columns. Cell Motil. Cytoskeleton. 1989, 14(2): 251-262.

95. Kawamura M., Maruyama K. Electron microscopic particle length of F-actin polymerized in vitro. J. Biochem. (Tokyo). 1970, 67(3): 437-457.

96. Kelleher J.F., Atkinson S.J., Pollard T.D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. J. Cell Biol. 1995, 131(2): 385-397.

97. Kocks C., Cossart P. Directional actin assembly by Listeria monocytogenes at the site of polar surface expression of the actA gene product involving the actin-bundling protein plastin (fimbrin). Infect. Agents Dis. 1993,2(4): 207-209.

98. Kocks С., Gouin E., Tabouret M., Berche P., Ohayon H., Cossart P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 1992, 68(3): 521-531.

99. Kocks C., Hellio R., Gounon P., Ohayon H., Cossart P. Polarized distribution of Listeria monocytogenes surface protein ActA at the site of directional actin assembly. J. Cell Sci. 1993, 105(Pt3): 699-710.

100. Korn E.D. Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells. Physiol. Rev. 1982, 62(2): 672-737.

101. Korn E.D., Carlier M.-F., Pantaloni D. Actin polymerization and ATP hydrolysis. Science. 1987,238(4827): 638-644.

102. Kouyama Т., Mihashi K. Fluorimetry study of N-(l-pyrenyl)iodoacetamide-labelled F-actin. Local structural change of actin protomer both on polymerization and on binding of heavy meromyosin. Eur. J. Biochem. 1981, 114(1): 33-38.

103. Krause M., Bear J.E., Loureiro J.J., Gertler F.B. The Ena/VASP enigma. J. Cell Sci. 2002, 115:4721-4726.

104. Krugmann S., Jordens I., Gevaert K., Driessens M., Vandekerckhove J., Hall A. Cdc42 induces filopodia by promoting the formation of an IRSp53:Mena complex. Curr. Biol. 2001, 11(21): 1645-1655.

105. Lai A.A., Brenner S.L., Korn E.D. Preparation and polymerization of skeletal muscle ADP-actin. J. Biol. Chem. 1984,259(21): 13061-13065.

106. Lai A.A., Korn E.D. Reinvestigation of the inhibition of actin polymerization by profilin. J. Biol. Chem. 1985, 260(18): 10132-10138.

107. Lanier L.M., Gates M.A., Witke W., Menzies A.S., Wehman A.M., Macklis J.D., Kwiatkowski D., Soriano P., Gertler F.B. Mena is required for neurulation and commissure formation. Neuron. 1999, 22(2): 313-325.

108. Lappalainen P., Drubin D.G. Cofllin promotes rapid actin filament turnover in vivo. Nature. 1997,388(6637): 78-82.

109. Lassing I., Lindberg U. Specific interaction between phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and profilactin. Nature. 1985, 314(6010):472-474.

110. Lassing I., Lindberg U. Specificity of the interaction between phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and the profilin:actin complex. J. Cell Biochem. 1988, 37(3): 255-267.

111. Laurent V., Loisel T.P., Harbeck В., Wehman A., Grobe L., Jockusch B.M., Wehland J., Gertler F.B., Carlier M.-F. Role of proteins of the Ena/VASP family in actin-based motility of Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 1999, 144: 1245-1258.

112. Lee J., Leonard M., Oliver Т., Ishihara A., Jacobson K. Traction forces generated by locomoting keratocytes J. Cell Biol. 1994, 127: 1957-1964.

113. Li R. Beel, a yeast protein with homology to Wiscott-Aldrich syndrome protein, is critical for the assembly of cortical actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 1997, 136(3): 649658.

114. Loisel Т., Boujemaa R., Pantaloni D., Carlier M.-F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999, 401: 613-616.

