Математическая модель нелинейной кинетики молекулы ДНК и ее применение для анализа клеточной динамики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.13.18, кандидат наук Никитюк Александр Сергеевич

• Никитюк Александр Сергеевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Никитюк Александр Сергеевич

Введение

1 Основные принципы и подходы к исследованию молекулы ДНК

1.1 Структура, динамика и функции молекулы ДНК

1.2 Формирование открытых комплексов как ключевой фактор локального раскрытия молекулы ДНК

1.3 Обзор структурно-динамических моделей молекулы ДНК

1.4 Экспериментальные методы исследования молекулы ДНК

1.5 Выводы по разделу

2 Математическое моделирование нелинейной кинетики ДНК

2.1 Содержательная постановка задачи моделирования нелинейной кинетики ДНК

2.2 Концептуальная постановка задачи моделирования нелинейной кинетики ДНК

2.3 Математическая постановка задачи моделирования нелинейной кинетики ДНК

2.4 Исследование статистической модели молекулы ДНК

2.5 Выводы по разделу

3 Исследование морфометрии и прижизненной динамики раковых и нормальных клеток методом лазерной интерференционной микроскопии

3.1 Лазерная интерференционная микроскопия

3.2 Культуры клеток

3.3 Подготовка образцов

3.4 Измерения оптической толщины клеток методом лазерной интерференционной микроскопии

3.5 Выделение морфометрических показателей фазовых изображений

клеток

3.6 Математическая обработка флуктуаций оптической толщины клетки

3.6.1 Алгоритм анализа фазовых портретов

3.6.2 Алгоритм мультифрактального анализа флуктуаций оптической толщины клетки

3.7 Сравнительный анализ морфометрических показателей раковых и нормальных клеток

3.8 Сравнительный анализ динамических параметров раковых и нормальных клеток

3.9 Выводы по разделу

4 Мультифрактальный анализ нелинейной кинетики ДНК

4.1 Мультифрактальный анализ сигналов биологического происхождения

4.2 Применение метода максимумов модулей вейвлет-преобразования для анализа данных численного моделирования нелинейной кинетики ДНК

4.3 Интерпретация данных лазерной интерференционной микроскопии раковых и нормальных клеток с помощью статистической модели

нелинейной кинетики ДНК

4.4 Выводы по разделу

Заключение

Список литературы

Как известно, клетка является структурно-функциональной элементарной единицей строения и жизнедеятельности любого живого организма и представляет собой упорядоченную систему биополимеров (белков, нуклеиновых кислот) и их макромолекулярных комплексов. На протяжении всего жизненного цикла внутри клетки происходит непрерывное взаимодействие макромолекул, обусловленное способностью к самоорганизации и внешними факторами. При этом клетки подчиняются вполне определенным сценариям своего развития. Тем не менее, при столь высоком уровне организации внутриклеточных процессов межмолекулярное взаимодействие оказывается чрезвычайно чувствительным к воздействию особых агентов, так называемых транскрипционных факторов, которые способны менять экспрессию тысячи генов [1, 2, 3]. Исследования устойчивых и наследуемых изменений в паттернах экспрессии генов молекулы ДНК позволяют установить особенности дифференцировки клеток, имеющих изначально одинаковый генотип. В рамках данных исследований одной из основных проблем является идентификация и описание физических механизмов, которые инициируют и поддерживают процесс феногенеза клетки. Так как экспрессия генов - это процесс реализации наследственной информации, хранящейся в генах, в виде белков, а белки в свою очередь отвечают за формирование определенных признаков клетки, транскрипционные факторы играют ключевую роль в формировании всей совокупности признаков клетки, т.е. её фенотипа.

В настоящее время широко обращается внимание на то, что формирование и наследование определенного фенотипа клетки можно рассматривать как влияние некоторого «аттрактора», характеризующего динамическое состояние системы на молекулярном уровне [4, 5, 6]. Концепция аттрактора предполагает, что система эволюционирует к

предпочтительному (минимальному по энергии) состоянию, являющемуся компактным подмножеством фазового пространства динамической системы. Наличие аттракторов системы, соответствующих определенным фенотипам клетки, означает, что существует некое «энергетическое поле», описывающее процесс реализации генома в тот или иной фенотип и представляющее собой множество метастабильных «притягивающих» состояний системы.

В 1942 году К. Уоддингтон предложил образное представление данного энергетического поля, названное им эпигенетическим ландшафтом [7]. В оригинальной формулировке эпигенетический ландшафт представляет собой рельеф горного склона, по которому с вершины к подножью по различным траекториям скатывается мраморный шарик, ассоциируемый с некоторым состоянием клетки. В данном описании траектория, которую проходит шарик, символизирует экспрессию генов, рельеф склона горы определяется набором генов молекулы ДНК, который может меняться под воздействием внешних факторов. Таким образом, эпигенетический ландшафт определяет воздействие генов на развитие фенотипа клетки и может быть интерпретирован как профиль энергии молекулы ДНК, определяющий феногенез клетки [10].

Одной из первых работ, в которой было предложено теоретическое описание изменения энергии ДНК, является исследование А.В. Инглэндера с соавторами, посвященное исследованию природы открытых состояний в длинных полинуклеотидных двойных спиралях. В работе был предложен нелинейный гамильтониан и впервые получено решение в виде солитона, имитирующее локальное расплетание двойной спирали. Дальнейшее развитие исследований в данном направлении получило в работах С. Ямосу, С. Такено и С. Хомма, Дж.А. Крумхансла с соавторами, В.К. Федянина с соавторами, Л.В. Якушевич, Ч.-Т. Жанга, Е.В. Проховского, В. Муто с соавторами, Л.Л. Ван Зандта, М. Пейрара, Т. Даоксиса, Г. Гаету, М. Салерно, А.А. Боголюбского и И.Л. Боголюбской, В. Хаи, Дж.А. Гонзализа и М. Мартина-Ландрова. Отличительной чертой результатов, полученных этой

группой авторов, является учёт структурно-динамических параметров применительно к изучению функциональных свойств молекулы ДНК.

В работах М. Пейрара отмечается, что исследования статической структуры и динамических свойств молекулы ДНК без учета температурных эффектов недостаточны для понимания процессов инициации и поддержания феногенеза клетки. Это связано с тем, что термические флуктуации играют важную роль при устойчивых и наследуемых изменениях экспрессии генов. Поэтому для описания изменения энергии молекулы ДНК целесообразным представляется использование концепции свободной энергии системы, а для изучения процессов формирования и развития фенотипа клетки -применение этой концепции в рамках статистической механики.

Статистико-термодинамический подход к описанию ДНК применялся многими исследователями, среди них: Дж.Ф. Марко, Е.Д. Сиггиа, М. Пейрар, А.Р. Бишоп, Т. Даоксис и др. [8, 9]

В настоящее время отмечается роль «микроскопических» переменных в термодинамике структурных превращений и динамике ДНК. Эти переменные ассоциируются с так называемыми открытыми комплексами, парами нуклеотидов, в которых происходит растяжение или разрыв водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями. В работе профессора О.Б. Наймарка [10] показано, что эффекты коллективного поведения открытых комплексов, образующихся и взаимодействующих в структуре цепи ДНК, играют значительную роль в функциональных процессах данной макромолекулы таких как транскрипция, репликация, репарация, денатурация и пр. В связи с этим актуальным представляется учет коллективного поведения ансамбля открытых комплексов при разработке математических моделей молекулы ДНК, основанных на подходах статистической термодинамики.

Экспериментальные исследования процесса формирования и наследования определенного фенотипа клетки, необходимые для идентификации и верификации новых математических моделей ДНК,

указывают на перспективность использования неинвазивных методов исследования прижизненной динамики и морфологии клеток, и, в частности, лазерной интерференционной микроскопии, позволяющей изучать, в том числе, поведение органелл в условиях сверхвысокого пространственного разрешения. Применение данных методов в биофизике позволило исследовать пространственно-временные флуктуации в ядрышке клетки (органелле, которая полностью состоит из ДНК) и получить ряд принципиально новых научных результатов, отраженных в работах В.Л. Кононенко, Я.К. Шимкуса, В.П. Тычинского, А.В. Лопарева, А.В. Кретушева, П.С. Игнатьева [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. Однако до сих пор остается открытым вопрос интерпретации экспериментальных данных о клетке на основе сопоставления результатов измерений с модельными представлениями о внутриклеточных процессах, происходящих в том числе в ДНК.

Таким образом, на основе вышеприведенной информации можно заключить, что создание математических моделей на базе статистико-термодинамического подхода, предназначенных для описания нелинейной кинетики молекулы ДНК, а также применение данных моделей для интерпретации данных лазерной интерференционной микроскопии клеток является актуальной задачей математического моделирования биологических систем. Одним из важных направлений является создание модели, учитывающей коллективное поведение ансамбля открытых комплексов молекулы ДНК для объяснения закономерностей феногенеза.

Цель работы - разработка математической модели молекулы ДНК, позволяющей описать её термодинамические и кинетические свойства с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов, и применение результатов моделирования для интерпретации данных лазерной интерференционной микроскопии нормальных и раковых клеток.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Разработать статистическую математическую модель молекулы ДНК, позволяющую описать её термодинамические и кинетические свойства с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов.

2. Разработать и реализовать алгоритмы на основе эффективных численных методов в виде комплексов проблемно-ориентированных программ для проведения моделирования нелинейной кинетики молекулы ДНК.

3. Провести натурные эксперименты по измерению морфометрических показателей и прижизненной динамики клеток методом лазерной интерференционной микроскопии с последующей обработкой полученных данных методами Фурье-анализа, вейвлет анализа, мультифрактального анализа и построения фазовых портретов.

4. Выявить объективные критерии дифференциации раковых и нормальных клеток на основе анализа результатов натурного эксперимента.

5. Применить математическую модель нелинейной кинетики ДНК для интерпретации данных натурного эксперимента.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:

1. Разработана новая статистико-термодинамическая модель молекулы ДНК, описывающая связь коллективного поведения ансамбля открытых комплексов с процессами формирования и развития фенотипа клетки.

2. Разработаны эффективные алгоритмы реализации модели и качественного анализа теоретических и экспериментальных результатов с использованием современных методов обработки сигналов, таких как Фурье -анализ, вейвлет анализ, мультифрактальный анализ и метод построения фазовых портретов. Создан комплекс проблемно-ориентированных программ для ЭВМ, реализующих данные алгоритмы.

3. Впервые предложен объективный диагностический критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека на основе оценки высоты и объема фазового изображения клетки, измеренных с помощью лазерной интерференционной микроскопии.

4. Впервые установлено, что флуктуации оптической толщины ядрышка эпителиальных клеток в норме характеризуются мультифрактальными свойствами, тогда как динамика ядрышка раковых клеток демонстрирует переход от мультифрактальности к монофрактальности.

5. Впервые предложена теоретическая интерпретация данных лазерной интерференционной микроскопии живых раковых клеток, базирующаяся на закономерностях «критичности» системы для различных диапазонов значений параметров, определяющих энергетический рельеф (эпигенетический ландшафт) биологической системы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость обусловлена разработкой математической модели ДНК, отражающей связь коллективного поведения ансамбля открытых комплексов с процессами феногенеза клетки, в частности - процессом превращения нормальной эпителиальной клетки в раковую. Практическая значимость заключается в возможности использования разработанной модели и комплекса программ для анализа патологических процессов в клетках различной природы. Практическую значимость представляют установленные критерии выявления патологически измененных клеток, которые могут оказаться востребованными при разработке новых клинических методик дифференциации раковых и нормальных клеток. Получены свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ «МаШТгашАэгт» № 2015661814 от 09.11.2015, «Программный модуль для анализа флуктуаций оптической толщины раковых и нормальных клеток» № 2019663089 от 10.10.2019 и «Программный модуль для анализа фазовых изображений раковых и нормальных клеток» № 2019663291 от

Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационной работы являются разработки отечественных и зарубежных ученых в области статистической механики и термодинамики биологических молекул, а также математической обработки сигналов биологической

природы. Информационную базу составляют материалы, содержащиеся в научных монографиях, справочной литературе, материалах научно-технических конференций, статьях в периодических изданиях и научных сборниках по исследуемой проблеме.

