Маркеры метилирования ДНК в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сигин Владимир Олегович

• Сигин Владимир Олегович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Сигин Владимир Олегович

Список сокращений

Введение

Актуальность

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна результатов исследования

Теоретическая и практическая значимость

Степень достоверности результатов

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Апробация работы

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Эпигенетика и метилирование ДНК

1.1.1 Роль метилирования ДНК в онкогенезе

1.2 Современные методы анализа метилирования ДНК

1.2.1 Методы, основанные на бисульфитной конверсии ДНК

1.2.2 Подходы, основанные на использовании метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции

1.3 Эпидемиология рака молочной железы

1.3.1 Заболеваемость и смертность

1.3.2 Факторы риска развития рака молочной железы

1.3.3 Наследственные формы рака молочной железы

1.4 Молекулярные подтипы рака молочной железы

1.5 Неоадъювантная химиотерапия при раке молочной железы

1.6 Механизм действия препаратов, входящих в схемы НАХТ при раке молочной железы

1.7 Прогностические и предиктивные маркеры рака молочной железы

1.7.1 Возраст

1.7.2 Классификация опухолей по системе ТММ

1.7.3 Степень злокачественности опухоли

1.7.4 Рецепторы эстрогеновых и прогестероновых гормонов при раке молочной железы

1.7.5 Маркер пролиферации К1-67

1.7.6 Рецептор эпидермального фактора роста, тип 2 (ИЕЯ2)

1.8 Предиктивные панели молекулярных маркеров ответа на неоадъювантную химиотерапию при РМЖ

1.9 Заключение по данным литературы

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Клинический материал

2.2 Стабилизация и подготовка фенола

2.3 Подготовка хлороформа

2.4 Выделение геномной ДНК из опухолевой ткани

2.5 Проведение широкогеномного секвенирования ХтаЬККВБ

2.5.1 Подготовка библиотек ХтаЬККВБ

2.5.2 Эмульсионная ПЦР, секвенирование библиотек и анализ данных

2.6 Критерии отбора маркеров метилирования ДНК

2.7 Дизайн праймеров и тест-систем из ограниченного числа маркёров метилирования ДНК

2.8 ПААГ-электрофорез и окрашивание продуктов

2.9 Обработка ДНК метилчувствительной рестриктазой и проведение МЧ-кПЦР

2.10 Обработка результатов МЧ-кПЦР

2.11 Оценка аналитических свойств метода МЧ-кПЦР

2.12 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1. Непредвзятый широкогеномный поиск маркёров метилирования ДНК методом ХтаЬККВБ

3.2 Формирование панелей метилирования ДНК из ограниченного числа маркеров

3.3 Проведение многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени

3.4 Аналитическая чувствительность разработанной тест-системы

3.5 Характеристика эпигенетических маркёров ответа на неоадъювантную

химиотерапию

3.5.1 Определение диагностической ценности индивидуальных маркёров метилирования ДНК

3.6 Клинико-эпигенетические корреляции

3.7 Объединение маркёров метилирования ДНК в панели

3.8 Ассоциации маркеров метилирования ДНК с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Применение результатов и научных выводов

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

Список публикаций в других изданиях

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AA - акриламид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЗГТ - Заместительная гормональная терапия

люм. A - люминальный A иммуногистохимический подтип рака молочной железы

люмЗ - люминальный B иммуногистохимический подтип рака молочной железы

МЖ - молочная железа

МС-П^ - метилспецифическая П^

МЧ-П^ - метилчувствительная П^

;RAXT - неоадъювантная (предоперационная) химиотерапия

^QAAT - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦP - полимеразная цепная реакция

PMЖ - рак молочной железы

ТН - тройной негативный иммуногистохимический подтип рака молочной железы

ЭДТA - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты AUC - площадь под ROC-кривой APS - аммония персульфат

BSP - Секвенирование ДНК после бисульфитной П^ CpG - цитозин-фосфо-гуанин

cvAUC - площадь под ROC-кривой после кросс-валидации

COBRA - Combined bisulfite restriction analysis (Комбинированный анализ с

использованием бисульфитной конверсии и метилчувствительных рестриктаз).

dCTP - дезоксицитидинтрифосфат

dNTP - дизоксинуклеотидтрифосфат

dTTP - дезокситимидинтрифосфат

ERE - элементы отклика эстрогена

HR - Pецептор гормонов

ER - Эстрогеновый рецептор

LNA - locked nucleic acid

NGS - секвенирование нового поколения

PR - Прогестероновый рецептор

PBS - фосфатный буфер

SDS - додецилсульфат натрия

TBE - трис-боратный буфер: 89 mM трис-борат, 89 mM борная кислота, 2 mM TEMED - тетраметилэтилендиамин

Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а также сокращения распространённых единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Маркеры метилирования ДНК в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы»

Введение Актуальность

Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых гетерогенных онкологических заболеваний [1]. Несмотря на прогресс в области диагностики, хирургического лечения, системной терапии, основной причиной смерти является резистентность к существующим методам лечения [2].

Подходом повышения эффективности терапии у больных с агрессивными подтипами РМЖ, такими как люминальный B (люм^) или тройной негативный (ТН), является назначение неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии (НАХТ). Согласно крупным клиническим исследованиям, при достижении полной патоморфологической регрессии в результате НАХТ выживаемость больных с агрессивными подтипами РМЖ близка к выживаемости пациентов с более благоприятными подтипами, в сравнении с больными этой группы при наличии резидуальной опухоли [3].

Помимо этого, у больных местно-распространенным РМЖ проведение НАХТ является обязательным компонентом лечения всех подтипов РМЖ, позволяет уменьшить объем первичной опухоли и повышает частоту выполнения органосохраняющих операций. Согласно крупным клиническим исследованиям в области онкологии молочной железы, ответ на неоадъювантную химиотерапию агрессивных подтипов, таких как тройной негативный и люминальный В, не превышает 65% [4]. В то же время показано, что метилирование ДНК — это раннее и частое событие в канцерогенезе [5]. Простота обнаружения с помощью хорошо зарекомендовавших себя методов, стабильность метилирования в фиксированных образцах с течением времени, возможность детекции в различных жидкостях организма делает метилирование ДНК перспективным предиктивным маркёром при назначении неоадъювантной химиотерапии пациенткам с РМЖ, что придаёт актуальности задачам по разработке молекулярных маркеров, которые позволят предсказывать чувствительность опухоли к НАХТ ещё до её начала, с использованием биоптата опухоли в качестве материала для анализа.

Степень разработанности темы исследования

Диагностические панели молекулярно-генетических маркеров в основном используются для прогноза эффективности адъювантной химиотерапии и не прогнозируют ответ опухоли на неоадъювантную химиотерапию. Маркеры метилирования ДНК практически не рассматриваются в составе панелей, определяющих принадлежность образца РМЖ группе чувствительных или устойчивых к НАХТ.

В последние годы было разработано несколько молекулярных сигнатур для прогнозирования ответа на неоадъювантную химиотерапию, такие как Oncotype-Dx [6], MammaPrint [7], Blue Print [8], Endopredict [9], Prosigna [10].

В литературе встречаются высказывания предположений, что обнаружение опухолеспецифических паттернов аберрантного метилирования ДНК может быть полезно для ранней диагностики рака, для дифференциальной диагностики злокачественных новообразований, а также в качестве прогностических и предиктивных маркеров [11,12]. В диссертационном исследовании освещается вопрос, недостаточно изученный в мировом научном сообществе: использование панелей маркёров метилирования ДНК при прогнозировании ответа опухоли на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: выявление маркеров метилирования ДНК, отличающих группы опухолей молочной железы устойчивых и чувствительных к неоадъювантной химиотерапии, и разработка диагностических тест-систем.

Задачи исследования:

1. Разработать метод многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени (МЧ-кПЦР) и охарактеризовать его с точки зрения аналитических свойств (аналитической чувствительности и относительной погрешности).

2. Выявить (на основе широкогеномного скрининга) дифференциально метилированные участки генома, различающие группы чувствительных и устойчивых к неоадъювантной химиотерапии опухолей молочной железы.

3. Определить уровень метилирования выбранных маркёров методом МЧ-кПЦР и оценить диагностическую ценность индивидуальных маркеров метилирования ДНК.

4. Объединить маркёры метилирования ДНК в панели и определить их диагностическую ценность.

5. Оценить диагностические свойства комбинированных панелей из клинико-морфологических и молекулярно-генетических маркёров в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической основой диссертационного исследования стали работы отечественных и зарубежных научных коллективов в области онкологии молочной железы; неоадъювантной химиотерапии при РМЖ; прогностических и предиктивных маркёров при РМЖ; современных методов анализа метилирования ДНК. В работе исследовалась предиктивная способность маркёров метилирования ДНК в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы. Индивидуальные маркёры рассматривались в составе панелей метилирования ДНК. Разрабатывался инновационный метод многолокусной метилчувствительной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с включением в систему внутренних контролей (положительный контроль амплификации и контроль эффективности гидролиза эндонуклеазой рестрикции).

Метод многолокуснрезисотой метилчувствительной количественной ПЦР использовался при определении уровня метилирования ДНК для характеристики маркёров метилирования ДНК, полученных в результате широкогеномного анализа метилирования методом бисульфитного секвенирования ограниченных

наборов геномных локусов (RRBS). Для анализа полученных данных применялись биоинформатические и статистические методы.

Положения, выносимые на защиту

1. По результатам широкогеномного анализа метилирования ДНК выявлены геномные локусы, уровень метилирования которых отличается в группах опухолей, чувствительных и устойчивых к НАХТ.

2. Для характеристики выявленных маркеров-кандидатов разработан метод метилчувствительной многолокусной количественной ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью в 4 раза превышающей чувствительность метода бисульфитного секвенирования ДНК по Сэнгеру. Мультиплексирование нескольких целевых локусов в одной реакции позволяет сократить количество входного материала, что важно при работе с биопсийным (коллекционным) опухолевым материалом.

3. Индивидуальные маркеры метилирования ДНК могут быть использованы в качестве предиктивных маркеров в оценке ответа пациенток с опухолями молочной железы на неоадъювантную химиотерапию.

4. Группировка индивидуальных маркеров метилирования ДНК в диагностические панели позволяет повысить качество классификаторов ответа на НАХТ опухолей ТН и люм.В подтипа РМЖ.

5. Добавление к классификатору независимого клинико-морфологического маркера (статус вовлечения лимфоузлов для опухолей люм.В и клинической стадии для опухолей ТН подтипа) к маркерам метилирования ДНК позволяет статистически значимо повысить диагностические характеристики панелей.

Научная новизна результатов исследования

Все результаты, полученные в работе, являются новыми и получены впервые.

На разведочной выборке биопсийного материала, взятого до лечения (73

образца), опухолей ТН и люм.В подтипа, впервые выполнен широкогеномный

поиск маркеров метилирования ДНК в группах опухолей, чувствительных и устойчивых к НАХТ, и выявлены дифференциально метилированные участки опухолевого генома, различающие эти группы.

В результате проведенного исследования впервые разработан метод многолокусной метилчувствительной количественной ПЦР, позволяющий мультиплексировать несколько таргетных и контрольные геномные локусы (положительный контроль амплификации и контроль эффективности гидролиза метилчувствительной рестриктазой) в одной реакции.

С использованием разработанного метода проведена оценка диагностической ценности маркёров метилирования ДНК на дополнительной выборке (83 образца).

Сформированы оригинальные тест-системы из маркеров метилирования для формирования классификатора ответа на НАХТ при раке молочной железы, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. отАиС=0,83; 95% 0=0,82-0,84, (панель генов ТМЕМ132Б и МУ015В, с чувствительностью и специфичностью 0,76 для ТН РМЖ), а для группы люм.В РМЖ - отАиС=0,76; 95% 0=0,75-0,78 (панель генов ТТС34, ЬТВЯ, СЬБС14Л, с чувствительностью 0,7 и специфичностью 0,79).

Впервые показана возможность использования молекулярно-эпигенетических классификаторов вкупе с клинико-морфологическими показателями для повышения диагностической ценности маркеров метилирования ДНК в оценке ответа на НАХТ при РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость

Показана возможность использования молекулярно-эпигенетических классификаторов вкупе с клинико-морфологическими показателями для повышения диагностической ценности маркеров метилирования ДНК в оценке ответа на НАХТ при РМЖ. Разработаны тест-системы с ограниченным набором маркеров метилирования ДНК для определения чувствительности опухоли

молочной железы к неоадъювантной химиотерапии методом многолокусной метилчувствительной количественной ПЦР в режиме реального времени. Применение этого метода позволяет снизить требование к количеству материала образца (40 нг). Использование полученных результатов должно привести к повышению качества молекулярно-генетической диагностики рака молочной железы и позволит оптимизировать назначение предоперационного лечения пациенткам с РМЖ ТН и люм.В подтипов. Разработанные диагностические тест-системы ориентированы на быстрое внедрение в практику клинических диагностических лабораторий.