115. Machesky L.M., Atkinson S.J., Ampe C., Vandekerckhove J., Pollard T.D. Purification of a cortical complex containing two unconventional actins from Acanthamoeba by affinity chromatography on profilin-agarose. J. Cell Biol. 1994,127(1): 107-115.

116. Machesky L.M., Goldschmidt-Clermont P.J., Pollard T.D. The affinities of human platelet and Acanthamoeba profilin isoforms for polyphosphoinositides account for their relative abilities to inhibit phospholipase C. Cell Regul. 1990, 1(12): 937-950.

117. Machesky L.M., Insall R.H. Scar I and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex. Curr. Biol. 1998, 8(25): 1347-1356.

118. Machesky L.M., Mullins R.D., Higgs H.N., Kaiser D.A., Blanchoin L., May R.C., Hall M.E., Pollard T.D. Scar, a WASp-related protein, activates nucleation of actin filaments by the Arp2/3 complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96(7): 3739-3744.

119. Machesky L.M., Poland T.D. Profilin as a potential mediator of membrane-cytoskeleton communication. Trends Cell Biol. 1993,3(11): 381-385.

120. Machner M.P., Urbanke C., Barzik M„ Otten S., Sechi A.S., Wehland J., Heinz D.W. ActA from Listeria monocytogenes can interact with up to four Ena/VASP homology 1 domains simultaneously. J. Biol. Chem. 2001, 276(43): 40096-40103.

121. Malawista S.E., De Boisfleury Chevance A. The cytokineplast: purified, stable, and functional motile machinery from human blood polymorphonuclear leukocytes. J. Cell Biol. 1982, 95(3): 960-973.

122. Marquis H., Bouwer H.G., Hinrichs D.J., Portnoy D.A. Intracytoplasmic growth and virulence of Listeria monocytogenes auxotrophic mutants. Infect. Immun. 1993, 61(9): 3756-3760.

123. McCollum D., Feoktistova A., Morphew M., Balasubramanian M., Gould K.L. The Schizosaccharomyces pombe actin-related protein, Arp3, is a component of the cortical actin cytoskeleton and interacts with profilin. EMBO J. 1996, 15(23): 6438-6446.

124. McGough A., Pope В., Chiu W., Weeds A. Cofilin changes the twist of F-actin: implications for actin filament dynamics and cellular function. J. Cell Biol. 1997, 138(4): 771-781.

125. Meberg P.J., Ono S., Minamide L.S., Takahashi M., Bamburg J.R. Actin depolymerizing factor and cofilin phosphorylation dynamics: response to signals that regulate neurite extension. CellMotil. Cytoskeleton. 1998, 39(2): 172-190.

126. Miki H., Miura K., Takenawa T. N-WASP, a novel actin-depolymerizing protein, regulates the cortical cytoskeletal rearrangement in a PIP2-dependent manner downstream of tyrosine kinases. EMBO J. 1996, 15(19): 5326-5335.

127. Miki H., Takenawa T. Direct binding of the verprolin-homology domain in N-WASP to actin is essential for cytoskeletal reorganization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 243(1): 73-78.

128. Miki H., Yamaguchi H., Suetsugu S., Takenawa T. IRSp53 is an essential intermediate between Rac and WAVE in the regulation of membrane ruffling. Nature. 2000, 408(6813): 732-735.

129. Mockrin S.C., Korn E.D. Acanthamoeba profilin interacts with G-actin to increase the rate of exchange of actin-bound adenosine 5-triphosphate. Biochemistry. 1980, 19(23): 5359-5362.

130. Mogilner A., Oster G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys. J. 1996, 71(6): 3030-3045.

131. Moon A., Drubin D.G. The ADF/cofilin proteins: stimulus-responsive modulators of actin dynamics. Mol. Biol. Cell. 1995, 6(11): 1423-1431.

132. Moreau V., Galan J.M., Devilliers G., Haguenauer-Tsapis R., Winsor B. The yeast actin-related protein Arp2p is required for the internalization step of endocytosis. Mol. Biol. Cell. 1997, 8(7): 1361-1375.

