Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.03, кандидат химических наук Горшков, Владимир Александрович

• Горшков, Владимир Александрович
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Горшков, Владимир Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль пептидов в живых организмах.

1.1.1. Коммуникативные пептиды.

1.1.2. Мембраноактивные пептиды.

1.1.2.1. Строение мембраноактивных пептидов.

1.1.2.2. Механизм действия мембраноактивных пептидов.

1.1.2.3. Ингибиторы синтеза N0.

1.2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства Anura.

1.2.1. Синтез пептидов в организме амфибий.

1.2.2. Амфибии рода Rana и Hyla.

1.2.3. Кожные пептиды ранидных лягушек.

1.2.3.1. Мембраноактивные пептиды.

1.2.3.1.1. Активность дисульфидсодержащих пептидов.

1.2.3.1.2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи.2Р

1.2.3.2. Нейропептиды ранидных лягушек.

1.2.3.2.1. Тахикинины.

1.2.3.2.2. Ранатензины ибомбезины.

1.2.3.2.3. Брадикинины.

1.2.4. Пептиды хилидных лягушек.

1.2.4.1. Мембраноактивные пептиды.

1.2.4.1.1. Семейство дермасептина.

1.2.4.1.2. Пептиды-антибиотики австралийских квакш.

1.2.4.2. Нейропептиды.

1.2.4.2.1. Каерулины.

1.2.4.2.2. Опиоидные пептиды.

1.2.4.2.3. Триптофиллины.

1.3. Секвенирование пептидов.

1.3.1. Химические методы.

1.3.1.1. Метод Эдмана.

1.3.1.2. Леддерное секвенирование.

1.3.2. Методы генной инженерии.

1.3.3. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов и белков.

1.3.3.1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации.

1.3.3.1.1. Ионизация электрораспылением (ЭР).

1.3.3.1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ).

1.3.3.2. Тандемная масс-спектрометрия.

1.3.3.2.1. Диссоциация, активированная соударениями (ДАС).

1.3.3.2.2. Диссоциация при захвате (ДЭЗ) или переносе электрона (ДПЭ).

1.3.3.2.3. Фрагментация в МАЛДИ.

1.3.3.3. Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей.

1.3.3.4. Сложности масс-спектрометрического секвенирования.

1.3.3.4.1. Изомерные и изобарные аминокислоты.

1.3.3.4.2. Внутримолекулярная днсульфидная связь.

1.3.3.4.3. Масс-спектрометрические методы разрушения S-S связей.

1.3.3.4.4. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов.

1.3.3.5. Модификация N-концевой аминогруппы.

1.3.3.5.1. Введение незаряженной группы на N-конец пептида.

1.3.3.5.2. Введение отрицательно заряженной группы на N-конец пептида.

1.3.3.5.3. Введение положительно заряженной группы на N-конец пептида.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов.

2.2. Оптимизация ВЭЖХ разделения кожных секретов.

2.3. Детальное масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек.

2.3.1. Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ.

2.3.2. Ранидные лягушки.

2.3.2.1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов.

2.3.2.2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидометилировании и окислении дисульфидных связей.

2.3.2.3. Кожный пептидом озерной лягушки, Rana ridibunda.

2.3.2.4. Кожный пептидом прудовой лягушки, Rana lessonae.

2.3.2.5. Кожный пептидом съедобной лягушки, Rana esculenta.

2.3.2.6. Кожный пептидом травяной лягушки, Rana temporaria.

2.3.2.7. Кожный пептидом остромордой лягушки, Rana arvalis.

2.3.3. Хилидные лягушки.

2.3.3.1. Газофазная циклизация Ъ- и а-ионов коротких пептидов.

2.3.3.2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов.

2.3.3.3. Кожный пептидом квакши обыкновенной, Hyla arborea.

2.4. Экспресс-профилирование кожных секретов ранидных лягушек.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек»

В процессе длительной эволюции для защиты от хищников и паразитов амфибии выработали высокосложный химический арсенал. Секрет, выделяемый их кожными железами в стрессовых ситуациях, помогает им эффективно противостоять внешней агрессии. В его составе присутствуют соединения с высокой биологической активностью, большая их часть относится к классу пептидов. Изученные к настоящему моменту пептиды амфибий проявляют антимикробные, противовирусные, противоопухолевые свойства, могут противодействовать паразитическим грибам и простейшим. Некоторые из них обладают нейроактивностыо и выполняют регуляторные функции в организмах продуцирующих их амфибий. Высокая степень сходства многих пептидов земноводных с пептидами млекопитающих делает их изучение актуальным для понимания физиологии в том числе и человека.

Постоянная эволюция патогенных микроорганизмов способствует появлению резистентных к существующим антибиотикам штаммов и, тем самым, вынуждает расширять поиск новых веществ, эффективных в борьбе с бактериями. Преимуществом антимикробных пептидов, в том числе кожных пептидов амфибий, в сравнении с традиционными антибиотиками является то, что их механизм действия исключает привыкание к ним со стороны патогенных микроорганизмов.

Классические биохимические методы определения структур белков и пептидов в настоящее время практически полностью вытеснены масс-спектрометрическим секвенированием. Оно оказалось более быстрым, простым и чувствительным методом,, что резко уменьшило необходимое для анализа количество образца без ущерба надежности получаемых результатов. Основной и наиболее трудоемкой задачей масс-спектрометрического секвенирования является так называемое de novo секвенирование, т.е. установление структуры абсолютно неизвестного пептида.

