Механизм антимикобактериального действия синтетического аналога дитерпеноида морского происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сидоров Роман Юрьевич

• Сидоров Роман Юрьевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Сидоров Роман Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Проблема устойчивости бактерий к антибиотикам

1.1.1 Резистентность к антибиотикам

1.1.2 Персистенция бактерий

1.2 Факторы образования персистеров

1.2.1 Дормантность бактерий

1.2.2 Токсин-антитоксиновые модули

1.2.3 Системы синтеза алармонов у бактерий

1.3 Суперсемейство белков RSH

1.3.1 Длинные гомологи RelA/SpoT

1.3.2 Малые алармонсинтетазы

1.4 Ингибиторы алармонсинтетаз бактерий

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микробиологические методы

2.1.1 Объекты исследования

2.1.2 Культивирование микроорганизмов

2.1.3 Определение минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной концентрации антибиотика

2.1.4 Кривые отмирания

2.1.4 Определение уровня выживаемости и частоты образования персистеров

2.1.6 Исследование комбинированного воздействия антибиотиков

2.2 Молекулярно-биологические методы

2.2.1 Подбор праймеров

2.2.2 Полимеразная цепная реакция

2.2.3 Электрофорез в агарозном геле

2.2.4 Электропорация

2.2.5 Осаждение этанолом

2.2.6 Выделение плазмидной ДНК

2.2.7 Молекулярное клонирование

2.2.8 ТА-клонирование

2.2.9 Верификация конструкций

2.2.10 Измерение активности люциферазы

2.2.11 Сверхэкспрессия в клетках микобактерий

2.2.12 Экспрессия и очистка белков

2.2.13 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле

2.3 Конструирование генно-инженерных штаммов

2.3.1 Список использованных плазмид

2.3.2 Конструирование экспрессионных векторов системы pET

2.3.3 Конструирование микобактериальных экспрессионных плазмид pMind

2.3.4 Создание микобактериальных репортерных слияний

2.3.5 Нокаутирование генов микобактерий по методу Пэриш и Стокера

2.4 Биохимические методы

2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.4.2 Определение активности алармонсинтетаз

2.4.3 Исследование цитотоксической активности

2.5 Биоинформатика и анализ данных

2.5.1 Источники нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, трехмерных структур белков

2.5.2 Статистическая обработка и визуализация результатов

2.5.3 Выравнивание аминокислотных последовательностей

2.5.4 Молекулярный докинг

2.5.5 Виртуальный скрининг

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

3.1 Влияние фазы роста периодической культуры M. smegmatis на антибактериальную активность DMNP в сравнении с традиционными антибиотиками

3.1.1 Зависимость характера кривых отмирания M. smegmatis от фазы роста периодической культуры

3.1.2 Зависимость антибактериальной активности DMNP и уровня экспрессии гена relMsm от фазы роста периодической культуры

3.2 Эффективность воздействия изомерных форм DMNP в сравнении с рацематом

3.3 Алармонсинтетазы как мишени антибактериального действия DMNP

3.3.1 Воздействие DMNP на штаммM. smegmatis со сверхэкспрессией длинного RSH-белка RelM sm

3.3.2 Воздействие DMNP на штамм со сверхэкспрессией малой алармонсинтетазы

RelZ

3.3.3 Воздействие витамина С, известного ингибитора алармонсинтетаз, на штамм

со сверхэкспрессией RelMsm

3.4 Оценка влияния DMNP на активность белков-мишеней in vitro

3.4.1 Воздействие DMNP на активность длинного RSH-белка RelMsm

3.4.2 Воздействие DMNP на активность малой алармонсинтетазы RelZ

3.4.3 Воздействие DMNP на активность длинного RSH-белка RelMtb

3.5 Ферментативная кинетика алармонсинтетаз при добавлении DMNP

3.5.1 Кинетика длинного RSH-белка RelMsm

3.5.2 Кинетика малой алармонсинтетазы RelZ

3.6 Влияние DMNP на выживаемость штаммов с делециями генов relMsm и relZ

3.7 Влияние DMNP на выживаемость штаммов с комплементацией нокаутов генов relMsm и relZ

3.8 Моделирование взаимодействия DMNP с мишенями с использованием молекулярного докинга

3.9 Виртуальный скрининг библиотеки структур производных DMNP

3.10 Усиление бактерицидного эффекта клинических антибиотиков за счет их комбинации с DMNP

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Протоколы генетического конструирования

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Детализация результатов виртуального скрининга библиотеки структур химических производных DMNP

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм антимикобактериального действия синтетического аналога дитерпеноида морского происхождения»

ВВЕДЕНИЕ

В диссертационной работе представлены результаты исследования механизма действия соединения 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановой кислоты (DMNP), которое является синтетическим аналогом природного дитерпеноида эрогоргиаена. Эрогоргиаен первоначально обнаружен как промежуточный метаболит морского коралла Antillogorgia elisabethae, обладающий антибактериальным эффектом в отношении Mycobacterium tuberculosis [Rodriguez, Ramirez, 2000; Kerr et al., 2006]. Синтез DMNP осуществлен на основе левовращающего энантиомера эрогоргиаена [Incerti-Pradillos et al., 2016] в лаборатории органического синтеза Пермского государственного национального исследовательского университета. Диссертационное исследование проведено в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов. В ходе работы установлен механизм действия DMNP и обнаружена его способность подавлять формирование клеток-персистеров Mycolicibacterium smegmatis, принятой экспериментальной модели возбудителя туберкулеза M. tuberculosis.

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Снижение уровня заболеваемости и смертности от социально значимых заболеваний, среди которых лидирующие места по этим показателям занимает туберкулез [Chakaya et al., 2021; Singh, Chíbale, 2021], является одной из актуальных проблем в области научных исследований, направленных на повышение уровня здоровья населения. Значительные трудности при лечении туберкулеза и других бактериальных инфекций возникают как результат действия механизмов устойчивости бактерий к антибиотикам: наследуемой резистентности и ненаследуемой персистенции [ Brauner et al., 2017; Ehrt et al., 2018]. Резистентность приводит к низкой эффективности лечения инфекции определенными антибиотиками, а персистенция повышает риск рецидива инфекции и способствует увеличению продолжительности лечения туберкулеза [Mandal et al., 2019; Boldrin et al., 2020].

В состоянии дормантности, характерном для клеток-персистеров, метаболические процессы замедляются [Wood et al., 2013; Pu et al., 2019]. Поэтому антибиотики, действующие на молекулярные мишени в активно растущих клетках, оказываются неэффективными в отношении клеток-персистеров [Zheng et al., 2020], особенно в поздней фазе терапии туберкулеза, направленной на устранение выжившей части популяции. Важно отметить, что клетки-персистеры представляют собой эволюционный резервуар для приобретения и распространения генетических детерминант наследственно закрепленной резистентности к антибиотикам [Cohen et al., 2013; Levin-Reisman et al., 2017]. Таким образом, существует необходимость поиска лекарственных соединений с новыми механизмами действия, направленными на предотвращение формирования резистентности и персистенции.

Одним из возможных путей преодоления механизмов устойчивости бактерий к антибиотикам может быть разработка веществ, воздействующих на стринджент-ответ -реакцию бактерий на стресс, которая регулируется сигнальными молекулами алармонов (p)ppGpp и ассоциирована с вирулентностью, образованием биопленок, резистентностью и персистенцией [Hobbs, Boraston, 2019; Gupta et al., 2021].

Цель исследования: установить молекулярный механизм антибактериального действия 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановой кислоты (DMNP) как потенциального ингибитора персистенции.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать антибактериальную активность соединения DMNP в отношении клеток Mycolicibacterium smegmatis в различных фазах роста периодической культуры в сравнении с известными противотуберкулезными антибиотиками.

2. Определить молекулярные мишени DMNP в клетках M. smegmatis, исследуя его активность в отношении генно-инженерных штаммов и очищенных рекомбинантных белков.

3. Провести анализ молекулярного взаимодействия DMNP с белками-мишенями in silico для детализации его механизма действия.

4. С помощью виртуального скрининга библиотеки трехмерных структур производных DMNP выбрать соединения, обладающие повышенной предсказанной эффективностью связывания с белками-мишенями.

5. Исследовать возможность повышения эффективности антибактериального действия используемых в клинике антибиотиков за счет их комбинирования с DMNP.

Научная новизна работы. В диссертационной работе исследованы антибактериальные свойства впервые синтезированного соединения DMNP, представляющего собой синтетический аналог дитерпеноида морского происхождения эрогоргиаена, промежуточного метаболита морского коралла Antillogorgia elisabethae. Обнаружена способность DMNP подавлять образование клеток-персистеров микобактерий, ранее неизвестная для представителей данного класса соединений. Установлен молекулярный механизм антиперсистерной активности DMNP, основанный на неконкурентном ингибировании бактериальных ферментов (p)ppGpp-синтетаз. На основе экспериментальных данных построена теоретическая модель взаимодействия лиганда DMNP с (p)ppGpp-синтетазами. Модель использована при проведении виртуального скрининга библиотеки производных DMNP для идентификации оптимизированных производных. Впервые выявлено усиление действия используемых в клинике антибиотиков рифампицина и стрептомицина в комбинации с DMNP, показана перспектива его применения для разработки способов подавления бактериальной персистенции и профилактики затяжных инфекций.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследование имеет как теоретическое, так и практическое значение в области разработки средств противодействия персистенции бактерий. Результаты подчеркивают важность изучения бактериальных механизмов ответа на стресс при разработке антибактериальных препаратов. Установленная в диссертационной работе связь подавления синтеза (p)ppGpp в клетках микобактерий с антибактериальной активностью в отношении клеток стационарной фазы и эффектом подавления бактериальной персистенции создает перспективу для разработки новых подходов к лечению бактериальных инфекций. Соединение DMNP в будущем может стать основой для нового противотуберкулезного лекарственного препарата, направленного на борьбу с персистенцией, в том числе для использования в комбинации с традиционными антибиотиками, воздействующими на активно растущие клетки микобактерий. Практическая значимость проведенного исследования также подтверждается соответствием одной из основных задач Стратегии предупреждения распространения антибиотикорезистентности в РФ: «разработка противомикробных препаратов и альтернативных методов лечения инфекционных заболеваний».