Степень достоверности результатов

Экспериментальные данные в ходе работы получены на разведочной, и дополнительной выборках образцов достаточного объема (превышающего объём выборки единственного опубликованного исследования по этой тематике). Достоверность полученных в исследовании результатов подтверждается статистическими методами. Работа основана на современных литературных данных и продолжает как теоретические, так и практические исследования в области эпигенетики и онкологии. Сформулированные в исследовании выводы полностью согласуются с поставленными задачами и целью. По результатам работы опубликованы статьи в рецензируемых изданиях.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Выполненное исследование «Маркеры метилирования ДНК в оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке молочной железы» соответствует формуле специальности «Генетика» 1.5.7. (03.02.07) (биологические науки)», охватывая методы генетического анализа у человека (пункт 5), эпигенетику (пункт 6), механизмы регуляции экспрессии генов (пункт 7), эпигенетику соматических клеток (пункт 13).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на IV Российском Конгрессе Лабораторной Медицины, 3-5 октября 2018 года (Россия, Москва); конгрессе Molecular Analysis for Personalised Therapy, 7-9 ноября 2019 года (Великобритания, Лондон); конгрессе ESMO Breast Cancer, 2-4 мая 2019 года (Германия, Берлин); онлайн конгрессе Molecular Analysis for Personalised Therapy, 9-10 октября 2020 года; онлайн конгрессе ESMO 2020, 18-21 октября 2020 года; II научно-практической онлайн - конференции Российского Общества Медицинских Генетиков «Новые технологии в диагностике и лечении наследственных болезней», 20-21 октября 2020 года; IX Съезде Российского общества медицинских генетиков, 30 июня - 2 июля, 2021 года.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при ФГБНУ «МГНЦ».

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор работы непосредственно участвовал в разработке дизайна исследования, формулировании цели, постановке задач, выборе методов исследования, проведении всех этапов исследования, статистической обработке полученных данных. Автором сформированы критерии включения образцов в исследование, изготовлены библиотеки RRBS, проведено секвенирование образцов из разведочной выборки, разработан метод многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени и проведена характеристики маркеров. Автор участвовал в подготовке рукописей для публикации результатов исследования в рецензируемых журналах и готовил материалы докладов для представления на российских и международных научных конференциях и представлял их.

Публикации

Материалы диссертации представлены в 10 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьях, рекомендованных ВАК МОН РФ (2 WoS) для соискателей ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, список литературы. Работа представлена на 148 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 29 рисунков. Библиографический указатель включает 252 наименований, из них 4 отечественных и 248 иностранных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эпигенетика и метилирование ДНК

Геном, состоящий из миллиардов нуклеотидов, содержит кодирующую информацию, контролирующую транскриптомный, трансляционный и протеомный ландшафт, и принимает участие в формировании фенотипа каждого человека. В течение долгого времени информация о кодировании в основном приписывалась расположению нуклеотидов в последовательности генома [13-15]. Однако за последнее десятилетие все больше становится общепризнанным, что геном содержит дополнительные слои информации помимо базовой последовательности, которая называется эпигеномом [15,16]. Термин «эпигенетика» впервые был предложен Конрадом Уоддингтоном в 1941 году для обозначения «раздела биологии, изучающего взаимодействия между генами и их продуктами, которые приводят к возникновению фенотипа» [17-20]. Эпигенетические механизмы контролируют транскрипционный уровень и участвуют в таких процессах, как инактивация Х-хромосомы, геномный импринтинг, экспрессия генов, специфичных для клеток и тканей, и подавление мобильных элементов генома [14]. Эпигенетическая регуляция играет решающую роль в процессах нормального развития и старения организма, а также в адаптации к окружающей среде на протяжении всей жизни [17,21-23].

Метилирование ДНК (5-метилцитозин, 5-тС), одна из наиболее изученных эпигенетических модификаций, которая действует непосредственно на геномную ДНК, где метильная группа добавляется в позиции С5 цитозинового кольца в палиндромном динуклеотиде CpG. Известно, что метилирование влияет на экспрессию генов посредством регуляции транскрипции генов [22,24].

Считается, что примерно от 60% до 80% всех CpG метилированы. Приблизительно на 98% геном млекопитающих является CpG-дефицитным, имеющим редко диспергированные одиночные CpG-пары с тенденцией к метилированию. Оставшаяся часть генома характеризуется представленностью

CpG в виде участков длиной от 200 пар оснований с ОС-составом более 50% и наблюдаемым соотношением СрО-пар не менее чем 0,6 от числа ожидаемых, называемых «СрО-островками» [25]. СрО-островки в основном связаны с промоторными и регуляторными областями генома [22,26-28].

1.1.1 Роль метилирования ДНК в онкогенезе

Платформы секвенирования нового поколения (N08) позволили получить полногеномные карты метилирования СрО, показав, что 5-10% обычно неметилированных промоторных СрО-островков могут приобретать аномальное метилирование в различных геномах опухолей [29]. Несмотря на то, что в злокачественных клетках можно наблюдать глобальное гипометилирование по множеству рассеянных СрО-пар, наиболее изученными эпигенетическими изменениями при раке являются изменение метилирования, которые происходят в районах СрО-островков промоторных участков генов [30,31]. Метилирование промоторов генов катализируется специфическими ферментами, называемыми ДНК-метилтрансферазами ^ЫМТ), и может участвовать в подавлении транскрипции различных генов-супрессоров опухолевого роста, что является обычным эпигенетическим событием на ранней стадии онкогенеза [32]. Становится все более явным, что эпигенетические события играют немаловажную роль в инициировании и прогрессировании рака. Гиперметилирование промоторных участков генов проявляется как потеря функции генов, что часто встречается при раке [33].

Ещё в 2003 году Питер Лэрд описывал, что недавние на тот момент достижения в понимании роли метилирования ДНК при раке могут однажды привести к появлению множества мощных биомаркеров, основанных на метилировании ДНК, особенно для использования в качестве диагностических маркёров в онкологии [32]. Это убеждение было основано на ряде характеристик аномального метилирования ДНК, которые делают его многообещающим источником биомаркеров: аномальное метилирование ДНК - раннее и частое

событие в онкогенезе, обладает простотой обнаружения с помощью хорошо зарекомендовавших себя методов, стабильно в фиксированных образцах с течением времени, может быть детектировано в различных жидкостях организма [5].

1.2 Современные методы анализа метилирования ДНК

В последние десятилетия быстро распространились разнообразные высокопроизводительные методы оценки метилирования ДНК. Несмотря на преимущества таких подходов, различия в метилировании ДНК, выявленные в высокопроизводительных экспериментах, несомненно, требуют подтверждения локус-специфическими методами, которые были проверены в клиниках в качестве диагностических, прогностических или предиктивных инструментов для различных нозологий [34]. Далее представлен обзор наиболее распространенных методов, доступных в настоящее время для изучения статуса метилирования определенных генов.

Выделяют три основные группы методов идентификации дифференциально метилированных регионов генома [34] основанные на:

1) бисульфитной конверсии ДНК,

2) использовании рестрикционных ферментов,

3) аффинном обогащении.

Методы, основанные на бисульфитной конверсии, возможно, являются наиболее часто используемым подходом в настоящее время для изучения статуса метилирования отдельных СрО пар. Однако выбор должен производиться в соответствии с конкретной исследуемой биологической проблемой, разрешением, необходимым для исследования, и доступностью технологии.

1.2.1 Методы, основанные на бисульфитной конверсии ДНК

Различные подходы, доступные как для качественного, так и для количественного анализа статуса/уровня метилирования ДНК, основаны на

обработке исследуемой матрицы бисульфитом натрия. Этот процесс заключается в дезаминировании неметилированного цитозина и конверсии его в урацил. Метилированные цитозины теряют метильную метку в процессе конверсии, что позволяет различать метилированную и неметилированную ДНК. Очень важно обеспечить полное превращение цитозинов, так как от этого зависит надежность анализа метилирования (рис. 1) [35].

Сульфирование КНт Деаминирование О Десульфирование О

НБСГ/ЩО, I 2 нр/нр II ОН /ОН

sulfonotioп Л. деат'та^оп вешИопаИоп ....

^ [| 7 ч мн

HSO ,

NH^O 3 NH^O NH ° NH

Цитозин / Cytosine Сульфонат цитозина / Сульфонатурацила / Урацил / Uracil

Cytosine sulfonate Uracil sulfonate

nh2

¿hso3 N -

„Л©

5-метилцитозин / 5-metilcytosine

me me mo me

5-ATGCCGGCCCGGCCATT-3'

Бисульфитная конверсия / Bisulfite conversion

5'-ATGCCGGCUCGGUUATT-3*

Полимеразная цепная реакция / Polymerase chain reaction

5-ATGCCGGCTCGGTTATT-3'

Анализ продуктов полимеразной цепной реакции /

Analysis of polymerase chain reaction products

)

Г-3* -S^

"* У

~~i-1-1—

Секвенирование / Полимеразная цепная реакция Высокочувствительное плавление /

Sequencing с меченными праймерами / Polymerase High resolution melting

chain reaction with labeled primers

Рисунок 1. Анализ метилирования ДНК на основе бисульфитной конверсии

Существует ряд требований, чтобы гарантировать более полную конверсию ДНК. При неполной конверсии неконвертированные цитозины будут неправильно интерпретироваться как метилированные цитозины, и результат может оказаться неточным. ДНК должна быть полностью денатурирована, чтобы облегчить доступ бисульфита натрия к остаткам цитозина. Удаление связанных белков и контроль различных параметров (концентрация соли, температура и время инкубации) необходимы для обеспечения полной денатурации ДНК. Кроме того, во время

процесса конверсии одноцепочечная ДНК может повторно отжигаться, избегая тем самым полного превращения цитозина. Для предотвращения повторного отжига в реакционную смесь могут быть добавлены различные реагенты, такие как мочевина. Качество ДНК и ее концентрация также могут влиять на выход бисульфитной реакции. Присутствие остаточного количества белков или РНК в образцах ДНК препятствует полной конверсии по причине образования стабильных комплексов РНК-ДНК. Рекомендуется обработка ДНК например, протеиназой и РНКазой, которые позволяют удалить остаточные молекулы [36].

Деградация ДНК в процессе конверсии также является ограничением бисульфитных методов, поскольку обработка бисульфитом вызывает депуринизацию оснований. Неблагоприятные для нуклеиновых кислот условия, такие как высокая концентрация бисульфита натрия, длительное время инкубации и высокая температура, могут ускорить деградацию ДНК.

В случае работы с образцами, фиксированными формалином (FFPE), где количество ДНК низкое, а степень деградации высока, необходимо использовать дополнительные реактивы, например, гидрохинон при конверсии, чтобы избежать ещё большей деградации [37]. Гидрохинон позволяет улавливать свободные радикалы, образующиеся в процессе бисульфитной конверсии и защищать ДНК от чрезмерной деградации. Когда количество ДНК очень низкое (<200 нг), рекомендуется использование носителей на этапе очистки после бисульфитной конверсии, таких как тРНК или гликоген, для увеличения выхода [34].

Обработка бисульфитом преобразует различие в статусе метилирования в различие в последовательности ДНК, которое может быть детектировано простыми методами на основе, например, ПЦР, которые описаны далее. Удаление остаточного бисульфита натрия после обработки имеет решающее значение для обеспечения оптимальных результатов, поскольку он проявляет ингибирующую активность для ДНК-полимераз [34].

1.2.1.1 Метилспецифическая ПЦР

Метилспецифическая ПЦР (МСП) — это классический метод, в котором используются два набора праймеров, один из которых способствует амплификации неметилированной ДНК, а другой — метилированной ДНК (рис. 2, рис. 3) [38].

/Т^Т^чУУ

Обработка бисульфитом

Рисунок 2. Анализ метилирования ДНК с использованием метилспецифической ПЦР. Праймеры М и и комплементарно метилированной и неметилированной последовательности ДНК (Метилированный цитозин теряет метильную метку в процессе обработки бисульфитом, а неметилированный становится урацилом.

Дизайн праймеров является наиболее важным этапом этого метода. Для дизайна рекомендуется использовать следующие критерии:

1) Праймеры к метилированным и неметилированным последовательностям должны специфично отжигаться с одной и той же областью, содержащей интересующий участок;

2) праймеры должны иметь длину около 30 п.н. для обеспечения специфичности;

3) каждый праймер должен содержать от одного до трех CpG, расположенных на его 3'-конце.

4) температура отжига обоих праймеров должна быть одинаковой (разница не должна превышать 2 °С), она должна находиться в диапазоне 60-65°C [38].

Рисунок 3. Пример анализа метилирования гена ER с использованием метода МСП. Дизайн праймеров осуществлялся таким образом, чтобы ампликон, полученный с неметилированного аллеля Un был короче (151 п.н.), чем ампликон с метилированного аллеля Me (247 п.н.) [39].