133. Moreau V., Madania A., Martin R.P., Winson B. The Saccharomyces cerevisiae actin-related protein Arp2 is involved in the actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 1996, 134(1): 117132.

134. Mounier J., Ryter A., Coquis-Rondon M., Sansonetti P.J. Intracellular and cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes involves interaction with F-actin in the enterocytelike cell line Caco-2. Infect. Immun. 1990, 58(4): 1048-1058.

135. Mullins R.D., Pollard T.D. Structure and function of the Arp2/3 complex. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9(2): 244-249.

136. Mullins R.D., Stafford W.F., Pollard T.D. Structure, subunit topology, and actin-binding activity of the Arp2/3 complex from Acanthamoeba. J. Cell Biol. 1997, 136(2): 331-343.

137. Murphy D.B., Gray R.O., Grasser W.A., Pollard T.D. Direct demonstration of actin filament annealing in vitro. J. Cell Biol. 1988, 106(6): 1947-1954.

138. Nachmias V.T. Small actin-binding proteins: the beta-thymosin family. Curr. Opin. Cell Biol. 1993, 5(1): 56-62.

139. Nagaoka R., Abe H., Obinata T. Site-directed mutagenesis of the phosphorylation site of cofilin: its role in cofilin-actin interaction and cytoplasmic localization. Cell Motil. Cytoskeleton. 1996, 35(3): 200-209.

140. Nakagawa H., Miki H., Ito M., Ohashi K., Takenawa Т., Miyamoto S. N-WASP, WAVE and Mena play different roles in the organization of actin cytoskeleton in lamellipodia. J. Cell Sci. 2001, 114(8): 1555-1565.

141. Nakaoka Y., Kasai M. Behaviour of sonicated actin polymers: adenosine triphosphate splitting and polymerization. J. Mol. Biol. 1969, 44(2): 319-332.

142. Nebl G., Meuer S.C., Samstag Y. Dephosphorylation of serine 3 regulates nuclear translocation of cofilin. J. Biol. Chem. 1996, 271(42): 26276-26280.

143. Nishimura R., Li W., Kashishian A., Mondino A., Zhou M., Cooper J., Schlessinger J. Two signaling molecules share a phosphotyrosine-containing binding site in the platelet-derived growth factor receptor. Mol. Cell Biol. 1993, 13(11): 6889-6896.

144. Nonoyama S., Ochs H.D. Characterization of the Wiskott-Aldrich syndrome protein and its role in the disease. Curr. Opin. Immunol. 1998,10(4): 407-412.

145. Nowak E., Goody R.S. Kinetics of adenosine 5'-triphosphate and adenosine 5'-diphosphate interaction with G-actin. Biochemistry. 1988, 27(23): 8613-8617.

146. Ohta Y., Nishida E., Sakai H., Miyamoto E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. J. Biol. Chem. 1989,264(27): 1614316148.

147. Oliver Т., Lee J., Jacobson K. Forces exerted by locomoting cells. Semin. Cell Biol. 1994, 5(3): 139-147.

148. Oosawa M., Maruyama К. Reannealing of phalloidin-treated actin filaments during recovery after sonication and its inhibition by beta-actinin. FEBS Lett. 1987, 213(2): 433437.

149. Pantaloni D., Boujemaa R., Didry D., Gounon P., Carlier M.-F. The Arp2/3 complex branches filament barbed ends: functional antagonism with capping proteins. Nat. Cell Biol. 2000, 2(7): 385-391.

150. Pantaloni D., Carlier M.-F. How profilin promotes actin filament assembly in the presence ofthymosinbeta4. Cell. 1993, 75(5): 1007-1014.