Методология и методы исследования. Для решения задач исследования использованы микробиологические принципы и подходы, дополненные методами молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии, биоинформатики, молекулярного моделирования и виртуального скрининга. Для установления механизма действия DMNP проведены исследования периодических культур микобактерий, кривых отмирания в присутствии антибиотиков, сконструированы и исследованы генно-инженерные штаммы микобактерий, наработаны, очищены и исследованы микобактериальные белки-мишени DMNP, проведены исследования взаимодействия DMNP с белками-мишенями т зШео.

Положения, выносимые на защиту:

1. Соединение DMNP оказывает наибольшее антибактериальное действие на клетки микобактерий в стационарной фазе периодической культуры, в противоположность традиционным антибиотикам, наиболее эффективным в экспоненциальной фазе.

2. Механизм антибактериального действия DMNP в отношении М. $тв£таИ$ обусловлен неконкурентным ингибированием активности (p)ppGpp-синтетаз: длинного RSH-белка Relмsm и малой алармонсинтетазы RelZ.

3. Модель взаимодействия антибактериального соединения DMNP с белками-мишенями, разработанная с использованием молекулярного докинга, локализует его вероятное место связывания в консервативной области вблизи активного сайта синтетического домена (p)ppGpp-синтетаз обоих типов.

4. Ряд соединений для наиболее эффективного подавления бактериальной персистенции выявлен посредством виртуального скрининга библиотеки производных DMNP по критерию наименьшей энергии связывания на поверхности мишени.

5. Использование DMNP в комплексе с известными клиническими антибиотиками приводит к повышению эффективности их антибактериального действия.

Степень достоверности и апробация результатов. Теоретические положения, выдвинутые в данном исследовании, подвергнуты многоплановой экспериментальной проверке в различных дизайнах экспериментов в условиях in vivo, in vitro и in silico. Методы проведения исследований подробно изложены в работе, делая доступным воспроизведение результатов диссертации в независимых лабораториях. Полученные экспериментальные данные соответствуют современным представлениям о природе явления персистенции. Достоверность результатов подтверждается методами статистического анализа.

Результаты диссертационной работы представлены на 10 международных и межрегиональных научных конференциях: X Российская научная конференция с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург, 20-22 сентября 2023 г.), VI Всероссийская научная конференция с международным участием «Устойчивость растений и микроорганизмов к неблагоприятным факторам среды» (Иркутск, 37 июля 2023 г.), XIII Международный конгресс молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2022» (Пермь, 24-29 октября 2022 г.), The 3rd International Conference on Cell & Experimental Biology (Бостон, США, 18-20 апреля 2022 г.), Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты биоинформатики, биотехнологии и недропользования» (Пермь, 18-20 октября 2021 г.), 3-й Российский микробиологический конгресс (Псков, 26 сентября - 1 октября 2021 г.), XII Всероссийский конгресс молодых ученых-биологов с международным участием «Симбиоз-Россия 2020» (Пермь, 28-30 сентября 2020 г.), VI Всероссийская конференция с международным участием «Экобиотех» (Уфа, 1-4 октября 2019 г.), II Международная научная конференция «Высокие технологии, определяющие качество жизни» (Пермь, 17-19 сентября 2018 г.), Третья всероссийская молодежная научная школа-конференция с международным участием «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2-6 октября 2017 г.), Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Наукоемкие биомедицинские технологии: от фундаментальных исследований до внедрения» (Пермь, 4-6 июля 2016 г.).

Личное участие автора. Выбор направления диссертационной работы, ее цели и задач проводился автором совместно с научным руководителем - д.м.н., проф. А.Г. Ткаченко. Автором самостоятельно проведен анализ данных литературы по теме диссертации, а также осуществлена основная экспериментальная работа: конструирование генно-инженерных штаммов, наработка и очистка ферментов, проведение экспериментов, молекулярный докинг и

виртуальный скрининг, обработка экспериментальных данных, подготовка материалов научных публикаций. Часть экспериментов по изучению воздействия DMNP на микобактерий и подавлению активности полноразмерного RelMsm выполнена в соавторстве с сотрудниками лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН НМ. Кашеваровой и А.В. Аховой. Синтез DMNP, разработка библиотеки структур производных DMNP и исследования токсичности выполнены сотрудниками лаборатории органического синтеза Пермского государственного национального исследовательского университета. Личный вклад автора суммарно составляет более 80%.

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ: 5 работ в научных изданиях, индексируемых в базах Web of Science или Scopus, 4 работы в научных изданиях из перечня ВАК, 2 работы в научных изданиях, индексируемых только в РИНЦ.

Связь работы с научными программами. Данная работа проводилась при финансовой поддержке: 1) гранта Российского научного фонда «Разработка высокоактивных соединений против резистентных форм туберкулеза с новым механизмом действия» (№18-73-10156); 2) гранта УМНИК-2020 (Пермский край) «Разработка антибиотика, подавляющего персистенцию микобактерий и активного против туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью»; 3) проекта «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды» при поддержке Минобрнауки РФ (АААА-А19-119112290009-1).

Структура и объем диссертации. Полный объём диссертации составляет 134 страницы, включая 33 рисунка, 10 таблиц и 2 приложения. Список литературы содержит 210 источников. Основная часть диссертации включает 4 главы.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.м.н., профессору А.Г. Ткаченко за руководство научной работой, сотрудникам лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ А.В. Аховой, Н.М. Кашеваровой и Л.Ю. Нестеровой за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах работы, М.С. Шумкову из ИНБИ РАН за консультативную поддержку, а также исследователям лаборатории органического синтеза ПГНИУ за плодотворное сотрудничество.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Проблема устойчивости бактерий к антибиотикам

Согласно данным, представленным в отчете Всемирной организации здравоохранения, не менее 700 тысяч человек умирают каждый год из-за лекарственно-устойчивых инфекций. Треть этих смертей приходится на туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью [ВОЗ, 2019]. По статистике 2019 года в России у приблизительно 50% заболевших туберкулезом был диагностирован туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью [ЦМТ, 2020]. Штаммы туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью не реагируют по меньшей мере на изониазид и рифампицин, два наиболее часто используемых противотуберкулезных препарата первой линии, делая лечение этими антибиотиками неэффективным [Lemos, Matos, 2013].

В основе лекарственной устойчивости заложены два основных феномена: резистентность и персистенция. Резистентность к антибиотикам приводит к неэффективному лечению острой фазы инфекции, а персистенция бактерий часто является причиной рецидива инфекции [Lewis, 2010; Mandal et al., 2019; Boldrin et al., 2020], что особенно характерно для туберкулеза - доля рецидивов составляет около 20% [ЦМТ, 2020]. Высокий риск рецидива туберкулеза приводит к необходимости применять многомесячную терапию высокими дозами одновременно нескольких антибиотиков. При этом снижение продолжительности курса с 6 до 4 месяцев повышает риск рецидива в 2,5 раза [Grace et al., 2019]. Рецидив туберкулеза требует повторного курса с применением более дорогих препаратов второй линии, что приводит к многократному увеличению стоимости лечения и увеличивает нагрузку на организм пациента [Ягудина, Сороковиков, 2014].

Связь персистенции и рецидива инфекции может быть проиллюстрирована на примере туберкулезной инфекции. Туберкулез может протекать в активной форме, когда микобактерии размножаются в организме пациента, вызывая симптомы болезни и способствуя распространению инфекции, но также и в скрытой форме, когда бактерии сохраняются в легких носителя, не вызывая симптомов болезни [Gong, Wu, 2021]. В ходе лечения туберкулеза активно размножающаяся бактериальная популяция устраняется в ходе фазы интенсивной терапии. Однако затем требуется многомесячная фаза продолжения лечения, цель которой устранить латентную туберкулезную инфекцию с большим числом клеток-персистеров для предотвращения рецидива [Mandal et al., 2019]. Если штамм туберкулеза не проявляет резистентности, то используемые в клинической практике антибиотики будут относительно эффективны в первой фазе лечения: позволят подавить экспансивный рост бактерий и справиться с проявлениями болезни [Huaman, Sterling, 2019]. Однако в последующей фазе

продолжения лечения традиционные антибиотики часто оказываются неэффективны против покоящихся персистентных клеток, что приводит к большой доле рецидивов инфекции [Mandal et al., 2019]. Персистенция является одной из основных причин трудности лечения многих хронических инфекций: туберкулеза, рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей, брюшного тифа, стафилококковых инфекций и многих других заболеваний бактериальной природы [Salcedo-Sora, Kell, 2020].

1.1.1 Резистентность к антибиотикам

Резистентность к антибиотикам - это вариант нечувствительности бактерий к антибиотикам, основанный на наследуемых генетических механизмах адаптации к антибиотику, позволяющих бактериям активно размножаться при его воздействии [Brauner et al., 2016].

В случае резистентности в результате естественного отбора появляется новый штамм бактерии, который имеет генетические мутации или специализированные гены резистентности. В результате стойких изменений генотипа, приводящих к модификации мишени воздействия антибиотика, инактивации антибиотика или выбросу антибиотика из клетки при помощи эффлюксных насосов, резистентные клетки могут продолжать расти в присутствии значительных концентраций антибиотика, превышающих минимальную подавляющую концентрацию (МПК) чувствительного штамма [Hobson et al., 2021].

При инфекции, вызванной резистентным штаммом возбудителя, определенный антибактериальный препарат или группа препаратов оказываются неэффективными в лечении болезни - у пациента сохраняются основные симптомы острой фазы инфекции [Singh et al., 2020]. При резистентной инфекции возможно подобрать антибиотик из другого класса веществ, к которому резистентный штамм проявляет чувствительность [Pontali et al., 2019], или использовать комбинированную терапию, например ß-лактамный антибиотик с ингибитором ß-лактамаз [Tooke et al., 2019]. Однако всё чаще появляется информация о штаммах возбудителей с резистентностью к разным группам антибиотиков [Magiorakos et al., 2012].

Резистентность обусловлена изменениями генома бактерии и потому сохраняется в ряду поколений. Резистентность может быть врожденной и приобретенной. Врожденная резистентность подразумевает природную нечувствительность бактерии к определенным антибиотикам без необходимости изменения генома (например, бактерии рода микоплазм нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки). В случае приобретенной резистентности геном бактерии претерпевает изменения, позволяющие нивелировать воздействие антибиотика. Совокупность таких изменений образуют так называемый резистом бактерий [Hobson et al., 2021].

1.1.2 Персистенция бактерий

Персистенция бактерий - это вариант нечувствительности бактерий к антибиотикам, при котором в составе бактериальной популяции образуется субпопуляция клеток-персистеров, генетически идентичная основной популяции, но способная переживать воздействие антибиотика в нерастущем состоянии, а затем восстанавливать рост в благоприятной среде [Brauner et al., 2016].