Методы исследования основаны на использовании алгоритмов математической обработки одномерных временных сигналов и аппарата статистической термодинамики, позволяющей определять поведение физической системы (молекулы ДНК) на основе её микро- (мезо) структурных свойств. Разработаны алгоритмы реализации модели с применением численных методов интегрирования дифференциальных уравнений в частных производных в пакете прикладных программ MathWorks Matlab. Реализованы одномерные методы Фурье-преобразования, вейвлет преобразования, мультифрактального анализа и метода построения фазовых портретов флуктуаций оптической толщины ядрышка клетки в пакете прикладных программ MathWorks Matlab.

Положения, выносимые на защиту:

1. Математическая модель молекулы ДНК, позволяющая описать её термодинамические и кинетические свойства с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов.

2. Алгоритмы численной реализации разработанной модели, основанные на численных методах решения дифференциальных уравнений в частных производных, и созданный на их основе программный комплекс в пакете прикладных программ MathWorks Matlab, предназначенный для проведения вычислительного эксперимента.

3. Оригинальные критерии классификации раковых и нормальных клеток на основе анализа данных лазерной интерференционной микроскопии.

4. Результаты сравнительного анализа данных натурного эксперимента и результатов математического моделирования нелинейной кинетики молекулы ДНК.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов численного моделирования подтверждается

удовлетворительным соответствием экспериментальным данным, результатами проверки устойчивости и сходимости, согласованностью с результатами других авторов.

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: XXII, XXIV и XXV Всероссийских школах-конференциях молодых ученых и студентов «Математическое моделирование в естественных науках» (2013, 2015, 2016, Пермь), Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Современные проблемы математики и её прикладные аспекты -2013» (2013, Пермь), International Workshop «Failure of Heterogeneous Materials under Intensive Loading: Experiment and Multi-scale Modeling» (2014, Пермь), XI Всероссийской конференции «Биомеханика-2014» (2014, Пермь), Международных конференциях «Перспективные материалы с иерархической структурой для новых технологий и надежных конструкций (2015, 2018 Томск), Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '15» (2015, Пущино), International workshop «Multiscale experimental and theoretical study of homeostasis and mechanobiology of tumors: results and prospective» (2015, Пермь), Международных конференциях «Физика рака: трансдисциплинарные проблемы и клинические применения» (2016, 2017, Томск), XII Всероссийской конференции «Биомеханика-2016» (2016, Пермь), XX, XXI Зимних школах по механике сплошных сред (2017, 2019 Пермь), International Workshop «Multiscale Biomechanics and Tribology of Inorganic and Organic Systems» (2019, Томск). Работа полностью докладывалась и обсуждалась на семинарах кафедры математического моделирования систем и процессов ПНИПУ (руководитель - д-р. физ.-мат. наук, проф. П.В. Трусов), кафедры композиционных материалов и конструкций ПНИПУ (руководитель - д-р.

тех. наук, проф. А.Н. Аношкин) , Института механики сплошных сред УрО РАН (руководитель - академик РАН, д-р. тех. наук, проф. В.П. Матвеенко).

Исследования проводились в рамках грантов Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-01-96044 р_урал_а

«Многомасштабное экспериментальное и теоретическое исследование механобиологии и гомеостаза опухолей», № 16-41-590235 р_а «Механобиологическое исследование фенотипов клеточных и тканевых структур в онкологии»), Правительства Пермского края (соглашение № С-26/614 от 19.12.2012 «Разработка многомасштабных подходов механобиологии при ранней диагностике в онкологии») и государственного контракта № АААА-А19-119013090021-5 «Структурно-скейлинговые переходы в конденсированных средах и биологических мезо(нано)системах с дефектами, широкодиапазонное моделирование и экспериментальное исследование механизмов деформирования и стадийности поврежденности; перспективные приложения».

Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60718X0202).

Личный вклад соискателя заключается в разработке математической модели молекулы ДНК, позволяющей описать её термодинамические и кинетические свойства с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов; программной реализации алгоритмов разработанной модели; проведении и анализе результатов вычислительных экспериментов по моделированию нелинейной кинетики ДНК; проведении измерений морфометрии и динамики раковых и нормальных эпителиальных клеток методом лазерной интерференционной микроскопии, анализе и интерпретации результатов измерений с помощью математической модели молекулы ДНК.

Публикации.

Основные результаты опубликованы в 15 печатных работах, включая 5 статей в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук (в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 - в изданиях, входящих в базы цитирования Web of Science и Scopus).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Математическая модель нелинейной кинетики молекулы ДНК и ее применение для анализа клеточной динамики»

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованной литературы. Работа изложена на 110 страницах, содержит 31 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает 135 наименований.

1 Основные принципы и подходы к исследованию молекулы ДНК

Раздел посвящен литературному обзору основных теоретических и экспериментальных подходов к исследованию молекулы ДНК. Приводятся сведения о структурных особенностях строения молекулы ДНК. Описываются основные свойства двойной спирали с учетом динамики структурных переменных ДНК. Обсуждаются некоторые особенности биологической активности цепи ДНК. Рассмотрены основные математические модели ДНК в достаточной степени учитывающие особенности внутреннего строения макромолекулы. Рассмотрены преимущества и недостатки подходов к моделированию ДНК. Сделан и обоснован выбор подхода, в рамках которого была разработана предложенная в диссертационной работе модель. Также приводится обзор прямых методов исследования клеточных структур, обосновывается их преимущество по сравнению с другими экспериментальными методами применительно к решению задачи анализа динамики ДНК.

1.1 Структура, динамика и функции молекулы ДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - это длинная полинуклеотидная макромолекула, состоящая из двух скрученных нитей в форме двойной спирали. Каждая нить состоит из последовательности нуклеотидов. Нуклеотид представляет собой химическое соединение сахара в виде фуранозного кольца, фосфата и азотистого основания. Cахарофосфатные группы цепи нуклеотидов образуют внешний остов нити ДНК. Основания, входящие в состав нуклеотидов, могут быть четырех видов: два пурина - аденин и гуанин и два пиримидина - цитозин (^ и тимин (Г). Схематическое изображение молекулы ДНК приведено на рисунке 1.1.

Рисунок 1.1 - Схематическое изображение молекулы ДНК.

Сахарофосфатные остовы изображены в виде лент. Пары азотистых оснований обозначены соответствующими символами: аденин - A, гуанин -

G, цитозин - C и тимин - T

Структуру двойной спирали ДНК стабилизируют следующие силы:

1. Ковалентные связи, которые возникают в сахарофосфатном остове.

2. Водородные связи (горизонтальное взаимодействие) между основаниями, которые объединяются в комплементарные пары по следующему принципу: A-T и G-C.

3. Стэкинг-взаимодействие, которое возникает между основаниями, уложенными одно над другим, то есть между соседними основаниями вдоль нити ДНК.

Полная энергия водородных связей оценивается для A-T-пары как Ба-т = 7,00 ккал/моль и для G-C-пары - Бо-с = 16,79 ккал/моль. Величины энергии ковалентных связей C-C и C-H соответствуют следующим значениям Бс-с = 81,1 ккал/моль, Бс-н = 98,8 ккал/моль. Это говорит о том, что для разрыва ковалентных связей необходимо значительно большая энергия по сравнению с энергией водородных связей [19]. Соответственно ковалентные связи являются более сильными в сравнении с водородными. Также стоит отметить, что водородные связи внутри пар легко разрушаются при физиологических температурах с помощью разнообразных химических агентов и физических воздействий при концентрациях, встречающихся в живых системах [19]. Стэкинг-взаимодействия представляют другой тип сил, стабилизирующих структуру молекулы ДНК. Они удерживают одно

основание над другим и подобно водородным связям зависят от температуры и других внешних воздействий окружающей среды.

Помимо приведенных выше сил на ДНК также действуют дальнодействующие силы внутри и снаружи сахарофосфатного остова и электростатическое поле молекулы.

Спираль молекулы ДНК может быть правозакрученной (А- и В- формы ДНК) или левозакрученной (7-форма ДНК). Большинство ДНК в геноме находится в В-форме, которая часто называется канонической формой ДНК. В этой структуре спираль делает оборот каждые 3,4 нм и расстояние между прилежащими азотистыми основаниями составляет 0,34 нм [19]. Таким образом, на одном витке молекулы ДНК находятся около 10 нуклеотидов. Угол вращения спирали ДНК, находящейся в B-форме, соответствует величине 36°. Расстояние между фосфатами, расположенными на двух разных нитях, приблизительно равно 2 нм.

Пары азотистых оснований, соединенные по принципу комплементарности, образуют так называемую первичную структуру ДНК. Две полинуклеотидные цепи, закрученные вокруг общей оси в форме спирали, называются вторичной структурой ДНК. Третичная структура ДНК получается благодаря конформационной гибкости данной макромолекулы и представляет из себя плотноупакованную двойную спираль ДНК.

В связи с тем, что молекула ДНК в реальных условиях находится под воздействием внешней среды, атомы, основания, пары оснований, сахара, фосфаты и сегменты двойной спирали прибывают в постоянным движении, которое играет важную роль в функциях данной макромолекулы. Источниками внутренней подвижности молекулы ДНК являются температура, столкновения с молекулами окружающей среды, взаимодействие с внешними полями, взаимодействия с белками или лигандами. Таким образом, рассмотрение динамических свойств ДНК является важным аспектом при её изучении.

К основным движениям молекулы ДНК относятся вращательные и изгибные движения двойной спирали, движения азотистых оснований, движения сахарофосфатного остова, конформационные переходы и движения, связанные с локальным разделением нитей. Вращательные и изгибные движения ДНК обычно представляются в приближении тонкого, гибкого стержня, погруженного в вязкую жидкость. Динамика оснований включает в себя вращательные движения и смещения оснований внутри пар, а также вращательные движения и смещения пар оснований как целого. Движения сахарофосфатного остова описываются с помощью вращательных углов сахарофосфатной группы с присоединенным тимином. Конформационные переходы ДНК соответствуют переходу между разнообразными формами молекулы (А-, B- и 7-формами ДНК). Группу движений, связанных с локальным разделением нитей составляют раскрытие пар оснований и поперечные смещения нуклеотидов.

Главная функция ДНК - хранение генетической информации, записанной в виде последовательности нуклеотидов в виде так называемого генетического кода [20]. Генетическая информация реализуется при экспрессии генов в процессе транскрипции. Транскрипция - перенос генетической информации с ДНК на РНК. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза - сложная молекулярная машина, обладающая многими каталитическими активностями и способная к разнообразным структурным перестройкам [21].

Процесс транскрипции состоит из нескольких этапов:

1. Узнавание промотора. Синтез молекул РНК начинается в определённых областях ДНК, которые называют промоторы. РНК-полимераза «садится» на ДНК и происходит процесс локального плавления ДНК в районе промотора.

2. Инициация. Синтезируется цепь РНК от 2 до 9 нуклеотидов. Появляется локальный разрыв нитей, что называется транскрипционным

пузырем (transcription bubble). Транскрипционный пузырь может быть идентифицирован с ансамблем открытых комплексов.

3. Элонгация. РНК-полимераза и локализованный ансамбль открытых комплексов двигаются вдоль цепи генома, тем самым копируя код и увеличивая длину РНК. РНК-полимераза двигается до тех пор, пока она не достигает конца гена.

4. Терминация. Составляющие элементы транскрипции распадаются.

Также ДНК участвует в таких процессах как, белок-нуклеиновое

узнавание (взаимодействие ДНК с другими соединениями, особенно с белками [22]), репликация (образование двух молекул ДНК из одной [23]), интеркаляция (встраивание молекул на подобие сэндвича между двумя соседними парами оснований ДНК [24]), денатурация (изменение естественных свойств белков при изменении условий среды [25]) и т.п.

