Механизм ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата по результатам молекулярного моделирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.17, кандидат физико-математических наук Шадрина, Мария Сергеевна

• Шадрина, Мария Сергеевна
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Шадрина, Мария Сергеевна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Методы молекулярного моделирования, использованные в работе.

1.1.1. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики на основе потенциалов эффективных фрагментов.

1.1.2. Метод молекулярного докинга.

1.1.3. Метод молекулярной динамики.

1.2. Объекты исследования: семейство ГТФаз.

1.2.1. Общие сведения о ГТФазах.

1.2.2. Мономерный белок р21Каз.

1.2.3. Белковый фактор ЕР-Ти.

1.2.4. Гетеротримерный белок

1.2.5. Мономерный белок Кап.

1.2.6. Гетеротримерный белок Оз.

1.2.7. Мономерные белки Яар.

1.2.8. Мономерные белки ЯаЬ.

Глава 2. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке ргШаБ.

2.1. Сравнение конформаций пептидных цепей в белках р21 Яаэ и р21Каз*КазОАР.

2.2. Молекулярный докинг.

2.3. Молекулярная динамика.

2.4. Результаты расчетов методом КМ/ММ.

2.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ в белках р2Жаэ и р21Клз*Ка$ОАР

Глава 3. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке ЕГ-Ти.

3.1. Сравнение кристаллических структур белка ЕР-Ти.

3.2. Молекулярная динамика.

3.3. Расчеты КМ/ММ: модель «закрытой конформации».

3.4. Расчеты КМ/ММ: модель «открытой конформации».

3.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ для двух моделей.

Глава 4. Сравнительный анализ деталей механизма гидролиза ГТФ для систем: p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu, ЕР-Ти*аа-тРНК*рибосома.

4.1. Сопоставление данных моделирования: структуры и энергии.

4.2. Расчет кинетического изотопного эффекта (КИЭ).

4.2.1. Экспериментальное определение КИЭ.

4.2.2. Методика расчета КИЭ.

4.2.3. Результаты расчетов.

Глава 5. Исследование активных центров различных ГТФаз.

5.1. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Gt.

5.2. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Ran.

5.3. Моделирование фермент-субстратного комплекса для белка Gs.

5.4. Сравнительный анализ строения активных центров ГТФаз.

5.5. Другие важные примеры ГТФаз.

5.5.1. Мономерный белок Rapl.

5.5.2. Мономерный белок Rab33.

5.5.3. Белковые факторы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата по результатам молекулярного моделирования»

Исследование механизмов реакций ферментативного катализа, включая стадии элементарных химических превращений в активных центрах белков, необходимо для получения знаний о функционировании клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии. Результаты экспериментальных методов, применяемых для изучения ферментативных реакций, включая традиционные кинетические исследования, часто в сочетании с приемами генной инженерии, а также исследования методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) комплексов ферментов с аналогами субстратов или ингибиторами, предоставляют важнейшую информацию о механизмах сложных превращений в белках.

Результаты компьютерных расчетов на основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой химии и комбинированных подходов квантовой механики - молекулярной механики (КМ/ММ), позволяют существенно дополнить экспериментальные исследования, добавить новую информацию и обеспечить визуализацию процессов ферментативного катализа с атомным разрешением.

Диссертация посвящена изучению методами молекулярного моделирования одной из важнейших биохимических реакций - ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в различных гуанозиннуклеотид связывающих белках (G-белках). Несмотря на большой объем накопленной экспериментальной информации по кинетическим и структурным данным для реакции

GTP + Н20 GDP + Pi где GTP и GDP обозначают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат, Pi -неорганический фосфат, и на неоднократные попытки ее теоретического осмысления, заключение о механизме этой реакции в различных средах остаётся предметом дискуссий в научной литературе.

Цель работы заключалась в систематическом изучении элементарных стадий реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в различных G-белках с использованием методов КМ/ММ, молекулярной механики и молекулярной динамики и установлении общего механизма химических превращений в активных центрах ферментов.

