Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Гасанов, Евгений Валерьевич

• Гасанов, Евгений Валерьевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гасанов, Евгений Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами.

2.1. Введение.

2.2. Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с субстратом.

2.3. Аспартильные протеазы.

2.4. Металлопротеазы.

2.5. Цистеиновые протеазы.

2.6. Сериновые протеазы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius»

Актуальность исследования

В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки — ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.

Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, по-разному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.

Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.

Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins (BIGEP) - сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы 5

ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.

Цели и задачи исследования

Основной целыо данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глугаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи:

1) изучение механизма созревания предшественника BIGEP;

2) получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.

Научная новизна исследования

В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга BIGEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента.

Практическая значимость исследования

Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕХАНИЗМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ ЗАРЯЖЕННЫХ СУБСТРАТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ

2.1. Введение

Исследование механизмов, лежащих в основе ферментативного катализа, является одним из важнейших направлений современной науки. Это связано как с исключительной важностью биологических функций ферментов, так и с их широчайшим биотсхпологическим применением.

Одним из основных элементов, определяющих эффективность функционирования любого фермента, является точность и сила его взаимодействия с субстратом — то есть его специфичность. С одной стороны, правильное позиционирование молекулы субстрата в активном центре необходимо для эффективного ферментативного катализа. С другой стороны, способность к тонкому распознаванию субстрата обеспечивает избирательность фермента. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия с субстратами, может позволить нам изменять как эффективность работы ферментов, так и их специфичность.

Удобной моделью для изучения механизмов фермент-субстратного взаимодействия являются протеолитические ферменты. Все протеазы взаимодействуют с одним и тем же субстратом - полипептидной цепью. В то же время существует огромное разнообразие протеолитических ферментов (эти белки встречаются абсолютно у всех известных организмов). При этом многие заметно отличающиеся по структуре протеазы взаимодействуют с одними и теми же участками полипептидной цепи, и наоборот, часто структурно близкие ферменты заметно различаются по специфичности. Таким образом, изучение закономерностей, лежащих в основе взаимодействия протеаз с субстратом, заметно приблизит нас к пониманию механизмов, определяющих субстратную специфичность ферментов.

Наиболее распространенными методиками, применяемыми для анализа механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются рентген о-структурный анализ молекул фермента (чаще в комплексе с субстратом или его аналогом) и генно-инженерная модификация белка. Первый метод позволяет визуализировать фермент-субстратное взаимодействие, и дает возможность выдвинуть предположение о роли отдельных структурных элементов фермента. С помощью второго подхода возможно 7 вносить изменения в структуру белка, а последующий анализ наблюдаемого эффекта позволяет судить об участии модифицированных элементов в функционировании фермента. Совместное применение этих методов позволяет формулировать гипотезы о механизмах, лежащих в основе специфичности того или иного белка, в том числе протеазы.

Аминокислотные остатки, образующие пептидную цепь, можно разделить на различные группы. Одно из наиболее очевидных делений - на заряженные и нейтральные. К первым относятся имеющие отрицательный заряд остатки дикарбоновых кислот: аспарагиновой и глутаминовой, а также положительно заряженные лизин и аргинин. Протеолитические ферменты, специфически взаимодействующие с участками полипептидной цепи, несущими заряд, играют заметную роль в биологических процессах. Достаточно упомянуть каспазы, играющие ключевую роль в процессе апоптоза, факторы свертывания крови и комплемента, пищеварительные ферменты эукариот и факторы патогенности микроорганизмов. Ниже представлен обзор данных, существующих для различных протеолитических ферментов, относительно механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия протеаз с заряженными субстратами.

По каталитическому механизму протеазы принято делить на четыре типа в зависимости от природы нуклеофильного агента, участвующего в реакции. Это аспаргильные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы. Эта классификация использована нами далее при анализе данных о механизмах, определяющих предпочтение различных протеолитических ферментов к заряженным субстратам.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гасанов, Евгений Валерьевич

выводы

1) Впервые продемонстрировано влияние (-1) остатка на формирование активной глутамилэндопептидазы В. intermedius (BIGEP) и продукцию активной протеиназы бактериальными клетками. Показано, что, в зависимости от природы аминокислотных остатков, формирующих сайт процессинга, BIGEP активируется различными ферментами. Возможно, модификация (-1) положения служит эволюционным механизмом изменения уровня продукции глутамилэндопептидаз.

2) Предложен новый подход для создания эффективных рекомбинантных продуцентов протеиназ с узкой субстратной специфичностью, заключающийся в модификации их сайта процессинга. С использованием этого подхода на основе клеток Е. coli сконструирован продуцент BIGEP.