1.2 Формирование открытых комплексов как ключевой фактор локального раскрытия молекулы ДНК

Формирование так называемых открытых комплексов в двойной спирали ДНК (пар нуклеотидов, в которых происходит растяжение или разрыв водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями) имеет важное значение в функциональных процессах, в которых задействована данная молекула, например, при транскрипции или денатурации. Важным условием процесса транскрипции ДНК является появление ансамбля открытых комплексов. На рисунке 1.2 представлена схема формирования транскрипционного пузыря за счет накопления открытых комплексов. В основе процесса денатурации (плавления) молекулы ДНК также лежит процесс формирования и взаимодействия открытых комплексов. Поэтому можно заключить, что базовым механизмом реализации данных функций ДНК является образование и накопление локализованных открытых комплексов.

Рисунок 1.2 - Формирование открытого комплекса в молекуле ДНК [10]

В ряде работ [8, 9] для характеристики открытых комплексов в термодинамике структурных превращений и динамике ДНК вводятся так называемые микроскопические переменные, которые ассоциируются с данным механизмом. При этом отмечается, что учет коллективного поведения ансамбля открытых комплексов при разработке математических моделей молекулы ДНК, основанных на подходах статистической термодинамики, представляет большой интерес и является перспективным направлением исследования.

1.3 Обзор структурно-динамических моделей молекулы ДНК

В связи с тем, что молекула ДНК является сложным объектом, описание взаимосвязей между структурно-динамическими свойствами ДНК и особенностями её биологической активности является комплексной проблемой механобиологии. Начало теоретическим изысканиям в рамках данного вопроса было положено в работе А.В. Инглэндера с соавторами [26], посвящённой исследованию природы открытых состояний в длинных полинуклеотидных двойных спиралях. В работе был предложен нелинейный гамильтониан и впервые получено решение в виде уединенной волны (солитона), имитирующее локальное расплетание двойной спирали. Дальнейшие исследования в данном направлении получили развитие в большом количестве работ, которые могут быть систематизированы по принципу возрастания сложности модельного представления молекулы ДНК. В работе Л.В. Якушевич [19] была предложена иерархия структурно-

динамических моделей молекулы ДНК, составленная согласно данному принципу. Данная классификация включает в себя 5 типов моделей ДНК. К первому типу относятся модели, в которых ДНК ставится в соответствие однородный эластичный стержень с некоторым круговым сечением. Модели второго уровня учитывают тот факт, что молекула состоит из двух полинуклеотидных цепочек, взаимодействующих друг с другом через водородные связи. К третьему типу относятся модели, в которых каждая полинуклеотидная цепочка состоит из трех групп атомов. Четвертая группа моделей состоит из так называемых решеточных моделей. Пятая группа моделей состоит из максимально точных моделей, учитывающих положение каждого атома ДНК.

Для изучения динамических аспектов процесса локального раскрытия двойной спирали ДНК, который лежит в основе многих функций данной молекулы, модели первого уровня иерархии не подходят, поскольку они не учитывают внутреннюю структуру ДНК и являются применимыми либо для изучения подвижности молекулы как целого, либо для исследования механизма суперспирализации структуры двойной спирали. Наиболее подходящими являются модели второго уровня иерархии. Модели более высоких уровней также являются подходящими, причем чем выше уровень иерархии выбранной модели, тем детальнее получается описать процесс, но при этом возникают сложности с формулировкой и решением дифференциальных уравнений, описывающих поведение системы. В связи с этим в данной работе разрабатываемая модель будет относиться ко второму уровню иерархии. Ниже приведен краткий обзор основных моделей, составляющих данный класс.

Математические модели второго уровня иерархии учитывают тот факт, что ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепочек, взаимодействующих друг с другом. Модели данного уровня подразделяют на прямые и спиральные. В прямых моделях каждая из цепочек моделируется как эластичный стержень (в континуальном приближении) или как цепочка

связанных дисков (дискретный аналог). Схема непрерывной и дискретной модели ДНК в виде двух эластичных стержней, слабо взаимодействующих друг с другом представлена на рисунке 1.3. Модели второго уровня иерархии обладают шестью видами внутренних движений: продольные, поперечные и вращательные движения в каждом из стержней (6 степеней свободы). (а) (б)

Рисунок 1.3 - Схема непрерывной и дискретной модели ДНК в виде двух эластичных стержней, слабо взаимодействующих друг с другом в спиральном (а) и прямом (б) представлении [19]

В 1983 году Йомоса [27] разработал модель плоских оснований-ротаторов, которая основывалась на математической модели динамики ДНК Инглэндера. Функция Гамильтона, описывающая изменение энергии системы, включает в себя слагаемые, учитывающие кинетическую энергию вращательного движения оснований вокруг оси спирали, водородные связи между основаниями, стэкинг-взаимодействие и энергию кручения. В работе представлены четыре типа решения уравнений движения оснований в виде уединенных волн (кинков и антикинков), полученные при введении гипотезы сплошности.

Модель Йомосы получила свое развитие в работе Такено и Хомма [28, 29]. Авторы рассмотрели дискретную модель плоских ротаторов молекулы ДНК, которая является обобщением модели Френкеля-Конторовой [30, 31]. Было показано, что кроме конечно-амплитудных решений в виде солитонов для непрерывного случая в ДНК возможны довольно большие флуктуации

значений углов кручения пар оснований. На основе данного результата Такено и Хомма делают вывод, что эффекты дискретности играют важную роль в динамике ДНК.

Усовершенствованная версия модели Ймосы также была представлена в работе Чжан [32]. Суть модификации заключалась во введении диполь-дипольного взаимодействия между азотистыми основаниями. Автором были получены решения уравнений движения оснований в форме кинков, а также выполнена оценка энтальпии системы при наличие открытых состояний ДНК. Данная оценка оказалось достаточно близкой к экспериментально оцененной аналогичной величине.

Исследования роли стэкинг-взаимодействия в динамических процессах молекулы ДНК было проведено Л.В. Якушевич и соавторами в работе [33]. В данной статье в качестве объекта исследования рассматривается фрагмент ДНК, состоящий из трех пар оснований. В соответствие с подходом Инглэндера [26] авторы работы моделируют данную систему посредством механического аналога. В качестве азотистых оснований выступают маятники, взаимодействия между которыми моделируется пружинками. В модели учитываются водородные и стэкинг-взаимодействия между парами оснований, а также спиральная геометрия молекулы ДНК. Предполагается, что подвижными являются только основания центральной пары и они могут двигаться исключительно в плоскости перпендикулярной главной оси. Спиральность ДНК задается поворотом плоскостей, в которых могут двигаться основания. Параметры модели разделены на две группы по критерию зависимости от последовательности оснований в фрагменте ДНК. Те, которые не зависят от структуры ДНК, идентифицированы согласно имеющимся в литературе экспериментальным данным. Остальные параметры вычислены из простейших модельных ситуаций (т.е. рассмотрены гомогенные случаи молекулы ДНК. На основе, описанной выше, постановки получены решения и траектории в конфигурационном пространстве для двух различных случаев однородных последовательностей ДНК. Сравнительный

анализ результатов в отсутствие и с учетом стэкинг-взаимодействия показал, что данный тип взаимодействия вносит существенный вклад в динамику вращательных движений оснований.

Как видно из описанных результатов модели Ймосы и Якушевич отличаются использованием в своей основе предположения о том, что основной вклад в локальное раскрытие двойной спирали ДНК вносят вращательные движения оснований вокруг сахарофосфатного остова. Данная идея получила широкое распространение в работах других авторов и модели подобного типа получили название У-моделей.

Одной из наиболее интересных работ в рамках развития У-моделей является работы Гаеты [34]. Автор за счет введения в функцию Гамильтона дополнительного слагаемого учел спиральность структуры ДНК.

Влияние эффектов диссипации энергии и воздействия внешних полей на ДНК было рассмотрено в работе [35]. Были получены уравнения движения, учитывающие вязкое трение и воздействие окружающей среды. Были получены решения автосолитонного типа и изучена зависимость параметров этих решений от значений диссипации энергии и внешних полей.

В работе [36] было представлено обобщение модели Якушевич для случая гетерогенной молекулы ДНК. Были получены численные решения уравнений динамики модели в виде кинков. Выполнено исследование модели для случаев однородной и неоднородной двойной спирали ДНК. Изучено влияние эффектов термализации системы на результаты моделирования. Показано, что решения, полученные в результате моделирования, являются устойчивыми и могут быть использованы для объяснения функциональных процессов молекулы ДНК.

Влияние последовательности оснований на динамику солитонных решений в структуре ДНК в рамках применения моделей Йомосы и Якушевич для моделирования динамики двойной спирали исследовалось в работах [37-39]. Учёт последовательности оснований производился за счет констант, характеризующих водородные связи и стэкинг-взаимодействия,

которые зависели от типа основания. Было определено, что движение кинка сильно зависит от конкретной последовательности азотистых оснований. При этом существование непосредственной связи между динамикой солитонов и особенностями биологической активности ДНК до сих пор остается недостаточно изученным вопросом [40, 41].

Другим типом моделей второго уровня иерархии классификации Л.В. Якушевич являются модели, в основе которых лежит предположение о том, что основной вклад в расплетание молекулы ДНК вносят сдвиговые движения оснований.

В 1989 году Мишель Пейрар и Алан Бишоп предложили простую модель ДНК, учитывающую что наибольший вклад в низкочастотные колебательные моды водородных связей оказывают именно сдвиговые движения оснований. В данном исследовании с помощью предложенной модели было описано так называемое «дыхание» молекулы ДНК и процесс её денатурации [9]. Модель Пейрара-Бишопа (ПБ-модель) ставит в соответствие двойной спирали ДНК две цепи сосредоточенных объектов, которые имеют упругую связь вдоль и поперек цепи. Взаимодействия в поперечном направлении описывается потенциалом Морзе, в продольном -гармоническим приближением. В рамках формулировки модели вводятся гипотезы об однородности последовательности нуклеотидов. Методами статистической физики авторы получили оценку влияния температуры на отклонение оснований от равновесных значений. На основе сопоставления результатов моделирования с экспериментальными данными определено, что константа гармонического потенциала должна быть порядка 3.0*10-3 эВ/А для того, чтобы адекватно описывать процесс денатурации молекулы ДНК. При этом стоит отметить, что полученные результаты не позволили объяснить, каким образом происходит процесс денатурации нитей ДНК. Поэтому Пейрар и Бишоп было предложено объяснение начального процесса термической денатурации локализацией энергии в ДНК наличием нелинейных эффектов в структуре молекулы. Также авторами данной работы

было получено решение модели бризерного типа. Это решение является объяснением экспериментально наблюдаемого «дыхания» молекулы ДНК.

Исследование динамики решений бризерного типа (бризеров) в ПБ-модели представлено в работе Доксуа [42]. В рамках модели дополнительно учтена спиральная структура, как это было сделано в работе Гаета [43]. В развитие данной работы Докусуа в [44] добавлен термостат Нозе-Гувера в исследуемую систему. По результатам моделирования было обнаружено формирование открытых состояний на небольших фрагментах цепи ДНК при достаточно низких температурах термостата, что также является подтверждением биологического дыхания ДНК. При увеличении температуры открытые состояния начинали взаимодействовать, что приводило к образованию ансамблей открытых состояний и как следствие разделению нитей ДНК. При этом стоит отметить, что значения температуры, при которой происходило плавление ДНК, не соответствовали реальным. Поэтому в работах [45, 46] Пейрар, Бишоп и Доксуа ввели ангармонический потенциал стэкинг-взаимодействия. Данная модель получила название ПБД-модели ДНК и позволила более точно описать процесс денатурации ДНК. Развитие ПБД-модель получила в работах [47-50]. Суть модификаций сводится к уточнению вида потенциала, описывающего водородные связи и потенциала стэкинг-взаимодейстия.

Формирование, движение и взаимодействие открытых состояний как сдвиговых движений азотистых оснований ДНК помимо описания процесса денатурации может быть применено к объяснению природы процесса транскрипции и эффектов дальнодействия, регулирующих транскрипцию. Поэтому в рамках данных направлений модели типа Пейрара, Бишоп и Доксуа также получили свое применение. В частности, были изучены процессы переноса и локализации энергии в двойных спиралях ДНК. Так как параллельно с работами Пейрара и Бишопа, Текьера с соавторами [51] разработали и провели исследования оригинальной модели ДНК. Были идентифицированы два нелинейных режима динамики в цепи ДНК, которые

зависят от параметров модели. Были получены условия, при которых возбуждение, инициированное в структуре ДНК, прекращает свое распространение и условия, при которых возбуждение является устойчивым и распространяется вдоль молекулы. В работе Текьера с соавторами [52] исследовалось влияние гетерогенности структуры ДНК на динамику бризеров. Были обнаружены различные типы мобильности бризера относительно неоднородности.