Глава Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Математическая и квантовая химия», Шадрина, Мария Сергеевна

Основные результаты и выводы

1. Комбинированным методом квантовой и »молекулярной механики (КМ/ММ) с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21Ras от фермент-субстратного комплекса до продуктов реакции гидролиза. Показано, что реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

2. Методом KiVl/MM с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке EF-Tu для двух вариантов конформации фермента, моделирующих белок в свободном состоянии и в комплексе с рибосомой. Показано, что в обоих случаях реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

3. Выделены общие характеристики реакции гидролиза ГТФ при сопоставлении результатов расчетов методом КМ/ММ: полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов для химических превращений в белках и комплексах: p21Ras. p21Ras*RasGAP, EF-Tu. Прямое сопоставление вычисленных и экспериментальных значений кинетических изотопных эффектов

1 /Г 1 о при замещении О на О в молекуле ГТФ предоставляет поддержку гипотезе о диссоциативном механизме реакции ферментативном гидролиза ГТФ.

4. Выделены основные структурные элементы активных центров G-белков и объяснены функции важнейших аминокислотных остатков, входящих в активные центры. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется у-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов с образованием неорганического фосфата и ГДФ.

5. По результатам моделирования гидролиза фосфатов в различных ферментах сделан вывод, что количество стадий в реакции гидролиза зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Таким образом, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gin и Asn - в две стадии.

Заключение

Сравнительный анализ большого числа кристаллических структур ГТФаз подтвердил консервативность основных водородных связей и взаимозаменяемость ключевых аминокислотных остатков в активных центрах.

В результате анализа белков нами было рассмотрено несколько типов активных центров. Таким образом, G-белки могут различаться по:

• каталитической аминокислоте - Gin (p21Ras), His (EF-Tu, Sari), Asn (Rap 1 * Rap 1 GAP);

• активационной аминокислоте - Arg (p21Ras*RasGAP), Туг (Ran*RanGAP), Ser (Rab33).

При этом каталитическая и активационная аминокислоты могут принадлежать как самому G-белку, так и его активационной частице.

К ряду активационных аминокислот мы считаем нужным добавить остаток Ser, который так же образует водородную связь с кислородом у-фостфатной группы, например, в белке Rab33 (Рис.6.1). Хотя остаток Ser, безусловно, выполняет такие же функции, как и Туг, он ускоряет реакцию в меньшей степени.

Так же стоит добавить в ряд каталитических аминокислот остаток Glu. Хотя этот остаток и не встретился в рассматриваемых ГТФазах, он встречается в АТФазах. Например, при гидролизе АТФ в белке миозине остаток Glu непосредственно участвует в реакции, забирая лишний протон от молекулы воды [95]. На Рис.6.1 приведена структура фермент-субстратного комплекса, полученного в работе [95].

Белок миозин содержит так же остальные элементы, выделенные нами для

ГТФаз:

Магниевый центр. Катион магния координируется Ser237, Thrl86, 2 кислородами фосфатной группы ГТФ и 2 молекулами воды,

Координация ß- н у- атомы кислорода. Аминокислотные остатки Glyl82, Lysl85, Gly457 образуют водородные связи с ß- и у- атомами кислорода фосфатных групп.

Кроме того в белке миозине появляются два остатка Ser, которые образуют водородные связи с кислородом у-фосфатной группы АТФ. Но они не являются характерной чертой АТФаз, т.к. такую же ситуацию можно видеть в активном центре белка Rab5C (код PDB: 1HUQ [112]). Гидроксильные группы остатков Ser52 и ЭегЗО координируют кислород субстрата, способствуя реакции гидролиза ГТФ в белке ЯаЬ5С (Рис.6.2).

Рис.6.1. Строение фермент-субстратного комплекса миозин* ЛТФ [95].

Рис.6.2. Строение активного центра комплекса ЯаЬ5С*ГТФ(1Мрт) (код РОВ: 1НиО).

Сходство между структурами ГТФаз и миозина позволяет расширить предположение о едином строении активных центров также для реакций гидролиза ЛТФ. В работе [95] было показано, что реакция гидролиза ЛТФ в миозине проходит через одну стадию по диссоцитивному механизму: у-фосфатная группа АТФ отщепляется под действием белкового окружения, связывается с реакционной молекулой воды, которая отдает лишний протон через вторую воду на остаток Glu. Данный механизм так же подтвеждает наше предположение о едином диссоциативном механизме гидролиза для белков с одинаковым устройством активных центров.