В 1944 году Джозеф Биггер, врач из Дублинского университета, работал в военном госпитале в Йорке и проводил эксперименты с пенициллином на заре массового производства этого прорывного лекарства. Добавление пенициллина к культуре стафилококков приводило к видимому лизису бактерий, то есть к разрушению их клеточной оболочки и гибели клеток. Тем не менее Биггер посеял лизированную культуру на чашки, на которой выросло небольшое число колоний выживших клеток. После повторного пересева эти колонии вырастали в культуру, сохраняющую чувствительность к пенициллину. Однако в новой культуре вновь формировалась невосприимчивая к пенициллину субпопуляция, которую Биггер назвал «персистеры», чтобы отличить их от уже известных на тот момент резистентных клеток, которые при воздействии пенициллина не подвергались лизису после пересева [Bigger, 1944].

Клетка-персистер, в отличие от резистентной клетки, не имеет специализированных генов или мутаций для защиты от определённого антибиотика. Персистерные клетки формируются вследствие изменений на фенотипическом уровне: белковый состав, ферментативная активность белков, транскриптомный профиль, концентрация вторичных мессенджеров, топология ДНК, метаболизм [Balaban et al., 2004; Davis, Isberg, 2016]. Клетки-персистеры характеризуются замедлением метаболических процессов, что позволяет предотвратить повреждения при воздействии антибиотика [Wood et al., 2013]. В отличие от генетически обусловленной резистентности персистентный фенотип не наследуется в ряду поколений, поэтому при окончании действия антибиотика клетки-персистеры восстанавливают активный метаболизм и способность к росту и делению, сохраняя исходный генотип [Maisonneuve, Gerdes, 2014].

Клетки-персистеры представляют собой субпопуляцию - небольшую часть любой популяции бактерии (например 1 клетка-персистер на 10 тысяч обычных клеток). Даже в оптимальных условиях, позволяющих активный рост бактериальных клеток, в популяции образуются медленно растущие и нерастущие персистерные клетки [Grimbergen et al., 2015]. Такая адаптация представляет собой пример стратегии хеджирования: основная часть популяции делает ставку на экспансивный захват доступных источников питания, а небольшая доля персистерных клеток дает возможность страховки на случай, если фактор стресса появится в будущем [Kaldalu et al., 2016].

По имеющимся данным персистенция в большей или меньшей степени свойственна всем видам бактерий. Объединенный анализ имеющихся на 2020 год публикаций по теме персистенции, включивший 54 различных антибиотика и 36 видов бактерий, не обнаружил вида бактерий, неспособного к формированию клеток-персистеров [Salcedo-Sora, Kell, 2020]. Если резистентность свойственна лишь определенным штаммам, то к персистенции способен почти любой представитель вида бактерий.

Эффективность действия классических антибиотиков зависит не только от непосредственного взаимодействия с клеточной мишенью, но и от каскада последующих метаболических нарушений [Stokes et al., 2019]. Так, бактерицидные антибиотики ампициллин, канамицин и норфлоксацин воздействуют на разные мишени, но все они индуцируют образование гидроксильного радикала, способного вызывать нарушения макромолекул и приводить к гибели клеток, чего не наблюдается для бактериостатических антибиотиков [Kohanski et al., 2007]. Поэтому снижение активности мишени антибиотика может предотвратить накопление токсических метаболитов.

Действительно, многие бактерицидные антибиотики классифицируют как сильно зависимые от метаболического состояния бактерий [Zheng et al., 2020]. Зависимость активности антибиотика от скорости метаболизма продемонстрирована для различных классов антибиотиков (ß-лактамов, хинолонов и аминогликозидов) на примере медленнорастущих штаммов бактерий, проявляющих повышенную выживаемость и толерантность. Клетки-персистеры тоже формируют замедленный метаболизм, что защищает эти клетки от уничтожения при воздействии бактерицидных антибиотиков [Kester, Fortune, 2014]. Вследствие того, что мишенью большинства антибиотиков являются активно функционирующие клеточные элементы растущих клеток, персистерные клетки оказываются нечувствительными к действию антибиотика, в то время как активно растущие - чувствительными.

Однако существуют некоторые антибиотики (колистин, митомицин С), активность которых слабо зависит от метаболизма, в противоположность большинству сильно зависимых от метаболизма антибиотиков [Zheng et al., 2020]. Эти антибиотики способны проявлять активность в отношении персистентных и толерантных клеток. Такой эффект возникает, благодаря способности этих антибиотиков воздействовать на клеточную мембрану. Нарушение целостности мембран клеток приводит к образованию наименьшего числа персистеров среди всех механизмов действия антибиотиков [Salcedo-Sora, Kell, 2020]. Однако эти антибиотики применяются в клинической практике ограниченно и в низких дозах вследствие высокой неспецифической токсичности в отношении мембран эукариотических, а не только бактериальных клеток. Комбинации высоких доз сильно зависимых от метаболизма антибиотиков и слабо зависимых в низкой дозе могут стать одним из возможных решений проблемы персистенции [Zheng et al., 2020].

Тест на минимальную подавляющую концентрацию (МПК) неприменим для анализа персистенции, так как персистерные клетки не размножаются в присутствии антибиотика, но способны к выживанию в нерастущем состоянии [Brauner et al., 2018]. Персистенцию, как и толерантность, анализируют при помощи кривых отмирания в присутствии антибиотика (Рис. 1). В культуру бактерий добавляют антибиотик в концентрации выше МПК и наблюдают изменение числа выживших клеток в объеме культуры в зависимости от времени инкубации с антибиотиком. Нерезистентные, чувствительные к антибиотику клетки образуют двухфазную кривую, на которой первая фаза отражает интенсивное отмирание основной части популяции активно растущих клеток, а вторая фаза характеризуется медленным отмиранием небольшой фракции персистеров [Lewis, 2010].

Рисунок 1. Типичная кривая отмирания при воздействии бактерицидного антибиотика. При добавлении антибиотика (в точке 1) культура резистентного мутанта не отмирает и может демонстрировать рост, игнорируя антибактериальное воздействие. Большая часть клеток в культуре нерезистентного штамма дикого типа (WT) погибнет на раннем этапе воздействия (2) - это популяция обычных активно растущих клеток. Около 104 оставшихся клеток отмирают гораздо медленнее (3), а часть из них выживает вплоть до последнего часа инкубации с антибиотиком. Эти клетки относятся к популяции персистерных клеток, в данном примере в 10 000 раз меньшей, чем вся популяция в целом (108 клеток, выражаемых в КОЕ на мл). А/р-мутант имеет повышенную частоту образования персистеров. Источник: [Maisonneuve, Gerdes, 2014].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сидоров Роман Юрьевич, 2024 год

Источник

Релацин

E. coli (неакт.)1,

B. subtilis1,

D. radio-durans1 ,

B. anthracis1,

E. faecalis3, Clostridioides difficile4

RelA

(E. coli)1

242

Rel/Spo

(D. rad. )

1151

RelQ

(E. faec. ) (неакт.)2

653,6

RSHCd (C. diff.)4

4179

1Wexselblatt et al., 2012; 2Gaca et al., 2015; 3Yanling et al., 2018; 4Pokhrel et al., 2020

Aналог релацина 2d

RelA

(E. coli)

261

B. subtilis

941,8

Wexselblatt et al., 2013

Rel/Spo

(D. rad. )

1366

Витамин С

M. smegmatis

RelM

2713

176,1

Syal et al., 2017a

Aналог

релацина

AC

M. smegmatis, M. tuberculosis

RelM

451,4

Syal et al., 2017b

Aналог

релацина

AB

M. smegmatis, M. tuberculosis

RelM

47

421,5

Syal et al., 2017b

в8К-Х9 М. (иЬегсиЬ^ч^' Re1мtь (53-446) 16* 384,5 БШа et а1., 2019

БМЫР М. smegmatis Яе^, Re1мsm (1-457) 195 260,4 Tkachenko et а1., 2021; 81^ГОУ & Tkachenko, 2023; Эта работа

260; 303; 311

Re1мtь 362

*расчет из значения р1С50, приведенного авторами.

«неакт.» - ингибитор не проявляет активность в отношении данного вида или мишени.

В данной диссертационной работе экспериментально исследована активность соединения DMNP как в отношении полноразмерного белка Relмsm (Рис. 16), так и в отношении Relмsm, лишенного регуляторного домена (RelNTD) (Рис. 20). Тот факт, что DMNP сохраняет свою активность в отсутствие регуляторного домена, позволило локализовать наиболее вероятное место его связывания в гидролазном или синтетазном домене Relмsm.

Проведенные исследования ферментативной кинетики белков Relмsm и RelZ при воздействии ингибитора DMNP в диапазоне концентраций субстрата дали возможность установить тип ингибирования в отношении данных белков (Рис. 20, 21). БМЫР характеризуется неконкурентным типом ингибирования в отношении обоих алармонсинтетаз, то есть не конкурирует с субстратами АТФ и ГТФ/ГДФ за активный сайт синтетического домена. Описанные в литературе ингибиторы алармонсинтетаз, для которых проводились исследования ферментативной кинетики, обладают отличным от DMNP типом ингибирования: конкурентный тип у аналога релацина АС [Буа1 й а1., 2017Ь], смешанный тип у витамина С и аналога релацина АВ [Буа1 й а1., 2017а, Буа1 й а1., 2017Ь].

Концентрация полумаксимального ингибирования 1С 50 представляет собой показатель эффективности лиганда при ингибирующем взаимодействии. Более низкое значение 1С50 означает более высокую эффективность ингибитора по отношению к мишени. Однако прямое сравнение 1С50 различных ингибиторов возможно только применительно к одному белку-мишени при аналогичных условиях анализа [Kalliokoski et а1., 2013]. Этот принцип иллюстрируется тем фактом, что релацин имеет различные значения действующих концентраций для алармонсинтетаз разных видов (Таблица 9). По показателю 1С50 релацин оказался более активным в отношении к Re1A и Re1/Spo, чем его оптимизированное производное 2d, несмотря на то, что в концентрации 1 мМ 2d имеет больший процент

подавления активности, чем релацин [Wexselblatt et al., 2013]. DMNP оказался в 14 раз более активным ингибитором по отношению к белку RelMsm, чем витамин С. Однако по сравнению с производным релацина AB DMNP имеет в 4 раза меньшую IC50. Для проведения более детального сравнительного анализа ингибиторов необходимо иметь большее количество данных, полученных в одинаковых условиях.