Количество циклов амплификации не должно превышать 35, а температуру отжига следует оптимизировать с использованием полностью метилированных и полностью неметилированных контрольных образцов ДНК. Длина продуктов ПЦР должна быть от 80 до 175 п.н. [40].

1.2.1.2 Бисульфитное секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование ДНК после бисульфитной конверсии (BSP) (рис. 4) является одним из самых популярных методов исследования метилирования ДНК. Методика секвенирования ДНК по Сэнгеру не позволяет отличать цитозины от метилцитозинов, но обработка бисульфитом перед секвенированием позволит различить неметилированные цитозины, дезаминированные до урацила и

секвенированные как тимины и метилированные цитозины, остающиеся непревращенными и секвенируемые как цитозины.

Рисунок 4. Схема возможных результатов бисульфитного секвенирования по Сэнгеру. Слева: клональное бисульфитное секвенирование. Справа: прямое бисульфитное секвенирование по Сэнгеру.

После обработки бисульфитом образцы ДНК амплифицируют при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров, не перекрывающих сайты СрО. Сравнение необработанной матрицы ДНК с бисульфит-конвертированным образцом ДНК позволяет выявить паттерны метилирования для конкретной области с разрешением в один нуклеотид. Хоть это и простой метод, который можно использовать для быстрой проверки, он создает ряд проблем, таких как наличие шума в результатах и недостаточная чувствительность метода из-за смеси аллелей и гетерогенных паттернов метилирования [41].

Одна из модификаций бисульфитного секвенирования по Сэнгеру -клональное секвенирование. Подход включает клонирование амплифицированных продуктов: создание рекомбинантных плазмид, бактериальную трансформацию, выделение плазмидной ДНК из отдельных колоний и, наконец, секвенирование плазмидной ДНК по Сэнгеру. Самое ключевое преимущества этого подхода заключается в том, что он дает информацию о метилировании одного аллеля на клон. Главный недостаток - трудоемкий и дорогой рабочий процесс. Поскольку одна плазмида равна одному аллелю, необходимо секвенировать несколько десятков плазмид для каждого образца, чтобы результат был статистически достоверным [12].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сигин Владимир Олегович, 2021 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Turashvili G., Brogi E. Tumor Heterogeneity in Breast Cancer // Front. Med. 2017. Vol. 4.

2. Cohen O., Kim D., Oh C., et al. Abstract S1-01: Whole exome and transcriptome sequencing of resistant ER+ metastatic breast cancer // General Session Abstracts. American Association for Cancer Research, 2017. P. S1-01-S1-01.

3. von Minckwitz G., Untch M., Blohmer J.-U., et al. Definition and Impact of Pathologic Complete Response on Prognosis After Neoadjuvant Chemotherapy in Various Intrinsic Breast Cancer Subtypes // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2012. Vol. 30, № 15. P. 1796-1804.

4. Li J., Mo M., Yu K., et al. ER-Poor and HER2-Positive: A Potential Subtype of Breast Cancer to Avoid Axillary Dissection in Node Positive Patients after Neoadjuvant Chemo-Trastuzumab Therapy // PLoS One / ed. Hoque M.O. Public Library of Science, 2014. Vol. 9, № 12. P. e114646.

5. Koch A., Joosten S.C., Feng Z., et al. Analysis of DNA methylation in cancer: location revisited // Nat. Rev. Clin. Oncol. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 15, № 7. P. 459-466.

6. Paik S., Shak S., Tang G., et al. A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer // N. Engl. J. Med. 2004. Vol. 351, № 27. P. 2817-2826.

7. van 't Veer L.J., Dai H., van de Vijver M.J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer // Nature. Nature, 2002. Vol. 415, № 6871. P. 530-536.

8. Whitworth P., Stork-Sloots L., de Snoo F.A., et al. Chemosensitivity Predicted by BluePrint 80-Gene Functional Subtype and MammaPrint in the Prospective Neoadjuvant Breast Registry Symphony Trial (NBRST) // Ann. Surg. Oncol. Springer New York LLC, 2014. Vol. 21, № 10. P. 3261-3267.

9. Bertucci F., Finetti P., Viens P., et al. EndoPredict predicts for the response to neoadjuvant chemotherapy in ER-positive, HER2-negative breast cancer // Cancer

Lett. Elsevier Ireland Ltd, 2014. Vol. 355, № 1. P. 70-75.

10. Prat A., Galvan P., Jimenez B., et al. Prediction of Response to Neoadjuvant Chemotherapy Using Core Needle Biopsy Samples with the Prosigna Assay // Clin. Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2016. Vol. 22, № 3. P. 560-566.

11. Hao X., Luo H., Krawczyk M., et al. DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 2017. Vol. 114, № 28. P. 7414-7419.

12. Martisova A., Holcakova J., Izadi N., et al. DNA Methylation in Solid Tumors: Functions and Methods of Detection // Int. J. Mol. Sci. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2021. Vol. 22, № 8. P. 4247.

13. Mazzio E.A., Soliman K.F.A. Basic concepts of epigenetics // Epigenetics. Taylor and Francis Inc., 2012. Vol. 7, № 2. P. 119-130.

14. Jirtle R.L., Skinner M.K. Environmental epigenomics and disease susceptibility // Nat. Rev. Genet. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 8, № 4. P. 253-262.

15. Eckhardt F., Beck S., Gut I.G., et al. Future potential of the Human Epigenome Project // Expert Rev. Mol. Diagn. Taylor & Francis, 2004. Vol. 4, № 5. P. 609618.

16. Siggens L., Ekwall K. Epigenetics, chromatin and genome organization: recent advances from the ENCODE project // J. Intern. Med. Blackwell Publishing Ltd, 2014. Vol. 276, № 3. P. 201-214.

17. Feinberg A.P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease // Nature. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 447, № 7143. P. 433-440.

18. Waddington C.H. (George A.& U.L. The Strategy of The Genesitle. 1957.

19. Dupont C., Armant D., Brenner C. Epigenetics: Definition, Mechanisms and Clinical Perspective // Semin. Reprod. Med. NIH Public Access, 2009. Vol. 27, № 05. P. 351-357.

20. Bird A. Perceptions of epigenetics // Nature. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 447, № 7143. P. 396-398.

21. Vinkers C.H., Kalafateli A.L., Rutten B.P., et al. Traumatic stress and human

DNA methylation: a critical review // Epigenomics. Future Medicine Ltd., 2015. Vol. 7, № 4. P. 593-608.

22. Garcia-Carpizo V., Ruiz-Llorente L., Fraga M., et al. The growing role of gene methylation on endocrine function // J. Mol. Endocrinol. 2011. Vol. 47, № 2. P. R75-R89.

23. Nagy C., Turecki G. Sensitive periods in epigenetics: bringing us closer to complex behavioral phenotypes // Epigenomics. Future Medicine Ltd London, UK, 2012. Vol. 4, № 4. P. 445-457.

24. Nestor C.E., Ottaviano R., Reinhardt D., et al. Rapid reprogramming of epigenetic and transcriptional profiles in mammalian culture systems // Genome Biol. BioMed Central Ltd., 2015. Vol. 16, № 1. P. 11.

25. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG Islands in vertebrate genomes // J. Mol. Biol. J Mol Biol, 1987. Vol. 196, № 2. P. 261-282.

26. Jones P.A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond // Nat. Rev. Genet. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 13, № 7. P. 484492.

27. Serre D., Lee B.H., Ting A.H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome // Nucleic Acids Res. Oxford Academic, 2010. Vol. 38, № 2. P. 391-399.

28. Illingworth R., Kerr A., DeSousa D., et al. A Novel CpG Island Set Identifies Tissue-Specific Methylation at Developmental Gene Loci // PLoS Biol. / ed. Liu E.T. Public Library of Science, 2008. Vol. 6, № 1. P. e22.

29. Dawson M.A., Kouzarides T. Cancer Epigenetics: From Mechanism to Therapy // Cell. Cell Press, 2012. Vol. 150, № 1. P. 12-27.

30. Baylin S.B., Jones P.A. A decade of exploring the cancer epigenome — biological and translational implications // Nat. Rev. Cancer. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 11, № 10. P. 726-734.

31. Robertson K.D. DNA methylation and human disease // Nat. Rev. Genet. Nature Publishing Group, 2005. Vol. 6, № 8. P. 597-610.

32. Laird P.W. The power and the promise of DNA methylation markers // Nat. Rev.

Cancer. European Association for Cardio-Thoracic Surgery, 2003. Vol. 3, № 4. P. 253-266.

33. Feinberg A.P., Tycko B. The history of cancer epigenetics // Nat. Rev. Cancer. Nature Publishing Group, 2004. Vol. 4, № 2. P. 143-153.

34. Pajares M.J., Palanca-Ballester C., Urtasun R., et al. Methods for analysis of specific DNA methylation status // Methods. Academic Press Inc., 2020. Vol. 1S7. P. 3-12.

35. Hong S.R., Shin K.-J. Bisulfite-Converted DNA Quantity Evaluation: A Multiplex Quantitative Real-Time PCR System for Evaluation of Bisulfite Conversion // Front. Genet. Frontiers Media S.A., 2021. Vol. 12. P. 173.

36. Warnecke P.M., Stirzaker C., Song J., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing // Methods. Methods, 2002. Vol. 27, № 2. P. 101107.

37. Patterson K., Molloy L., Qu W., et al. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis // J. Vis. Exp. Journal of Visualized Experiments, 2011. № 56.

38. Ramalho-Carvalho J., Henrique R., Jerónimo C. Methylation-Specific PCR // Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., 2018. Vol. 1708. P. 447-472.

39. LAN V.T.T., HA N.T., UYEN N.Q., et al. Standardization of the methylation-specific PCR method for analyzing BRCA1 and ER methylation // Mol. Med. Rep. Spandidos Publications, 2014. Vol. 9, № 5. P. 1844-1850.

40. Hernández H.G., Tse M.Y., Pang S.C., et al. Optimizing methodologies for PCR-based DNA methylation analysis // Biotechniques. Biotechniques, 2013. Vol. 55, № 4. P. 181-197.

41. Jiang M., Zhang Y., Fei J., et al. Rapid quantification of DNA methylation by measuring relative peak heights in direct bisulfite-PCR sequencing traces // Lab. Investig. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 90, № 2. P. 282-290.

42. Shen L., Guo Y., Chen X., et al. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis // Biotechniques. Future Science Ltd London, UK, 2007. Vol. 42, № 1. P. 48-58.

43. Weisenberger D.J., Trinh B.N., Campan M., et al. DNA methylation analysis by

digital bisulfite genomic sequencing and digital MethyLight // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2008. Vol. 36, № 14. P. 4689-4698.

44. Morcia C., Ghizzoni R., Delogu C., et al. Digital PCR: What Relevance to Plant Studies? // Biology (Basel). MDPI AG, 2020. Vol. 9, № 12. P. 433.

45. Ronaghi M. DNA SEQUENCING:A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate // Science (80-. ). Science, 1998. Vol. 281, № 5375. P. 363-365.

46. Tost J., El abdalaoui H., Glynne Gut I. Serial pyrosequencing for quantitative DNA methylation analysis // Biotechniques. Biotechniques, 2006. Vol. 40, № 6. P. 721-726.

47. Ehrich M., Nelson M.R., Stanssens P., et al. Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. Vol. 102, № 44. P. 1578515790.

48. Wojdacz T.K., Dobrovic A., Hansen L.L. Methylation-sensitive high-resolution melting // Nat. Protoc. Nat Protoc, 2008. Vol. 3, № 12. P. 1903-1908.

49. Slomka M., Sobalska-Kwapis M., Wachulec M., et al. High Resolution Melting (HRM) for High-Throughput Genotyping—Limitations and Caveats in Practical Case Studies // Int. J. Mol. Sci. MDPI AG, 2017. Vol. 18, № 11. P. 2316.

50. Moore T. Southern Analysis Using Methyl-Sensitive Restriction Enzymes // Genomic Imprinting. Totowa, NJ: Humana Press, 2002. Vol. 181. P. 193-203.

51. Beikircher G., Pulverer W., Hofner M., et al. Multiplexed and Sensitive DNA Methylation Testing Using Methylation-Sensitive Restriction Enzymes "MSRE-qPCR" // Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., 2018. Vol. 1708. P. 407-424.

52. Wong I.H.N. Qualitative and Quantitative Polymerase Chain Reaction-Based Methods for DNA Methylation Analyses // Clinical Applications of PCR. New Jersey: Humana Press, 2006. Vol. 336. P. 33-44.

53. Jung M., Uhl B., Kristiansen G., et al. Bisulfite Conversion of DNA from Tissues, Cell Lines, Buffy Coat, FFPE Tissues, Microdissected Cells, Swabs, Sputum, Aspirates, Lavages, Effusions, Plasma, Serum, and Urine // Methods in Molecular

Biology. Humana Press Inc., 2015. Vol. 1589. P. 139-159.

54. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 1997. Vol. 25, № 12. P. 2532-2534.

55. Fraga M.F., Esteller M. DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications // Biotechniques. Eaton Publishing Company, 2002. Vol. 33, № 3. P. 632-649.

56. Eads C.A. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 2000. Vol. 28, № 8. P. 32e - 0.

57. Thomassin H. MethylQuant: a sensitive method for quantifying methylation of specific cytosines within the genome // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 2004. Vol. 32, № 21. P. e168-e168.

58. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. // Proc. Natl. Acad. Sci. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. Vol. 89, № 5. P. 1827-1831.

59. Vogelstein B., Kinzler K.W. Digital PCR // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 1999. Vol. 96, № 16. P. 9236-9241.

60. Colella S., Shen L., Baggerly K.A., et al. Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing™ methylation analysis of CpG sites // Biotechniques. Eaton Publishing Company, 2003. Vol. 35, № 1. P. 146-150.

61. Bird A.P., Southern E.M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation // J. Mol. Biol. Academic Press, 1978. Vol. 118, № 1. P. 27-47.

62. Melnikov A.A. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33, № 10. P. e93-e93.

63. Sung H., Ferlay J., Siegel R.L., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA. Cancer J. Clin. Wiley, 2021. P. caac.21660.

64. Аксель Е.М., Виноградова Н.Н. СТАТИСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ.

65. Rawal R., Bermejo J.L., Hemminki K. Risk of subsequent invasive breast

carcinoma after in situ breast carcinoma in a population covered by national mammographic screening // Br. J. Cancer. 2005. Vol. 92, № 1. P. 162-166.

66. Hartmann L.C., Sellers T.A., Frost M.H., et al. Benign Breast Disease and the Risk of Breast Cancer // N. Engl. J. Med. 2005. Vol. 353, № 3. P. 229-237.

67. Boyd N.F., Lockwood G.A., Byng J.W., et al. Mammographic densities and breast cancer risk. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998. Vol. 7, № 12. P. 11331144.

68. Hamajima N., Hirose K., Tajima K., et al. Menarche, menopause, and breast cancer risk: individual participant meta-analysis, including 118 964 women with breast cancer from 117 epidemiological studies // Lancet Oncol. Lancet Publishing Group, 2012. Vol. 13, № 11. P. 1141-1151.

69. George A., Stead T.S., Ganti L. What's the Risk: Differentiating Risk Ratios, Odds Ratios, and Hazard Ratios? // Cureus. 2020. Vol. 12, № 8. P. e10047.

70. Islami F., Liu Y., Jemal A., et al. Breastfeeding and breast cancer risk by receptor status—a systematic review and meta-analysis // Ann. Oncol. Oxford University Press, 2015. Vol. 26, № 12. P. 2398-2407.

71. Beral V., Bull D., Doll R., et al. Breast cancer and breastfeeding: collaborative reanalysis of individual data from 47 epidemiological studies in 30 countries, including 50 302 women with breast cancer and 96 973 women without the disease // Lancet. Elsevier Limited, 2002. Vol. 360, № 9328. P. 187-195.

72. Calle E.E., Heath C.W., Miracle-McMahill H.L., et al. Breast cancer and hormonal contraceptives: collaborative reanalysis of individual data on 53 297 women with breast cancer and 100 239 women without breast cancer from 54 epidemiological studies // Lancet. Lancet Publishing Group, 1996. Vol. 347, № 9017. P. 1713-1727.

73. Kumle M., Weiderpass E., Braaten T., et al. Use of oral contraceptives and breast cancer risk: The Norwegian-Swedish Women's Lifestyle and Health Cohort Study. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2002. Vol. 11, № 11. P. 1375-1381.

74. Jones M.E., Schoemaker M.J., Wright L., et al. Menopausal hormone therapy and breast cancer: what is the true size of the increased risk? // Br. J. Cancer. Nature

Publishing Group, 2016. Vol. 115, № 5. P. 607-615.

75. Calle E.E., Heath C.W., Coates R.J., et al. Breast cancer and hormone replacement therapy: collaborative reanalysis of data from 51 epidemiological studies of 52 705 women with breast cancer and 108 411 women without breast cancer // Lancet. Lancet Publishing Group, 1997. Vol. 350, № 9084. P. 1047-1059.

76. Hankinson S.E., Eliassen A.H. Endogenous estrogen, testosterone and progesterone levels in relation to breast cancer risk // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2007. Vol. 106, № 1-5. P. 24-30.

77. Key T.J., Appleby P.N., Reeves G.K., et al. Body Mass Index, Serum Sex Hormones, and Breast Cancer Risk in Postmenopausal Women // JNCI J. Natl. Cancer Inst. Oxford University Press, 2003. Vol. 95, № 16. P. 1218-1226.

78. van den Brandt P.A. Pooled Analysis of Prospective Cohort Studies on Height, Weight, and Breast Cancer Risk // Am. J. Epidemiol. 2000. Vol. 152, № 6. P. 514-527.

79. Friedenreich C.M. Review of anthropometric factors and breast cancer risk. // Eur. J. Cancer Prev. 2001. Vol. 10, № 1. P. 15-32.

80. Harris H.R., Willett W.C., Terry K.L., et al. Body Fat Distribution and Risk of Premenopausal Breast Cancer in the Nurses' Health Study II // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2011. Vol. 103, № 3. P. 273-278.

81. Preston D.L., Mattsson A., Holmberg E., et al. Radiation Effects on Breast Cancer Risk: A Pooled Analysis of Eight Cohorts // Radiat. Res. Radiation Research Society, 2002. Vol. 158, № 2. P. 220-235.

82. Hamajima N., Hirose K., Tajima K., et al. Alcohol, tobacco and breast cancer -collaborative reanalysis of individual data from 53 epidemiological studies, including 58 515 women with breast cancer and 95 067 women without the disease // Br. J. Cancer. Nature Publishing Group, 2002. Vol. 87, № 11. P. 12341245.

83. Wu Y., Zhang D., Kang S. Physical activity and risk of breast cancer: a metaanalysis of prospective studies // Breast Cancer Res. Treat. 2013. Vol. 137, № 3. P. 869-882.

84. Thune I., Brenn T., Lund E., et al. Physical Activity and the Risk of Breast Cancer // N. Engl. J. Med. 1997. Vol. 336, № 18. P. 1269-1275.

85. Zhang J., Yu K.F. What's the Relative Risk? // JAMA. American Medical Association, 1998. Vol. 280, № 19. P. 1690.

86. Lichtenstein P., Holm N. V., Verkasalo P.K., et al. Environmental and Heritable Factors in the Causation of Cancer — Analyses of Cohorts of Twins from Sweden, Denmark, and Finland // N. Engl. J. Med. New England Journal of Medicine (NEJM/MMS), 2000. Vol. 343, № 2. P. 78-85.

87. Ford D., Easton D.F., Stratton M., et al. Genetic Heterogeneity and Penetrance Analysis of the BRCA1 and BRCA2 Genes in Breast Cancer Families // Am. J. Hum. Genet. Cell Press, 1998. Vol. 62, № 3. P. 676-689.

88. Moran A., O'Hara C., Khan S., et al. Risk of cancer other than breast or ovarian in individuals with BRCA1 and BRCA2 mutations // Fam. Cancer. 2012. Vol. 11, № 2. P. 235-242.

89. Antoniou A.C., Casadei S., Heikkinen T., et al. Breast-Cancer Risk in Families with Mutations in PALB2 // N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 371, № 6. P. 497-506.

90. Ripperger T., Gadzicki D., Meindl A., et al. Breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling // Eur. J. Hum. Genet. 2009. Vol. 17, № 6. P. 722-731.

91. Mahdi K.M., Nassiri M.R., Nasiri K. Hereditary Genes and SNPs Associated with Breast Cancer // Asian Pacific J. Cancer Prev. 2013. Vol. 14, № 6. P. 3403-3409.

92. Кулигина Е.Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы. 2010. Vol. 11. 203-216 p.

93. Viale G. The current state of breast cancer classification // Ann. Oncol. Ann Oncol, 2012. Vol. 23, № SUPPL. 10. P. x207-x210.

94. Kittaneh M., Montero A.J., Glück S. Molecular Profiling for Breast Cancer: A Comprehensive Review // Biomark. Cancer. SAGE PublicationsSage UK: London, England, 2013. Vol. 5. P. BIC.S9455.

95. Goldhirsch A., Wood W.C., Coates A.S., et al. Strategies for subtypes—dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert

Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011 // Ann. Oncol. Oxford University Press, 2011. Vol. 22, № 8. P. 1736-1747.

96. Grunau C. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 2001. Vol. 29, № 13. P. 65e - 65.

97. Perou C.M., S0rlie T., Eisen M.B., et al. Molecular portraits of human breast tumours // Nature. Nature, 2000. Vol. 406, № 6797. P. 747-752.

98. Carey L.A., Perou C.M., Livasy C.A., et al. Race, Breast Cancer Subtypes, and Survival in the Carolina Breast Cancer Study // JAMA. JAMA, 2006. Vol. 295, № 21. P. 2492.

99. Elesawy B.H., Abd El hafez A., Shawky A.E., et al. Immunohistochemistry-based subtyping of breast carcinoma in Egyptian women // Ann. Diagn. Pathol. Ann Diagn Pathol, 2014. Vol. 18, № 1. P. 21-26.

100. Zhang M., Liu H., Teng X., et al. The Differences in CXCR4 Protein Expression Are Significant for the Five Molecular Subtypes of Breast Cancer // Ultrastruct. Pathol. Ultrastruct Pathol, 2012. Vol. 36, № 6. P. 381-386.

101. Al-thoubaity F.K. Molecular classification of breast cancer: A retrospective cohort study // Ann. Med. Surg. Elsevier Ltd, 2020. Vol. 49. P. 44-48.

102. Shien T., Iwata H. Adjuvant and neoadjuvant therapy for breast cancer // Jpn. J. Clin. Oncol. Oxford Academic, 2020. Vol. 50, № 3. P. 225-229.

103. Семиглазов В., Семиглазов В. Стратегия лечения рака молочной железы, основанная на выделении биологических подтипов // elibrary.ru. 2011. Vol. 12. P. 28-34.

104. Gianni L., Bonadonna G., Hortobagyi G., et al. Textbook of breast cancer: a clinical guide to therapy. 2006.

105. Kaufmann M., von Minckwitz G., Bear H.D., et al. Recommendations from an international expert panel on the use of neoadjuvant (primary) systemic treatment of operable breast cancer: new perspectives 2006 // Ann. Oncol. 2007. Vol. 18, № 12. P. 1927-1934.

106. Fasching P.A., Gass P., Hein A. Neoadjuvant Treatment of Breast Cancer -

Advances and Limitations // Breast Care. S. Karger AG, 2016. Vol. 11, № 5. P. 313-314.

107. Bonadonna G., Valagussa P., Brambilla C., et al. Primary chemotherapy in operable breast cancer: eight-year experience at the Milan Cancer Institute. // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 1998. Vol. 16, № 1. P. 93100.

108. Cortazar P., Zhang L., Untch M., et al. Abstract S1-11: Meta-analysis Results from the Collaborative Trials in Neoadjuvant Breast Cancer (CTNeoBC) // General Session Abstracts. American Association for Cancer Research, 2012. Vol. 72, № 24 Supplement. P. S1-11-S1-11.

109. Fisher B., Bryant J., Wolmark N., et al. Effect of preoperative chemotherapy on the outcome of women with operable breast cancer. // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 1998. Vol. 16, № 8. P. 2672-2685.

110. Rastogi P., Anderson S.J., Bear H.D., et al. Preoperative Chemotherapy: Updates of National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocols B-18 and B-27 // J. Clin. Oncol. 2008. Vol. 26, № 5. P. 778-785.

111. Bear H.D., Anderson S., Brown A., et al. The Effect on Tumor Response of Adding Sequential Preoperative Docetaxel to Preoperative Doxorubicin and Cyclophosphamide: Preliminary Results From National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-27 // J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 21, № 22. P. 41654174.

112. Ruiz-Borrego M., Martin Jimenez M., Ruiz A., et al. 148OPhase III evaluating the addition of fulvestrant (F) to anastrozol (A) as adjuvant therapy in postmenopausal women with hormone receptor positive HER2 negative (HR+/HER2-) early breast cancer (EBC): Results from the GEICAM/2006-10 study // Ann. Oncol. 2017. Vol. 28, № suppl_5.

113. Spring L., Greenup R., Reynolds K., et al. Abstract 1439: Pathological complete response after neoadjuvant chemotherapy predicts improved survival in all major subtypes of breast cancer: systematic review and meta-analyses of over 18,000 patients // Clinical Research (Excluding Clinical Trials). American Association for

Cancer Research, 2016. Vol. 76, № 14 Supplement. P. 1439-1439.