В силу неоднородности состава кожные выделений амфибий чрезвычайно сложны даже для масс-спектрометрического исследования. Они содержат пептиды разной длины от 5 до 46 аминокислот) и природы (гидрофильность, зарядное состояние и т. д.); часто осложненные С-терминальным дисульфидным кольцом; Ь- и а-ионы коротких пептидов самопроизвольно циклизуются в газовой фазе масс-спектрометра. Концентрации отдельных компонентов пептидной смеси различаются на порядки, что может приводить к потере информации как о минорных, так и о мажорных ее составляющих в процессе массспектрометрического эксперимента. Таким образом, изучение состава кожных секретов амфибий, содержащих поистине уникальные биоактивные вещества, разработка и развитие новых подходов к анализу многокомпонентных смесей природных пептидов 6 неизвестной структуры, а также повышение эффективности их de novo секвенирования являются актуальными задачами современной науки.

Целью данной работы является апробация нового масс-спектрометрического подхода к de novo секвенированию пептидных компонентов кожных секретов лягушек, объединяющего два способа активации фрагментации пептидных цепей (соударениями и захватом электрона) с простыми химическими модификациями компонентов кожных секретов.

В работе решались следующие задачи:

1. Установление состава кожных выделений пяти видов ранидных лягушек (R. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta, R. temporaria и R. arvalis), используя сумму параллельных процедур модифицирования внутримолекулярной дисульфидной связи: восстановление с последующим карбоксамидометилированием и окисление их надмуравьиной кислотой.

2. Сравнительное изучение трех способов модификации N-концевой КНг-труппы коротких пептидов с дальнейшим применением наиболее эффективного из них для анализа кожного секрета квакши обыкновенной Hyla arborea.

3. Изучение возможности проведения межвидовой идентификации ранидных. лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Органическая химия», Горшков, Владимир Александрович

Выводы

1. Разработан и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных пептидов в составе природных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он сочетает в себе использование двух методов активации фрагментации пептидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ) с простыми химическими модификациями кожного субстрата.

2. Изучены три способа модификации N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их Ъ- и а-ионов.

3. Впервые установлены составы кожных секретов трех видов лягушек: R. lessonae, R. esculenta и Ну la arbor еа. Уточнены составы кожных пептид омов трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). Установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных — 39. Первичные структуры пяти новых пептидов дополнительно подтверждены методом деградации по Эдману.

4. Показана возможность проведения межвидовой идентификации ранидных лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ-УФ и МАЛДИ-МС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Горшков, Владимир Александрович, 2010 год

1. Jablonka Е., Lachmann М., Lamb MJ. Evidence, mechanisms and models for the inheritance of acquired characters. // J. Theor. Biol. 1992. V. 158. № 2. P. 245-268.

2. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. // Nature. 2004. V. 429. № 6990. P. 457-463.

3. File S.E., Fluck E., Fernandes C. Beneficial effects of glycine (bioglycin) on memory and attention in young and middle-aged adults. // J. Clin. Psychopharmacol. 1999. V. 19. № 6. P. 506-512.

4. Viu E., Zapata A., Capdevila J., Skolnick P., Trullas R. Glycine(B) receptor antagonists and partial agonists prevent memory deficits in inhibitory avoidance learning. // Neurobiol. Learn. Mem. 2000. V. 74. № 2. P. 146-160.

5. McEntee W.J., Crook Т.Н. Glutamate: its role in learning, memory, and the aging brain. // Psychopharmacology (Berl). 1993. V. 111. № 4. P. 391-401.

6. Hooi D.S., Bycroft B.W., Chhabra S.R., Williams P., Pritchard D.I. Differential immune modulatory activity of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules. // Infect. Immun. 2004. V. 72. № 11. P. 6463-6470.

7. Jurgens M., Schrader M. Peptidomic approaches in proteomic research. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2002. V. 4. № 3. P. 236-241.

8. Schulz-Knappe P., Zucht H.D., Heine G., Jurgens M., Hess R., Schrader M. Peptidomics: the comprehensive analysis of peptides in complex biological mixtures. // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2001. V. 4. № 2. P. 207-217.

9. Strand F.L. Neuropeptides: general characteristics and neuropharmaceutical potential in treating CNS disorders. // Prog. Drug Res. 2003. V. 61. № 1-37.

10. Soloviev M., Shaw C., Andren P. Peptidomics: Methods and Applications. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2008. 409 p.

11. Hummon A.B., Amare A., Sweedier J.V. Discovering new invertebrate neuropeptides using mass spectrometry. // Mass Spectrom. Rev. 2006. V. 25. № 1. P. 77-98.

12. Robas N.M., Fidock M.D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. // Methods Mol. Biol. 2005. V. 306. № 17-26.

13. Kimbrell D.A., Beutler B. The evolution and genetics of innate immunity. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. № 4. P. 256-267.

14. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. // Nature. 1981. V. 292. № 5820. P. 246-248.

15. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 15. P. 5449-5453.

16. Bechinger В., Zasloff M., Opella S.J. Structure and orientation of the antibiotic peptide magainin in membranes by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. // Protein Sci. 1993. V. 2. № 12. P. 2077-2084.

17. Romeo D., Skerlavaj В., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 20. P. 9573-9575.

18. Selsted M.E., Harwig S.S., Ganz Т., SchillingJ.W., Lehrer R.I. Primary structures of three human neutrophil defensins. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. № 4. P. 1436-1439.

19. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang Y.Q., Smith W., Cullor J.S. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 7. P. 4292-4295.

20. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1-2. P. 1-10.

21. Yang L., Weiss T.M., Lehrer R.I., Huang H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. // Biophys. J. 2000. V. 79. № 4. P. 2002-2009.

22. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1-2. P. 55-70.

23. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. 2002. V. 415. № 6870. P. 389-395.27.28,2930,31,32,33,34,35,36.37,38.