Включение миозина в число рассматриваемых систем позволяет сделать еще одно наблюдение: в зависимости от типа каталитической аминокислоты реакция гидролиза может проходить в одну или две стадии. Если каталитическая аминокислота - Gin (p21Ras), то реакция проходит в две стадии, при этом протон от реакционной молекулы воды отрывается только на второй стадии. Если каталитическая аминокислота - His (EF-Tu) или Glu (миозин), то реакция проходит в одну стадию, и протон омывается ría первой стадии. Вероятно, ход реакции зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Тогда как остатки His и Glu достаточно легко принимают протон, для Gin это сделать сложнее.

Таким образом, можно обобщить данные по структурным элементам активных центров рассмотренных ферментов:

1. Каталитическая аминокислота: может принадлежать как G-белку, так и активационному белку; непосредственно участвует в реакции гидролиза, во время реакции принимает на себя протон от молекулы воды,, в конце реакции может оставаться в протонированной форме или отдавать лишний протон на отщепившуюся у-фосфатную группу; в «сжатом» активном центре образует водородную связь с кислородом у-фосфатной группы; в зависимости от сродства к протону гидролиз может проходить в одну или две стадии.

• Glu (р21 Ras-'RasGAP), Asn (Rapl *RaplGAP) - 2 стадии,

• His (EF-Tu, Sari), Glu (миозип) - 1 стадия.

2. Активацпонная аминокислота: в зависимости от типа может принадлежать как G-белку, так и акшвациопному белку («аргининовый палец» принадлежит спиральному домену для гетеротримерных G-белков и активационному белку для мономерных G-белков, заместители «аргининового пальца», Туг и Ser, принадлежат G-доменам для всех белков); образует водородные связи с атомами кислорода ß- и у-фосфатных групп, тем самым способствуя отщеплению у-фосфата; мутация по каталитическому Arg уменьшает скорость гидролиза примерно в 1000 раз, мутация по каталитическому Туг — примерно в 25 раз.

• Arg(p21Ras:;:RasGAP),

• Туг (Ran*RanGAP), Ser (Rab33).

3. Координация реакционной молекулы воды: роль реакционной молекулы воды заключается в нуклсофилыюй атаке по фосфору отщепившейся у-фосфатной группы; в момент начала реакции положение реакционной воды фиксируется тремя водородными связями: первый протон воды образует связь с атомом кислорода основной цепи остатка Thr/Ser, второй протон координируется акцепторным атомом каталитической аминокислоты (Gln/His/Asn) или кислородом второй молекулы воды в зависимости от механизма гидролиза, кислород воды направлен на фосфор у-фосфатной группы.

4. Магниевый центр: положительно заряженный катион магния так же способствует отщеплению у-фосфатной группы; координируется шестью кислородами: кислородамн боковых цепей остатков Thr/Ser и Thr/Ser, кислородами [3- и у-фосфатиых групп и кислородами двух молекул воды.

5. Координация р- п у- атомов кислорода: в координации атомов кислорода р~ и у-фосфатных групп также принимают участие водороды консервативных остатков активных центров ферментов: водороды амидных групп основных цепей Gly и Gly/Asp/Ala/Asn/Glu и водороды аминогруппы Lys; их роль заключается в связывании л и ганда, но они так же способствуют отщеплению у-фосфатной группы.

Также на нескольких примерах нами была продемонстрирована роль активационной частицы в гидролизе ГТФ. В роли активационпой частицы может выступать или белок-активатор (для всех ГТФаз) или спиральный домен (для гетеротримерных белков). В зависимости от типа активного центра активационная частица может:

• фиксировать каталитическую аминокислоту в положении, удобном для проведения реакции гидролиза, или предоставлять каталитическую аминокислоту в активный центр G-белка.

• предоставлять активацнонную аминокислоту в активный центр G-белка и таким образом способствовать отщеплению у-фосфатной группы, стабилизируя переходное состояние во время гидролиза.

Другими словами роль активационной частицы заключается в сжатии активного центра О-белка, что позволяет гидролизу ГТФ проходить с меньшим энергетическим барьером.