114. Houssami N., Macaskill P., von Minckwitz G., et al. Meta-analysis of the association of breast cancer subtype and pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy // Eur. J. Cancer. Pergamon, 2012. Vol. 48, № 18. P. 3342-3354.

115. Sethy C., Kundu C.N. 5-Fluorouracil (5-FU) resistance and the new strategy to enhance the sensitivity against cancer: Implication of DNA repair inhibition // Biomed. Pharmacother. Elsevier Masson, 2021. Vol. 137. P. 111285.

116. Johnson-Arbor K., Dubey R. Doxorubicin // StatPearls. Elsevier Inc., 2021. 1-5 p.

117. Weiss A., Bashour S.I., Hess K., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy regimen on relapse-free survival among patients with breast cancer achieving a pathologic complete response: an early step in the de-escalation of neoadjuvant chemotherapy // Breast Cancer Res. BioMed Central Ltd., 2018. Vol. 20, № 1. P. 27.

118. Имянитов Е.Н. Принципы индивидуализации противоопухолевой терапии // Практическая онкология. Общество с ограниченной ответственностью" Центр ТОММ", 2013. Vol. 14, № 4. P. 187-194.

119. Weigel M., Dowsett M. Current and emerging biomarkers in breast cancer: prognosis and prediction in: Endocrine-Related Cancer Volume 17 Issue 4 (2010) [Electronic resource]. 2010. P. 245-262. URL:

https: //erc. bioscientifica.com/view/j ournals/erc/17/4/R245 .xml.

120. Nixon A.J., Neuberg D., Hayes D.F., et al. Relationship of patient age to pathologic features of the tumor and prognosis for patients with stage I or II breast cancer. // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 1994. Vol. 12, № 5. P. 888-894.

121. de la Rochefordiere A., Campana F., Fenton J., et al. Age as prognostic factor in premenopausal breast carcinoma // Lancet. Elsevier, 1993. Vol. 341, № 8852. P. 1039-1043.

122. Gnerlich J.L., Deshpande A.D., Jeffe D.B., et al. Elevated Breast Cancer Mortality in Women Younger than Age 40 Years Compared with Older Women Is

Attributed to Poorer Survival in Early-Stage Disease // J. Am. Coll. Surg. 2009. Vol. 208, № 3. P. 341-347.

123. Sheridan W., Scott T., Caroline S., et al. Breast cancer in young women: have the prognostic implications of breast cancer subtypes changed over time? // Breast Cancer Res. Treat. Springer New York LLC, 2014. Vol. 147, № 3. P. 617-629.

124. Partridge A.H., Hughes M.E., Warner E.T., et al. Subtype-Dependent Relationship Between Young Age at Diagnosis and Breast Cancer Survival // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2016. Vol. 34, № 27. P. 3308-3314.

125. Fredholm H., Magnusson K., Lindström L.S., et al. Long-term outcome in young women with breast cancer: a population-based study // Breast Cancer Res. Treat. Springer New York LLC, 2016. Vol. 160, № 1. P. 131-143.

126. Huober J., von Minckwitz G., Denkert C., et al. Effect of neoadjuvant anthracycline-taxane-based chemotherapy in different biological breast cancer phenotypes: overall results from the GeparTrio study // Breast Cancer Res. Treat. Breast Cancer Res Treat, 2010. Vol. 124, № 1. P. 133-140.

127. Loibl S., Jackisch C., Gade S., et al. Abstract S3-1: Neoadjuvant Chemotherapy in the very young 35 years of age or younger // General Session Abstracts. American Association for Cancer Research, 2012. Vol. 72, № 24 Supplement. P. S3-1-S3-1.

128. Brierley J.D., Greene F.L., Sobin L.H., et al. The "y" symbol: An important classification tool for neoadjuvant cancer treatment // Cancer. John Wiley & Sons, Ltd, 2006. Vol. 106, № 11. P. 2526-2527.

129. Carter C.L., Allen C., Henson D.E. Relation of tumor size, lymph node status, and survival in 24,740 breast cancer cases // Cancer. 1989. Vol. 63, № 1. P. 181-187.

130. Mirza A.N., Mirza N.Q., Vlastos G., et al. Prognostic Factors in Node-Negative Breast Cancer // Ann. Surg. Lippincott, Williams, and Wilkins, 2002. Vol. 235, № 1. P. 10-26.

131. Elston C.W., Ellis I.O. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up // Histopathology. 1991. Vol. 19, № 5. P. 403-410.

132. Bloom H.J.G., Richardson W.W. Histological Grading and Prognosis in Breast

Cancer // Br. J. Cancer. 1957. Vol. 11, № 3. P. 359-377.

133. Rakha E.A., El-Sayed M.E., Lee A.H.S., et al. Prognostic Significance of Nottingham Histologic Grade in Invasive Breast Carcinoma // J. Clin. Oncol. 2008. Vol. 26, № 19. P. 3153-3158.

134. Beatson G.T. On The Treatment of Inoperable Cases of Carcinoma of the Mamma: Suggestions for a New Method of Treatment, with Illustrative Cases // CA. Cancer J. Clin. 1983. Vol. 33, № 2. P. 108-121.

135. Jensen E. V, Jacobson H.I. Fate of steroid estrogens in target tissues // Biological activities of steroids in relation to cancer. Elsevier, 1960. P. 161-178.

136. Kuiper G.G.J.M., Enmark E., Pelto-Huikko M., et al. Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary. // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 1996. Vol. 93, № 12. P. 5925-5930.

137. Green S., Walter P., Kumar V., et al. Human oestrogen receptor cDNA: sequence, expression and homology to v-erb-A // Nature. 1986. Vol. 320, № 6058. P. 134139.

138. Enmark E., Pelto-Huikko M., Grandien K., et al. Human Estrogen Receptor P-Gene Structure, Chromosomal Localization, and Expression Pattern 1 // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. Vol. 82, № 12. P. 4258-4265.

139. Allred D.C., Brown P., Medina D. The origins of estrogen receptor alpha-positive and estrogen receptor alpha-negative human breast cancer // Breast Cancer Res. 2004. Vol. 6, № 6. P. 240.

140. Jonsson P., Katchy A., Williams C. Support of a bi-faceted role of estrogen receptor P (ERP) in ERa-positive breast cancer cells // Endocr. Relat. Cancer. Society for Endocrinology, 2014. Vol. 21, № 2. P. 143-160.

141. Thomas C., Gustafsson J.-A. The different roles of ER subtypes in cancer biology and therapy // Nat. Rev. Cancer. 2011. Vol. 11, № 8. P. 597-608.

142. Gustafsson J.-A. What pharmacologists can learn from recent advances in estrogen signalling // Trends Pharmacol. Sci. Elsevier Ltd, 2003. Vol. 24, № 9. P. 479-485.

143. Couse J.F., Lindzey J., Grandien K., et al. Tissue Distribution and Quantitative

Analysis of Estrogen Receptor-a (ERa) and Estrogen Receptor-P (ERP) Messenger Ribonucleic Acid in the Wild-Type and ERa-Knockout Mouse // Endocrinology. Endocrine Society, 1997. Vol. 138, № 11. P. 4613-4621.

144. Gottardis M.M., Robinson S.P., Satyaswaroop P.G., et al. Contrasting actions of tamoxifen on endometrial and breast tumor growth in the athymic mouse. // Cancer Res. American Association for Cancer Research, 1988. Vol. 48, № 4. P. 812-815.

145. Dahlman-Wright K., Cavailles V., Fuqua S.A., et al. International Union of Pharmacology. LXIV. Estrogen Receptors // Pharmacol. Rev. Pharmacol Rev, 2006. Vol. 58, № 4. P. 773-781.

146. DM G., JC H. Conjugated Estrogens--The Natural SERMs // Gynecol. Endocrinol. Gynecol Endocrinol, 1999. Vol. 13 Suppl 6.

147. Heldring N., Pike A., Andersson S., et al. Estrogen Receptors: How Do They Signal and What Are Their Targets // Physiol. Rev. Physiol Rev, 2007. Vol. 87, № 3. P. 905-931.

148. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The Multifaceted Mechanisms of Estradiol and Estrogen Receptor Signaling // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2001. Vol. 276, № 40. P. 36869-36872.

149. Deroo B.J. Estrogen receptors and human disease // J. Clin. Invest. J Clin Invest, 2006. Vol. 116, № 3. P. 561-570.

150. Slowikowski B.K., Lianeri M., Jagodzinski P.P. Exploring estrogenic activity in lung cancer // Mol. Biol. Rep. 2017. Vol. 44, № 1. P. 35-50.

151. Rhodes A. Frequency of oestrogen and progesterone receptor positivity by immunohistochemical analysis in 7016 breast carcinomas: correlation with patient age, assay sensitivity, threshold value, and mammographic screening // J. Clin. Pathol. J Clin Pathol, 2000. Vol. 53, № 9. P. 688-696.

152. Rastelli F., Crispino S. Factors Predictive of Response to Hormone Therapy in Breast Cancer // Tumori J. Tumori, 2008. Vol. 94, № 3. P. 370-383.

153. Viale G., Regan M.M., Maiorano E., et al. Prognostic and Predictive Value of Centrally Reviewed Expression of Estrogen and Progesterone Receptors in a

Randomized Trial Comparing Letrozole and Tamoxifen Adjuvant Therapy for Postmenopausal Early Breast Cancer: BIG 1-98 // J. Clin. Oncol. J Clin Oncol, 2007. Vol. 25, № 25. P. 3846-3852.

154. Curigliano G., Burstein H.J., Winer E.P., et al. De-escalating and escalating treatments for early-stage breast cancer: the St. Gallen International Expert Consensus Conference on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2017 // Ann. Oncol. Oxford University Press, 2017. Vol. 28, № 8. P. 1700-1712.

155. Harris L.N., Ismaila N., McShane L.M., et al. Use of Biomarkers to Guide Decisions on Adjuvant Systemic Therapy for Women With Early-Stage Invasive Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2016. Vol. 34, № 10. P. 1134-1150.

156. Senkus E., Kyriakides S., Ohno S., et al. Primary breast cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. Oxford University Press, 2015. Vol. 26. P. v8-v30.

157. Hammond M.E.H., Hayes D.F., Dowsett M., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2010. Vol. 28, № 16. P. 2784-2795.

158. Goetz M.P., Gradishar W.J., Anderson B.O., et al. Breast Cancer, Version 3.2018 // J. Natl. Compr. Cancer Netw. Harborside Press, 2019. Vol. 17, № 2. P. 118126.

159. Barnes D., Harris W., Smith P., et al. Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of different methods of assessment of staining and correlation with clinical outcome of breast cancer patients // Br. J. Cancer. Nature Publishing Group, 1996. Vol. 74, № 9. P. 1445-1451.

160. Liao G.-S., Dai M.-S., Hsu H.-M., et al. Survival outcome of weak estrogen/progesterone receptor expression in HER2 negative breast cancer is similar to triple negative breast cancer // Eur. J. Surg. Oncol. W.B. Saunders Ltd,

2017. Vol. 43, № 10. P. 1855-1861.

161. Yi M., Huo L., Koenig K.B., et al. Which threshold for ER positivity? a retrospective study based on 9639 patients // Ann. Oncol. Ann Oncol, 2014. Vol. 25, № 5. P. 1004-1011.

162. Deyarmin B., Kane J.L., Valente A.L., et al. Effect of ASCO/CAP Guidelines for Determining ER Status on Molecular Subtype // Ann. Surg. Oncol. Ann Surg Oncol, 2013. Vol. 20, № 1. P. 87-93.

163. Iwamoto T., Booser D., Valero V., et al. Estrogen Receptor (ER) mRNA and ER-Related Gene Expression in Breast Cancers That Are 1% to 10% ER-Positive by Immunohistochemistry // J. Clin. Oncol. J Clin Oncol, 2012. Vol. 30, № 7. P. 729-734.

164. McGuire W., WL M. An update on estrogen and progesterone receptors in prognosis for primary and advanced breast cancer // AN Updat. ESTROGEN PROGESTERONE Recept. Progn. Prim. Adv. BREAST CANCER. 1980.

165. Abe O., Abe R., Enomoto K., et al. Relevance of breast cancer hormone receptors and other factors to the efficacy of adjuvant tamoxifen: patient-level meta-analysis of randomised trials // Lancet. Lancet Publishing Group, 2011. Vol. 378, № 9793. P. 771-784.

166. Hilsenbeck S.G., Ravdin P.M., de Moor C.A., et al. Time-dependence of hazard ratios for prognostic factors in primary breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. Breast Cancer Res Treat, 1998. Vol. 52, № 1-3. P. 227-237.

