Механизм двухфотонного возбуждения светособирающих комплексов фотосинтезирующих пурпурных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Степаненко, Илья Александрович

• Степаненко, Илья Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Степаненко, Илья Александрович

1. Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Бактериальный фотосинтез.:.;.

1.1.1 Пурпурные фотосинтезирующие бактерии.

1.1.2 Устройство фотосинтезирующего аппарата. , 1.1.3 Светособирающие антенны. 1.2 Пигмент-белковые комплексы светособирающей антенны пурпурных " бактерий;.;. , 1.2.1:Бактериохлорофилл^ его модификации и их свойства.

1.2.2 Каротиноиды и их свойства.

1.2.3. Комплексы ЪШ и ЬН2.;.;.

1.3 Теоретическое описание процессов переноса энергии в антенных комплексах;.;.:.;.

1.3.1 Экситонная теория для светособирающих комплексов.

1.3.2 Экситонная модель кольцевого агрегата В

1.4 Двухфотонное поглощение молекул и молекулярных комплексов

1.4.1 Двухфотонные переходы в молекулах и молекулярных кристаллах.

1.4.2 Экспериментальная методика.

Глава 2. Материалы и методика измерений

2.1 Спектроскопия возб5^ждения флуоресценции: экспериментальная установка;.

2.2 Спектроскопия фотоиндуцированных изменений оптического поглощения с фемтосекундным временным разрешением: экспериментальная установка.

2.3 Подготовка образцов.

Глава 3. Двухфотонное возбуждение флуоресценции светособирающих комплексов LH2.

3.1 Стационарные линейные спектры поглощения и возбуждения флуоресценции исследуемых образцов.

3.2 Флуоресценция молекул бактериохлорофилла как индикатор двухфотонного возбуждения комплекса LH2.

3.3 Сравнение спектров двухфотонного возбуждения каротиноид-содержащих и бескаротиноидных комплексов.

Глава 4. Спектроскопия фотоиндуцированных изменений оптического поглощения комплексов LH2 при двухфотонном возбуждении.

4.1 Динамика релаксации энергии в комплексе LH2 при двухфотонном возбуждении.

4.2 Экспериментальная и теоретическая оценка сечения двухфотонного поглощения.

4.3 Сравнение динамики релаксации энергии в комплексах LH2 при однофотонном и двухфотонном возбуждении.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм двухфотонного возбуждения светособирающих комплексов фотосинтезирующих пурпурных бактерий»

Фотосинтез является важнейшим процессом преобразования солнечной энергии, происходящим в живой природе. Он присущ высшим растениям, сине-зелёным водорослям, цианобактериям и фотосинтезирующим бактериям. [Clayton & Sistrom, 1978]. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий уже много десятилетий является не только классическим объектом5 экспериментальных исследований, но и, предметом пристального внимания-физиков и химиков; интересующихся фундаментальными основами процессов» преобразования^ световой энергии в биологических системах. Можно назвать, по крайней мере, две причины столь широкой популярности пурпурных бактерий. Во-первых, существование информации о пространственной структуре с точностью до атомных расстояний, и, во-вторых, в-отличие от растений, наличие четкого спектрального разделения между отдельными группами пигментов.

Исторически сложилось, что фотосинтезирующие организмы подразделяют на два класса. Когда фотосинтез происходит на воздухе, то его называют кислородным- фотосинтезом,, [Ort & Yocum,1996]. В- противном-случае - бескислородным [Blankenship et al. 1995]. У- высших растений, и цианобактерий фотосинтез происходит» с, участием, кислорода, который включает в себя процессы восстановления диоксида углерода и окисления воды. Некоторые фотосинтезирующие- бактерии, например' пурпурные, демонстрируют бескислородный фотосинтез, при котором в роли окислителя вместо воды (-ОН) используются другие молекулы. Однако, несмотря на все различия* основные принципы переноса энергии одинаковы для этих двух типов' фотосинтеза5 [Stanier, 1961; Gest, 1993]. Первичные процессы фотосинтеза включают в себя поглощение фотонов'молекулами пигментов светособирающих комплексов (LH), образующих светособирающую антенну, перенос энергии от LH комплексов к реакционным центрам (РЦ) и разделение зарядов в РЦ [Sauer, 1975; Knox, 1977; Fleming & van Grondelle,

1994; Novoderezhkin & Razjivin, 1995; van Grondelle et al. 1994]. У бактерий светособирающие комплексы и РЦ представлены разными пигмент-белковыми комплексами (ПБК), а у растений и цианобактерий РЦ образуют единый ПБК с прицентровой частью светособирающей антенны [Kaplan &Arntzen, 1982; Zuber & Brunisholz, 1991]. Образующие фотосинтетический аппарат ПБК антенны и РЦ* располагаются во внутренних клеточных мембранах в виде двумерных структур. Вспомогательные светособирающие комплексы зелёных бактерий (хлоросомы), цианобактерий и, низших водорослей (фикобилисомы) могут располагаться^ вне мембраны вплотную к ней.