Схожие результаты для различных параметров модели были получены Хисакадо и Вадати [53, 54]. Методом многомасштабного разложения решения ими было получено стохастическое нелинейное уравнение Шрёдингера. Исследование решения данного уравнения позволило установить, что неоднородность ДНК может приводить к остановке, отражению или же наоборот способствовать распространению бризерного решения.

Исследование взаимодействия РНК-полимеразы и бризера было выполнено в работах Тинга и Пейрара [55, 56] при этом использовался метод коллективных координат. РНК-полимераза моделировалась в континуальном пределе неоднородным стэкинг-взаимодействием в виде ступеньки функции Хевисайда. Было получено, что бризер при взаимодействии с дефектом прекращал свое движение. Данный результат был интерпретирован как процесс локализации энергии ДНК, обусловленной термическими флуктуациями, в области открытого состояния. Эта энергия является необходимым условием для разрыва пар оснований.

В работе Ф.К. Закирьянова и М.И. Фахретдинова [57] была рассмотрена модифицированная ПБ-модель, учитывающая нелинейность стэкинг-взаимодействия. Было получено решение модели в виде дискретного бризера.

П.Б. Нджоко, Дж.М. Билбо [58] в своей работе также использовали ПБ-модель и получили обобщенное нелинейное уравнение Шредингера, описывающее динамику модулированной волны в модели ДНК. Было

найдено решение данного уравнения и получены аналитические критерии существования этого решения.

Эффекты диссипации энергии в ПБ-моделях были исследованы в работах Здравковича с соавторами [59, 60]. Для поиска решения использовался метод медленно меняющихся параметров [61]. Было получено уменьшение скорости и амплитуды бризера в виде экспоненциальной зависимости от значений демпфирующего фактора, являющегося характеристикой вязкости раствора, в котором находится молекула ДНК. При этом бризер демонстрировал «расплывание» по узлам цепи ДНК Схожие результаты получены в работе [62].

В работе [63] исследовались свойства мобильных бризеров в изогнутой цепи ДНК с помощью модифицированной модели Пейрара-Бишопа, которая учитывает эффекты дальнодействия. В основе предлагаемой авторами модели лежит классический подход к моделированию молекулы ДНК, разработанный М. Пейраром и А. Бишопом. Cuevas и соавторами в рамках своего исследования вводят гипотезу о геометрии объекта исследования. Предполагается, что плоскость, в которой лежит цепь ДНК, может быть изогнута в форме параболы с заданной кривизной. В гамильтониан вводится дополнительный потенциал, определяющий дипольный момент водородных связей внутри каждой пары оснований. Благодаря этому у модифицированной модели Пейрара-Бишопа появляется возможность учета эффектов дальнодействия в молекуле ДНК. Для получения мобильных бризеров, в работе [63] используется следующий подход. На первом этапе аналитически решается система обыкновенных дифференциальных уравнений в антиконтинуальном пределе и находится решение соответствующие статическому бризеру [64]. Полученный результат используется в качестве начальных условий при дальнейших расчетах. Далее в процессе моделирования задается возмущение скорости движения нелинейных возмущений вдоль молекулы ДНК [65]. Также в данной работе

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Никитюк Александр Сергеевич, 2020 год

— - Ь

О

\ - !Л V о

Р (О')

+ 3\ ;. + 0,04 - {'- А'АО'

/

М (О')

О' (2,0) —А ООБ (2т / дО

д2 дО

— 0,

2—

д2

— 0,

(2.37)

2—О

где А - амплитуда гармонических начальных условий, ф - фаза гармонических начальных условий, О - количество генов молекулы ДНК.

С учетом вышеизложенного математическая постановка задачи моделирования молекулы ДНК формулируется следующим образом: необходимо решить дифференциальное уравнение в частных производных (второго порядка) при заданных граничных условиях, начальном расположении микроскопических открытых комплексов ДНК д и векторе обобщенной внешней силы i.

<

V

2.4 Исследование статистической модели молекулы ДНК

На первом этапе исследования математической модели ДНК была решена квазистатическая задача (т.е. рассматривался случай, когда скорость изменения значения термодинамической переменной равна 0) с целью определения чувствительности модели к структурному параметру д. На рисунке 2.4 представлены зависимости изменения термодинамической переменной ансамбля открытых комплексов О' от приложенной силы I1 без учета эффектов нелокальности при различных значения структурного параметра д соответствующие различным видам реакций ДНК в зависимости от разных значений д без учета эффектов нелокальности.

(а) (б) (в)

0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7

Рисунок 2.4 - Зависимость изменения термодинамической переменной ансамбля открытых комплексов О' от приложенной силы без учета эффектов нелокальности (а) при д = 0,9, (б) при д = 1,1, (в) при д = 1,2

Установлены два критических значения структурного параметра, относительно которых ДНК демонстрирует качественно различное поведение (дс; дг) равные (1; 1,16) соответственно. Критическое значение дс получено путем анализа первого слагаемого соотношения (2.33). Критическое значение дг определялось как максимальное значение структурного параметра, при котором вторая производная потенциала неравновесной свободной энергии (2.33) обращается в ноль.

Используя соотношение (2.16), для одного гена ДНК, находящейся в В-форме (наиболее распространённой своей конформации), можно определить значения среднего расстояния I между микроскопическими открытыми

комплексами. Для 5С величина расстояния между микроскопическими комплексами составила примерно 3,17 нм, для 5Г - 3,36 нм. Параметры соотношение (2.16) представлены в таблице 2.1.

Таблица №2.1 - Параметры соотношения (2.16) для В-формы ДНК [64]

№ Параметр Единицы измерения Значение

1 Б эВ 0,04

2 эВ/ А2 0,31

3 до А 11,2

На втором этапе исследования предложенной математической модели ДНК для выделенных диапазонов значений параметра 3 были построены профили свободной энергии (см. рисунок 2.5). Зависимости представленные на рисунке 2.5, соответствуют переходам между тремя характерными нелинейными режимами, связанными с изменением симметрии системы вследствие накопления и взаимодействия большого количества открытых комплексов. Данный результат позволяет сделать вывод, что параметр 3 определяет новые условия термализации системы, которые не зависят от обычной температуры. Под термализацией понимается процесс перехода неравновесной системы между различными структурными состояниями, который зависит от величины некоторого структурного параметра.

(а) (б) (в)

Рисунок 2.5 - Профили неравновесной свободной энергии при различных значениях структурного параметра 3 и внешней силы (а) 3 = 0,9 и f = 0,45, (б) 3 = 1,1 и f = 0,66, (в) 3 = 1,2 и f = 0,77

На следующем этапе исследования статистической модели ДНК было выполнено численное моделирование кинетики молекулы ДНК для различных диапазонов структурного параметра д. Система (2.37) соответствует одномерной краевой задаче. Алгоритм решения одномерный краевой задачи использованным в данной работе заключается в следующем. Соотношение (2.37)1 параболического типа дискретизируется по времени и полученное дифференциально-алгебраическое уравнение решается с помощью разностной схемы неявного метода Гира пятого порядка при заданных начальных и граничных условиях (2.37)2-4. Данный алгоритм расчета реализован в пакете прикладных программ MathWorks Matlab на высокоуровневом языке программирования Matlab. На рисунке 2.6 представлены фазовые траектории, соответствующие решениям кинетического уравнения (2.37)1 для параметра порядка О' для трех различных областей структурного параметра. Данные зависимости получены путем решения соотношения (2.37)1 при значении кинетического коэффициента Ь = 10 и значении коэффициента нелокальности А = 1. Фазовые траектории получены при времени, стремящемся к бесконечности. Данное условие преобразует дифференциальное уравнение в частных производных (2.37)1 в обыкновенное дифференциальное уравнение второго порядка по пространственной координате

(а) (б) (в)

г

0.15 0.1 0.05 0

-0.05 -0.1

-0.15 0.

0.2 0.3 0.4 0.5

0.6 0.4 0.2 О -0.2 -0.4 -0.6 -о.а

<г' <У <з'

Рисунок 2.6 - Фазовые траектории системы для трех различных областей

структурного параметра (а) д < дс, (б) дс < д < дг, (в) д > дг и при различных

величинах внешней силы

По результатам моделирования были устанавлены типы автомодельных решений и соответствующие им коллективные моды открытых комплексов. Автомодельные решения имеют природу конечно -амплитудных флуктуаций в виде мод бризерного типа, автосолитонного типа и диссипативных структур обострения.

На рисунке 2.7 представлено бризерное решение кинетического системы (2.37), представленное в виде зависимости нормированного значения Р' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 1,2 и I1 = 0,77 в различные моменты расчётного времени.

На рисунке 2.8 представлено автосолитонное решение кинетического системы (2.37) в виде зависимости нормированного значения Р' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 1,1 и I1 = 0,66 в различные моменты расчётного времени.

(а)

(б)

(в)

(г)

200 300 400 500 № гена

200 300 400 500 № гена

0.2 о

100 200 300 400 № гена

(д)

100 200 300 400 № гена

100 200 300 400 500 № гена

(е)

100 200 300 400 500 № гена

Рисунок 2.7 - Бризерное решение кинетического уравнения (2.37), представленное в виде зависимости нормированного значения Р' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 1,2 и I1 = 0,77 в различные моменты времени (а) г = 10, (б) г = 30, (в) г = 50, (г) г = 70, (д) г = 80, (е) г = 90

(а)

(б)

(в)

200 300 400 500 № гена

100 200 300 400 № гена

100 200 300 400 500 № гена

(Г)

(Д)

(е)

200 300 400 500 № гена

100 200 300 400 № гена

100 200 300 400 500 № гена

Рисунок 2.8 - Автосолитонное решение кинетического уравнения (2.37), представленное в виде зависимости нормированного значения О' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 1,1 и I1 = 0,66 в различные моменты времени (а) г = 10, (б) г = 30, (в) г = 50, (г) г = 70, (д) г = 80, (е) г = 90

На рисунке 2.9 представлены диссипативные структуры обострения, полученные при решении кинетического системы (2.37) в виде зависимости нормированного значения О' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 0,9 и ? = 0,54 в различные моменты расчётного времени.

Существование бризеров в диапазоне структурного параметра 3 > 3г является подтверждением достоверности предложенной в работе математической модели нелинейной кинетики ДНК. Решение бризерного типа описывает наблюдаемый экспериментально и теоретически [100, 101] процесс локального раскрытия двойной спирали ДНК с последующим закрытием пар оснований, т.е. восстановлением водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями. Наличие автомодельных уединенных волн (автосолитонов) для диапазона 3С < 3 < 31 подтверждает факт распространения возбуждений вдоль цепи ДНК характеризующих процесс транскрипции на стадии элонгации [102-106]. Возникновение диссипативных структур обострения для 3 < 3С означает нарушение

нормальных функций молекулы ДНК и может приводить к инициации патологических процессов внутри клетки.

(а)

(б)

(в)

100 200 300 400 500 № гена

0.2 о

100 200 300 400 № гена

200 300 № гена

400 500

(Г)

(Д)

(е)

100 200 300 400 500 № гена

100 200 300 400 № гена

100 200 300 400 500 № гена

Рисунок 2.9 - Диссипативные структуры обострения, полученные при решении кинетического уравнения (12), представленные в виде зависимости нормированного значения Р' от номера гена молекулы ДНК для 3 = 0,9 и f = 0,54 в различные моменты времени (а) г = 10, (б) г = 30, (в) г = 50,

(г) г = 70, (д) г = 80, (е) г = 90

На заключительном этапе было выполнено исследование результатов моделирования, полученных с помощью модели при различных начальных условиях для 3 > 3г с применением одномерного Фурье-анализа. В качестве анализируемого сигнала использовалась зависимость суммарной свободной энергии системы от времени ¥е(0. Данная зависимость рассчитывалась по результатам численного моделирования задачи (2.37) На рисунке 2.10 представлены спектры мощности суммарной свободной энергии системы от времени ¥^(1:) гармонических, «бризерных» и постоянных начальных условиях.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что спектры мощности Б(к) не отличаются друг от друга и имеют одинаковый наклон в ~ 2 (где в определяется согласно соотношению Б(к) ~ к'в).