167. Natarajan L., Pu M., Parker B.A., et al. Time-Varying Effects of Prognostic Factors Associated With Disease-Free Survival in Breast Cancer // Am. J. Epidemiol. Am J Epidemiol, 2009. Vol. 169, № 12. P. 1463-1470.

168. Colleoni M., Sun Z., Price K.N., et al. Annual Hazard Rates of Recurrence for Breast Cancer During 24 Years of Follow-Up: Results From the International Breast Cancer Study Group Trials I to V // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2016. Vol. 34, № 9. P. 927-935.

169. Khoshnoud M.R., Fornander T., Johansson H., et al. Long-term pattern of disease recurrence among patients with early-stage breast cancer according to estrogen

receptor status and use of adjuvant tamoxifen // Breast Cancer Res. Treat. Springer, 2007. Vol. 107, № 1. P. 71-78.

170. Blows F.M., Driver K.E., Schmidt M.K., et al. Subtyping of Breast Cancer by Immunohistochemistry to Investigate a Relationship between Subtype and Short and Long Term Survival: A Collaborative Analysis of Data for 10,159 Cases from 12 Studies // PLoS Med. / ed. Marincola F.M. PLoS Med, 2010. Vol. 7, № 5. P. e1000279.

171. Tsai S.Y., Carlstedt-Duke J., Weigel N.L., et al. Molecular interactions of steroid hormone receptor with its enhancer element: Evidence for receptor dimer formation // Cell. Cell, 1988. Vol. 55, № 2. P. 361-369.

172. Mohammed H., Russell I.A., Stark R., et al. Progesterone receptor modulates ERa action in breast cancer // Nature. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 523, № 7560. P. 313-317.

173. Mote P.A., Bartow S., Tran N., et al. Loss of Co-ordinate Expression of Progesterone Receptors A and B is an Early Event in Breast Carcinogenesis // Breast Cancer Res. Treat. Breast Cancer Res Treat, 2002. Vol. 72, № 2. P. 163172.

174. Richer J.K., Jacobsen B.M., Manning N.G., et al. Differential Gene Regulation by the Two Progesterone Receptor Isoforms in Human Breast Cancer Cells // J. Biol. Chem. J Biol Chem, 2002. Vol. 277, № 7. P. 5209-5218.

175. Brankovic-Magic M., Jankovic R., Neskovic-Konstantinovic Z., et al. Progesterone receptor status of breast cancer metastases // J. Cancer Res. Clin. Oncol. J Cancer Res Clin Oncol, 2002. Vol. 128, № 1. P. 55-60.

176. Cui X., Schiff R., Arpino G., et al. Biology of Progesterone Receptor Loss in Breast Cancer and Its Implications for Endocrine Therapy // J. Clin. Oncol. J Clin Oncol, 2005. Vol. 23, № 30. P. 7721-7735.

177. Arpino G., Weiss H., Lee A. V., et al. Estrogen Receptor-Positive, Progesterone Receptor-Negative Breast Cancer: Association With Growth Factor Receptor Expression and Tamoxifen Resistance // JNCI J. Natl. Cancer Inst. J Natl Cancer Inst, 2005. Vol. 97, № 17. P. 1254-1261.

178. De Maeyer L., Van Limbergen E., De Nys K., et al. Does Estrogen Receptor-Negative/Progesterone Receptor-Positive Breast Carcinoma Exist? // J. Clin. Oncol. 2008. Vol. 26, № 2. P. 335-336.

179. Nadji M., Gomez-Fernandez C., Ganjei-Azar P., et al. Immunohistochemistry of Estrogen and Progesterone Receptors Reconsidered // Am. J. Clin. Pathol. 2005. Vol. 123, № 1. P. 21-27.

180. Dunnwald L.K., Rossing M.A., Li C.I. Hormone receptor status, tumor characteristics, and prognosis: a prospective cohort of breast cancer patients // Breast Cancer Res. 2007. Vol. 9, № 1. P. R6.

181. Rakha E.A., El-Sayed M.E., Green A.R., et al. Biologic and Clinical Characteristics of Breast Cancer With Single Hormone Receptor-Positive Phenotype // J. Clin. Oncol. 2007. Vol. 25, № 30. P. 4772-4778.

182. Rhodes A., Jasani B. The oestrogen receptor-negative/progesterone receptor-positive breast tumour: a biological entity or a technical artefact? // J. Clin. Pathol. 2009. Vol. 62, № 1. P. 95-96.

183. Schroth W., Winter S., Büttner F., et al. Clinical outcome and global gene expression data support the existence of the estrogen receptor-negative/progesterone receptor-positive invasive breast cancer phenotype // Breast Cancer Res. Treat. 2016. Vol. 155, № 1. P. 85-97.

184. Hefti M.M., Hu R., Knoblauch N.W., et al. Estrogen receptor negative/progesterone receptor positive breast cancer is not a reproducible subtype // Breast Cancer Res. 2013. Vol. 15, № 4. P. R68.

185. Purdie C.A., Quinlan P., Jordan L.B., et al. Progesterone receptor expression is an independent prognostic variable in early breast cancer: a population-based study // Br. J. Cancer. 2014. Vol. 110, № 3. P. 565-572.

186. Prat A., Cheang M.C.U., Martin M., et al. Prognostic Significance of Progesterone Receptor-Positive Tumor Cells Within Immunohistochemically Defined Luminal A Breast Cancer // J. Clin. Oncol. 2013. Vol. 31, № 2. P. 203-209.

187. Baird R.D., Carroll J.S. Understanding Oestrogen Receptor Function in Breast Cancer and its Interaction with the Progesterone Receptor. New Preclinical

Findings and their Clinical Implications // Clin. Oncol. 2016. Vol. 28, № 1. P. 13.

188. Bardou V.-J., Arpino G., Elledge R.M., et al. Progesterone Receptor Status Significantly Improves Outcome Prediction Over Estrogen Receptor Status Alone for Adjuvant Endocrine Therapy in Two Large Breast Cancer Databases // J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 21, № 10. P. 1973-1979.

189. Stendahl M., Ryden L., Nordenskjold B., et al. High Progesterone Receptor Expression Correlates to the Effect of Adjuvant Tamoxifen in Premenopausal Breast Cancer Patients // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12, № 15. P. 4614-4618.

190. Ferno M., Stal O., Baldetrop B., et al. Results of two or five years of adjuvant tamoxifen correlated to steroid receptor and S-phase levels // Breast Cancer Res. Treat. 2000. Vol. 59, № 1. P. 69-76.

191. Ekholm M., Bendahl P.-O., Ferno M., et al. Two Years of Adjuvant Tamoxifen Provides a Survival Benefit Compared With No Systemic Treatment in Premenopausal Patients With Primary Breast Cancer: Long-Term Follow-Up (&gt; 25 years) of the Phase III SBII:2pre Trial // J. Clin. Oncol. 2016. Vol. 34, № 19. P. 2232-2238.

192. Duffy M.J., Harbeck N., Nap M., et al. Clinical use of biomarkers in breast cancer: Updated guidelines from the European Group on Tumor Markers (EGTM) // Eur. J. Cancer. 2017. Vol. 75. P. 284-298.

193. Nordenskjold A., Fohlin H., Fornander T., et al. Progesterone receptor positivity is a predictor of long-term benefit from adjuvant tamoxifen treatment of estrogen receptor positive breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. 2016. Vol. 160, № 2. P. 313-322.

194. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation // Cell. 2011. Vol. 144, № 5. P. 646-674.

195. van Diest P.J. Prognostic value of proliferation in invasive breast cancer: a review // J. Clin. Pathol. 2004. Vol. 57, № 7. P. 675-681.

196. Stal O., Dufmats M., Hatschek T., et al. S-phase fraction is a prognostic factor in stage I breast carcinoma. // J. Clin. Oncol. 1993. Vol. 11, № 9. P. 1717-1722.

197. Meyer J.S., Friedman E., McCrate M.M., et al. Prediction of early course of breast carcinoma by thymidine labeling // Cancer. 1983. Vol. 51, № 10. P. 1879-1886.

198. Volpi A., Paola F. De, Nanni O., et al. Prognostic significance of biologic markers in node-negative breast cancer patients: a prospective study // Breast Cancer Res. Treat. 2000. Vol. 63, № 3. P. 181-192.

199. Malmström P., Bendahl P.-O., Boiesen P., et al. S-Phase Fraction and Urokinase Plasminogen Activator Are Better Markers for Distant Recurrences Than Nottingham Prognostic Index and Histologic Grade in a Prospective Study of Premenopausal Lymph Node-Negative Breast Cancer // J. Clin. Oncol. 2001. Vol. 19, № 7. P. 2010-2019.

200. Ahlin C., Aaltonen K., Amini R.-M., et al. Ki67 and cyclin A as prognostic factors in early breast cancer. What are the optimal cut-off values? // Histopathology. 2007. Vol. 51, № 4. P. 491-498.

201. Cheang M.C.U., Chia S.K., Voduc D., et al. Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2009. Vol. 101, № 10. P. 736-750.

202. Stuart-Harris R., Caldas C., Pinder S.E., et al. Proliferation markers and survival in early breast cancer: A systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32,825 patients // The Breast. 2008. Vol. 17, № 4. P. 323-334.

203. Dowsett M., Nielsen T.O., A'Hern R., et al. Assessment of Ki67 in Breast Cancer: Recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2011. Vol. 103, № 22. P. 1656-1664.

204. Denkert C., Budczies J., von Minckwitz G., et al. Strategies for developing Ki67 as a useful biomarker in breast cancer // The Breast. 2015. Vol. 24. P. S67-S72.

205. Ellis M.J., Tao Y., Luo J., et al. Outcome Prediction for Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer Based on Postneoadjuvant Endocrine Therapy Tumor Characteristics // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2008. Vol. 100, № 19. P. 1380-1388.

206. Dowsett M., Smith I.E., Ebbs S.R., et al. Prognostic Value of Ki67 Expression After Short-Term Presurgical Endocrine Therapy for Primary Breast Cancer // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2007. Vol. 99, № 2. P. 167-170.

207. Goldhirsch A., Winer E.P.E.P., Coates A.S.A.S., et al. Personalizing the treatment of women with early breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013 // Ann. Oncol. 2013. Vol. 24, № 9. P. 2206-2223.

208. Petrelli F., Viale G., Cabiddu M., et al. Prognostic value of different cut-off levels of Ki-67 in breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 64,196 patients // Breast Cancer Res. Treat. 2015. Vol. 153, № 3. P. 477-491.

209. Swanson P.E., Schmidt R.A. Beneath the Surface of the Mud, Part II // Am. J. Clin. Pathol. 2005. Vol. 123, № 1. P. 9-12.

210. Polley M.-Y.C., Leung S.C.Y., McShane L.M., et al. An International Ki67 Reproducibility Study // JNCI J. Natl. Cancer Inst. 2013. Vol. 105, № 24. P. 1897-1906.

211. Coussens L., Yang-Feng T., Liao Y., et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene // Science (80-. ). 1985. Vol. 230, № 4730. P. 1132-1139.

212. Slamon D., Clark G., Wong S., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene // Science (80-. ). 1987. Vol. 235, № 4785. P. 177-182.

213. Romond E.H., Perez E.A., Bryant J., et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer // N. Engl. J. Med. 2005. Vol. 353, № 16. P. 1673-1684.

214. Cronin K.A., Harlan L.C., Dodd K.W., et al. Population-based Estimate of the Prevalence of HER-2 Positive Breast Cancer Tumors for Early Stage Patients in the US // Cancer Invest. 2010. Vol. 28, № 9. P. 963-968.

215. Piccart-Gebhart M.J., Procter M., Leyland-Jones B., et al. Trastuzumab after Adjuvant Chemotherapy in HER2-Positive Breast Cancer // N. Engl. J. Med. 2005. Vol. 353, № 16. P. 1659-1672.

216. Honarvar H., Calce E., Doti N., et al. Evaluation of HER2-specific peptide ligand for its employment as radiolabeled imaging probe // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 2998.

217. LINGGI B., CARPENTER G. ErbB receptors: new insights on mechanisms and biology // Trends Cell Biol. 2006. Vol. 16, № 12. P. 649-656.

218. Graus-Porta D. ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 7. P. 1647-1655.

219. Moasser M.M. The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis // Oncogene. 2007. Vol. 26, № 45. P. 64696487.

220. Barnes C.J., Kumar R. Biology of the Epidermal Growth Factor Receptor Family // Molecular Targeting and Signal Transduction. Boston: Kluwer Academic Publishers. P. 1-13.

221. Stefansson O.A., Esteller M. Epigenetic Modifications in Breast Cancer and Their Role in Personalized Medicine // Am. J. Pathol. Am J Pathol, 2013. Vol. 183, № 4. P. 1052-1063.

222. Tanas A.S., Sigin V.O., Kalinkin A.I., et al. Genome-wide methylotyping resolves breast cancer epigenetic heterogeneity and suggests novel therapeutic perspectives // Epigenomics. Future Medicine Ltd., 2019. Vol. 11, № 6. P. 605-617.