Высокая молярная масса лекарственного соединения может привести к повышению липофильности и числа неспецифических взаимодействий, затруднить оптимизацию соединения, подразумевающую дальнейшее повышение молярной массы, снизить биодоступность конечного препарата [Lipinski, 2000]. Релацин и его аналог 2d имеют наибольшую молярную массу, значительно превышающую условную оптимальную отсечку в 500 г/моль [Lipinski et al., 1997], однако молярная масса аналогов релацина AC и AB, а также соединения X9 находится в оптимальных пределах (Таблица 9). DMNP обладает наименьшей молярной массой, за исключением слабого ингибитора витамина С, и потому допускает дальнейшую оптимизацию соединения, сопряженную с возрастанием молярной массы, с целью повышения специфичности к мишени и эффективности антибактериального действия.

Анализ комбинированного воздействия ингибитора алармонсинтетаз DMNP с антибиотиками, воздействующими на активно растущие клетки, показал, что комбинация с DMNP позволяет добиться большего снижения выживаемости клеток микобактерий и оптической плотности культуры, чем рифампицин или стрептомицин по отдельности (Рис. 27, 28). Другие ингибиторы алармонсинтетаз также показывали эффективность в комбинированном использовании. Так, релацин в связке с сублетальными концентрациями клиндамицина или метронидазола статистически значимо снижал оптическую плотность культуры C. difficile по сравнению с воздействием без релацина [Pokhrel et al., 2020]. Также релацин значимо повышал эффективность обработки биопленок E. faecalis в комбинации с гипохлоритом натрия [Yanling et al., 2018]. Ингибитор X9 снижал минимальную бактерицидную концентрацию изониазида в отношении M. tuberculosis в условиях голодания в 16 раз [Dutta et al., 2019]. Таким образом, DMNP, аналогично другим ингибиторам алармонсинтетаз, имеет перспективы использования в комбинированной терапии.

Исследования цитотоксичности релацина показали, что он практически не снижал выживаемость фибробластов и эпителиальных клеток в концентрации 14 мМ [Yanling et al., 2018]. Аналогичный результат был получен для производных релацина AC и AB в отношении эритроцитов в концентрации 220 мкг/мл. Кроме того, соединения были способны проникать в клетки эпителиальной клеточной линии легких человека, что имеет значение для достижения места действия при лечении легочного туберкулеза [Syal et al., 2017b]. X9 был отобран в скрининге на отсутствие токсичности в отношении к клеткам линии HepG2 [Dutta et al., 2019]. Исследования цитотоксичности DMNP продемонстрировали одно из его важных

положительных качеств, демонстрирующее отсутствие детектируемой подавляющей активности в отношении 9 различных линий клеток человека (Таблица 8).

Экспериментальные результаты в совокупности с предварительными расчетными данными, полученными при помощи построения модели молекулярного докинга, свидетельствуют о том, что DMNP связывается вблизи активного сайта синтетического домена в структурно сходных областях гомологичных белков, относящихся к суперсемейству RSH, посредством общего механизма, тем самым подавляя их (p)ppGpp-синтезирующую активность (Рис. 25). Мы использовали данную модель молекулярного докинга для проведения виртуального скрининга библиотеки структур производных DMNP с целью поиска оптимизированных производных для будущего химического синтеза (Рис. 26).

Практическая часть данной диссертационной работы была сосредоточена на анализе клеток и ферментов модельного организма M. smegmatis. Диапазон видов бактерий, относительно которых исследована активность DMNP, расширен посредством анализа фермента из M. tuberculosis. Кроме того, DMNP как ингибитор не только длинных RSH-белков, но и малых алармонсинтетаз имеет перспективы применения против бактериальных видов, имеющих более широкий набор (p)ppGpp-синтезирующих ферментов, таких как S. aureus, B. subtilis, E. faecalis и многих других.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование посвящено изучению механизма антимикобактериального действия нового соединения DMNP. В диссертационной работе обнаружена необычная динамика антибактериального действия DMNP на клетки M. smegmatis, зависящая от фазы роста периодической культуры. Наибольший антибактериальный эффект DMNP наблюдался в стационарной фазе периодической культуры и был минимальным в отношении клеток экспоненциальной фазы роста. Напротив, традиционные антибиотики (рифампицин, тетрациклин и стрептомицин), используемые в клинической практике, проявляют выраженную активность в отношении клеток экспоненциальной фазы, но не стационарной.

На основании обнаруженных свойств DMNP мы выдвинули гипотезу о том, что данное соединение может проявлять свойства ингибитора алармонсинтетаз. Для верификации гипотезы нами создан ряд генно-инженерных штаммов M. smegmatis: штамм с репортерным слиянием под контролем промотора гена relMsm; штаммы с плазмидами, способные к индуцируемой сверхэкспрессии RelMsm или RelZ; штаммы с одиночной или двойной делецией генов relMsm и relZ; штаммы с комплементацией делеций. Эксперименты с данными штаммами выявили ряд результатов:

• максимум экспрессии гена relMsm наблюдался в фазе роста периодической культуры, где наиболее выражен антибактериальный эффект DMNP;

• сверхэкспрессия белков RelMsm или RelZ приводит к снижению антибактериальной активности DMNP;

• активность DMNP усиливается в отношении нокаутных по relMsm и relZ штаммов пропорционально увеличению числа делеций;

• комплементация делеций в результате эктопической экспрессии с плазмид компенсирует их эффект на активность DMNP.

Эти результаты свидетельствуют о том, что мишенями воздействия DMNP в клетках M. smegmatis являются RelMsm и RelZ, (p)ppGpp-синтетазы M. smegmatis.

На следующем этапе работы с использованием экспрессионных плазмид E. coli и Ni-NTA-аффинной хроматографии (p)ppGpp-синтетазы RelMsm и RelZ из M. smegmatis и RelMtb из M. tuberculosis препаративно выделены в очищенном виде. Эксперименты in vitro продемонстрировали, что функциональная (p)ppGpp-синтезирующая активность исследованных белков снижалась пропорционально концентрации добавляемого DMNP. В ходе дальнейших экспериментов по влиянию добавления ингибитора DMNP на ферментативную кинетику RelMsm и RelZ, обнаружилось, что DMNP имеет неконкурентный механизм действия в отношении данных белков, что отличает его от описанных в литературе ингибиторов, имеющих конкурентный или смешанный механизм действия.

Результаты экспериментов in vitro и in vivo также были дополнены в исследованиях in silico. С использованием молекулярного докинга разработана модель взаимодействия DMNP как лиганда длинных RSH-белков и малых алармонсинтетаз. Согласно модели DMNP связывается с участком вблизи каталитического сайта синтетазного домена, блокируя продукцию (p)ppGpp.

На основании разработанной модели молекулярного докинга произведен виртуальный скрининг библиотеки структур производных DMNP, и по значениям энергии связывания определены наиболее перспективные кандидаты для их химического синтеза с целью дальнейшего развития представленной диссертационной работы в направлении разработки новых лекарственных средств для эффективного подавления персистенции микобактерий при туберкулезной инфекции.

Оценка эффективности комбинированного применения клинических антибиотиков и DMNP показали потенциал его применения для усиления антибиотикотерапии туберкулеза. Было показано, что использование DMNP в комплексе с рифампицином или стрептомицином приводит к усилению антибактериального эффекта в отношении устойчивых к действию антибиотиков клеток микобактерий стационарной фазы роста.

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что новое антибактериальное соединение DMNP является представителем класса ингибиторов алармонсинтетаз. Этот класс потенциально может иметь клиническое значение для борьбы с рецидивирующими бактериальными инфекциями, сложность лечения которых обусловлена в том числе механизмами, ассоциированными с алармонами (p)ppGpp: образованием клеток-персистеров и способностью к образованию биопленок.

ВЫВОДЫ

1. Антибактериальная активность DMNP в значительной степени зависит от фазы роста периодической культуры микобактерий. Наибольший антибактериальный эффект DMNP проявляется в ранней стационарной фазе роста. Это отличает его от традиционных антибиотиков, наиболее активных в отношении экспоненциально растущих клеток, но слабо действующих на клетки стационарной фазы.

2. Механизм антибактериального действия DMNP на микобактерии M. smegmatis основан на неконкурентном ингибировании активности алармонсинтетаз Relмsm и RelZ, ответственных за продукцию алармонов (p)ppGpp, которые участвуют в формировании клеток-персистеров. Это приводит к подавлению персистенции при переходе микобактериальных культур в стационарную фазу.

3. Построенная с использованием молекулярного докинга модель описывает взаимодействие DMNP с белками-мишенями в сайте связывания вблизи активного центра синтетического домена ферментов двух типов: длинных RSH-белков и малых алармонсинтетаз.

4. Посредством виртуального скрининга библиотеки структур производных DMNP проведен отбор перспективных соединений для создания на их основе лекарственных средств со способностью подавлять образование клеток-персистеров микобактерий, среди которых наиболее эффективной энергией связывания характеризуются соединения под шифром 27, 90 и 170.

5. Комбинированное использование DMNP в сочетании с применяемыми в клинике антибиотиками (рифампицин, стрептомицин) повышает эффективность их антибактериального действия в отношении культур микобактерий в стационарной фазе роста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Соединение DMNP имеет механизм действия, связанный с подавлением ферментативной активности (р)ррОрр-синтетаз бактерий. Данный механизм действия является перспективным с точки зрения подавления регуляторных путей, ассоциированных с адаптацией бактерий к условиям стресса. Полученные данные обуславливают необходимость расширенного поиска соединений, обладающих свойствами ингибиторов алармонсинтетаз, в том числе среди производных DMNP, а также поиска данного механизма действия у существующих антибиотиков.

При проведении микробиологических исследований новых антибактериальных соединений следует включать в анализ не только стандартные тесты на минимальную ингибирующую концентрацию, но и оценивать влияние ответа на стресс на антибактериальную активность соединения. В качестве фактора стресса рекомендуется использовать стационарную фазу периодической бактериальной культуры, поскольку в данной фазе бактериальная популяция в основном характеризуется повышенной долей персистентных и толерантных клеток. Наибольшим потенциалом для применения в антибиотикотерапии рецидивирующих инфекций характеризуются антибактериальные средства, сочетающие в себе активность против медленно растущих клеток стационарной фазы с антибактериальным воздействием на быстро растущие клетки экспоненциальной фазы.