Несмотря на различия в строении в-белков, во всех рассмотренных случаях мы видим единое устройство активных центров. Как было показано для детально изученных систем р21Яай, р21Каз*Па50АР, ЕР-Ти, ЕБ-Ти*рибосома, общее строение активных центров соответствует единой схеме прохождения реакции гидролиза.

Таким образом, мы считаем, что во всех О-белках, имеющих рассмотренное строение активного центра, реакция гидролиза ГТФ протекает по единому диссоциативному механизму.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Шадрина, Мария Сергеевна, 2008 год

1. Warshel A., Levitt М. Theoretical Studies of Enzymic Reactions: Dielectric, Electrostatic and Steric Stabilization of the Carbonium Ion in the Reaction of Lysozyme // J. Mol. Biol., 1976, V. 103, pp. 227-249.

2. Ponder J. W.; Richards F.M. An efficient Newton-Like method for molecular mechanics energy minimization of large moleculcs // J.Comput.Chem., 1987, V. 8, pp. 1016-1023.

3. Granovsky A, URL: http://lcc.chem.msu.ru/gran/gamess/index.html.

4. A. V. Nemnkhin, B.L. Grigorenko, A.A. Granovsky, Molecular modeling with the PC GAMESSpackage: From diatomic molecides to enzymes, Moscow Univ. Chem. Bull. 45 (2004) 75-102.

5. Stevens W. REPGEN for Optimizing Effective Fragment Repulsive Potentials // CARB, 1991.

6. Bakowies D.; Thiel W. Hybrid models for combined quantum mechanical and molecular mechanical approaches И J.Chem.Phys., 1996, V. 100, pp. 10580-10594.

7. Lavery R.; Etchebest C.; Pullman A. Calculation of the molecular electrostatic potential from a multipole expansion based on localized orbitals // Chem. Phys. Lett., 1982, V. 85, pp. 266-270.

8. Stone A.J.; Alderton M. Distributed Polarizabilities // Mol.Phys., 1985, V. 56, pp. 10651082.

9. Боченкова A.B. Развитие комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. дисс. на соиск. уч. ст. канд. физ.-мат. наук. - 2004.

10. Nemukhin А. V.; Grigorenko B.L.; Bochenokova А. V.; Topol I.A.; Burt S.K. A QM/MM approach with effective fragment potentials applied to the dipeptide-water structures // J.Mol.Structure (Theochem), 2002, V. 581, pp. 167-175.

11. Brian K.S.; McGovern S.L.; Binqing IV.; Irwin J.J. Lead discovery using molecular docking // Current Opinion in Chemical Biology, 2002, V. 6, pp. 439-446.

12. Hanessian S.; MacKay В.; Moitessier N. Design and synthesis of matrix metalloproteinase inhibitors guided by molecular modeling // J. Medicinal Chemistry,2001, V. 44, pp. 3074-3082.

13. Беленикин М.С.; Маккиаруло А.; Константино Г.; Палюлин В.А.; Пелличари Р.; Зефиров Н.С. Молекулярный докинг лигандов глугаматных рецепторов // Вестн. Моск. Ун-та, Сер.2. Химия, 2002, том 43, с. 221-230.

14. Contance J. J.; Koshland D.E. Three-dimensional structure of the serine receptor ligand-binding domain // Proteine Science, 1993, V. 2, pp. 559-566.

15. Henetyi C.; Spoel D. Efficient docking of peptides to proteins without prior knowledge of the binding site // Protein Science. 2002, V. 11, pp. 1729-1737.

16. Шадрина M.C.; Рогов A.B.; Бравая К.Б.; Немухин A.B. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестн. Моск. Унта, Химия, 2005, том 46. №6, с. 363-369.

17. Protein Data Bank, URL htlp://ww\v.rcsb.oru/pdb/

18. Morris G.; Goodsell D.; Halliday R.; Huey R.; Hart W.; Belew R.; Olson A. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function //.¡.Computational Chemistry. 1998, V. 19, pp. 1639-1662.

19. Westmoreland P.R.; Kollman P.A.; Chaka A.M.; Cummings P.T.; Morokuma K.; Neurock M.; Stechel E.B.; Vashishta P. WTEC panel report on applications of molecular and materials modeling // 2000, URL: http.V/www. wtcc.org/lovola/molmodel/ mm final.pdf.