С помощью- биохимических и спектроскопических методов исследования» фотосинтезирующих бактерий' были выявлены следующие структурные и физические принципы, лежащие в основе поглощения солнечной энергии:

Г. Фотосинтетические мембраны бактерий содержат тысячт молекулпигментов — бактериохлорофилловч (БХл) и. каротиноидов (Кар), которые нековалентно связываясь с белками,, образуют высоко симметричные пигмент-белковые комплексы» [Stoll, 1936; Thornber et al. 1983; Zuber, 1986;

Zuber & Brunisholz, 1991; Zuber & Cogdell, 2004]. Из всех пигментов только несколько находятся» в реакционном центре, и непосредственно принимают участие в химических реакциях. Остальные, образуя светособирающие антенны, ответственны за поглощение энергии, и ее транспортировку к РЦ

Emerson & Arnold, 1932; Duysens, 1989]. Реакционный центр и связанные с ним по переносу энергии возбуждения светособирающие антенны* условно называют фотосинтетической единицей (ФСБ) [Mauzerall & Greenbaum,

1989; Francke & Amesz, 1995; Gogdell et al. 1996]. На. самом деле, формирование пигментов в ФСБ, в которых многочисленные антенны обслуживают РЦ; происходит у всех фотосинтезирующих организмов

Duysens, 1989; Grossman et al. 1995; Gantt, 1996; Green & Durnford, 1996;

Hankamer et al. 1997]. С их помощью они могут поглощать свет в широком, 6 спектральном диапазоне и используют солнечную энергию более эффективно, т.е. увеличивают вероятность захвата возбуждения реакционным центром. При ярком солнечном свете хлорофиллы поглощают с частотой порядка 10 Гц, а при тусклом - 0:1 Гц [Borisov & Godik, 1973]. Однако, химические реакции в РЦ происходят с частотой 1000 Гц. Таким образом, светособирающие комплексы, поставляя энергию реакционному центру, согласовывают работу РЦ с процессами переноса энергии.

2. У большинства пурпурных бактерий» ФСЕ состоит из двух типов светособирающих комплексов. В800-В850- (LH2). и В875 (ЬН1)> с пиками поглощения in« vivo 800нм, 850нм и 875нм соответственно [Thornber et! al. 1983; Zuber & Brunisholz, 1991; Hawthornthwaite & Cogdell; 1991]; LH1 непосредственно окружает РЦ, a-LH2 с ним не контактирует [Miller, 1982; Walz & Ghosh, 1997]. Для некоторых типов бактерий, например-Rhodopseudomonas (Rps.) acidophila u Rhodospirillum (Rs.) molischianum strain * DSM-120 [Germerroth-et al. 1993], существует третий* тип» антенн»B800-B8304 (ЬНЗ).

3. Пурпурные бактерии поглощают видимый- свет главным образом в области 500 нм благодаря- каротиноидам и в области 800 нм благодаря молекулам бактериохлорофилла. Пигменты периферических комплексов LH2 поглощают в более коротковолновой области по- сравнению с комплексами LH1. Такие особенности5 оптических свойств компонентов, входящих в состав ФСЕ, не случайны, так- как они формируют энергетическую «воронку», которая обеспечивает миграцию энергии от LH2 к LH1 и на РЦ.

4. Опыты с временным разрешением показали, что процессы.переноса энергии в ФСЕ происходят за короткие, промежутки времени, в пределах пико и фемто секунд, и с очень большой эффективностью (95%) [Pullerits & Sundström, 1996; Fleming & van Grondelle, 1997; Пащенко, 1990]. Характерное время за которое возбуждение антенны достигает РЦ составляет меньше 100 пс.

Актуальность темы

Фотосинтез является глобальным процессом, посредством которого энергия солнечного света собирается; преобразуется, используется? или запасается- в биосфере Земли. Попадающая на Землю часть, энергии Солнца, является? неисчерпаемым, источником экологически чистой • энергии. Однако доля солнечной.энергии: на энергетическом рынке сейчас составляет менее трех- процентов. Несмотря на то, что на.Землю энергия поступает бесплатно; ее преобразование с помощью солнечных батарей пока слишком затратно по технологическим; причинам. Считается,, что проблему можно решить, разработав-, более эффективные способы сбора, переработки и хранения солнечнойэнергии: ' : . : /,:■. •-■■.•

Решение энергетических проблем; может быть.'. связано« с созданием^ искусственных преобразователей солнечной энергии, работающих по принципу природного фотосинтеза, эффективность сбора и; преобразования энергии света на ранних стадиях которого близка; к 100%. Но такие преобразователи «фотосинтетического» типа; которые могли: бы превзойти или, по крайней мере, сравниться с солнечными батареями; пока не существуют. Основнаяшричина этого состоит в том; что полное понимание работы фотосинтетического• аппарата еще не: достигнуто.; Теоретические и экспериментальные работы по исследованию фотосинтеза: имеют не только фундаментальное научное значение, но? и могут сделать использование солнечной энергии экономически оправданным.