(а) (б) (в)

Рисунок 2.10 - Спектры мощности суммарной свободной энергии системы от

времени ¥^)(а) гармонических, (б) «бризерных» и (в) постоянных

начальных условиях

Данный наклон соответствует наклону спектра мощности, вычисленного для броуновского («коричневого») шума. На основании данных результатов делается вывод о том, что результат моделирования зависит от вида нелинейности модели.

2.5 Выводы по разделу

Разработана математическая модель молекулы ДНК, основанная на статистической термодинамике и позволяющая описать термодинамические и кинетические свойства ДНК с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов. В результате исследования разработанной математической модели установлены критические значения структурного параметра 3, определяющих качественные изменения динамики ДНК; выполнена оценка среднего расстояния между открытыми комплексам; определены виды профилей неравновесной свободной энергии системы при различных значениях 3; установлены типы автомодельных решений и соответствующие им коллективные моды ансамбля открытых комплексов, а именно бризеры, автосолитоны и диссипативные структуры обострение; а также по результатам обработки данных численного моделирования нелинейной кинетики ДНК получено, что они зависят от вида нелинейности модели.

Разработаны и реализованы алгоритмы на основе эффективных численных методов в виде комплексов проблемно-ориентированных программ для проведения моделирования нелинейной кинетики молекулы ДНК.

3 Исследование морфометрии и прижизненной динамики раковых и нормальных клеток методом лазерной интерференционной

микроскопии

Раздел посвящен применению метода лазерной интерференционной микроскопии к анализу морфологии и прижизненной динамики раковых и нормальных клеток молочной железы человека. Описываются основные принципы метода лазерной интерференционной микроскопии, а также алгоритмы методов анализа фазовых портретов и максимумов модулей вейвлет-преобразования, реализующего мультифрактальный анализ. Обосновывается перспективность использования лазерной интерференционной микроскопии на примере дифференциации живых раковых и нормальных клеток человека различной области локализации. Приводится оригинальная методика интерпретации результатов измерения прижизненной динамики клеток с помощью современных методов математического анализа. Формулируются критерии идентификации раковых клеток на основе анализа их морфометрии и флуктуаций оптической толщины. Обосновывается возможность применения статистической модели молекулы ДНК для интерпретации динамических процессов, протекающих в клетке человека.

3.1 Лазерная интерференционная микроскопия

Лазерная интерференционная микроскопия относится к широкому классу оптических методов, который называется количественной фазовой микроскопией. Количественная фазовая микроскопия (КФМ) является перспективным подходом исследования морфометрии и динамики клеточных структур [90]. КФМ основана на современных методах математической обработки интерферограмм [91-93]. Изображение, получаемое посредством количественной фазовой микроскопии, содержит количественную

информацию об оптических, геометрических и динамических свойствах клетки [94].

Для исследований клеточного материала первоначально использовалась световая микроскопия. Как видно из рисунка 3.1а, данный подход имел низкую разрешающую способность. Этот недостаток был компенсирован в другом методе изучения биологических объектов - фазово-контрастной микроскопии (рисунок 3.1 б). Количественная фазовая микроскопия является усовершенствованной версией фазово-контрастной микроскопии. Суть улучшения сводится к появлению возможности количественного представления исследуемого объекта (рисунок 3.1в). К основным преимуществам КФМ относится: сверхвысокое оптическое разрешение, количественная информация об оптических и геометрических свойствах измеряемого объекта, неинвазивность при специальной подготовке образцов, возможность исследования динамических характеристик объекта. (а) (б) (в)

Рис. 3.1. Изображение нейрона, полученное с помощью светового микроскопа (а), фазово-контрастного микроскопа (б) и количественного

фазового микроскопа (в) [107].

В рамках выполнения диссертационной работы исследования живых клеток проводились на базе Пермского федерального исследовательского центра УрО РАН (г. Пермь) с помощью лазерного модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 (см. рисунок 3.2), реализующего принципы количественной фазовой микроскопии. Преимуществами лазерного микроскопа МИМ-340 по сравнению с аналогичными приборами

визуализации и анализа клеточных структур являются высокое пространственное разрешение, неинвазивный мониторинг и отсутствие особых требований к подготовке образца (химические красители или среда, в которых происходит измерение) [90]. В таблицах 3.1 и 3.2 приведены технические характеристики лазерного микроскопа МИМ-340. Лазерный микроскоп МИМ-340 успешно применялся для биологических исследований в различных областях: исследование эритроцитов [95], трехмерная визуализация межфазного хроматина, исследование активации тромбоцитов, взаимодействие между клетками и наночастицами [96], нанодинамика нервных волокон [97].

Рисунок 3.2 - Внешний вид лазерного микроскопа МИМ-340 Таблица №3.1 - Технические характеристики микроскопа МИМ-340

Характеристики микроскопа

Оптическое увеличение 10х

Поле зрения, мкм 51.4х32.8

Разрешение по вертикали, нм 0,3

Разрешение в плоскости XY, нм 10-100

Размер кадра, пикс. 752х480

Скорость съемки, кадр/сек 1, 3-100

Задержка между кадрами, мс 12

Источник света Лазер 655 нм

Таблица 3.2 - Технические характеристики предметного стола лазерного микроскопа МИМ-340_

Характеристики предметного стола

Длина хода (X - У - Z), мм 300x300x100

Результирующая точность, нм 150

Разрешение обратной связи, нм 100

Неплоскостность хода, нм 80

Непрямолинейность хода, нм 40

Скорость перемещения, мм/с До 100

Грузоподъемность, кг. 100

Вес, кг. 700

Принципиальная оптическая схема лазерного интерференционного микроскопа изображена на рисунке 3.3.

и

Рисунок 3.3 - Принципиальная оптическая схема лазерного микроскопа МИМ-340, где 1 - лазер, 2 - светодиод (белый свет), 3 - светоделитель, 4 -тубусная линза, 5 - поворотное зеркало, 6 - проектив, 7 - микрообъектив предметного плеча, 8 - исследуемый объект, 9 - микрообъектив опорного плеча, 10 - фазовый модулятор, 11 - цифровая камера навигационного канала, 12 - цифровая камера измерительного канала

Измерение оптической толщины исследуемого объекта осуществляется следующим образом. Когерентный луч, генерируемый лазером красного цвета 1 (длина волны 655 нм), проходит через светоделитель 3 и разделяется на два луча. Первый луч фокусируется микрообъективом предметного плеча 7 на исследуемом объекте 8 и называется предметным лучом. Второй луч фокусируется микрообъективом опорного плеча 9 на зеркальной

поверхности фазового модулятора 10. После отражения оба луча, пройдя через светоделитель 3, тубусные линзы 4 и проектив 6, отражаются от поворотного зеркала 5 и попадают в камеру измерительного канала 12, где возникает и фиксируется интерференционная картина. Также в описанной оптической схеме есть камера навигационного канала 11, которая необходима при позиционировании исследуемого объекта 8.

Для получения величин оптических толщин исследуемого объекта используется модернизированный трехшаговый метод [90]. Благодаря фазовому модулятору при каждом измерении фиксируются четыре интерферограммы, которые могут быть представлены следующей системой

I о ( x, y ) = A( x, y ) + B ( x, y ) cos (Аф( x, y )) A ( x, y ) = A ( x, y ) + B ( x, y ) cos (Аф( x, y + kd )) I2 ( x, y ) = A( x, y ) + B ( x, y ) cos (Аф( x, y + 2kd ))

I3(x,y) = A(x,y) + B(x,y)cos(Аф(x,y + 3kd)) . Тогда оптическая толщина Аф(ху) вычисляется как

(3.1)

.(3.2)

Функция Аф несет в себе количественную информацию об оптических и геометрических свойствах измеряемого объекта и определяется следующим соотношением

Аф( х, у, г ) = К п ( х, у, г)-По) dz,

(3.3)

где п(х,у,2,/) - показатель преломления объекта, п0 - показатель преломления среды, X - длина волны излучения, 2 - высота объекта в заданной точке.

3.2 Культуры клеток

В качестве материалов исследования выступали культуры раковых и нормальных эпителиальных клеток, выделенных из аналогичного источника

(ткани, органа). В качестве модельной линии клеток злокачественной опухоли эпителиального происхождения (раковых) была выбрана линия MCF-7 (карцинома молочной железы человека), в качестве нормальных клеток - MCF-10A (эпителий молочной железы человека). В сравнительных исследованиях использовали также нормальные клетки линии НЕК 293 (эмбриональные клетки почки человека). Линии MCF-7 и НЕК 293 культивировали в среде DMEM с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки MCF-10A выращивали в среде DMEM/F12 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 5% лошадиной сыворотки, эпителиального фактора роста, EGF (20 нг/мл), гидрокортизона (0,5 нг/мл) и инсулина (10 нг/мл). Клетки культивировали в условиях 5% СО2, при 37°С [108].

3.3 Подготовка образцов

Подготовку препаратов клеток раковых и нормальных эпителиальных клеток человека осуществляли следующим образом.

В чашку Петри помещали одно или несколько покровных стекол, избегая их перекрещивания, и стерилизовали в сухожаровом шкафу в соответствии с режимом. Затем, в стерильную чашку Петри со стеклами в стерильных условиях ламинарного бокса вносили 10 мл культуральной среды, в соответствии с требованиями культивирования исследуемой культуры клеток, не допуская образования пузырей и пены, и 1 мл клеточной суспензии с концентрацией 1х105 клеток/мл. Для того чтобы распределить клетки диффузно в объёме среды в чашке Петри, содержимое закрытой чашки тщательно перемешивали осторожными движениями, не допуская выплёскивания за пределы внутренних краёв чашки. Далее чашку Петри на 48 часов помещали в СО2-инкубатор, в условия 5% содержания углекислого газа, при Т 37 °С.

По истечении указанного времени готовили препарат для сканирования методом ЛИМ. Для этого на зеркальную поверхность предметного стекла точечными касаниями ватной палочки равномерно в соответствии с периметром покровного стекла наносили силиконовую смазку, которая выступает в качестве спейсера. Затем при помощи пинцета за самый край доставали покровное стекло из чашки Петри. Жидкость, свободно стекающую на край, удаляли при помощи марли. Покровное стекло аккуратно укладывали на спейсер предметного стекла таким образом, чтобы клетки располагались между покровным и предметным стеклом, и прижимали точечными касаниями ватной палочки, придерживая стекло пальцами за боковые края. Оставшуюся среду аккуратно смывали с верхней поверхности готового препарата смоченной в воде марлей, излишки воды удаляли отжатой марлей [108].

3.4 Измерения оптической толщины клеток методом лазерной интерференционной микроскопии

Измерения оптической толщины и флуктуаций оптической толщины клеток выполняли на базе Пермского федерального исследовательского центра УрО РАН (г. Пермь) с помощью лазерного интерференционного микроскопа. Всего было измерено 93 клеток культуры MCF-7, 96 клеток культуры HEK 293 и 100 клеток культуры MCF-10A, результаты типовых измерений которых представлены на рисунке 3.4. На данных рисунках четко визуализируются область адгезии живых клеток (зеленый цвет), тонкий слой цитоплазмы (желтый цвет), ядра (красный цвет) и ядрышки (темно-красный цвет) [109].

Измерения флуктуаций оптической толщины клеток выполнялись с помощью лазерного интерференционного микроскопа, согласно следующему алгоритму:

1. выполнялась съемка фазового изображения исследуемой клетки (кадр №1);

2. через 60 секунд, выполнялась повторная съемка фазового изображения клетки (кадр №2);

3. рассчитывался разностный кадр путем вычитания кадра №1 из кадра №2;

4. определялось положение скан-линии, вдоль которой в дальнейшем осуществлялась регистрация флуктуаций оптической толщины клетки;

5. измерялись флуктуации оптической толщины клетки вдоль установленной скан-линии в течение 250 секунд (8192 скан-линии), которые сохранялись в виде трек-диаграмм.