20. Шайтан К.В.; Терёшкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. Методическое пособие // URL http://www.mо 1 dvn.ru/librarv/manual/p 1-1.htm.

21. Car Li.; Parrinello A4. Unified Approach for Molecular Dynamics and Density-Functional Theory //Phys. Rev. Lett., 1985, V. 55, pp. 2471-2474.

22. NAMD User's Guide Version 2.6 // URL http://wvvw.ks.uiuc.edu/Researeh/ namd/2.6/uu/.

23. Bekker H.; Dijkstra E. J.; Renardus M. K; R., Berendsen H. J. C. An efficient, box shape independent non-bonded force and virial algorithm for molecular dynamics. // Mol. Sim., 1995, V. 14, pp. 137-152.

24. HyperChem // URL http://vvwvv .hyper.com

25. Kale L., Skeel R., Bhandarkar M., Brunner R., GursoyA., KrawetzN., Phillips J., Shinozaki A., Varadarajan K, Schulten K. NAMD2: Greater scalability for parallel molecular dynamics II J. Comp. Phys. 1999, V. 151, pp. 283-312.

26. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.S., Swaminathan S., Karplas M. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations//./. Comp. Chem., 1983, V. 4, pp. 187-217.

27. KosloffM., Selinger Z. GTPase Catalysis by Ras and Other G-proteins: Insights from Substrate Directed Supeiimposition II J. Mol. Biol, 2003, V. 331, pp. 1157-1170.

28. Sprang S.R., Chen Z, DuX. Structural basis of effector regulation and signal termination in heterotrimeric Galpha proteins // Adv Protein Chem., 2007, V. 74, pp. 1-65.

29. Sprang S.R. G proteins, effectors and GAPs: structure and mechanism II Curr Opin Struct Biol., 1997, V. 7(6). pp. 849-856.

30. Lehninger A.L.; Nelson D.L.; Cox M.M. Principles of Biochemistry// Worth Publishers, 1993.

31. Scheffzek K.; Ahmadian M.R.; Kabsch W.; Wiesmidler L.; Lautwein A.; Schmitz F.; Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutations // Science, 1997, V. 277, pp. 333-338.

32. Resat /-/./ Straatsma T.P.; Dixon D.A.; Miller J.H. The argentine finger of RasGAP helps Gln-61 align the nucleophilic water in GAP-stimulated hydrolysis of GTP // PNAS, 2001, V. 98(11), pp. 6033-6038.

33. Ma J.; Karplus M. Molecular switch in signal transduction: Reaction paths of the conformational changes in Rasp21 // Biophysics, 1997, V. 94, pp. 11905-11910.

34. Langen Ii.; Schweins T.; Warshel A. On the mechanism of guanosine triphosphate hydrolysis in Ras p21 proteinst II Biochemistry, 1992, V. 31, pp. 8691-8696.

35. Chung H.-H.; Benson D.R.; Schultz P. G. Probing the structure and mechanism of Ras protein with an expanded genetic code // Science, 1993, V. 259, pp. 806-809.

36. Schweins T.; Langen R.; Warshel A. Why have mutagenesis studies not located the general base in Ras p21? II Nat. Struct. Biol., 1994, V. 1, pp. 476-484.

37. SondekJ.; Lambright D.G.; Noel J. P. ; Hamm H.E.; Sigler P.B. GTPase mechanism of G proteins from the 1.7 À crystal structure of transducin a-GDP-AlF4- II Nature, 1994, V. 372, pp. 276-279.

38. Schweins T.; Warshel A. Mechanistic Analysis of the Observed Linear Free Energy Relationships in p21Ras and Related Systems // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 1423214243.

39. Mildvan A.S. Mechanisms of signaling and related enzymes // Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1997, V. 29, pp. 401-416.

40. Scheidig A.J. ; Burmester C.; Goody R.S. The pre-hydrolysis state of p21Ras in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of Ras-like proteins // Structure, 1999, V. 7, pp. 1311-1324.

41. Futatsugi /V.; HataM.; Hoshino T.; Tsuda M. Ab initio study of the role of Lysine 16 for the molecular switching mechanism of Ras protein p21 // Biophysical Journal, 1999, V. 77, pp. 3287-3292.