223. Davalos V., Martinez-Cardus A., Esteller M. The Epigenomic Revolution in Breast Cancer // Am. J. Pathol. Elsevier Inc., 2017. Vol. 187, № 10. P. 21632174.

224. Mark K.M.K., Varn F.S., Ung M.H., et al. The E2F4 prognostic signature predicts pathological response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients // BMC Cancer. BioMed Central Ltd., 2017. Vol. 17, № 1. P. 306.

225. Wachter D.L., Fasching P.A., Haeberle L., et al. Prognostic molecular markers and neoadjuvant therapy response in anthracycline-treated breast cancer patients // Arch. Gynecol. Obstet. Springer, 2013. Vol. 287, № 2. P. 337-344.

226. Litviakov N. V., Cherdyntseva N. V., Tsyganov M.M., et al. Deletions of multidrug resistance gene loci in breast cancer leads to the down-regulation of its expression and predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy // Oncotarget. Impact Journals LLC, 2016. Vol. 7, № 7. P. 7829-7841.

227. Pineda B., Diaz-Lagares A., Perez-Fidalgo J.A., et al. A two-gene epigenetic signature for the prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer patients // Clin. Epigenetics. 2019. Vol. 11, № 1. P. 33.

228. Diana A., Carlino F., Franzese E., et al. Early Triple Negative Breast Cancer: Conventional Treatment and Emerging Therapeutic Landscapes // Cancers (Basel). MDPI AG, 2020. Vol. 12, № 4. P. 819.

229. Eisenhauer E.A., Therasse P., Bogaerts J., et al. New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) // Eur. J. Cancer. Eur J Cancer, 2009. Vol. 45, № 2. P. 228-247.

230. Symmans W.F., Peintinger F., Hatzis C., et al. Measurement of Residual Breast Cancer Burden to Predict Survival After Neoadjuvant Chemotherapy // J. Clin. Oncol. J Clin Oncol, 2007. Vol. 25, № 28. P. 4414-4422.

231. Langmead B., Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 4. P. 357-359.

232. Krueger F., Andrews S.R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications // Bioinformatics. 2011. Vol. 27, № 11. P. 1571-1572.

233. Clifford H., Wessely F., Pendurthi S., et al. Comparison of Clustering Methods for Investigation of Genome-Wide Methylation Array Data // Front. Genet. 2011. Vol. 2.

234. Shen Z., Qu W., Wang W., et al. MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design // BMC Bioinformatics. 2010. Vol. 11, № 1. P. 143.

235. Guescini M., Sisti D., Rocchi M.B.L., et al. Accurate and Precise DNA Quantification in the Presence of Different Amplification Efficiencies Using an Improved Cy0 Method // PLoS One / ed. Maga G. Public Library of Science, 2013. Vol. 8, № 7. P. e68481.

236. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. // Clin. Biochem. Rev. The Australian Association of Clinical Biochemists, 2008. Vol. 29 Suppl 1, № Suppl 1. P. S49-52.

237. Team R.C. R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria: 2015 // R A Lang. Environ. Stat. Comput. 2018. P. 2013.

238. Mardia K. V., Zemroch P.J. Algorithm AS 86: The Von Mises Distribution Function // Appl. Stat. JSTOR, 1975. Vol. 24, № 2. P. 268.

239. Koboldt D.C., Fulton R.S., McLellan M.D., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours // Nature. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 490, № 7418. P. 61-70.

240. Chen Y., Lemire M., Choufani S., et al. Discovery of cross-reactive probes and polymorphic CpGs in the Illumina Infinium HumanMethylation450 microarray // Epigenetics. Taylor and Francis Inc., 2013. Vol. 8, № 2. P. 203-209.

241. Harper K.N., Peters B.A., Gamble M. V. Batch Effects and Pathway Analysis: Two Potential Perils in Cancer Studies Involving DNA Methylation Array Analysis // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. American Association for Cancer Research, 2013. Vol. 22, № 6. P. 1052-1060.

242. Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., et al. Rapid and affordable genome-wide bisulfite DNA sequencing by Xmal-reduced representation bisulfite sequencing // Epigenomics. Future Medicine Ltd., 2017. Vol. 9, № 6. P. 833-847.

243. Sigin V.O., Kalinkin A.I., Kuznetsova E.B., et al. DNA methylation markers panel can improve prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in luminal B breast cancer // Sci. Rep. Nature Research, 2020. Vol. 10, № 1. P. 9239.

244. Bansal A., Sullivan Pepe M. When does combining markers improve classification performance and what are implications for practice? // Stat. Med. NIH Public Access, 2013. Vol. 32, № 11. P. 1877-1892.

245. Mazzara S., Rossi R.L., Grifantini R., et al. CombiROC: an interactive web tool for selecting accurate marker combinations of omics data // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 7, № 1. P. 45477.

246. Paula L.M., De Moraes L.H.F., Do Canto A.L., et al. Analysis of molecular markers as predictive factors of lymph node involvement in breast carcinoma // Oncol. Lett. Spandidos Publications, 2017. Vol. 13, № 1. P. 488-496.

247. Sorlie T., Perou C.M., Tibshirani R., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. Vol. 98, № 19. P. 10869-10874.

248. Banin Hirata B.K., Oda J.M.M., Losi Guembarovski R., et al. Molecular Markers for Breast Cancer: Prediction on Tumor Behavior // Dis. Markers. Hindawi Limited, 2014. Vol. 2014. P. 1-12.

249. Moldovan G.-L., Pfander B., Jentsch S. PCNA, the Maestro of the Replication Fork // Cell. Elsevier, 2007. Vol. 129, № 4. P. 665-679.

250. N. Aoki M., K. Amarante M., M.M. Oda J., et al. Caveolin Involvement and Modulation in Breast Cancer // Mini-Reviews Med. Chem. Bentham Science Publishers Ltd., 2011. Vol. 11, № 13. P. 1143-1152.

251. Liu H., Yang Z., Lu W., et al. Chemokines and chemokine receptors: A new strategy for breast cancer therapy // Cancer Med. John Wiley & Sons, Ltd, 2020. Vol. 9, № 11. P. 3786-3799.

252. Ouyang M., Li Y., Ye S., et al. MicroRNA Profiling Implies New Markers of Chemoresistance of Triple-Negative Breast Cancer // PLoS One / ed. Rameshwar P. Public Library of Science, 2014. Vol. 9, № 5. P. e96228.

Приложение 1

Гены, дифференциально метилированные в опухолях ТН РМЖ с различным ответом на НАХТ: ABCA17P, ABCA3, ADAMTS2, ADAP1, AKT3, ALOXE3, ATP8B2, B4GALT7, BCL2L1, BEGAIN, BMP2, BMP3, BMPER, C1orf86, CAPN2, CCDC69, CD8BP, CDC34, CDO1, CELF2, CHRNA7, CLDND1, CLEC14A, CLIP3, CNTN4, COL4A1, COL4A2, CRIP1, CRTC3, CSF3R, DCHS1, DLEU2, DMRT2, DMTN, DNAH10, DNAH3, EBF4, EHMT1, ELAVL3, EPHA1, EPHA1-AS1, ESPN, EXOC6, FAM149A, FAM163A, FAM69C, FBN1, FBXW7, FMNL1, FOXR1, FYTTD1, GABRA5, GALR2, GAS6, GAS6-AS2, GATA6, GCOM1, GFRA1, GIPR, GLT1D1, GMDS, GNG10, GP5, GPC2, GPC4, GRIK1, GRIN1, HLA-AS1, HLX, HOXC13, HOXC13-AS, HPS1, HRAS, HUNK, IFNL3, INTS4L1, IRF4, KBTBD11, KCNIP2, KCNK12, KCNK17, KIAA0226, KIAA0930, KIAA1462, KLHL30, KRT8, LAMA3, LGALSL, LIMS2, LRCH2, LRRC27, LRRC56, LYPD6, MACROD1, MATK, MCOLN3, MFNG, MIR4453, MLC1, MPV17L, MRPL20, MT1G, MT1H, MYO15B, MYZAP, NANOS3, NEK4P2, NID2, NKX2-2, NKX2-2-AS1, NOTUM, NTN1, NTRK1, NUMBL, OR7E14P, OTUB1, PALM, PAX9, PDSS1, PHLDA2, PLEKHA7, PNCK, POLR2M, PPP4R1, PRR25, PTGER2, PTPRN, RAB34, RAB9A, RALA, RCE1, RFX1, RGS7, RN7SL657P, RNA5SP488, RNF128, RPH3AL, RPL23A, SCO2, SEMA3B, SEMA6D, SFMBT1, SFRP2, SHH, SMARCD3, SNORD42B, SOX21, SOX21-AS1, SPNS2, SRP68, SYNGR3, SYT12, TBCC, TCERG1, TLX3, TMEM200B, TNFRSF25, TNNI2, TOB1, TOB1-AS1, TRIP13, TUBB6, TWIST2, UBL4A, UBTF, UNCX, WDR13, ZNF385A, ZNF747), ACTL6B, ADAMTSL5, ADCY4, AGAP3, AJAP1, ALDH3B1, ALOX12, ANKRD23, ARHGAP8, ASPDH, B3GNTL1, BCAS2, BHLHA9, BMS1P18, BNC1, CACNA1H, CAPN15, CD46P1, CELF4, CHTF18, COL18A1-AS2, CPXM2, CPZ, CR1L, DBN1, DOCK1, EBF1, EDA, EFNB1, EMILIN1, EML2, ENTPD8, EPO, EVPL, FAM132B, FAM228A, FEV, FGF13, FGF13-AS1, FTH1P19, FZD10, FZD10-AS1, GBX1, GFM2, GPR143, H2BFM, HEYL, HMHA1, HMX2, HOXA9, HTATSF1, IFI27, INTS1, IRF7, ISLR2, JOSD2, KCNA5, KCNQ1OT1, KLHL15, LHX3, LINC00354, LINC01006, LYSMD2, MAMDC2, MAPK8IP2, MEG3, MEGF8, MIR4478, MIR5587, MOSPD1, MTMR1, MXRA5, NARFL, NAT9, NSA2,

NSUN5, NSUN5P1, OLFM2, PACSIN3, PARD3B, PARP10, PDE4A, PNPLA3, PPP1R14A, PRKCB, PSEN1, PTMA, RAB34, RBFADN, RN7SKP151, RN7SL554P, RN7SL734P, RPS6KA6, SH3GLB2, SH3KBP1, SLC35A2, SLC35F3, SLC7A2, SRD5A3-AS1, TAF4, TMEM104, TMEM132C, TMEM132D, TMEM165, TMOD2, TNNT3, TREX2, TRIM67, TTC34, TTC40, TTLL12, USF2, VGLL4, WAS, WWTR1, WWTR1-AS1, XKR6, ZG16B, ZIK1.

Гены, дифференциально метилированные в опухолях люм.В РМЖ с различным ответом на НАХТ: ANK1, ARHGAP9, ARMC4P1, C1QL3, CACNA1H, CEACAM22P, CNPY1, COL18A1, COL9A1, DMRT3, EBF1, FAM83H-AS1, FBXO17, FLT4, GATA2, GNAS, HEYL, IFI27, INTS1, ISLR2, KLHL15, KRTCAP3, LAD1, LINC00354, LINC00629, LRRC37A6P, LTBR, MARS, MIR4489, NMRK2, PGR, PLXNB2, PNPLA7, RBFOX1, RFPL3, RPH3AL, RUNX3, SDK1, SIPA1, SIX1, SLC13A3, SLC16A12, SNORD111, SNTG1, TSPAN11, XKR6, ZNF578), и, 152, (ABCA17P, ABCA3, ABHD12B, ACADS, ADAMTS7P3, ADCY9, ADRA2A, AJAP1, ANKRD36BP2, ARID3A, ATP1A3, BARX1, BMS1P17, BNC1, BNIP3, C17orf64, CAPN15, CCDC137, CD248, CD8A, CDX1, CELF4, CKB, CLEC14A, CLEC4G, COL9A2, CRMP1, CTSA, CYBA, DKK1, DLG4, DMRTC1, DOK1, DPP6, DPYSL3, DUSP9, EFNA2, EGFL7, EPS8L1, ERICH1, ERICH1-AS1, FAM155B, FAM228A, FAM83H-AS1, FBXL16, FOXE3, FOXH1, FOXI2, FSTL1, GALR2, GAS6, GBGT1, GLP1R, GNAT1, GPR25, GSC2, GUSBP1, HAND2, HAND2-AS1, HHAT, HMGB3, HOXD12, IBA57-AS1, IRF4, ITGB4, KLHL34, KREMEN1, L1TD1, LINC00092, LINC00159, LINC00273, LINC01044, LOXL3, LRRC38, LTBP3, MAPK12, MAPK8IP2, MIR503, MIR503HG, MIR5587, MUM1, MYO15B, NEURL2, NKX2-2, NODAL, NOTUM, NPR2, NRN1, OLIG3, OXT, PALM, PHKA2, PLCD1, PNCK, PPP1R14BP2, PPP1R16A, PPP1R16B, PRKAR1B, PRKCB, PRKG1-AS1, PROX1-AS1, PRR5, PRSS44, PRSS45, PRSS50, PSKH2, PTGIS, QRFPR, RABL6, RALGDS, RAP1GAP2, RBPJ, RHOQP2, RHOQP3, RN7SL121P, RNA5SP175, RNU6-664P, RPL10, SALL1, SEMA5B, SEPT9, SFRP2, SLC25A43, SLC30A2, SLC6A3, SLC6A8, SNAP25, SNAP25-AS1, SOX1, SRP68, TCEA2, THNSL2, TMEM132C, TMEM132D, TMEM164, TMEM235, TMEM92, TRABD, TTC22, TTC34, USP32, VGLL4, VSX1, VWC2, WAS, WBSCR17, YBX1P1, YBX1P10, YBX1P6, ZAR1, ZIC1, ZNF630