151. Pantaloni D., Le Clainche C., Carlier M.-F. Mechanism of actin-based motility. Science. 2001,292(5521): 1502-1506.

152. Pardee J.D., Spudich J.A. Mechanism of K+-induced actin assembly. J. Cell Biol. 1982, 93(3): 648-654.

153. Perelroizen I., Marchand J.B., Blanchoin L., Didry D., Carlier M.-F. Interaction of profilin with G-actin and poly(L-proline). Biochemistry. 1994, 33(28): 8472-8478.

154. Pollard T.D., Cooper J.A. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev. Biochem. 1986, 55: 987-1035.

155. Pollard T.D., Cooper J. A. Quantitative analysis of the effect of Acanthamoeba profilin on actin filament nucleation and elongation. Biochemistry. 1984, 23(26): 6631-6641.

156. Pollard T.D., Weeds A.G. The rate constant for ATP hydrolysis by polymerized actin. FEBS Lett. 1984, 170(1): 94-98.

157. Pollard, T.D., Craig S.W. Mechanism of actin polymerization. Trends in Biochem. Sci. 1982, 7: 55-58.

158. Prehoda K.E., Lee D.J., Lim W.A. Structure of the enabled/VASP homology 1 domain-peptide complex: a key component in the spatial control of actin assembly. Cell. 1999, 97(4): 471-480.

159. Prehoda K.E., Scott J. A., Mullins R.D., Lim W.A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 2000, 290(5492): 801806.

160. Pring M., Weber A., Bubb M.R. Profilin-actin complexes directly elongate actin filaments at the barbed end. Biochemistry. 1992, 31(6): 1827-1836.

161. Reinhard M., Halbrugge M., Scheer U., Wiegand C., Jockusch B.M., Walter U. The 46/50 kDa phosphoprotein VASP purified from human platelets is a novel protein associated with actin filaments and focal contacts. EMBO J. 1992, 11: 2063-2070.

162. Reinhard M., Rudiger M., Jockusch B.M., Walter U. VASP interaction with vinculin: a recurring theme of interactions with proline-rich motifs. FEBS Lett. 1996, 399: 103-107.

163. Renfranz P.J., Beckerle M.C. Doing (F/L)PPPPs: EVH1 domains and their proline-rich partners in cell polarity and migration. Curr. Opin. Cell Biol. 2002,14(1): 88-103.

164. Robinson R.C., Turbedsky K., Kaiser D.A., Marchand J.B., Higgs H.N., Choe S., Pollard T.D. Crystal structure of Arp2/3 complex. Science. 2001, 294(5547): 1679-1684.

165. Rohatgi R., Ho H.Y., Kirschner M.W. Mechanism of N-WASP activation by CDC42 and phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J. Cell Biol. 2000,150(6): 1299-1310.

166. Rohatgi R., Ma L., Miki H., Lopez M., Kirchhausen Т., Takenawa Т., Kirschner M.W. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-dependent signals to actin assembly. Cell. 1999, 97(2): 221-231.

167. Rottner K., Behrendt В., Small J.V., Wehland J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nature Cell Biol. 1999, 1(5): 321-322

168. Sadler I., Crawford A.W., Michelsen J.W., Beckerle M.C. Zyxin and cCRP: two interactive LIM domain proteins associated with the cytoskeleton. J. Cell Biol. 1992, 119(6): 1573-1587.

169. Sampath P., Pollard T.D. Effects of cytochalasin, phalloidin, and pH on the elongation of actin filaments. Biochemistry. 1991, 30(7): 1973-1980.

170. Sanger J.M., Sanger J.W., Southwick F.S. Host cell actin assembly is necessary and likely to provide the propulsive force for intracellular movement of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 1992, 60(9): 3609-3619.

171. Schafer D.A., Cooper J.A. Control of actin assembly at filament ends. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1995, 11: 497-518.

172. Schuchat A., Swaminathan В., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. Clin. Microbiol. Rev. 1991, 4(2): 169-183.