(а) (б)

5 10 15

X, мкм

Рисунок 3.4 - Фазовые изображения клеток культур (а) МСБ-7, (б) НЕК 293,

(в) МСБ-10Л

Всего было измерено 15 клеток культуры МСБ-7, 15 клеток культуры НЕК 293 и 23 клетки культуры МСБ-10Л, типовой результат измерений которых представлен на рисунке 3.5.

50 100 150 200

с

Рисунок 3.5 - Результаты регистрации флуктуаций оптической толщины клетки культуры MCF-7 методом

лазерной интерференционной микроскопии

3.5 Выделение морфометрических показателей фазовых изображений клеток

В качестве количественных характеристик, на которых базируется критерий дифференциации патологически измененных и нормальных эпителиальных клеток, использовались морфометрические показатели клеток. Под морфометрическими показателями понимаются геометрические характеристики фазовых изображений клеток, а именно: высота, минимальный и максимальный диаметры, периметр, площадь и объем. Данные характеристики применительно к исследованиям биологических объектов на основе методов количественной фазовой микроскопии были впервые подробно описаны в работе [110], посвященной исследованию нормальных и патологически измененных эритроцитов человека. Авторами было показано, что такие морфометрические показатели как периметр и объем фазовых изображений могут быть использованы в качестве маркеров патологии.

Для того чтобы вычислить морфометрические показатели клеток, определялся контур фазового изображения, согласно методу Кэнни [111]. На рисунке 3.6 представлено фазовое изображение клетки МСБ-7 с выделенным по методу Кэнни контуром.

5 10 15 20 25

X, МКМ

Рисунок 3.6 - Фазовое изображение раковой клетки MCF-7. Сплошная линия выделяет контур клетки

Высота фазового изображения рассчитывалась как разница между минимальным и максимальным значениями локальных задержек фазы внутри контура

Л = АФшах ^п , (3.4)

где И - высота фазового изображения клетки, Л<^тах, Л<^тт - это максимальное и минимальное значение оптической толщины клетки соответственно. Далее в рамках данного контура рассчитывались все возможные диаметры и из них выбирался минимальный и максимальный ^тах). Периметр, площадь и объем фазового изображения клетки рассчитывались согласно следующим соотношениям

Р = /ЯЪ, (3.5)

5 = /2 (па+ п6}), (3.6)

V = 11 /мх,У), (3.7)

где Р - это периметр фазового изображения клетки, I - размер пикселя, пО -количество точек, принадлежащих множеству точек контура О, пт -количество точек внутри контура О, V - объем фазового изображения клетки, Лф(х,у) - значение фазовой толщины клетки в точке (х,у). Алгоритм расчета морфометрических реализован в пакете прикладных программ MathWorks МаНаЬ на высокоуровневом языке программирования Ма^аЬ и получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «Программный модуль для анализа фазовых изображений раковых и нормальных клеток» № 2019663291 от 15.10.2019.

3.6 Математическая обработка флуктуаций оптической толщины клетки

Обработка данных лазерной интерференционной микроскопии клеток осуществлялась на основе анализа динамических параметров, получаемых с помощью построения фазовых портретов, и применением метода

максимумов модулей вейвлет-преобразования, реализующего мультифрактальный анализ. Для этого из каждой трек-диаграммы выделялся сигнал, который имел наибольшую амплитуду флуктуаций оптической толщины. Далее выполнялась высокочастотная фильтрация сигнала, строились фазовые портреты и применялся метод максимумов модулей вейвлет-преобразования. По фазовым портретам определялись ширина фазового портрета в горизонтальном и вертикальном направлениях, средний радиус области, заполняемой фазовым портретом. По результатам применения метода максимумов модулей вейвлет-преобразования находился спектр сингулярностей и по нему вычислялись его ширина, значение показателя Гёльдера, соответствующее максимуму спектра сингулярностей и показатель Хёрста. Таким образом, в результате обработки флуктуаций оптической толщины клетки получался следующий набор динамических параметров: ширина фазового портрета в горизонтальном и вертикальном направлениях; средний радиус области, заполняемой фазовым портретом; ширина спектра сингулярностей, значение показателя Гёльдера, соответствующее максимуму спектра сингулярностей, и показатель Хёрста.

3.6.1 Алгоритм анализа фазовых портретов

Фазовые портреты анализируемых сигналов строились для двумерного случая (Лф(0, &(Лф(^)/&). Производная функции Лф() рассчитывалась по следующему соотношению

с1ьт_ т -1) -т+1) (38)

& 2Д '

где Л1 - шаг по времени.

Результаты построения фазовых портретов для клеток культур МСБ-7, НЕК 293 и МСБ-10Л представлены на рисунке 3.7а, б, в соответственно. По полученным фазовым портретам вычислялись следующие динамические параметры

Я(Аф) = Афтах - ДФт-т, (3.9)

Я (& ( Аф) / &) = (& ( Аф) / &)тах - (& ( Аф) / &)тт, (3.10)

А^(АФ)2 +((&(Аф)/ &))2, I = , (3.11)

1 N

м (р)=1 е я> <3л2)

^ ¿=1

где Я(^) - ширина фазового портрета, р - радиус области, заполняемой фазовым портретом, N - длина сигнала Лф, М(р) - средний радиус области, заполняемой фазовым портретом. При этом в соотношении (3.11) использовались безразмерные значения Лф и ^(Лф)/Л.

3.6.2 Алгоритм мультифрактального анализа флуктуаций оптической толщины клетки

Мультифрактальный анализ позволяет исследовать неоднородные и нестационарные сигналы с целью определения их фрактальных характеристик. Данный вид анализа позволяет установить какими свойствами обладает изучаемый сигнал - свойствами монофрактала (однородного фрактала) или мультифрактала (неоднородного фрактала).

Как известно, существует множество математических подходов и алгоритмов, реализующих мультифрактальный анализ. Среди них подходы на основе частичных функций, структурных функций, вейвлет-преобразовании, флуктуаций с удаленным трендом и прочие. В данной работе был выбран метод максимумов модулей вейвлет-преобразования, как один из наиболее универсальных и простых методов реализующих мультифрактальный формализм.

Метод максимумов модулей вейвлет-преобразования (ММВП) впервые был предложен в начале девяностых годов прошлого столетия в работе [112]. Данный метод предназначен для анализа нестационарных сигналов различной природы. Безусловными преимуществами метода ММВП, которые

выделяют его среди классических подходов, являются исключительная чувствительность к любым видам сингулярностей исследуемой функции (при этом регулярное поведение «отфильтровывается»), возможность исследования корреляционных зависимостей по всему пространству и на различных масштабах, а также относительно малая погрешность вычисления скейлинговых характеристик.

Алгоритм метода ММВП состоит из двух этапов [113-114]. На первом этапе выполняется непрерывное вейвлет-преобразование (НВП) анализируемого сигнала у(х)

где х0 - пространственный параметр, а (> 0) - масштабный параметр, щ(х) -анализирующий вейвлет, в качестве которого используется вейвлет «мексиканская шляпа»

Данный вейвлет является второй производной функции Гаусса и имеет два нулевых момента, что позволяет с его помощью выявлять всю необходимую информацию о сингулярностях анализируемой функции. На анализирующий вейвлет накладывается условие равенства нулю моментов более высоких порядков, нежели порядок рассматриваемого вейвлета (в данном случае более второго порядка)

где п¥ - порядок анализирующего вейвлета. В результате НВП функции у(х) определяются вейвлет-коэффициенты (Жу)(х,а). Таким образом, в трехмерном пространстве (вейвлет-коэффициентов, пространственного и масштабного параметров) можно построить поверхность вейвлет-коэффициентов. Наиболее важная информация содержится в линиях локальных экстремумов данной поверхности, поиск которых осуществляется

х ) = (х2 -1) ехр (—х2 / 2 ).

(3.14)

(3.15)

на каждом масштабе по всему пространству. Совокупность таких линий называется скелетоном. Выделением скелетона заканчивается первый шаг алгоритма метода ММВП.

На втором шаге алгоритма метода ММВП выполняется поиск спектра сингулярностей. Для этого рассчитываются частичные функции согласно следующему соотношению

где Да) - множество линий локальных экстремумов (/) существующих масштабу а, х/ определяют координаты экстремума, относящегося к линии /, на масштабе а, а'- масштаб меньший заданного масштаба а. Соотношение (3.16) означает, что выбирается максимальное значение модуля локального экстремума (коэффициентов вейвлет-преобразования) вдоль каждой линии на масштабах меньших заданного значения а.

Далее определяется показатель скейлинга (или скейлинговая экспонента) т(д) согласно зависимости

при а ^ 0.

Величина т(д) для некоторого значения д вычисляется по наклону зависимости (3.17) в логарифмических координатах. Затем используется преобразование Лежандра для того, чтобы определить гёльдеровский показатель а и построить спектр сингулярностей анализируемой функции

Если т(д) имеет линейную зависимость от д (а=дт(д)/дд=сош1:) или ширина спектра сингулярностей /(а) стремится к 0, следовательно, анализируемая функция монофрактальна, если же зависимость между т( д) и

(3.16)

(3.17)

а = дт(д)/дд

(3.18)

q нелинейная (а=дт(д)/дд^еош1:) или ширина спектра сингулярностей отлична от 0, тогда это признак мультифрактальности.

Авторами метода отмечается, что расчеты, выполняемые на втором этапе, можно проводить на основе структурных функций. Однако их использование накладывает ограничение на величину д (а именно, д>0). В то время как использование частичных функций при отрицательных значениях д характеризуют особенности скейлинга для «малых» сингулярностей, а положительные - для «больших» сингулярностей.

Визуализация результатов применения алгоритма метода модулей максимумов модулей вейвлет-преобразования, описанного в разделе 4.1, для анализа флуктуаций фазовой толщины раковых и нормальных клеток культур МСБ-7, НЕК 293 и МСБ-10Л представлена на рисунке 3.7г, е, д соответственно.

(а) (б) (в)

20 -10 0 10 20 30 40 -15 -10 -5 0 5 10 -20 -10 0 10 20

Дф, нм Дф, ни Дф, нм

(Г) (Д) (е)

1 -0,5 0 0,5 1 1.5 0.15 0.2 0,25 0.3 0,35 0,4 0.45 0.25 0.3 0,35 0,4 0.45

Рисунок 3.7 - Типовые результаты обработки флуктуаций оптической толщины клеток культур MCF-7 (красный цвет), MCF-10A (синий цвет), НЕК 293 (зеленый цвет), методами анализа фазовых портретов и максимумов

модулей вейвлет-преобразования

По полученным спектрам сингулярностей вычислялись следующие динамические параметры

где атах, атт - это максимальное и минимальное значения показателя Гёльдера. Также по мультифрактальному спектру определялся показатель Хёрста (Н). Алгоритм метода ММВП реализован в пакете прикладных программ MathWorks МаНаЬ на высокоуровневом языке программирования МаНаЬ и получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «МаШТгашйят» № 2015661814 от 09.11.2015.

3.7 Сравнительный анализ морфометрических показателей раковых и нормальных клеток

Анализ морфометрических параметров для дифференциации раковых и нормальных клеток проводился для двух случаев: сравнение клеток культуры МСБ-7 с клетками линии НЕК 293 и сравнение клеток культуры MCF-7 с клетками MCF-10A. В качестве метода оценки статистически значимой разницы был выбран двухвыборочный непараметрический тест Уилкоксона-Манна-Уитни. Для оценки взаимосвязи между исследуемыми показателями одной культуры применяли непараметрический тест ранговой корреляции Спирмена.

На первом этапе было проведено сравнение морфометрических показателей клеток злокачественной опухоли эпителиального происхождения из молочной железы человека MCF-7 и нормальных клеток почки человека НЕК 293. Установлено (рисунки 3.8, 3.9), что по всем морфометрическим показателям исследуемые выборки имеют статистически значимые различия (р < 0,001).