42. Glennon T.M.; Villa J.; Warshel A. How does GAP catalyze the GTPase reaction of Ras?: A computer simulation study // Biochemistry, 2000, V. 39, pp. 9641-9651.

43. Cheng H.; Sukal S.; Deng II; Leyh T.S.; Callender R. Vibrational structure of GDP and GTP bound to RAS: an isotope-edited FTIR study // Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 40354043.

44. Allin С.; Gerwerl К. Ras catalyzes GTP hydrolysis by shifting negative charges from y-to (3-phosphate as revealed by time-resolved FTIR difference spectroscopy // Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 3037-3046.

45. Mori K.; Hata M.; Neyci S.; Hoshino T. A study on the role Mg2+ in a Ras protein by MD simulation // Chem-Bio Informatics Journal, 2002, V. 2(4), pp. 147-155.

46. Katagiri D.; Hata M.; Itoh Т.; Neya S.; Hoshino T. Atomic-scale mechanism of the GTP-GDP hydrolysis reaction by the Gial protein II J. Phys. Chem. B, 2003, V. 107, pp. 3278-3283.

47. Shwki A.; WarshelA. Why does the Ras switch "break" by oncogenic mutations? // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, V. 55, pp. 1—10.

48. Григоренко Б.JI.; Рогов А.В.; Князева М.А.; Исаева Е.В.; Немухин А.В. Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом RAS-GAP // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23.

49. Topol I.A.; Cachau R.E.; Nemukhin А. V.; Grigorenko B.L.; Burt S.K. Quantum chemical modeling of the GTP hydrolysis by the RAS-GAP protein complex // Biochimica et Biophysica Acta, 2004, V. 1700. pp. 125- 136.

50. Сингер M., БергП. Гены и геномы // Мир. 1998.

51. Лыоин Б. Гены //Мир. 1987.

52. Rodnina М. V., Раре Т., Fricke R. Wintermeyer W. Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption // Biochem. Cell Biol, 1995, V. 73, pp. 1221-1227.

53. Раре Т., Wintermeyer W., Rodnina M. Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminiacyl-tRNA to the A site of the E.coli ribosome // EMBOJ., 1998, V. 17, pp. 7490-7497.

54. Scarano G., Krab I.M., Bocchini V., Parmeggiani A. Relevance of histidine-84 in the elongation factor Tu GTPase activity and in poly(Phe) synthesis: its substitution by glutamine and alanine // FEBSLetters. 1995, V. 365, pp. 214-218.

55. Cool R.H., Parmeggiani A. Substitution of Histidine-84 and the GTPase Mechanism of Elongation Factor Tu// Biochemistry. 1991, V. 30. pp. 362-366.

56. Hilgenfeld R., Mesters J.R., Hogg T. Insights into the GTPase Mechanism ofEF-Tu from Structural Studies // The Ribosome: Struct., Fund., Antibiotics, and Cellular Interactions, 2000, V. 28, pp. 347-357.

57. Kjeldgaard M., Nissen P., Thirup S., NyborgJ. The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation // Structure, 1993, v. 1, pp. 35-50.

58. Daviter Т., Wieden H.-J., Rodnina M. V. Essential role of Histidine 84 in elogation factor Tu for the chemical step of GTP hydrolysis on the ribosome //./. Mol. Biol., 2003, V. 332, pp.689-699.

59. Vogeley L., Palm G.J., Mesters J. R., Hilgenfeld R. Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding. Crystal structure of the complex between EF-Tu*-GDP and aurodox H J. Biol. Chem2001, V. 276, pp. 17149-17155.

60. Липкий B.M. Зрительная система. Механизмы передачи и усиления зрительного сигнала в сетчатке глаза // Соросовский образовательный эюурнал, 2001, Т.7, №9, с.2-8.

61. Pages F.; Deterre P.; Pfister С. Enhancement by Phosphodiesterase Subunits of the rate of GTP hydrolysis by transducine in bovine retinal rods // J. Biol. Chem., 1993, V. 268, № 35, pp. 26358-26364.

62. Udovichenko I.P.; CunnickJ.; Gonzalez K.; Yakhnin A.; Takemoto D.J. Protein kinase С in rod outer segments: effect of phosphorylation of the phosphodiesterase inhibitory subunit // Biochem. J., 1996, V.317. pp. 291-295.