К простейшим организмам^ способным: осуществлять фотосинтез, относятся фотосинтезирующие пурпурные бактерии. Их фотосинтетический аппарат устроен гораздо проще, чем у высших растений и цианобактерий, и лучше подходит для, исследования первичных (физических) процессов фотосинтеза. Первичные процессы протекают в двух основных структурных компонентах фотосинтетического аппарата — в реакционном центре (РЦ) и светособирающей антенне. В антенне всегда присутствует прицентровый. • ' ' 8 светособирающий комплекс LH1 (или В875) с полосой поглощения в области 875-900 нм. Периферический светособирающий комплекс LH2 (или В800-850) с пиками поглощения около 800 и 850 нм обнаруживается у многих, но не у всех бактерий. Строение комплекса LH2 известно, в частности, по рентгеноструктурным данным. Это сложный пигмент-белковый комплекс содержащий два вида* пигментов - молекулы бактериохлорофилла (БХл) и молекулы* каротиноидов. Пути и механизмьь переноса и преобразования поглощенной световой энергии в- пигментной- системе светособирающей антенны продолжают оставаться. предметом1 интенсивных экспериментальных и теоретических исследований.

Цели и задачи исследования'

Цель работы состояла, в исследовании свойств «невидимых» для линейной спектроскопии энергетических состояний и» связанных с ними процессов-переноса и конверсии энергии в светособирающих' комплексах фотосинтезирующих пурпурных бактерий. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследование энергетических состояний светособирающих комплексов методом флуоресцентной спектроскопии при двухфотонном возбуждении лазерными импульсами.

2. Исследование динамики * переноса и конверсии энергии в светособирающих- комплексах методом спектроскопии фотоиндуцированных изменений оптического поглощения с фемтосекундным временным разрешением при двухфотонном возбуждении лазерными импульсами.

3. Сравнительное исследование светособирающих комплексов, содержащих каротиноиды и не содержащих каротиноиды (с подавленным синтезом каротиноидов или из бескаротиноидных мутантов), а также комплексов из различных видов фотосинтезирующих пурпурных бактерий. 9

Научная новизна работы

В работе впервые прямым экспериментом опровергнуто устоявшееся предположение о существенном вкладе каротиноидов в спектр двухфотонного поглощения светособирающего комплекса ЬН2 фотосинтезирующих пурпурных бактерий. Впервые экспериментально обоснована гипотеза о возможности двухфотонного возбуждения* наивысшего экситонного состояния (к-0^) кольцевого агрегата» В850 комплекса ЬН2. Методом' спектроскопии- двухфотонного возбуждения-определена, энергия наивысшего'экситонного, состояния и оценена-энергия взаимодействия молекул бактериохлорофилла в, кольцевом агрегате В850.-Впервые получены экспериментальные оценки, сечения двухфотонного-поглощения комплексов ЬН2, а также исследована динамика конверсии энергии возбуждения в кольцевом- агрегате-В850.

Практическая, значимость работы

Практическая значимость работы заключается» в доказанной перспективности- использования фемтосекундной лазерной1 спектроскопии двухфотонного возбуждения. для исследования компонентов фотосинтетического аппарата* бактерий и высших растений. Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей, работы, проясняют механизм двухфотонного возбуждения фотосинтетических светособирающих комплексов, а также раскрывают возможности использования данного механизма для экспериментального исследования процессов! переноса энергии возбуждения.

Личный вклад соискателя

Все экспериментальные результаты, изложенные в работе, получены соискателем самостоятельно. Разработана и создана измерительная часть установки для регистрации спектров возбуждения флуоресценции образцов

10 на основе перестраиваемого параметрического усилителя и прецизионной ПЗС-матрицы. Создана установка для исследования фотоиндуцированных изменений оптического поглощения образцов с возможностью получения спектров возбуждения (поддержка автоматического сканирования по длине волны возбуждения и автоматического, регулирования, мощности^ возбуждения)? Для обеих установок разработано- специализированное-программное обеспечение;

Апробация работы.

Основные материалы диссертационной^ работы г докладывались и обсуждались на международной конференции "Photosynthesis Research for Sustainability" (24-30 July 2011, Baku; Azerbaijan), международной конференции» "Laser Applications, in; Life Sciences; LALS-2010" (9-11 June, 2010; Oulu, Finland); международной конференции "Laser applications, and Technologies, ICONO/LAT 2010" (23-26 августа 2010; Казань), XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах", посвященных 100-летию со дня^ рождения В.Б.Евстигнеева (15 июня 2009 г., Пущино), Конференции "Light Energy Conversion in Photosynthesis" и V-мСъезде-Российского, фотобиологического общества (12;июня 2008 г., Пущино), на рабочей? конференции Европейского научного фонда программы, DMNA "Novel Methods in Exploring Carotenoid Excited State Dynamics" (21 September, 2008, Chech Republic), XIV международной научной; конференции-«Ломоносов» (25 ноября 2008 г., Москва).

Публикации;

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных научных журналах.

Структура и объем диссертации.