Приложение 2

Название локусов в пулах, последовательность праймеров, длина ампликонов, последовательность TaqMan-зондов, экспериментально отработанная температура отжига праймеров и количество сайтов BstHHI в ампликоне

Пул, локус Последовательность праймеров, 5' - 3' Длина ПЦР продукта, пн Последовательность зонда, 5' - 3' T отжига, °C Кол-во сайтов BstHHI

G1PCSBNO2 F: CGTCCACTGGGGCAGCATTC R: CGGAGCGAGAAGCCCAGATAGA 293 FAM-CGGGTA+AT+CC+CTGT+C+CA+TG-BHQ1 66 0

G1DCTMEM158 F: CTCCAGACCCGGTTGCGTTT R: GGGAATCCTGCTCTGGGATAGCA 106 HEX-CTGCCG+CGCT+GCT+CTG-BHQ2 2

G1TERT F: AGAAAGGAAGGGGAGGGGCTG R: CGCTGGCGTCCCTGCA 303 ROX-AGC+TG+GAA+GG+T+G+AAG-BHQ2 7

G1TTC34 1 F: TCAGTGTGGCCTCTTCTGCCA R: GGGAGTCTGGGGTCGGATTGA 293 CY5-TGG+T+AG+TGAAG+C+C+TC-BHQ2 3

G1TMEM132D3 F: GTGGCCGGGCTCGCTG R: GCCGCACCCGCCAAACT 122 CY5. 5 -CCCCA+TCCCAGGCC+GG-BHQ2 6

G2PCLINC00493 F: CACAGTTCTACACCCGAAAGTCC R: GTGAACTCATTTCGATACATGGGTACG 224 FAM-TCCTTAA+T+GGTTCC+GGCG-BHQ1 64 0

G2DCANO10 F: CGGGCGAAAGAGTGCTCG R: CCTGCGTGTGACCGCATC 108 HEX-AGCGCTGGGCGTGGCGGA-BHQ2 4

G2_TMEM132D_2 F: CCCTGCGAGCGCGGA R: GCCCTTCTCCAGCCATCCTT 209 ROX-CG+T+CA+T+CAAAA+C+C+TCAG-BHQ2 4

G2VGLL42 F: CTGTTCTTGGTCAGTGCGAGG R: TAAATAAGCAACACGGAGTGCCTG 252 CY5-CGTTTTCT+CAAA+GG+CAAA+GGG-BHQ2 3

G3PC3 F: CGCCCTCGGTGCCGAC R: GAATGCGAGGAGAGGAGATGGAAATG 245 CY5.5-CC+GGGAT-BHQ2-AATAA+GGTCTGT+G+GGTG 64 0

G3DCANO10 F: GGGCGAAAGAGTGCTCGGTG R: CTGCGTGTGACCGCATCTAGG 106 CY5-CGGGCCAGGCCAGT-BHQ2-GGGGCGG 4

G3ABCA3 1 F: GACTCCCGGGCTCCAGCA R: GGCGTTGCATTAGGTCGGGG 250 FAM-ACC+ACAGT-BHQ1-GA+GGTGC+GTCCGTGGT 5

G3DPYS1 F: ACCCGCAGCCCCGCA R: TGCAGGAGGGCACCCCAAG 241 HEX-A+GAAG+TCAT-BHQ2-CGTT+GA+CCACGC+GAC 6

G3IRF4 F: GGCAGCTCTTCTCCCCGCA R:GCTCTTCTCCTCGTTCTCCCACA 219 ROX-C+CAG+T+GGCT-BHQ2-+GATCGACCAGATCG 3

Пул, локус Последовательность праймеров, 5' - 3' Длина ПЦР продукта, пн Последовательность зонда, 5' - 3' Т отжига, °с Кол-во сайтов БзШШ

04_РС2_СЮЫт Б: ОЛЛСООСООТТСОТССЛЛО Я: СЛТОТТСССООСООТТТОЛЛО 238 СУ5-СС+ССООТ-БИ02-ЛССС+ОЛССЛОО 62 0

04_ОС6_АВИ05 Б: ООСТССССТСЛОСОТСО Я: ОСТТЛТЛСЛЛСЛЛСООООСОО 105 РЛМ-ССОО+ОЛООСС+ОССТ-БИР1 -ТОЛС 4

04_ТМЕЫ132С_1 Б: ОЛОТООССССОООСЛТ Я: СООЛЛССОООЛЛОТТСОСЛ 232 ИБХ-ЛОСООС+СОООЛСОСЛОО-БИ01 9

04_8ЕКР2_1 Б: СЛОТОСОЛООСОЛООЛЛОЛ Я: СЛОСЛЛСООСТСЛТТСТОСТ 294 ЯОХ-СЛОЛО+ООЛОСООЛОССООО-БИ02 7

05РС3 Б: СССЛОССТСТСССЛООЛООТЛ Я: ТОСОЛООЛОЛООЛОЛТООЛЛЛТОС 286 Су5-СС+О+ООЛТЛЛТЛЛ+ООТСТО+ТОО-БИ03 65 0

05 0С_АЫ010 Б: ООСОЛЛЛОЛОТОСТСООТОС Я: СССТОСОТОТОЛССОСЛТС 107 РЛМ-СОООССЛООССЛОТООООС-БИ01 4

0580X21 Б: СССООССТОТОЛТСОСТТТС Я: ТОССЛСЛОЛОСТОООССТ 150 Су5.5-СОЛОСТСССОООССООСО-БИ03 4

05МУ015В Б: ССООООЛООООЛЛЛООЛСС Я: СССТОЛООССООССТСС 117 ИБХ-СТС+СТТТОО+ОССЛОССЛ+ТООО-БИ01 3

05_ТМЕМ132Б_3 Б: ООТООССОООСТСОСТ Я: СЛОССОСЛСССОССЛЛЛС 125 ЯОХ-СООСССООООСТСССТОО-БИ02 6

ТЫ1_РС5_АШИ4А1 Б: ССЛСТТТОЛТССОЛСТОТО Я: ООЛЛЛОЛЛСТТССЛСТТСОТ 184 Су5-ТОО+ССЛССОТ-БИ02-ЛС+ТСОЛЛО 58 0

ТЫ1АВСА31 Б: ЛОООЛОЛООТООЛОТОЛ Я: ТССЛОЛЛСЛТСЛТСЛОЛОТОЛ 384 ИБХ-ССЛЛ+ОЛОТ-БИР2-+ССТОЛ+ТООЛОТЛО 5

ТЫ1_С001_1 Б: ОЛТСТОТООООТТСЛТССТ Я: ЛОЛСЛЛСООООСТСТТО 197 ЯОХ-ТТЛ+ЛО+СО+СТ-БИ02-Т+ООЛОТС 3

ТЫ1_С1ЕС14А_1 Б: СЛОООЛСЛСЛЛСЛСЛТСО Я: ССОССТСТЛЛСТТОЛОСТЛ 181 Су-5.5-ЛОТТТОТ-БИ03-+ССЛОС+ОЛОСО 4

ТЫ2_РС8 Б: ТССОООЛЛОЛЛССОЛЛЛЛ Я: СТТЛЛОССЛСТСССЛЛОС 283 Су5.5-Л+ССТС+ОСТ-БИ02-СЛОЛСТСОТО 58 0

ТЫ2_БС8_ТСА1М Б: ОЛСОТСЛОСТЛОЛООСЛ Я: ООТОЛСОСССТООТТ 108 РЛМ-Л+ССО+СООЛЛООТ-БИ01ТОЛЛТС 3

ТЫ2_БЬЕи2_1 Б: ОЛОСОЛЛЛОСЛЛЛЛСОЛЛЛ Я: СТТТТССЛЛОООООТТОЛО 198 ИБХ-ССЛЛО+ЛТ-БИР2-СТО+Л+ООТ+СО 4

Пул, локус Последовательность праймеров, 5' - 3' Длина ПЦР продукта, пн Последовательность зонда, 5' - 3' T отжига, 0C Кол-во сайтов BstHHI

TN3_PC7_LINC00493 F: GACACCTGAGCGACTTTC R: GTGAACTCATTTCGATACATGG 200 Cy5.5 -AAGC+GGACGC+TGAAAACT-BHQ3 58 0

TN3_DC4_ANOl 0 F: CGAAAGAGTGCTCGGTG R: GGAGCTACCGCCCAG 153 FAM-CCTA+GAT-BHQ1-GCGGTCA+CACG 7

ТЮ_БШ1_1 F: CGGATAACGCCCTAAATCAG R: GAGGCCGAATCATCTCCT 215 HEX-CACAGA+CGT-BHQ2-GT+CGGTGTT 3

TN3_SFRP2_l F: AGTTCGAGCTTGTCCCG R: CACCCTCCAGATTTGCATAA 232 ROX-AGA+AT+G+AGC+CGTT-BHQ2-GCT 4

т3_ТТС34_1 F: ATTGTTGGACCTGGGGT R: CTTGATCTCCCCTCTTGGT 230 Cy-5 -CGCCAT-BHQ2 -GAGC+TC+TG+AGTC 3

ТШРСб F: TAGAGGAAGTCGTAGAGGTGT R: TCATTGTGTCTTGACAACCG 244 Cy5.5 -CGG+CACT-BHQ2-AG+CAGAGACCA 58 0

TN4_DCl 0_ТМЕМ158 F: CCCCAGGTGCTCGATG R: CGACCTACTGCTCTTCTCC 97 FAM-CGAAGA+AAGCGCGGCCGt-BHQ 1 2

TN4_PRKCБ_2 F: TCAAGAACCACAAATTCACCG R: ACTGTCCATCCGGGAGT 240 HEX-CTT+CA+TCT-BHQ2-+GGT+GAGCG 6

TN4_GMDS_l F: CAGCTCCCCTCACTTCTC R: TCGCTTTCGATGTGAGTATCT 148 Cy5-CCCG+ACCC+TGAG+AGC-BHQ3 3

ТЖРС10_ЕАМ83А F:CACCTCTACGCCTCCTCCAA R: TGAAGACGCGGACACACTTC 198 Cy5.5 -AAT+GGCC+GCCT-BHQ2-TA+GCAGC 62 0

ТЖ^С10_ТМЕМ158 F: GGTGCTCGATGAGCAGCG R: CTTCCAGTGCGACCTACTGC 101 FAM-CGAA+GAAAGCGCG+GCCGT-BHQ1 2

ТЖ_Ж015Б_1 F: TGCACTGCACAGAAGGTCAC R: CGACTCCTGCTCCCCTGA 166 ROX-CGG+GA+G+G+CCAA+ATCC-BHQ2 3

TNб_TMEMl32D_l F: AAAAGCCCCACCCTTTCGG R: CTCAGTGTGGCGTGTCAGAG 373 Cy5-CAC+CGGCCT+CT-BHQ2-CGTC+GTC 3

1Б1РС3 F: TCTCCCAGGAGGTAGGGAC R: CACAGACCTTATTATCCCGGC 174 Cy5.5 -AAGGCAGAA+GGCCCCCAA-BHQ3 62 0

ЬБ1_0С12_ТМШ158 F: GACCCGGTTGCGTTTGG R: GGGAATCCTGCTCTGGGATA 101 FAM-CTGC+CGCGCT-BHQ1-GCTCTG 3

LБl_LTБR F: GAAAAACTCCCACAGTAGGGC R: GAGCAGAGGGAGTTCCAGAG 198 ROX-TTCTGC+GGCC+TT-BHQ2-GCAGTC 3

1Б1_ЖЫ1 F: GCTGTGGCCATCTCTTTCC R: CGGGACACATTCACACACAA 230 Cy-5 -CT+GGAAGC+TG+AGTGCC-BHQ3 5