63. Nekrasova E.R.; Berman D.M.; Rustandi R.R.; Hamm Ii.E.; Gilman A.G.; Arshavsky V. Y. Activation of transducin guanosine triphosphate by two proteins of the RGS family I I Biochemisty, 1997, V.36, pp. 7638-7643.

64. Faurobert E.; Hurley J.B. The core domain of a new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V.94, pp.2945-2950.

65. He W.; Cowan С. IV.; Wensel G. IV. RGS9, a GTPase Accelerator for Phototransduction //Neuron, 1998, V. 20, pp. 95-102.

66. Skiba P.N.; Yang C.S.; Huang Т.; Iluyunsu В.; Hamm H.E. The a-Helical domain of Gat determines specific interactions with regulator of protein signaling 9 // J. Biol. Chem., 1999, V.274, №13, pp. 8870-8878.

67. Slep K.C.; Kercher MA; He W.; Cowan C. W.; Wense! T.G.; Sigler P.B. Structural determinants for regulation of phosphodiesterase by a G protein at 2.0A // Nature, 2001, V. 409, pp. 1071-1077.

68. Noel J.P.; Hamm HE.; Sigler P.B. The 2.2A crystal structure of transducin-a complexed with GTPyS II Nature, 1993, V. 366, pp. 654-663.

69. SondekJ.; Lambrighl D.G.; Noel J.P.; Hamm HE.; Sigler P.B. GTPase mechanism of Gproteins from the 1.7-A crystal structure of transducin a*GDP*AlF4~ // Nature, 1994, V. 372, pp. 276-279.

70. Seewald M.J., Körner C., Wittinghofer A, Vetter I.R. RanGAP mediates GTP hydrolysis without an arginine finger // Nature, 2002, V. 415, pp. 662-666.

71. Klebe C, BischoffFR, Ponstingl II, Wittinghofer A. Interaction of the nuclear GTP-binding protein Ran with its regulatory proteins RCC1 and RanGAP 1 II Biochemistry, 1995, V. 34(2), pp. 639-647.

72. Haberland.J., Gerkes V. Conserved charged residues in the leucine-rich repeat domain of the Ran GTPase activating protein are required for Ran binding and GTPase activation. II Biochem. J., 1999, V. 343, pp. 653-662.

73. Görlich D., Seewald M.J., Ribbeck K. Characterization of Ran-driven cargo transport and the RanGTPase system by kinetic measurements and computer simulation 11 The EMBO Journal, 2003, Vol. 22, pp. 1088-1100.

74. Graziano M.P., Oilman A.G. Synthesis in .Escherichia coli of GTPase-deficient Mutants of Gsa* // The Journal of Biological Chemistry, 1989, V. 264, No. 26, pp. 1547515482.

75. Markby, D. W., Onrusl, R., Bourne, II. R. Separate GTP-binding and GTPase-activating domains of a G-alphasubunit // Science, 1993, V. 262, pp. 1895-1901.

76. Sunahara R.K., Tesmer J. J.G., Gihnan A.G., Sprang S.R. Crystal structure of the adenylyl cyclase activator Gsa // Science, 1997, V. 278, No. 5345, pp. 1943 1947.

77. Shnerb T, Lin N, Shurki A. What is the role of the helical domain of Gsalpha in the GTPase reaction? II Biochemistry, 2007, V. 46(38), pp. 10875-10885.

78. Hart P.A., Marshall C.J. Amino acid 61 is a determinant of sensitivity of rap proteins to the ras GTPase activating protein // Oncogene, 1990, V. 5(7), pp. 1099-1101.

79. Brinkmann T., Daumke O., Herbrancl U., Kuhlmann D., Stege P., Ahmadian M.R., Wittinghofer A. Rap-specific GTPase Activating Protein follows an Alternative Mechanism HJ. Biol. Chem., 2002, V. 277, No. 15, pp. 12525-12531.

80. Scrima A., Thomas G, Deaconescu D., Wittinghofer A. The Rap-RapGAP complex: GTP hydrolysis without catalytic glulamine and arginine residues // The EMBO Journal, 2008, V. 27, pp. 1145-1153.