Соединения с механизмом действия ингибиторов алармонсинтетаз, такие как DMNP, представляют потенциал для включения в состав комбинированной антибиотикотерапии. В этом случае применение конвенционального антибиотика направлено на устранение активно растущих клеток бактерии, в то время как добавление ингибитора алармонсинтетаз нацелено на подавление адаптивных реакций бактерии, в том числе толерантности, персистенции, формирования биопленок, вирулентности и других процессов, ассоциированных с молекулами

(р)ррОрр.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Продолжение исследований на данную тему может быть связано с несколькими основными направлениями:

• Расширенное исследование активности DMNP в отношении различных клинически значимых видов бактерий, каждый из которых обладает уникальным набором (р)ррОрр-синтетаз бактерий.

• Проведение доклинических и клинических исследований DMNP или его оптимизированных производных с целью регистрации лекарственного препарата.

• Поиск новых соединений с механизмом действия ингибиторов алармонсинтетаз с использованием разработанных методических подходов.

• Поиск дополнительного механизма действия ингибитора алармонсинтетаз у существующих и уже используемых в клинической практике антибактериальных препаратов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ДМСО - диметилсульфоксид ДТТ - дитиотреитол

ИПТГ - изопропил^^-1-тиогалактопиранозид

КОЕ - колониеобразующая единица

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МПК - минимальная подавляющая концентрация

п.о. - пар оснований

CTD - C-терминальный домен

DMNP - 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановая кислота

GPX - гуанозин 5'-дифосфат-2':3'-циклический монофосфат

MetOH - метанол

Msm - Mycolicibacterium smegmatis

Mtb - Mycobacterium tuberculosis

NTD - N-терминальный домен

OD - оптическая плотность

PBS - натрий-фосфатный буфер

PDB ID - идентификатор Protein Data Bank

(p)ppGpp - гуанозинпентафосфат и гуанозинтетрафосфат

(pp)pGpp - гуанозинпентафосфат, гуанозинтетрафосфат и гуанозин 5'-моно-3'-дифосфат PPK - полифосфаткиназа PPX - экзополифосфатаза

PVC - Planctomycetota, Verrucomicrobiota, Chlamydiota

RLU - относительные единицы света

RSH - гомолог RelA/SpoT (RelA/SpoT homolog)

SAH - малая алармонгидролаза

SAS - малая алармонсинтетаза

Seq - Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis SDS - додецилсульфат натрия

SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия VBNC - viable but nonculturable, жизнеспособные, но некультивируемые WT - wild type, дикий тип

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил^^-галактопиранозид

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов / Ткаченко, А.Г. - Екатеринбург: УрО РАН. - 2012. - 268 с.

Бухарин, О.В. Персистенция бактериальных патогенов как физиологический феномен // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. - 2008. - №1. - С. 6-13. Замахаев, М.В. Токсин-антитоксиновые системы и бактериальная персистенция (обзор) / Замахаев, М.В., Гончаренко, А.В., Шумков, М.С. // Прикладная биохимия и микробиология. -2019. - T. 55. - № 6. - С. 523-534.

ЦМТ, 2020 Федеральный центр мониторинга противодействия распространению туберкулеза в РФ. - Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации: Основные показатели по туберкулезу за 2019 год. - 2020.

Ягудина, Р.И. Фармакоэкономика туберкулеза: методологические особенности проведения исследований / Ягудина, Р.И., Сороковиков, И.В. // Фармакоэкономика: Теория и практика. -2014. - Т. 2. - №4.

Akhova, A.V. HPLC-UV method for simultaneous determination of adenosine triphosphate and its metabolites in Mycobacterium smegmatis / Akhova, A.V., Tkachenko, A.G. // Acta Chromatographica. - 2019. - V. 31. - №1. - P. 45-48.

Amato, S.M. Metabolic control of persister formation in Escherichia coli / Amato, S.M., Orman, M.A., Brynildsen, M.P. // Molecular Cell. - 2013. - V. 50. - №4. - P. 475-87.

Amato, S.M. Persister heterogeneity arising from a single metabolic stress / Amato, S.M., Brynildsen, M.P. // Current Biology. - 2015. - V. 25. - №16. - P. 2090-8.

Anderson, B.W. Evolution of (p)ppGpp-HPRT regulation through diversification of an allosteric oligomeric interaction / Anderson, B.W., Liu, K., Wolak, C., Dubiel, K., She, F., et al. // Elife. - 2019 -V. 8 - P. e47534.

Atkinson, G.C. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life / Atkinson, G.C., Tenson, T., Hauryliuk, V. // PLoS One. - 2011 - V. 6 - №8 - P. e23479.

Avarbock, D. Differential regulation of opposing RelMtb activities by the aminoacylation state of a tRNA.ribosome.mRNA.RelMtb complex / Avarbock, D., Avarbock, A., Rubin, H. // Biochemistry. -2000 - V. 39 - №38 - P. 11640-8.

Baba, T. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection / Baba, T. et al. // Molecular Systems Biology. - 2006. - V. 2. - P. 2006.0008. Bag, S. Mutational analysis of the (p)ppGpp synthetase activity of the Rel enzyme of Mycobacterium tuberculosis / Bag, S., Das, B., Dasgupta, S., Bhadra, R.K. // Archives of microbiology. - 2014. - V. 196. - №8. - P. 575-88.

Balaban, N.Q. Bacterial persistence as a phenotypic switch / Balaban, N.Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. // Science. - 2004. - V. 305. - №5690. - P. 1622-5.

Beljantseva, J. Molecular mutagenesis of ppGpp: turning a RelA activator into an inhibitor / Beljantseva, J., Kudrin, P., Jimmy, S., Ehn, M., Pohl, R., Varik, V., Tozawa, Y., Shingler, V., Tenson, T., Rejman, D., Hauryliuk, V. // Nature Scientific Reports. - 2017. - V. 7. - P. 41839. Bhaskar, A. Elucidating the role of (p)ppGpp in mycobacterial persistence against antibiotics / Bhaskar, A., De Piano, C., Gelman, E., McKinney, J.D., Dhar, N. // IUBMB Life. - 2018. - V. 70. -№9. - P. 836-844.

Bigger, J. W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation / Lancet. - 1944. - V. 244. - P. 497-500.

Blokpoel, M.C.J. Tetracycline-inducible gene regulation in mycobacteria / Blokpoel, M.C.J., Murphy, H.N., O'Toole, R., Wiles, S., Runn, E.S.C., Stewart, G.R., Young, D.B., Robertson, B.D. // Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33. - №2. - P. e22.

Boniecka, J. Within and beyond the stringent response-RSH and (p)ppGpp in plants / Boniecka, J., Prusinska, J., D^browska, G.B., Goc, A. // Planta. - 2017. - V. 246. - №5. - P. 817-842.

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

Boldrin, F. Tolerance and persistence to drugs: a main challenge in the fight against Mycobacterium tuberculosis / Boldrin, F., Provvedi, R., Cioetto Mazzabo, L., Segafreddo, G., Manganelli, R. // Frontiers in microbiology. - 2020. - V. 11. - P. 1924.

Brauner, A. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment / Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N.Q. // Nature Reviews Microbiology. - 2016. -V. 14. -P. 320-330.

Bremer, H. Modulation of chemical composition and other parameters of the cell at different exponential growth rates / Bremer, H., Dennis, P.P. // EcoSal Plus. - 2008. - V. 3. - №1. Burgos, H.L. Roles of transcriptional and translational control mechanisms in regulation of ribosomal protein synthesis in Escherichia coli / Burgos, H.L., O'Connor, K., Sanchez-Vazquez, P., Gourse, R.L. // Journal of bacteriology. - 2017. - V. 199. - №21. - P. e00407-17.

Cashel, M. Two compounds implicated in the function of the RC gene of Escherichia coli / Cashel, M., Gallant, J. // Nature. - 1969. - V. 221. - №5183. - P. 838-41.

Chakaya, J. Global tuberculosis report 2020 - Reflections on the global TB burden, treatment and prevention efforts / Chakaya, J., Khan, M., Ntoumi, F., et al. // International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases. - 2021. - V. 113. - P. S7-S12.

Chen, S. A marine antibiotic kills multidrug-resistant bacteria without detectable high-level resistance / Chen, S., Liu, D., Zhang, Q., Guo, P., Ding, S. et al. // ACS infectious diseases. - 2021. - V. 7. - №4.

- P. 884-893.

Chowdhury, N. Persistence increases in the absence of the alarmone guanosine tetraphosphate by reducing cell growth / Chowdhury, N., Kwan, B.W., Wood, T.K. // Scientific Reports. - 2016. - V. 6- P. 20519.

Christensen, S.B. Natural products that changed society / Biomedicines. - 2021. - V. 9. - №5. - P. 472.

Cohen, N.R. Microbial persistence and the road to drug resistance / Cohen, N.R., Lobritz, M.A., Collins, J.J. // Cell host & microbe. - 2013. - V. 13. - №6. - P. 632-42.

Coppa, C. New chemotypes for the inhibition of (p)ppGpp synthesis in the quest for new antimicrobial compounds / Coppa, C., Sorrentino, L., Civera, M. // Molecules. - 2022. - V. 27. - №10.

- P. 3097.

Corrigan, R.M. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria / Corrigan, R.M., Bellows, L.E., Wood, A., Gründling, A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2016. - V. 113. -№12. - P. E1710-9.

Dahl, J. The role of RelMtb-mediated adaptation to stationary phase in long-term persistence of Mycobacterium tuberculosis in mice / Dahl, J., Kraus, C.N., Boshoff, H.I., Doan, B., Foley, K., Avarbock, D. et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - 100, 10026-10031. - DOI: 10.1073/pnas.1631248100a.

Dahl, J. The relA homolog of Mycobacterium smegmatis affects cell appearance, viability, and gene expression / Dahl, J., Arora, K., Boshoff, H.I. et al. // Journal of bacteriology. - 2005. - V. 187. - №7.

- P. 2439-2447.

Danchik, C. Targeting the Mycobacterium tuberculosis stringent response as a strategy for shortening tuberculosis treatment / Danchik, C., Wang, S., Karakousis, P.C. // Frontiers in microbiology. - 2021. -V. 12. - P. 744167.

Dasgupta, S. Genetic and mutational characterization of the small alarmone synthetase gene relV of Vibrio cholerae/ Dasgupta, S., Basu, P., Pal, R.R., Bag, S., Bhadra, R.K. // Microbiology (Reading). -2014. - V. 160. - №9. - P. 1855-1866.