173. Selden L.A., Estes J.E., Gershman L.C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, 116(2): 478-485.

174. Selden L.A., Gershman L.C., Estes J.E. A kinetic comparison between Mg-actin and Ca-actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 1986, 7(3): 215-224.

175. Sept D., Xu J., Pollard T.D., McCammon J.A. Annealing accounts for the length of actin filaments formed by spontaneous polymerization. Biophys. J. 1999, 77(6): 2911-2919.

176. Sheehan В., Kocks C., Dramsi S., Gouin E., Klarsfeld A.D., Mengaud J., Cossart P. Molecular and genetic determinants of the Listeria monocytogenes infectious process. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994, 192: 187-216.

177. Skoble J., Portnoy D.A., Welch M.D. Three regions within ActA promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility. J. Cell Biol. 2000, 150(3): 527-538.

178. Small J.V. The actin cytoskeleton. Electron. Microsc. Rev. 1988, 1(1): 155-174.

179. Small J.V., Herzog M., Anderson K. Actin filament organization in the fish keratocyte lamellipodium. J. Cell Biol. 1995,129(5): 1275-1286.

180. Small J.V., Isenberg G., Celis J.E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 1978, 272(5654): 638-639.

181. Small J.V., Rottner K., Hahne P., Anderson K.I. Visualising the actin cytoskeleton. Micr. Res. and Technique. 1999, 47: 3-17.

182. Smith P.R., Fowler W.E., Pollard T.D., Aebi U. Structure of the actin molecule determined from electron micrographs of crystalline actin sheets with a tentative alignment of the molecule in the actin filament. J. Mol. Biol. 1983, 167(3): 641-660.

183. Straub F.B. Studies. University of Szeged. II, 1942: 3-15

184. Sun H.Q., Kwiatkowska K., Wooten D.C., Yin H.L. Effects of CapG overexpression on agonist-induced motility and second messenger generation. J. Cell Biol. 1995, 129(1): 147-156.

185. Svitkina T.M., Borisy G.G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J. Cell Biol. 1999, 145(5): 1009-1026.

186. Symons M., Derry J.M., Karlak В., Jiang S., Lemahieu V., Mccormick F., Francke U., Abo A. Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase CDC42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell. 1996, 84(5): 723-734.

187. Symons M.H., Mitchison T.J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J. Cell Biol. 1991,114(3): 503-513.

188. Tanaka M., Shibata H. Poly(L-proline)-binding proteins from chick embryos are a profilin and a profilactin. Eur. J. Biochem. 1985, 151(2): 291-297.

189. Theriot J.A., Mitchison T.J., Tilney L.G., Portnoy D.A. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992,357(6375): 257-260.

190. Tilney L.G., DeRosier D.J., Tilney M.S. How Listeria exploits host cell actin to form its own cytoskeleton. I. Formation of a tail and how that tail might be involved in movement. J. Cell Biol. 1992, 118(1): 71-81.

191. Tilney L.G., DeRosier D.J., Weber A., Tilney M.S. How Listeria exploits host cell actin to form its own cytoskeleton. II. Nucleation, actin filament polarity, filament assembly, and evidence for a pointed end capper. J. Cell Biol. 1992, 118(1): 83-93.

192. Tilney L.G., Portnoy D.A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 1989, 109(4 Pt 1): 1597-1608.

193. Tobacman L.S., Korn E.D. The kinetics of actin nucleation and polymerization. J. Biol. Chem. 1983,258(5): 3207-3214.

194. Tseng P.C., Runge M.S., Cooper J.A., Williams R.C. Jr., Pollard T.D. Physical, immunochemical, and functional properties of Acanthamoeba profilin. J. Cell Biol. 1984, 98(1): 214-221.

195. Van Aelst L., D'Souza-Schorey C. Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev. 1997, 11(18): 2295-2322.

196. Vandekerckhove J., Weber K. Actin amino-acid sequences. Comparison of actins from calf thymus, bovine brain, and SV40-transformed mouse 3T3 cells with rabbit skeletal muscle actin. Eur. J. Biochem. 1978, 90(3): 451-462.

