MALDI-TOF масс-спектрометрический дифференциальный анализ протеома штаммов Escherichia coli, Vibrio cholerae и диагностического бактериофага El Tor тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Чайка Софья Олеговна

• Чайка Софья Олеговна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Чайка Софья Олеговна

Стр

18

23

25

54

55

55

57

MALDI

63

MALDI

67

микроорганизмов. Визуализация и интерпретация результатов идентификации.

Создание виртуальных коллекции масс-спектров

протеомов клеток микроорганизмов с помощью программы Biotyper. Разработка дизайна масс-спектрометрического паспорта вносимого в базу данных объекта.

Методика идентификации константных и вариабельных

рибосомальных белков клеток представителей вида Escherichia coli, Vibrio cholerae и белков диагностического бактериофаг El Tor с помощью программ Biotyper и MS Excel

Построение дендрограмм. Филогенетический

компьютерный анализ штаммов Глава 3. ПРОТЕОМНЫЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ E. COLI,, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЧЕЛОВЕКА

Создание базы данных масс-спектров клеток E. coli

Сравнительный анализ константных и вариабельных

белков представителей E. coli гемолитических, негемолитических и штаммов ассоциированных с условно-патогенными энтеробактериями родов Klebsiella и Enterobacter выделенных от человека

3.3 Филогенетический кластерный анализ штаммов E.coli, 83 на основе характеристики протеома Глава 4. ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ВИБРИОНОВ НА

ОСНОВЕ СОЗДАНИЯ БИБЛИОТЕКИ МАСС-СПЕКТРОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА VIBRIO

Протеомный анализ V. albensis

Идентификация таксон-специфических протеомных

маркеров вида Vibrio cholerae

Протеомный маркер токсигенности вида Vibrio

cholerae в формате MALDI-TOF

Применение протеомных методов анализа на основе 115 сравнения биохимических признаков и молекулярных масс рибосомальных белков клеток для дифференциации близкородственных видов рода Vibrio. Глава 5. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ MALDI-TOF

МАСС-СПЕКРОМЕТРИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ УГЛЕВОД -СПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ БАКТЕРИОФАГА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

165

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и современное состояние исследований в данной области

Метод времяпролетной масс-спектрометрии на базе матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации с времяпролетным разделением ионов (MALDI-ToF-MS) - это физико - биохимический метод разделения белков в вакууме под действием лазерного луча и определения комплекса молекулярных масс клеток или тканей, с целью выявления маркеров патологического процесса, на основе создания коллекций масс-спектров протеома виртуальных образцов. В настоящее время можно выделить два основных технологических приема, основанных на времяпролетной спектрометрии. В основе одного из них, лежит предварительное разделение белков путем двумерного электрофореза, с последующей тандемной масс-спектрометрией (MS-TOF-TOF). Такой анализ позволяет идентифицировать белки не только клеток, но и тканей, путем фингерпринта (Zou et al., 2006; Yan et al., 2009; Ruibai et al.,2009; Агафонов и др., 2013;). Второй подход включает в себя непосредственно работу масс-спектрометра в линейном режиме - это прямое белковое профилирование клеток, в частности микроорганизмов и получение их виртуального «облика» - протеомного спектра, молекулярных масс объекта в диапазоне заданных масс-зарядов (Телесманич, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018; Гапон, 2015, 2016; Чайка 2016, 2017, 2018). Профилирование клеток лежит в диапазоне масс-зарядов от 2000 до 18000 Да, что достигается использованием в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Бочарова и др., 2016).

Однако, имеющаяся коммерческая база данных не содержит образцы с измененными свойствами, отличными от референтных протеомов клеток. Протеомы представителей вида Vibrio cholerae, отсутствуют. Отсутствуют также масс-спектры вирусов и бактериофагов. Основными преимуществами

программы MALDI Biotyper аппарата «Bruker Daltonics» является возможность создания персональных коллекций протеомов баз данных, обработка и анализ спектров молекулярных масс (масс-спектров) микроорганизмов новых профилей и их сравнение с библиотекой референтных спектров (Телесманич, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018). Описание биохимических свойств клеток холерных вибрионов довольно разнопланово, но рассматривается больше с позиции таксономии и клинической лабораторной диагностики, но не метаболизма. Так по способности к ферментации сахаров - манноза, арабиноза, сахароза виды вибрионов подразделены на восемь таксономических групп.

У холерных вибрионов описана протеолитическая, лецитиназная, триацилглицероллипазная, нейраминидазная, РНКзная, аденилатциклазная активности (Casanova et. al., 1995; Ogierman et. al., 1997; Телесманич и др., 2004; Di Pinto et. al., 2005; под ред.А.С. Лабинской и др, 2010; Oh et al., 2015).

Развитие методов протеомного анализа позволяет расширить представления о метаболических особенностях клеток холерных вибрионов.