Davis, K.M. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches / Davis, K.M., Isberg, R.R. // Bioessays. - 2016. - V. 38. - №8. - P. 782-90.

Diez, S. The alarmones (p)ppGpp directly regulate translation initiation during entry into quiescence / Diez, S., Ryu, J., Caban, K., Gonzalez, R.L. Jr., Dworkin, J. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2020. - V. 117. - №27. - P. 15565-15572.

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

Don, R. "Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification / Don, R., Cox, P., Wainwright, B., Baker, K., Mattick, J. // Nucleic Acids Research. - 1991. - V. 19. - №14. - P. 4008. Dörr, T. Ciprofloxacin causes persister formation by inducing the TisB toxin in Escherichia coli / Dörr, T., Vuli, C.M., Lewis, K. // PLoS Biology. - 2010. - V. 8. - №2. - P. e1000317. Dutta, N.K. Inhibiting the stringent response blocks Mycobacterium tuberculosis entry into quiescence and reduces persistence / Dutta, N.K., Klinkenberg, L.G., Vazquez, M.-J. et al. // Science advances. - 2019. - V. 5. - №3. - P. eaav2104.

Ehrt, S. Metabolic principles of persistence and pathogenicity in Mycobacterium tuberculosis / Ehrt, S., Schnappinger, D., Rhee, K.Y. // Nature reviews. Microbiology. - 2018. - V. 16. - №8. - P. 496-507. Fernandez-Coll, L. The absence of (p)ppGpp renders initiation of Escherichia coli chromosomal DNA synthesis independent of growth rates / Fernandez-Coll, L., Maciag-Dorszynska, M., Tailor, K., Vadia, S., Levin, P.A., Szalewska-Palasz, A., Cashel M. // mBio. - 2020. - V. 11. - №2. - P. e03223-19.

Friesner, R.A. Extra precision Glide: docking and scoring incorporating a model of hydrophobic enclosure for protein-ligand complexes / Friesner, R.A., Murphy, R.B., Repasky, M.P. et al. // Journal of medicinal chemistry. - 2006. - V. 49. - P. 6177-6196.

Gaal, T. Guanosine 3'-diphosphate 5'-diphosphate is not required for growth rate-dependent control of rRNA synthesis in Escherichia coli / Gaal, T., Gourse, R.L. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1990. - V. 87. - №14. - P. 5533-7.

Gaca, A.O. From (p)ppGpp to (pp)pGpp: Characterization of regulatory effects of pGpp synthesized by the small alarmone synthetase of Enterococcus faecalis / Gaca, A.O., Kudrin, P., Colomer-Winter, C., Beljantseva, J. Liu, K., Anderson, B., et al. // Journal of bacteriology. - 2015. - V. 197. - №18. - P. 2908-19.

Galindo-Murillo, R. Ethidium bromide interactions with DNA: an exploration of a classic DNA-ligand complex with unbiased molecular dynamics simulations / Galindo-Murillo, R., Cheatham, T.E. // Nucleic acids research. - 2021. - V. 49 - №7 - P. 3735-3747.

Giramma, C.N. The alarmone (p)ppGpp regulates primer extension by bacterial primase / Giramma, C.N., DeFoer, M.B., Wang, J.D. // Journal of molecular biology. - 2021. - V. 433. - №19. - P. 167189. Gong, W. Differential diagnosis of latent tuberculosis infection and active tuberculosis: a key to a successful tuberculosis control strategy / Gong, W., Wu, X. // Frontiers in microbiology. - 2021. - V. 12. - P. 745592.

Goude, R. Electroporation of mycobacteria / Goude, R., Roberts, D.M., Parish, T. //. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). - 2015. - V. 1285. - P. 117-30.

Grace, A.G. Shortened treatment regimens versus the standard regimen for drug-sensitive pulmonary tuberculosis / Grace A.G. et al. // The Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2019. - V. 12. - P. CD012918.

Gratani, F.L. Regulation of the opposing (p)ppGpp synthetase and hydrolase activities in a bifunctional RelA/SpoT homologue from Staphylococcus aureus / Gratani, F.L., Horvatek, P., Geiger, T., et al. // PLoS genetics. - 2018. - V. 14. - №7. - P. e1007514.

Grimbergen, A.J. Microbial bet-hedging: the power of being different / Grimbergen, A.J., Siebring, J., Solopova, A., Kuipers, O.P. // Current opinion in microbiology. - 2015. - V. 25. - P. 67-72. Gupta, K.R. Novel functions of (p)ppGpp and cyclic di-GMP in mycobacterial physiology revealed by phenotype microarray analysis of wild-type and isogenic strains of Mycobacterium smegmatis / Gupta, K.R., Kasetty, S., Chatterji, D. // Applied and environmental microbiology. - 2015. - V. 81. -№7. - P. 2571-8.

Gupta, K.R. Stringent response in mycobacteria: from biology to therapeutic potential / Gupta, K.R.,

Arora, G., Mattoo, A., Sajid, A. // Pathogens. - 2021. - V. 10. - №11. - P. 1417.

Harms, A. Mechanisms of bacterial persistence during stress and antibiotic exposure / Harms, A.,

Maisonneuve, E., Gerdes, K. // Science. - 2016. - V. 354. - №6318. - P. aaf4268.

Harrison, J. J. The chromosomal toxin gene yafQ is a determinant of multidrug tolerance for

Escherichia coli growing in a biofilm / Harrison, J. J., Wade, W. D., Akierman, S. et al. //.

Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2009. - V. 53. - P. 2253-2258.

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

Henry, T.C. Development of Persister-FACSeq: a method to massively parallelize quantification of persister physiology and its heterogeneity / Henry, T.C., Brynildsen, M.P. // Scientific reports. - 2016.

- V. 6. - P. 25100.

Herigstad, B. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria / Herigstad, B.,

Hamilton, M., Heersink, J. // Journal of Microbiological Methods. - 2001. - V. 44. - №2. - P. 121-9.

Hobbs, J.K. (p)ppGpp and the stringent response: an emerging threat to antibiotic therapy / Hobbs,

J.K., Boraston, A.B. // ACS infectious diseases. - 2019. - V. 5. - №9. - P. 1505-1517.

Hobson, C. The antibiotic resistome: a guide for the discovery of natural products as antimicrobial

agents / Hobson, C., Chan, A.N., Wright, G.D. // Chemical Reviews. - 2021. - V. 121. - №6. - P.

3464-3494.

Hogg, T. Conformational antagonism between opposing active sites in a bifunctional RelA/SpoT

homolog modulates (p)ppGpp metabolism during the stringent response / Hogg, T., Mechold, U.,

Malke, H., Cashel, M., Hilgenfeld, R. // Cell. - 2004. - V. 117. - №1. - P. 57-68.

Hong, S.H. Bacterial persistence increases as environmental fitness decreases / Hong, S.H., Wang,

X.,O'Connor, H.F.,Benedik, M.J.,Wood, T.K. // Microbial biotechnology. - 2012. - V. 5. - №4. - P.

509-522.

Hu, Y. High-dose rifampicin kills persisters, shortens treatment duration, and reduces relapse rate in vitro and in vivo / Hu, Y., Liu, A., Ortega-Muro, F., Alameda-Martin, L., Mitchison, D., Coates, A. // Frontiers in microbiology. - 2015. - V. 6. - P. 641.

Huaman, M.A. Treatment of Latent Tuberculosis Infection-An Update / Huaman, M.A., Sterling, T.R. // Clinics in chest medicine. - 2019. - V. 40. - №4. - P. 839-848.

Incerti-Pradillos, C.A. Asymmetric total synthesis of (-)-erogorgiaene and its C-11 epimer and investigation of their antimycobacterial activity / Incerti-Pradillos, C.A., Kabeshov, M.A., O'Hora, P.S., Shipilovskikh, S.A., Rubtsov, A.E. et al. // Chemistry. - 2016. - V. 22. - №40. - P. 14390-6. Irving, S.E. The stringent response and physiological roles of (pp)pGpp in bacteria / Irving, S.E., Choudhury, N.R., Corrigan, R.M. // Nature reviews. Microbiology. - 2021. - V. 19. - №4. - P. 256271.

Ito, D. ppGpp functions as an alarmone in metazoa / Ito, D., Kawamura, H., Oikawa, A. et al. // Communications biology. - 2020. - V. 3. - №1. - P. 671.

Izutsu, K. Expression of ribosome modulation factor (RMF) in Escherichia coli requires ppGpp / Izutsu, K., Wada, A., Wada, C. // Genes to cells: devoted to molecular & cellular mechanisms. - 2001.

- V. 6. - №8. - P. 665-76.

Jain, V. Molecular dissection of the mycobacterial stringent response protein Rel / Jain, V., Saleem-Batcha, R., China, A., Chatterji, D. // Protein science: a publication of the Protein Society. - 2006. - V. 15. - №6. - P. 1449-64.

Kaldalu, N. Persisters - as elusive as ever / Kaldalu, N., Hauryliuk, V., Tenson, T. // Applied microbiology and biotechnology. - 2016. - V. 100. - №15. - P. 6545-6553.

Kalliokoski, T. Comparability of mixed IC50 data - a statistical analysis / Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - №4. - P. e61007.

Kendall, S. L. Construction of targeted mycobacterial mutants by homologous recombination / Kendall, S. L., Frita, R. // Mycobacteria Protocols. - 2008. - V. 20. - P. 297-310. Kenny, P.W. The nature of ligand efficiency / Journal of Cheminformatics. - 2019. - V. 11. - P. 8. Keren, I. Persister cells and tolerance to antimicrobials / Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. // FEMS Microbiology Letters. - 2004. - V. 230. - P. 13-18.

Kerr, R.G. Elucidation of the biosynthetic origin of the anti-inflammatory pseudopterosins / Kerr, R.G., Kohl, A.C., Ferns, T.A. // Journal of industrial microbiology & biotechnology. - 2006. - V. 33. -№7. - P. 532-8.

Kester, J.C. Persisters and beyond: mechanisms of phenotypic drug resistance and drug tolerance in bacteria / Kester, J.C., Fortune, S.M. // Critical reviews in biochemistry and molecular biology. - 2014.

- V. 49. - №2. - P. 91-101.

Kim, H.Y. Guanosine tetra- and pentaphosphate increase antibiotic tolerance by reducing reactive oxygen species production in Vibrio cholerae / Kim, H.Y., Go, J., Lee, K.M., Oh, Y.T., Yoon, S.S. // The Journal of biological chemistry. - 2018. - V. 293. - №15. - P. 5679-5694.