197. Vandekerckhove J., Weber K. Chordate muscle actins differ distinctly from invertebrate muscle actins. The evolution of the different vertebrate muscle actins. J. Mol. Biol. 1984, 179(3): 391-413.

198. Walders-Harbeck В., Khaitlina S.Y., Hinssen H., Jockusch B.M., Illenberger S. The vasodilator-stimulated phosphoprotein promotes actin polymerisation through direct binding to monomelic actin. FEBS Lett. 2002, 529: 275-280.

199. Waldmann R., Nieberding M., Walter U. Vasodilator-stimulated protein phosphorylation in platelets is mediated by cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. Eur. J. Biochem. 1987,167(3): 441-448.

200. Walsh T.P., Weber A., Higgins J., Bonder E.M., Mooseker M.S. Effect of villin on the kinetics of actin polymerization. Biochemistry. 1984, 23: 2613-2621.

201. Wang Y.L. Exchange of actin subunits at the leading edge of living fibroblasts: possible role of treadmilling. J. Cell Biol. 1985, 101(2): 597-602

202. Weber A., Nachmias V.T., Pennise C.R., Pring M., Safer D. Interaction of thymosin beta 4 with muscle and platelet actin: implications for actin sequestration in resting platelets. Biochemistry. 1992, 31(27): 6179-6185.

203. Wegner A. Head to tail polymerization of actin. J. Mol. Biol. 1976, 108(1): 139-150.

204. Wegner A., Engel J. Kinetics of the cooperative association of actin to actin filaments. Biophys. Chem. 1975, 3(3): 215-225.

205. Wegner A., Savko P. Fragmentation of actin filaments. Biochemistry. 1982, 21(8): 19091913.

206. Welch M.D., Iwamatsu A., Mitchison T.J. Actin polymerization is induced by Arp2/3 protein complex at the surface of Listeria monocytogenes. Nature. 1997, 385(6613): 265269.

207. Welch M.D., Rosenblatt J., Skoble J., Portnoy D.A., Mitchison T.J. Interaction of human Arp2/3 complex and the Listeria monocytogenes ActA protein in actin filament nucleation. Science. 1998,281(5373): 105-108.

208. Wiesner S., Heifer E., Didry D., Ducouret G., Lafuma F., Carlier M.-F., Pantaloni D. A biomimetic motility assay provides insight into the mechanism of actin-based motility. J. Cell Biol. 2003,160(3): 387-398.

209. Wills Z., Bateman J., Korey C.A., Comer A., Van Vactor D. The tyrosine kinase Abl and its substrate enabled collaborate with the receptor phosphatase Dlar to control motor axon guidance. Neuron. 1999, 22(2): 301-312.

210. Winter D., Podtelejnikov A.V., Mann M., Li R. The complex containing actin-related proteins Arp2 and Arp3 is required for the motility and integrity of yeast actin patches. Curr. Biol. 1997, 7(7): 519-529.

211. Witke W., Sharpe A.H., Hartwig J.H., Azuma Т., Stossel T.P., Kwiatkowski D.J. Hemostatic, inflammatory, and fibroblast responses are blunted in mice lacking gelsolin. Cell. 1995, 81(1): 41-51.

212. Zicha D., Allen W.E., Brickell P.M., Kinnon C., Dunn G.A., Jones G.E., Thrasher A.J. Chemotaxis of macrophages is abolished in the Wiskott-Aldrich syndrome. Br. J. Haematol. 1998,101(4): 659-665.

213. Zigmond S.H., Joyce M., Yang C., Brown K., Huang M., Pring M. Mechanism of Cdc42-induced actin polymerization in neutrophil extracts. J. Cell Biol. 1998, 142(4): 10011012.