(3.19)

(3.20)

а0 =а( д = 2),

(Д) (е)

НЕК 293 МСР-7 НЕК 293 МСР-7

Рисунок 3.8 - Сравнение морфометрических показателей нераковых (НЕК 293) и раковых (МСР-7) клеток: сравнение высоты фазового рельефа (а); сравнение по минимальному и максимальному диаметрам фазового изображения (б, в); сравнение по периметру и площади фазового изображения (г, д); сравнение объема фазового рельефа клеток (е). Средняя горизонтальная линия - это медианное значение выборки. Верхняя и нижняя горизонтальные границы бокса - это 75-процентная и 25-процентная

квантили соответственно. Верхний и нижний доверительные интервалы соответствуют экстремальным значениям выборки. Красные точки (+) -точки выборки, которые выходят за границы доверительных интервалов

Проведена оценка парной корреляции морфометрических показателей культур МСБ-7 и НЕК 293. В таблице №3.3 представлены результаты оценки парных корреляций высоты фазового изображения клетки И, объема фазового изображения клетки V и среднего радиуса фазового изображения клетки М(г) определяемого как

Данные показатели выбраны на основе анализа распределений их относительной вероятности (рисунок 3.10). Критерием служила малость области пересечения распределений относительной вероятности исследуемых параметров. Полученные результаты показали положительные корреляционные зависимости взаимосвязи для всех пар за исключением И -М(г) для культуры НЕК 293.

Таблица 3.3 - Корреляционные взаимосвязи высоты фазового изображения клетки И, объема фазового изображения клетки V и среднего радиуса фазового изображения клетки М(г) для культур МСБ-7, НЕК 293 и МСБ-10Л

(3.21)

Культура клеток

Корреляционные взаимосвязи

И - V

И - М(г)

V - М(г)

МСБ-7

0,6097***

0,3292***

0,8739***

НЕК 293

0,4739***

-0,0175

0,8021***

МСБ-10Л

0,4205***

-0,0110

0,8388***

0.16

-о 0.14

I 0.12

9- 0.1

0.08

0.06

0.04

0.02

^НЕК 293 Д И МСР-7

А

(в)

10

(г)

12

14

(д)

(е)

Рисунок 3.9 - Распределения высоты (а), минимального диаметра (б), максимального диаметра (в), периметра (г), площади (д) и объема (е) фазовых изображений клеток культур МСБ-7 (красный цвет) и НЕК 293

(зеленый цвет)

Исследуемая в качестве модельной линия раковых клеток MCF-7 является широко используемой клеточной линией рака молочной железы, которая была выделена более 40 лет назад из инвазивной аденокарциномы [115]. МСБ-7 представляет собой слабоагрессивную и неинвазивную клеточную линию с низким метастатическим потенциалом [116]. Эта линия является наиболее подходящей клеточной линией для исследований рака молочной железы во всем мире, в том числе чувствительности раковых клеток в отношении противоопухолевых препаратов [117]. По морфологии МСБ-7 относится к эпителиальным клеточным линиям, а на основании оценки уровня экспрессии определенных маркеров - к клеткам люминального типа [118].

Клетки НЕК 293 были получены в 1977 году путем вирусной трансформации клеток эпителия почки эмбриона человека [119]. Клетки НЕК 293 часто используются в экспериментах в качестве контрольной нераковой клеточной линии. Имеются данные об исследованиях свойств клеток данной линии, где указано на большее сходство клеток НЕК 293 с надпочечниками, нежели с почками. Выявлено сходство клеток НЕК 293 с низкодифференцированной нервной тканью [120].

На основе результатов статистического и корреляционного анализа для корректного сравнения морфометрических свойств клеток культур МСР-7 и НЕК 293 предложено использовать следующие безразмерные комплексы И/Ы(г) и ¥/(0,5ХБ0), где 5Ь = 4/3 п г2. На рисунке 3.10 представлены гистограммы относительной вероятности этих комплексов. Видно, что они накладываются одна на другую и не позволяют дифференцировать клетки из разных источников (тканей, органов): клетки злокачественной опухоли молочной железы эпителиального происхождения МСР-7 от нормальных клеток эпителия почки НЕК 293.

Рисунок 3.10 - Распределения безразмерных комплексов к/М(г) (а), У1(0,5ХБо) (б) клеток культур МСБ-7 (красный цвет) и НЕК 293 (зеленый цвет)

На втором этапе было проведено сравнение морфометрических показателей клеток, выделенных из одного источника - молочной железы человека: клеток злокачественной опухоли эпителиального происхождения MCF-7 и нормальных клеток MCF-10A. Установлено (рисунок 3.11), что по всем морфометрическим показателям исследуемые выборки имеют статистически значимые различия ф < 0,001).

Проведена оценка парной корреляции морфометрических показателей культур MCF-7 и MCF-10A. В таблице №3.3 представлены результаты оценки парных корреляций высоты фазового изображения клетки к, объема фазового изображения клетки У и среднего радиуса фазового изображения клетки М(г). Данные показатели выбраны на основе анализа распределений их относительной вероятности (рисунок 3.12). Критерием служила малость области пересечения распределений относительной вероятности исследуемых параметров. Полученные результаты показали положительные корреляционные зависимости взаимосвязи пар за исключением к - М(г) для культуры MCF-10A.

(в) (г)

(д) (е)

Рисунок 3.11 - Сравнение морфометрических показателей нераковых (МСБ-10Л) и раковых (МСБ-7) клеток: сравнение высоты фазового рельефа (а); сравнение по минимальному и максимальному диаметрам фазового изображения (б, в); сравнение по периметру и площади фазового изображения (г, д); сравнение объема фазового рельефа клеток (е). Средняя горизонтальная линия - это медианное значение выборки. Верхняя и нижняя

горизонтальные границы бокса - это 75-процентная и 25-процентная квантили соответственно. Верхний и нижний доверительные интервалы соответствуют экстремальным значениям выборки. Красные точки (+) -точки выборки, которые выходят за границы доверительных интервалов

На основе результатов статистического и корреляционного анализа для корректного сравнения морфометрических параметров клеток МСБ-7 и МСБ-10Л предложено использовать следующие безразмерные комплексы И/М(г) и ^(0,5Л£Ь), где 5Ь = 4/3 п г2. На рисунке 3.13 представлены гистограммы относительной вероятности этих комплексов. Из анализа данных распределений выведены критерии дифференциации нормальных и патологически измененных клеток, полученных из одной и той же ткани (органа), на примере раковых и нормальных клеток молочной железы человека.

Критерий формулируются следующим образом. Эпителиальная клетка молочной железы человека считается нормальной, если значение И/М(г) не превышает 2,2 х 104 и значение М(0,5АБ0) не превышает 0,02, в противном случае исследуемая клетка - раковая (см .рисунок 3.12).

Как упоминалось выше, такие параметры как периметр и объем фазового изображения могут служить критерием для оценки патологического состояния эритроцитов [110]. Имеются также данные об использовании оптической толщины клетки для обнаружения различий между раковой и нормальной клеткой молочной железы на примере 55 образцов, полученных от 11 пациентов с диагнозом рак молочной железы [121]. Однако, данный критерий применим исключительно к клеткам молочной железы человека, так как базируется на оценке только одного параметра, который к тому же измеряется в абсолютных величинах (нм). Полученные в данном разделе критерии базируются на значениях безразмерных комплексов морфометрических показателей, что обусловливает возможность применения последних для дифференциации клеток злокачественной опухоли эпителиального происхождения (раковых клеток).

(в)

(г)

(д)

(е)

Рисунок 3.12 - Распределения высоты (а), минимального диаметра (б), максимального диаметра (в), периметра (г), площади (д) и объема (е) фазовых изображений клеток культур MCF-7 (красный цвет) и MCF-10A

(синий цвет)

Рисунок 3.13 - Распределения безразмерных комплексов й/М(г) (а), У/(0,5ХБо) (б) клеток культур МСБ-7 (красный цвет) и МСБ-ЮЛ (синий цвет)

Поэтому дальнейшие исследования должны проводиться на клетках из одного источника (органа, ткани). Результаты морфометрических исследований фазовых изображений раковых и нормальных клеток опубликованы в работе [122].

3.8 Сравнительный анализ динамических параметров раковых и нормальных клеток

Анализ динамических параметров для дифференциации раковых и нормальных клеток проводился для двух случаев: сравнение культуры MCF-7 с клетками линии НЕК 293 и с клетками MCF-10A. В качестве метода оценки статистически значимой разницы был выбран двухвыборочный непараметрический тест Уилкоксона-Манна-Уитни.

На рисунке 3.14 представлены результаты сравнения динамических показателей клеток линий НЕК 293, МСБ-ЮЛ и МСБ-7. Установлено (таблица №3.4), что линии НЕК 293 и МСБ-7 имеют статистически значимые различия по следующим динамическим показателям: ^(Дф), Л(^(Дф)/^), М(р), Н, ао, в то время как линии МСБ-ЮЛ и МСБ-7 различны только по Н, ао, Да. При этом раковым клеткам соответствует монофрактальный спектр сингулярностей, а нормальным клеткам - мультифрактальный.

(в)

(д)

(г)

(е)

Рисунок 3.14 - Сравнение динамических показателей клеток линий НЕК 293, MCF-10A и MCF-7: сравнение по Я(Аф) (а); Я(<1(Аф)/<Н) (б); М(р) (в); Н (г); а (д) и Аа (е). Средняя горизонтальная линия - это медианное значение выборки. Верхняя и нижняя горизонтальные границы бокса - это 75-

процентная и 25-процентная квантили соответственно. Верхний и нижний

доверительные интервалы соответствуют экстремальным значениям выборки. Красные точки (+) - точки выборки, которые выходят за границы

доверительных интервалов На основе результатов статистического анализа для критерия

дифференциации нормальных и раковых клеток предложено использовать (1)

показатель Хёрста, так как в сравнительных экспериментах клеток раковой

линии с нормальными клетками, полученными из различных органов,

результаты теста Уилкоксона-Манна-Уитни показали наибольшую степень

различия, а также (2) ширину мультифрактального спектра, при этом только

раковые клетки имели монофрактальную динамику.

Таким образом, критерий заключаются в следующем. Эпителиальная

клетка человека считается раковой, если значение Н превышает значение

0,45 и ширина спектра сингулярностей равна 0 (т.е. он монофрактален), в

противном случае исследуемая клетка считается нормальной. Предложенный

критерий позволяет дифференцировать раковую клетку от нормальной,

независимо от источника (ткани, органа) их происхождения. Результаты

исследований прижизненной динамики раковых и нормальных клеток с

помощью лазерной интерференционной микроскопии опубликованы в

работах [100, 108, 123, 124, 125].

Таблица 3.4 - Результаты статистического анализа (р-значение) динамических показателей клеток для культур MCF-7, НЕК 293 и MCF-10A

Культуры Динамические показатели

клеток ЖАф) Д(Д(Аф)М0 М(р) Н а0 Аа

НЕК 293 и 0,005** 0,014* 0,009** 0,002** 0,046* 0,054

MCF-7

MCF-10A и 0,156 0,228 0,909 1,8е- 2,4е- 2,9е-

MCF-7 5*** 5*** 4***

Алгоритм сравнительного анализа динамических параметров флуктуаций оптической толщины раковых и нормальных клеток реализован в пакете прикладных программ MathWorks Matlab на высокоуровневом языке

программирования МаНаЬ и получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ «Программный модуль для анализа флуктуаций оптической толщины раковых и нормальных клеток» № 2019663291 от 10.10.2019.

3.9 Выводы по разделу

Предложен объективный диагностический критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека на основе оценки высоты и объема фазового изображения клетки, получаемого методом лазерной интерференционной микроскопии. Критерий формулируются следующим образом. Эпителиальная клетка молочной железы человека считается нормальной, если значение Н/М(г) не превышает 2,2 х 104 и значение У/(0,5Л£0) не превышает 0,02, в противном случае исследуемая клетка - раковая.

Установлен критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток на основе анализа результатов измерений флуктуаций оптической толщины клетки методом мультифрактального анализа данных лазерной интерференционной микроскопии. Критерий заключаются в следующем. Эпителиальная клетка человека считается раковой, если значение Н превышает значение 0,45 и ширина спектра сингулярностей равна 0 (т.е. он монофрактален), в противном случае исследуемая клетка считается нормальной. Предложенный критерий позволяет дифференцировать раковую клетку от нормальной, независимо от источника (ткани, органа) их происхождения.