С помощью различных вариантов MALDI описаны белки, участвующие в ферментации сорбита, в функции которых входит метаболизм сахаров, тиосульфатов, метаболизм аминокислот (Yan et al., 2009), описаны особенности метаболизма дыхательной цепи и переноса электронов у представителей Ogava и Inaba (Chmelik et al., 2007), с помощью наножидкостной хроматографии и электроспрейной квадрупольной и тандемной масс-спектрометрии выявлены рецепторные углеводсвязывающие пептиды - места гликозилирования моносахаридом V.cholerae (Jahouh et. al., 2012).

В связи с отсутствием в референтной базе данных, масс-спектров протеомов различных представителей холерных вибрионов затруднено не только изучение отдельных белков ассоциированных с их биохимическими свойствами, но их дифференциация, в частности отсутствует описание масс-спектрометричесой структуры холерного токсина или его маркеров.

Создание баз данных протеомных характеристик представителей V. cholerae позволит получить новую информацию о спектре белков и пептидов разных представителей и выявить протеомный маркер холерного токсина в формате идентификации MALDI-TOF.

E.coli является тем микроорганизмом, изучение которого лежало в основе масс-спектрометрической идентификации (Arnold et al., 1998; Jones et. al., 2003; Pribil et al., 2005 ). Модифицированный коммерческий препарат белкового лизата DH-5-alpha E.coli (Bruker bacteria test standart) используется в качестве бактериального стандарта калибровки для метода MALDI. В коммерческой базе данных Bruker находятся несколько протеомных профилей референтных штаммов эшерихий. Однако в настоящее время в мире встречаются штаммы с измененными свойствами (Кафтырева и др., 2011). Так бесконтрольное применение антибиотиков привело к появлению в Германии полиантибиотикорезистентного штамма E. coli 0104: H4, вызвавшего вспышку инфекции с гемолитико-уремическим синдромом. В качестве средств элиминирующих гемолитические эшерихии обычно применяют антибактериальные препараты, что ведет к хронизации дисбиотических состояний (Березов, 2008; Телесманич, 2013, 2016, 2017). Очевидно, что в биологическом плане E.coli являются микроорганизмами, способными к обмену генетической информацией с другими энтеробактериями (Терновская и др., 2009) и способны повышать свою вирулентность в результате активации индуцибельных протеомных признаков. Создание MALDI-ToF коллекций протеомов штаммов эшерихий, выделенных от человека и поиск маркеров протеома между различными биохимическими кластерами, в частности, между гемолитическими и негемолитическими вариантами, позволит идентифицировать таксон-специфические белки инфекционного процесса, вызванного E. coli, что может расширить перспективы анализа происхождения факторов их патогенности, совершенствовать подходы к коррекции дисбиотических состояний (Гапон, 2015, 2016;). До настоящего времени не существовало

данных о создании подобных масс-спектрометрических коллекций протеомов представителей E.coli. Изучение межпопуляционных отличий с помощью анализа спектров молекулярных масс коллекций также в литературе не описаны. Все вышеизложенное обосновывает актуальность создания баз данных протеомов клеток штаммов V. cholerae и E.coli.

Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных бактерий в природе (Hendrix, 2002), а их внедрение в микробные клетки, не приводящие к лизису, обеспечивают появление новых свойств и эволюционную приспосабливаемость бактерий (.М. Ломов и др., 2007). Было показано (Faruque et al., 2005), что филаментозный фаг KSF-1phi Vibrio cholerae способствует морфогенезу саттелитного фага RS1 и облегчает горизонтальный перенос генов. Штаммы, несущие ген mshA, кодирующий пили IV типа - маннозочувствительный гемагглютинин (MSHA) -восприимчивы к инфицированию бактериофагом KSF-1phi, а природные MSHА - негативные штаммы и мутанты с делецией гена mshA были резистентны к этому фагу. Обнаружена способность углевода D- маннозы ингибировать MSHA позитивные штаммы, указывая на то, что MSHA пили являются лектиновыми (углевод-связывающими) рецепторами бактериофага KSF-1phi. Таким образом, формируется фагорезистентность клеток Vibrio cholerae. Возможным подходом к изучению формирования фагорезистентности является изучение биохимических рецепторных комплексов, таких как углевод - специфические рецепторы фагов, участвующих во взаимодействии с углеводными лигандами клеток-мишеней, используя современные подходы, в частности масс-спектрометрический метод, что возможно, будет способствовать преодолению трудностей связанных с применением бактериофагов для диагностики и лечения (Гончаренко, 2013; Телесманич, 2013, 2016; Чайка 2016). Важным аспектом является знание биохимических структур изучаемых объектов, ответственных за этот процесс. Измерение стабильного спектра белков бактериофагов и его изменение под влиянием различных факторов может

способствовать развитию наших знаней о бактериофагах и их взаимоотношений с бактериальной клеткой.