3) Впервые исследовано созревание BIGEP с собственным пропептидом in cis и in trans, а также без пропоследовательности и показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента.

4) Продемонстрировано, что отсутствие свободной а-аминогруппы Vail в предшественнике BIGEP не влияет на его способность распознавать отрицательно заряженные остатки.

5) Впервые получен вариант зрелой BIGEP с удаленными тремя N-концевыми аминокислотными остатками и продемонстрировано, что эти остатки важны для функционирования фермента

4.4. Заключение

Таким образом, как полученные нами, так и литературные данные говорято важности N-концевых остатков бациллярных и кокковых ГЭПаз в функционироватьии фермента. В то же время предшественник BIGEP, по-видимому, обладает характерной ГЭПаз специфичностью до формирования свободной аминогруппы Vail. Этот подразумевает, что а-аминогруппа Vail является как минимум не единствен

Ым элементом, определяющим субстратную специфичности ГЭПаз. Подтверждают та.^^^^^ трактовку данные о ГЭПазах Str. griseus [83] и nsp4 вируса артериита [82], чьи: ^ концевые районы удалены от субстратсвязывающего участка ферментов.

Итак, ГЭПазы с высокой избирательностью распознают отрицательно заряжетз^^^ остатки. В то же время, ни свободная аминогруппа, ни абсолютно консервативиь.^.^ ГЭПаз остаток His213 [90], видимо, не являются элементами, целиком определяюгхд—-^

-•^МИ субстратные предпочтения фермента. Можно предположить, что специфичен

Кое взаимодействие с отрицательно заряженными остатками осуществляется благо суммарному эффекту целой группы положительно заряженных остатков ГЭПаз. В случае ни один из остатков не является единственным «компенсатором» отрицагел того заряда и, следовательно, критическим для распознавания субстрата. Тогда централ ^^^ роль в механизме, определяющем специфичность, должна играть геом субстратсвязывающего района ГЭПаз, обеспечивающая точное распознавание ос*: гков глутаминовой кислоты. Следовательно, можно предполагать, что ГЭПазы спосо^> ^ ы с низкой эффективностью распознавать и близкие по структуре, но нейтральные ос^-^ глутамина. Хотя для большинства ферментов этой группы таких данных нет, способ ^ атки ость гидролизовать связи, образованные остатками глутамина, описана для протеаз V8 nsp4 in vivo [87, 118]. Исходя из этого, возможно предположение, что Vail является в

Лрвую очередь важнейшим структурным элементом, необходимым для формир<^>^ правильной геометрии субстратсвязывающего района BIGEP, в то время как ~ аряд свободной аминогруппы важен в значительно меньшей степени.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гасанов, Евгений Валерьевич, 2009 год

1. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. // Biochem Biophys Res Commun, 1967. 27(2): p. 157-62.

2. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. II Nucleic Acids Res, 2008. 36(Database issue): p. D320-5.

3. Fruton J.S. The mechanism of the catalytic action of pepsin and related acid proteinases. // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1976. 44: p. 1-36.

4. Lowther W.T., Majer P., Dunn B.M. Engineering the substrate specificity of rhizopuspepsin: the role of Asp77 of fungal aspartic proteinases in facilitating the cleavage of oligopeptide substrates with lysine in PI. // Protein Sci, 1995. 4(4): p. 689702.

5. Gagnon-Arsenault I., Tremblay J., Bourbonnais Y. Fungal yapsins and cell wall: a unique family of aspartic peptidases for a distinctive ccllular function. // FEMS Yeast Res, 2006. 6(7): p. 966-78.

6. Setlow P. Small, acid-soluble spore proteins of Bacillus species: structure, synthesis, genetics, function, and degradation. // Annu Rev Microbiol, 1988. 42: p. 319-38.

7. Kramer R.A., Vandeputte-Rutten L., de Roon G.J., Gros P., Dekker N., Egmond M.R. Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site. // FEBS Lett, 2001. 505(3): p. 426-30.

8. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N., Egmond M.R., Gros P. Crystal structure of the outer membrane protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site. // Embo J, 2001. 20(18): p. 5033-9.

9. Varadarajan N., Gam J., Olsen M.J., Georgiou G., Iverson B.L. Engineering of protease variants exhibiting high catalytic activity and exquisite substrate selectivity. // Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(19): p. 6855-60.

10. Garrigue-Antar L., Barker C., Kadler K.E. Identification of amino acid residues in bone morphogenetic protein-1 important for procollagen C-proteinase activity. IIJ Biol Chem, 2001.276(28): p. 26237-42.

11. Dcmidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural organization of precursors of thermolysin-like proteinases. // Protein J, 2008. 27(6): p. 343-54.