4 Мультифрактальный анализ нелинейной кинетики ДНК

Раздел посвящен мультифрактальному анализу данных численного моделирования нелинейной кинетики молекулы ДНК одномерным методом максимумов модулей вейвлет-преобразования. Обсуждается эффективность применения мультифрактального анализа для обработки сигналов биологического происхождения. С помощью метода максимумов модулей вейвлет-преобразования выполняется мультифрактальный анализ по данным численного моделирования нелинейной кинетики ДНК. Выдвигается гипотеза о причинах нарушения функционирования молекулы ДНК по результатам анализа и обсуждается возможный способ проверки или опровержения данного предположения.

4.1 Мультифрактальный анализ сигналов биологического происхождения

Как, известно, многие сигналы биологического происхождения являются сильно неоднородными и нестационарными, и для их анализа целесообразно применять универсальные методы, эффективность которых не зависит от свойств стационарности регистрируемых процессов [126]. Мультифрактального анализ относится к категории подобных методов. Как показано в ряде исследований [127-132] динамика очень многих биологических систем обладает мультфрактальными свойствами.

Так в работах [127-129] выявлено, что сигналы, характеризующие сердечный ритм человека, обладают мультифрактальными свойствами. В частности, сердечный ритм здорового человека обладает мультифрактальными свойствами, в то время как человека с патологией -монофрактальными. На основе данного результата был предложен критерий нарушения работы сердца человека [1 29].

Четкое разделение фрактальных свойств было обнаружено при мультифрактальном анализе цифровых маммограмм молочных желез человека [133]. Авторы обнаружили, что железистые ткани по своей структуре являются мультифрактальными. Жировые ткани молочной железы демонстрировали монофрактальные свойства.

В работе [134] установлено, что температурные сигналы снятые с поверхности молочных желез с опухолью характеризуются монофрактальными свойствами по сравнению с температурными сигналами, снятыми с поверхности противоположных непораженных молочных желез, где наблюдаются мультифрактальность. На основе данного результата был предложен критерий состояния «здоровья» и патологии молочной железы человека.

Можно заключить, что мультифрактальный анализ представляет интерес как потенциальный инструмент диагностики состояния ДНК. Поэтому был выполнен мультифрактальный анализ результатов моделирования нелинейной кинетики ДНК с целью определения мультифрактальных характеристик для различных диапазонов структурного параметра.

4.2 Применение метода максимумов модулей вейвлет-преобразования для анализа данных численного моделирования нелинейной кинетики ДНК

С помощью метода максимумов модулей вейвлет-преобразования, алгоритм которого приведен в разделе 3.6.2, был выполнен мультифрактальный анализ по данным численного моделирования нелинейной кинетики ДНК. Для трех характерных нелинейных режимов системы задается функция распределения структурного параметра 8 при различных значениях её разброса. На рисунке 4.1,а представлена функция распределения параметра 8 для 8 с < 8 < 8г. Выполнено численное

моделирование нелинейной кинетики молекулы ДНК для каждого режима и оценивается суммарная свободная энергия системы в каждый момент времени. Полученные данные анализируются одномерным методом максимумов модулей вейвлет-преобразования с целью определения мультифрактальных свойств. Устанавливается связь между результатами измерения флуктуаций оптической толщины раковых и нормальных эпителиальных клеток в области ядрышка и характерными нелинейными режимами ДНК на основе мультифрактальных свойств анализируемых сигналов (см. рисунок 4. 1,б,в).

(а) (б) (в)

Рисунок 4.1 - Мультифрактальный анализ динамики ДНК по данным численного моделирования. (а) Распределения структурного параметра 3 при

различных значениях дисперсии а для диапазона 3С < 3 < 31 (б) Типовые мультифрактальные спектры Д(а) суммарной свободной энергии системы для трёх диапазонов 3: 3 < 3С (красная линия с круглыми маркерами), 3С < 3 < 3г (черная линия с треугольными маркерами) и 3 > 3г (синяя линия с квадратными маркерами) (в) Зависимости ширины мультифрактального спектра Да от дисперсии а распределения структурного параметра 3 для 3 < 3С (красная линия с круглыми маркерами), 3С < 3 < 3г (черная линия с треугольными маркерами), 3 > 3г (синяя линия с квадратными маркерами)

Установлено, что для 3 > 31 с увеличением дисперсии значений структурного параметра 3 увеличивается ширина мультифрактального спектра. Для 3С < 3 < 31 рост дисперсии не влияет на ширину спектра сингулярностей, при этом динамика ДНК остается мультифрактальной. Переход через критическую точку приводит к резкому изменению значений структурного параметра, переходу системы в область метастабильности и зарождению автосолитонов (уединенных волн),

способных к перемещению вдоль цепи ДНК. Данная способность открытых комплексов может быть связана с важнейшей функцией ДНК -транскрипцией (см. рисунок 4.2).

РНК-поли мераа а

Рисунок 4.2 - Обобщенная схема основных стадий транскрипции [19]

При значениях структурного параметра 8 меньших 5С происходит переход системы в качественно новое состояние, характеризующееся вырождением мультифрактального спектра в монофрактальный. На основе данного результата было выдвинуто предположение, что достижение структурным параметром 8 критического значения 8С приводит к неограниченному росту числа открытых комплексов. Это влечет за собой качественное изменение процесса экспрессии генов и, как следствие, нарушение функций ДНК, что приводит к «перерождению» нормальной клетки в раковую в условиях ее неконтролируемого деления [135].

4.3 Интерпретация данных лазерной интерференционной микроскопии раковых и нормальных клеток с помощью статистической модели нелинейной кинетики ДНК

Чтобы подтвердить или опровергнуть предположение, выдвинутое в разделе 4.2, было выполнено сопоставление результатов цикла натурных экспериментов по измерению флуктуаций оптической толщины ядрышка раковых и нормальных клеток с результатами моделирования динамики молекулы ДНК при различных значениях структурного параметра.

На основе сравнительного анализа результатов мультифрактального анализа данных лазерной интерференционной микроскопии раковых и нормальных клеток различной области локализации (рисунок 3.14е) и данных численного моделирования нелинейной кинетики ДНК (рисунок 4.11) можно заключить, что достижение структурным параметром 3 критического значения 3С приводит к неограниченному росту числа открытых комплексов (см. рисунок 4.3).

(а) (б)

Рисунок 4.3 - (а) Схематическое изображение процесса термической денатурации молекулы ДНК [64]. (б) Результаты численного моделирования

процесса денатурации

Это влечет за собой качественное изменение процесса экспрессии генов и, как следствие, нарушение функций ДНК и «перерождение» нормальной клетки в раковую в условиях ее неконтролируемого деления.

4.4 Выводы по разделу

Сопоставлением результатов моделирования и данных лазерной интерференционной микроскопии продемонстрирована возможность применения предложенной модели для анализа процессов эволюции клеток, в том числе патологического характера, на основе анализа качественных различий прижизненной динамики клеток, базирующейся на закономерностях «критичности» ДНК-системы для различных диапазонов значений структурного параметра термализации неравновесной системы. Также предложена интерпретация процесса транскрипции на основе предложенной математической модели нелинейной кинетики молекулы ДНК.

Рассмотрены проблемы математического описания нелинейной кинетики молекулы ДНК. На основании анализа теоретических работ по математическому моделированию ДНК выбран класс, соответствующий второму уровню иерархии математических моделей ДНК. При разработке модели ДНК используется статистико-термодинамический подход с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов. На основе анализа экспериментальных работ был выбран перспективный прямой метод исследования клеточных структур, в частности ядрышка клетки - лазерная интерференционная микроскопия. Целью работы являлась разработка математической модели молекулы ДНК, позволяющей описать её термодинамические и кинетические свойства с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов, и применение результатов моделирования для интерпретации данных лазерной интерференционной микроскопии нормальных и раковых клеток.

Основные результаты диссертационной работы заключаются в следующем:

1. Разработана математическая модель молекулы ДНК, основанная на статистической термодинамике и позволяющая описать термодинамические и кинетические свойства ДНК с учетом коллективного поведения ансамбля открытых комплексов.

2. Разработаны и реализованы алгоритмы на основе эффективных численных методов в виде комплексов проблемно-ориентированных программ для проведения моделирования нелинейной кинетики молекулы ДНК.

3. Предложен объективный диагностический критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток молочной

железы человека на основе оценки высоты и объема фазового изображения клетки.

4. Установлен критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток на основе анализа результатов измерений флуктуаций оптической толщины клетки методом мультифрактального анализа.

5. На основе сопоставления результатов моделирования и данных лазерной интерференционной микроскопии продемонстрирована возможность применения предложенной модели для анализа процессов эволюции клеток, в том числе патологического характера, на основе анализа качественных различий прижизненной динамики клеток, базирующейся на закономерностях «критичности» ДНК-системы для различных диапазонов значений структурного параметра термализации неравновесной системы.

Разработанная математическая модель нелинейной кинетики ДНК, учитывающая коллективное поведение ансамбля открытых комплексов имеет перспективу применения для анализа патологических процессов клеток различной природы, например, контрактуры Дюпюитрена, а также для изучения функций ДНК, таких как регуляция генной экспрессии, эффекты дальнодействия и интеркаляция. Кроме того, установленные критерии выявления патологически измененных клеток могут оказаться востребованными при разработке новых клинических методик дифференциации раковых и нормальных клеток.

1. Klevecz, R.R. A genomewide oscillation in transcription gates DNA replication and cell cycle / Klevecz R.R., Bolen J., Forrest G., Murray D.B. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2004. - Vol. 100. - P. 1200-1205.

2. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors / Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. -2006. - Vol. 131. P. 861-872.

3. Young, R.A. Control of the embryonic stem cell state / Young RA // Cell 2011. - Vol. 144, P. 940-945.

4. Kauffman, S.A. The origins of order: Self-organization and selection in evolution. - Oxford University Press, New York, 1993. - 709 p.

5. Huang, S. Cell fates as high-dimensional attractor states of a complex gene regulatory network / Huang S., Eichier G., Bar-Yam Y., Ingber D.E. // Phys Rev Lett. - 2005. - Vol. 94. - P. 128701-128705.

6. Tsuchiya, M. Collective dynamics of specific gene ensembles crucial for neutrophil differentiation: The existence of genome vehicles revealed / Tsuchiya M., Piras V., Giuliani A., Tomita M., Selvarajoo K. // PLOS One. - 2010. - Vol. 5. - P.12116.

7. Waddington, C. Canalization of development and the inheritance of acquired characters / Waddington C.H. // Nature. - 1942. - Vol. 150. - P. 563-565.

8. Marco, J.F. Statistical mechanics of supercoiled DNA / Marco J.F., Siggia E.D. // Phys. Rev. E. -1995. - V. 52. - No. 3. - P. 2912-2938.

9. Peyrard, M. Statistical mechanics of a nonlinear model for DNA denaturation / Peyrard M., Bishop A.R. // Phys. Rev. Lett. - 1989. - V. 62. - №. 23. - P. 2755-2758.

10. Наймарк, О.Б. Структурно-скейлинговые переходы и локализованные моды дисторсии в двойной спирали ДНК / Наймарк О.Б. // Физическая мезомеханика. - 2006. - Т. 9. - № 4. - С. 15-29.

11. Кононенко, В. Л. Когерентное и некогерентное оптическое зондирование динамических флуктуаций формы эритроцитов / Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. // Изв. РАН. Сер. физическая. 1999. Т. 63. № 6. С. 11661172.

12. Кононенко, В.Л. Спонтанные и вынужденные колебания клеточной мембраны нормальных эритроцитов человека: отсутствие резонансных частот в области 0.03-500 Гц / Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. // Биол. мембраны. 2000. Т. 17. № 3. С. 289-301.,

13. Kononenko, V.L. Flicker spectroscopy of erythrocytes: a comparative study of several theoretical models / Kononenko V.L. // Proc. SPIE. 1994. V. 2082. P. 236-247.,