81. Chakrabarti P.P., Suveyzdis Y., Wittinghofer A., Gerwerl K. Fourier Transform Infrared Spectroscopy on the Rap'RapGAP Reaction, GTPase Activation without an Arginine Finger//./. Biol. Chem., 2004, V. 279. No. 44. pp. 46226-46233.

82. PanX., Eathiraj S., Munson M., I.ambright D.G. TBC-domain GAPs for Rab GTPases accelerate GTP hydrolysis by a dual-finger mechanism // Nature, 2006, V. 442, pp. 303306.

83. Cavalli A., Carloni P. Enzymatic GTP hydrolysis: insights from an ab initio molecular dynamics H J. Am. Chem. Soc, 2002. V. 124, pp. 3763-3768.

84. Heesen Te H., Gerwerl K., Schlitier J. Role of the arginine finger in Ras*RasGAP revealed by QM/MM calculations // FEBS Lett., 2007, V. 581, pp. 5677-5684.

85. Grigorenko B.L., NemukhinA. V., Topol J.A., Cachau R.E., Burt S.K. QM/MM modeling the Ras-GAP catalyzed hydrolysis of guanosine triphosphate ¡/Proteins: Struct. Fund. Bioinf, 2005. V. 60, pp. 495-503.

86. Grigorenko B.L., Rogov A. V., Topol I.A., Burl S.K., Martinez H.M., Nemukhin A.V. Mechanism of the myosin catalyzed hydrolysis of ATP as rationalized by molecular modeling // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2007, V.104, pp. 7057-7061.

87. Bourne HR., Sanders D.A., McCormick F. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions // Nature, 1990, V. 348, pp. 125-131.

88. Sprang S.R. G protein mechanisms: Insights from structural analysis // Annu. Rev. Biochem., 1997, V. 66, pp. 639-672.

89. Wittinghofer A. Phosphoryl transfer in Ras proteins, conclusive or elusive? // Trends Biochem Sei, 2006, V. 31, pp. 20-23.

90. Cleland W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms II Arch. Biochem. Biophys., 2005, V. 433, pp. 2-12.

91. Du X., Ferguson K., Sprang S. It A Method to Determine 180 Kinetic Isotope Effects in the Hydrolysis of Nucleotide Triphosphates II Anal Biochem, 2008, V. 372(2), pp. 213— 221.

92. DuX., Black G.E., Lecchi P., Abramson F.P., SprangS.R. Kinetic isotope effects in Ras-catalyzed GTP hydrolysis: evidence for a loose transition state // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2004, V. 101, pp. 8858-8863.

93. Grigorenko B.L., Rogov A. V., Neanikhin A. V. Mechanism of triphosphate hydrolysis in aqueous solution: QM/MM simulations in water clusters II JPhys Chem B, 2006, v. 110(9), pp. 4407-4412.

94. Vetter I.R., NowakC., Nishimolo T., Kuhlmann J., Wittinghofer A. Structure of a Ran-binding domain complexed with Ran bound to a GTP analogue: implications for nuclear transport II Nature, 1999, V. 398(6722), pp. 39-46.

95. Maesaki R., Ihara K., Shimizu T., Kuroda S., Kaibuchi K., Hakoshima T. The structural basis of Rho effector recognition revealed by the crystal structure of human RhoA complexed with the effector domain of PKN/PRK1 //Mol. Cell, 1999, V. 4, pp. 793803.

96. Rittinger K., Walker P.A., Eccle.sion J.F., Smerdon S.J., Gamblin S.J. Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transition-state analogue // Nature, 1997, V. 389, pp. 758-762.

97. Jeffrey P.D., Bajorath J., Chang C. K, Yell on D., Hellstrom I., Iiellstrom K.E., Sheriff S. The x-ray structure of an anti-tumour antibody in complex with antigen // Nat. Struct Biol., 1995, V. 2, pp. 466-471.

98. Westheimer F.H. Monomeric metuphosphates // Chem. Rev., 1981, V. 81, pp. 313-326.

99. Eathiraj S., PanX., Ritacco C., Lambright D.G. Structural basis of family-wide Rab GTPase recognition by rabenosyn-5 // Nature, 2005, V. 436, pp. 415-419.