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

Kim, J.-S. Persistent persister misperceptions / Kim, J.-S., Wood, T.K. // Frontiers in microbiology. -2016. - V. 7. - P. 2134.

Klinkenberg, L.G. The stringent response is required for full virulence of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs / Klinkenberg, L.G., Lee, J., Bishai, W.R., Karakousis, P.C. // The Journal of infectious diseases. - 2010. - V. 202. - P. 1397-1404.

Kohanski, M.A. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics / Kohanski, M.A., Dwyer, D.J., Hayete, B., Lawrence, C.A., Collins, J.J. // Cell. - 2007. - V. 130. - №5. - P. 797-810.

Korch, S.B. Characterization of the hipA 7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis / Korch, S.B., Henderson, T.A., Hill, T.M. // Molecular microbiology. - 2003. - V. 50. - №4. - P. 1199-213.

Krishnan, S. R-loop induced stress response by second (p)ppGpp synthetase in Mycobacterium smegmatis: functional and domain interdependence / Krishnan, S., Petchiappan, A., Singh, A., Bhatt, A., Chatterji, D. // Molecular microbiology. - 2016. - V. 102. - №1. - P. 168-82. Kushwaha, G.S. Stringent response protein as a potential target to intervene persistent bacterial infection / Kushwaha, G.S., Oyeyemi, B.F., Bhavesh, N.S. // Biochimie. - 2019. - V. 165. - P. 67-75. Kushwaha, G.S. Structural analysis of (p)ppGpp reveals its versatile binding pattern for diverse types of target proteins / Kushwaha, G.S., Patra, A., Bhavesh, N.S. // Frontiers in microbiology. - 2020. - V. 11. - P. 575041.

Kwan, B.W. Arrested protein synthesis increases persister-like cell formation / Kwan, B.W., Valenta, J A., Benedik, M.J., Wood, T.K. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2013. - V. 57. - №3. - P. 1468-1473.

Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / Nature. - 1970. - V. 227. - №5259. - P. 680-685.

Lemos, A.C. Multidrug-resistant tuberculosis / Lemos, A.C., Matos, E.D. // The Brazilian journal of infectious diseases: an official publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases. - 2013. - V. 17. - №2. - P. 239-46.

Levin-Reisman, I. Antibiotic tolerance facilitates the evolution of resistance / Levin-Reisman, I., Ronin, I., Gefen, O., Braniss, I., Shoresh, N., Balaban, N.Q. // Science. - 2017. - V. 355. - №6327. - P. 826-830.

Lewis, K. Persister cells / The Annual Review of Microbiology. - 2010. - V. 64. - P. 357-72.

Li, Y. Bedaquiline and delamanid in the treatment of multidrug-resistant tuberculosis: Promising but

challenging / Li, Y., Sun, F., Zhang, W. // Drug development research. - 2019. - V. 80. - №1. - P. 98-1

05.

Lin, C.C. The regulation of ferroptosis by MESH1 through the activation of the integrative stress response / Lin, C.C., Ding, C.C., Sun, T., Wu, J., et al. // Cell death & disease. - 2021. - V. 12. - №8. -P. 727.

Lipinski, C.A. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings / Lipinski, C.A., Lombardo, F., Dominy, B.W., Feeney, P.J. // Advanced drug delivery reviews. - 1997. - V. 23. - №1-3. - P. 3-25.

Lipinski, C.A. Drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability / Journal

of pharmacological and toxicological methods. - 2000. - V. 44. - №1. - P. 235-49.

Liu, H. Influence of (p)ppGpp on biofilm regulation in Pseudomonas putida KT2440 / Liu, H., Xiao,

Y., Nie, H., Huang, Q., Chen, W. // Microbiological research. - 2017. - V. 204. - P. 1-8.

Luidalepp, H. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of

mutations implicated in altered persistence / Luidalepp, H., Joers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. // Journal

of bacteriology. - 2011. - V. 193. - P. 3598-3605.

Magiorakos, A.-P. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance / Magiorakos et al. // Clinical microbiology and infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - 2012. - V. 18. - №3. - P. 268-81.

97 Maisonneuve, E. (p)ppGpp controls bacterial persistence by stochastic induction of toxin-antitoxin activity / Maisonneuve, E., Castro-Camargo, M., Gerdes, K. // Cell. - 2013. - V. 154. - №5. - P. 11401150. - Ретракция: Cell. 2018-02-22 V. 172 №5 P. 1135.

98 Maisonneuve, E. Molecular mechanisms underlying bacterial persisters / Maisonneuve, E., Gerdes, K. // Cell. - 2014. - V. 157. - №3. - P. 539-48.

99 Manav, M.C. Structural basis for (p)ppGpp synthesis by the Staphylococcus aureus small alarmone synthetase RelP / Manav, M.C., Beljantseva, J., Bojer, M.S., Tenson, T., Ingmer, H., Hauryliuk, V., Brodersen, D.E. // The Journal of biological chemistry. - 2018. - V. 293. - №9. - P. 3254-3264.

100 Mandal, S. The relevance of persisters in tuberculosis drug discovery / Mandal, S., Njikan, S., Kumar, A., Early, J.V., Parish, T. // Microbiology. - 2019. - V. 165. - №5. - P. 492-499.

101 Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual / Maniatis, T., Green, M.R., Sambrook, J. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2001. - Изд. 4-е. - P. 32-34, 84-87, 119-122.

102 Maciag, M. ppGpp inhibits the activity of Escherichia coli DnaG primase / Maciag, M., Kochanowska, M., Lyzen, R., Wegrzyn, G., Szalewska-Palasz, A. // Plasmid. - 2010. - V. 63. - №1. - P. 61-7.

103 Mechold, U. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli / Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K.S., Cashel, M. // Nucleic Acids Research. - 2013. - V. 41. -№12. - P. 6175-89.

104 Merrikh, H. Growth phase and (p)ppGpp control of IraD, a regulator of RpoS stability, in Escherichia coli / Merrikh, H., Ferrazzoli, A.E., Lovett, S T. // Journal of bacteriology. - 2009. - V. 191. - №24. - P. 7436-46.

105 Mohan, A. Complete genome sequences of a Mycobacterium smegmatis laboratory strain (MC2155) and isoniazid-resistant (4XR1/R2) mutant strains / Mohan, A., Padiadpu, J., Baloni, P., Chandra, N. // Genome announcements. - 2015. - V. 3. - №1. - P. e01520-14.

106 Mok, W.W. Impacts of global transcriptional regulators on persister metabolism / Mok, W.W., Orman, M.A., Brynildsen, MP. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2015. - V. 59. - №5. - P. 2713-9.

107 Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of immunological methods. - 1983. 65(1-2):55-63.

108 Moyed, H.S. hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis / Moyed, H.S., Bertrand, K. // Journal of bacteriology.

- 1983. - V. 155. - №2. - P. 768-775.

109 Murakami, K.S. Structural biology of bacterial RNA polymerase / Biomolecules. - 2015. - V. 5. -№2. - P. 848-64.

110 Murdeshwar, M.S. MS_RHII-RSD, a dual-function RNaseHII-(p)ppGpp-synthetase from Mycobacterium smegmatis / Murdeshwar, M.S., Chatterji, D. // Journal of bacteriology. - 2012. - V. 194. - №15. - P. 4003-14.

111 Nanamiya, H. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis / Nanamiya, H., Kasai, K., Nozawa, A., Yun, C.S., et al. // Molecular microbiology. - 2008. -V. 67. - №2. - P. 291-304.

112 Nguyen, D. Active starvation responses mediate antibiotic tolerance in biofilms and nutrient-limited bacteria / D. Nguyen [et al.] // Science. - 2011. - V. 334. - P. 982-986.

113 Niederweis, M. Mycobacterial outer membranes: in search of proteins / Niederweis, M., Danilchanka, O., Huff, J., Hoffmann, C., Engelhardt, H. // Trends in microbiology. - 2010. - V. 18. - №3. - P. 10916.

114 Njire, M. Pyrazinoic acid inhibits a bifunctional enzyme in Mycobacterium tuberculosis / Njire, M., Wang, N., Wang, B. et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2017. - V. 61. - №7. - P. e00070-17.

115 Ojha, A.K. High intracellular level of guanosine tetraphosphate in Mycobacterium smegmatis Changes the morphology of the bacterium / Ojha, A.K., Mukherjee, T.K., Chatterji, D. // Infection and immunity.

- 2000. - V. 68. - №7. - P. 4084-4091.

116 Orman, M.A. Dormancy is not necessary or sufficient for bacterial persistence / Orman, M.A., Brynildsen, M P. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2013. - V. 57. - №7. - P. 3230-3239.

117 Osbourne, D.O. Polyphosphate, cyclic AMP, guanosine tetraphosphate, and c-di-GMP reduce in vitro Lon activity / Osbourne, D.O., Soo, V.W.C., Konieczny, I., Wood, T.K. // Bioengineered. - 2014. - V. 5.

- №4. - P. 264-268.

118 Pacios, O. (p)ppGpp and its role in bacterial persistence: new challenges / Pacios, O., Blasco, L., Bleriot, I. et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2020. - V. 64. - №10. - P. e01283-20.

119 Palmer, A.C. Opposing effects of target overexpression reveal drug mechanisms / Palmer, A.C., Kishony, R. // Nature communications. - 2014. - V. 5. - P. 4296.

120 Parish, T. Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement / Parish, T., Stoker, N.G. // Microbiology (Reading). - 2000. - V. 146. - №8. - P. 1969-1975.

121 Pedersen, F.S. Analysis of the relA gene product of Escherichia coli / Pedersen, F.S., Kjeldgaard, N.O. // European journal of biochemistry. - 1977. - V. 76. - P. 91-97.

122 Pelicic, V. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria / Pelicic, V., Reyrat, J.-M., Gicquel, B. // Journal of bacteriology. - 1996. - . V. 178. - №4. - P. 11971199.

123 Petchiappan, A. RelZ-mediated stress response in Mycobacterium smegmatis: pGpp synthesis and its regulation / Petchiappan, A., Naik, S.Y., Chatterji, D. // Journal of bacteriology. - 2020. - V. 202. - №2.

- P. e00444-19.

124 Pokhrel, A. The (p)ppGpp synthetase RSH mediates stationary-phase onset and antibiotic stress survival in Clostridioides difficile / Pokhrel, A., Poudel, A., Castro, K.B., Celestine, M.J., Oludiran, A., et al. // Journal of bacteriology. - 2020. - V. 202. - №19. - P. :e00377-20.

125 Pontali, E. Regimens to treat multidrug-resistant tuberculosis: past, present and future perspectives / Pontali, E., Raviglione, M.C., Migliori, G.B. // European respiratory review: an official journal of the European Respiratory Society. - 2019. - V. 28. - №152. - P. 190035.

126 Potrykus, K. ppGpp is the major source of growth rate control in E. coli / Potrykus, K., Murphy, H., Philippe, N., Cashel, M. // Environmental microbiology. - 2011. - V. 13. - №3. - P. 563-575.

127 Prax, M. Metabolic aspects of bacterial persisters / Prax, M., Bertram, R. // Frontiers in cellular and infection microbiology. - 2014. - V. 4. - P. 148.

128 Primm, T.P. The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long-term survival / Primm, T.P., Andersen, S.J., Mizrahi, V., Avarbock, D., Rubin, H., Barry, C.E. // Journal of bacteriology. - 2000. - V. 182. - №17. - P. 4889-4898.

129 Prusa, J. The stringent response and Mycobacterium tuberculosis pathogenesis / Prusa, J., Zhu, D.X., Stallings, C.L. // Pathogens and disease. - 2018. - V. 76. - №5. - P. fty054.

130 Pu, Y. ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance / Pu, Y., Li, Y., Jin, X., Tian, T., Qi, M., et al. // Molecular Cell. - 2019. - V. 73. - P. 143-156.

131 Quinting, B. Purification and properties of the Mycobacterium smegmatis mc(2)155 beta-lactamase / Quinting, B., Galleni, M., Timm, J., Gicquel, B., Amicosante, G., Frère, J.M. // FEMS microbiology letters. - 1997. - V. 149. - №1. - P. 11-5.

132 Rodionov, D.G. Direct correlation between overproduction of guanosine 3',5'-bispyrophosphate (ppGpp) and penicillin tolerance in Escherichia coli / Rodionov, D.G., Ishiguro. E.E. // Journal of bacteriology. - 1995. - V. 177. - №15. - P. 4224-9.

133 Rodriguez, A.D. Serrulatane diterpenes with antimycobacterial activity isolated from the West Indian sea whip Pseudopterogorgia elisabethae / Rodriguez, A.D., Ramirez, C. // Journal of natural products.

- 2001. - V. 64. - №1. - P. 100-2.

134 Roghanian, M. (p)ppGpp controls stringent factors by exploiting antagonistic allosteric coupling between catalytic domains / Roghanian, M., Van Nerom, K., Takada, H., et al. // Molecular Cell. -2021. - V. 81. - P. 3310-3322.

135 Ronneau, S. Make and break the alarmone: regulation of (p)ppGpp synthetase/hydrolase enzymes in bacteria / Ronneau, S., Hallez, R. // FEMS microbiology reviews. - 2019. - V. 43. - №4. - P. 389-400.

136 Sajish, M. A charge reversal differentiates (p)ppGpp synthesis by monofunctional and bifunctional Rel proteins / Sajish, M., Tiwari, D., Rananaware, D., Nandicoori, V.K., Prakash, B. // The Journal of biological chemistry. - 2007. - V. 282. - №48. - P. 34977-83.

137 Sala, A. Multiple toxin-antitoxin systems in Mycobacterium tuberculosis / Sala, A., Bordes, P., Genevaux, P. // Toxins. - 2014. - V. 6. - №3. - P. 1002-1020.

138 Salcedo-Sora, J. E. A quantitative survey of bacterial persistence in the presence of antibiotics: towards antipersister antimicrobial discovery/ Salcedo-Sora, J. E., Kell, D.B. // Antibiotics. - 2020. - V. 9. - №8. - P. 508.

139 Salzer, A. Small alarmone synthetases RelP and RelQ of Staphylococcus aureus are involved in biofilm formation and maintenance under cell wall stress conditions / Salzer, A., Keinhörster, D., Kästle, C., Kästle, B., Wolz, C. // Frontiers in microbiology. - 2020. - V. 11. - P. 575882.

140 Sánchez-Linares, I. High-throughput parallel blind virtual screening using BINDSURF / Sánchez-Linares, I., Pérez-Sánchez, H., Cecilia, J.M., García, J.M. // BMC Bioinformatics. - 2012. - V. 13. - P. S13.

141 Sebastian, J. De novo emergence of genetically resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis from the persistence phase cells formed against antituberculosis drugs in vitro / Sebastian, J. et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2017. - V. 61. - №2. - P. e01343-16.

142 Shan, Y. Genetic basis of persister tolerance to aminoglycosides in Escherichia coli / Shan, Y., Lazinski, D., Rowe, S., Camilli, A., Lewis, K. // mBio. - 2015. - V. 6. - №2. - P. e00078-15.

143 Shan, Y. ATP-dependent persister formation in Escherichia coli / Shan, Y., Gandt, A.B., Lewis, K. et al. // mBio. - 2017. - V. 8. - №1. - P. e02267-16.

144 Shin, J. Atomic structure of, and valine binding to the regulatory ACT domain of the Mycobacterium tuberculosis Rel protein / Shin, J., Singal, B., Manimekalai, M.S.S., Chen, M.W., Ragunathan, P., Grüber, G. // The FEBS journal. - 2021. - V. 288. - №7. - P. 2377-2397.

145 Sidorov, R.Yu. DMNP, a synthetic analog of erogorgiaene, inhibits the ppGpp synthetase activity of the small alarmone synthetase RelZ / Sidorov, R.Yu., Tkachenko, A.G. // BIO Web of Conferences. -2023. - V. 57. - P. 08002.

146 Singal, B. Crystallographic and solution structure of the N-terminal domain of the Rel protein from Mycobacterium tuberculosis / Singal, B., Balakrishna, A.M., Nartey, W., Manimekalai, M.S.S., Jeyakanthan, J., Grüber, G. // FEBS letters. - 2017. - V. 591. - №15. - P. 2323-2337.

147 Singh, R. Recent updates on drug resistance in Mycobacterium tuberculosis / Singh, R., Dwivedi, S.P., Gaharwar, U.S., Meena, R., Rajamani, P., Prasad, T. // Journal of applied microbiology. - 2020. - V. 128. - №6. - P. 1547-1567.

148 Singh, V. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis / Singh, V., Chibale, K. // Accounts of chemical research. - 2021. - V. 54. - №10. - P. 2361-2376.

149 Sinha, A.K. The RelA hydrolase domain acts as a molecular switch for (p)ppGpp synthesis / Sinha, A.K., Winther, K.S. // Communications biology. - 2021. - V. 4. - №1. - P. 434.

150 Smeulders, M.J. Adaptation of Mycobacterium smegmatis to stationary phase / Smeulders, M.J., Keer, J., Speight, R.A., Williams, H.D. // Journal of bacteriology. - 1999. - V. 181. - №1. - P. 270-83.

151 de Sousa Luis, J.A. Virtual screening of natural products database / de Sousa Luis, J.A., Barros, R.P.C., de Sousa, N.F., Muratov, E., Scotti, L., Scotti, M.T. // Mini reviews in medicinal chemistry. -2021. - V. 21. - №18. - P. 2657-2730.

152 Starosta, A.L. The bacterial translation stress response / Starosta, A.L., Lassak, J., Jung, K., Wilson, D.N. // FEMS microbiology reviews. - 2014. - V. 38. - №6. - P. 1172-201.

153 Steinchen, W. Catalytic mechanism and allosteric regulation of an oligomeric (p)ppGpp synthetase by an alarmone / Steinchen, W., Schuhmacher, J.S., Altegoer, F., Fage, C.D., Srinivasan, V., Linne, U., Marahiel, M.A., Bange, G. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2015. - V. 112. - №43. - P. 13348-53.

154 Steinchen, W., Bange, G. The magic dance of the alarmones (p)ppGpp / Molecular microbiology. -2016. - V. 101. - №4. - P. 531-44.

155 Stokes, J.M. Bacterial metabolism and antibiotic efficacy / Stokes, J.M., Lopatkin, A.J., Lobritz, M.A., Collins, J.J. // Cell metabolism. - 2019. - V. 30. - №2. - P. 251-259.

156 Sundarsingh, J.A. Features of the biochemistry of Mycobacterium smegmatis, as a possible model for Mycobacterium tuberculosis / Sundarsingh, J.A., Ranjitha, J., Rajan, A., Shankar, V. // Journal of infection and public health. - 2020. - V. 13. - №9. - P. 1255-1264.

157 Sureka, K. Polyphosphate kinase is involved in stress-induced mprAB-sigE-rel signalling in mycobacteria / Sureka, K., Dey, S., Datta, P. et al. // Molecular microbiology. - 2007. - V. 65. - №2. -P. 261-76.

158 Sureka, K. Positive feedback and noise activate the stringent response regulator Rel in mycobacteria / Sureka, K., Ghosh, B., Dasgupta, A., Basu, J., Kundu, M., Bose, I. // PLoS One. - 2008. - V. 3. - №3.

- P. e1771.

159 Syal, K. Novel pppGpp binding site at the C-terminal region of the Rel enzyme from Mycobacterium smegmatis / Syal, K., Joshi, H., Chatterji, D., Jain, V. // The FEBS journal. - 2015. - V. 282. - №19. -P. 3773-85.

160 Syal, K. Vitamin C targets (p)ppGpp synthesis leading to stalling of long-term survival and biofilm formation in Mycobacterium smegmatis / Syal, K., Bhardwaj, N., Chatterji, D. // FEMS microbiology letters. - 2017a. - V. 364. - №1. - P. fnw282.

161 Syal, K. Synthetic (p)ppGpp analogue is an inhibitor of stringent response in mycobacteria / Syal, K., Flentie, K., Bhardwaj, N., Maiti, K., Jayaraman, N., Stallings, C.L., Chatterji, D. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2017b. - V. 61. - №6. - P. e00443-17.

162 Syal, K. The extended (p)ppGpp family: new dimensions in stress response / Syal, K., Rs, N., Reddy, M.V.N.J. // Current research in microbial sciences. - 2021. - V. 2. - P. :100052.

163 Tamman, H. A nucleotide-switch mechanism mediates opposing catalytic activities of Rel enzymes / Tamman H, Van Nerom K, Takada H, Vandenberk N, et al. // Nature chemical biology. - 2020. - V. 16.

- №8. - P. 834-840.