Рецепторы фагов, иной чем маннозочувствительной (MSHA) углеводной специфичности не описаны, учитывая тот факт, что бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями (Koonin, 2006). В литературе не найдено ни одной работы, посвященной масс-спектрометрическому исследованию бактериофагов.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности создания расширенных протеомных коллекций микроорганизмов на основе MALDI-TOF масс-спектрометрии в виртуальном формате их белкового спектра. Это позволит получить новую информацию об изменчивости протеома микроорганизмов, идентифицировать вариабельные и константные белки -маркеры инфекционного и эпидемического процессов в формате компьютерного анализа, а также изучить белковые рецепторные комплексы бактериофага и углеводные лиганды клетки мишени путем протеомного анализа с помощью матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации с времяпролетным разделением ионов (MALDI-ToF-MS) (Телесманич, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018; Чайка 2016, 2017, 2018).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования:

Создание протеомных коллекций масс-спектров и компьютерный анализ константных и вариабельных белков различных представителей энтеробактерий и бактериофага El Tor для идентификации масс-зарядов, отражающих таксон-специфическую, биохимическую принадлежность.

Задачи исследования:

1. Провести MALDI-ToF-MS прямое белковое профилирование биохимически охарактеризованных штаммов коллекций клеток Escherichia coli и Vibrio cholerae, создать базы данных масс-спектрометрических протеомных профилей.

2. Провести дифференциальный анализ протеома коллекции представителей Escherichia coli внутри вида на основе таксон-специфических маркерных белков характерных для гемолитических и негемолитических вариантов.

3. Идентифицировать таксон-специфические белки, характерные для биоваров и серогрупп Vibrio cholerae, и протеомные маркеры ассоциированные с токсигенностью в формате MALDI-TOF.

4. Подобрать и адаптировать методику масс-спектрометрического профилирования для снятия белкового спектра бактериофага и чувствительной к нему культуры. Изучить роль углеводсвязывающих рецепторных комплексов бактериофага.

5. Оценить изменения протеомного профиля диагностического бактериофага El Tor, чувствительных к нему клеток Vibrio cholerae и масс-спектрометрического протеомного профиля, полученного после их совместной инкубации.

Научная новизна работы.

Впервые разработаны масс-спектрометрические методические подходы протеомного анализа рецепторных белков бактериофага и углеводных лигандов их на поверхности чувствительной клетки на модели изучения протеомов холерных вибрионов El Tor и стандартизированного препарата холерного диагностического бактериофага El Tor.

Впервые получен стабильный белковый профиль холерного бактериофага, профиль фага провзаимодействовавшего с культурой. Описаны изменения, происходящие с протеомом бактериофага El Tor и

чувствительного к нему штамма V. cholerae El Tor 18507 при инкубации с углеводами. Впервые разработан способ изучения лектиновых (углеводных) рецепторов бактериофага El Tor методом конкурентного ингибирования углеводами, при использовании протеомной линейной масс-спектрометрии.

Впервые выявлены константные и вариабельные белки клеток вибрионов на примере штамма V. cholerae El Tor 18507, участвующие в каскаде реакций при взаимодействии фага и клетки. Такой протеомный анализ позволил впервые выявить комплекс белков - рецепторов стандартизированного препарата холерного диагностического бактериофага El Tor, имеющих молекулярную массу (m/z) 4373Да. Это комплекс доминантных белков, который поддается гликозилированию сахарозой и ингибируется этим углеводом, что выражается в уменьшении его количства (показателе интенсивности (%)). Впервые масс-спектрометрическим методом установлено, что при взаимодействии с углеводными лигандами, изменение происходит с бактериофагом, а не с клеткой микроорганизма. При этом бактериофаг изменяет свой протеомный масс-спектрометрический профиль, с невозможностью идентификации по отношению к масс-спектру из базы данных, показатель идентичности профилей Score бактериофага El Tor падает с 2.845 до значения 0.973. При взаимодействии бактериофага El Tor и клетки V. cholerae изменение происходит со стороны бактериофага, а не чувствительной к нему клетки микроорганизма, о чем свидетельствует показатель эффективности идентификации Score - для бактериофага El Tor 0.324, для V. cholerae El Tor 2.440 определенные после их взаимодействия. Из чего следует, что при формировании фагоустойчивости большую роль играет изменение самого вириона. Впервые установлено, что углеводы, введенные в систему фаг-клетка, в частности сахароза, отрицательно влияют на фаговую активность, по всей видимости путем гликозилирования рецепторных белков фаговой частицы путем конкурентного ингибирования.

Впервые получена коллекция протеомных масс-спектров представителей Vibrio cholerae разных биоваров, выделенных от человека и

из объектов окружающей среды в разные годы и охарактеризованных по биохимическим признакам и генам токсигенности (ctx-/+, tcp -/+).

Создана и зарегистрирована MALDI-ToF-MS база данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae для программы MALDI Biotyper» Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2013620585, бюллетень №2 от 29.04.2013 года.

Впервые выявлено, что комплекс белков, имеющих молекулярную массу 3202 Да, ассоциирован с токсигенностью холерных вибрионов, этот масс-заряд может быть использован в масс-спектрометрическом анализе для дифференциации токсигенных и атоксигенных протеомов.

Впервые показаны протеомные различия, основанные на кластерном протеомном анализе между близкородственными видами рода Vibrio, которые труднодифференцируемы с помощью биохимических признаков, в том числе V. parahaemolyticus и V. alginolyticus.

Впервые проведен анализ масс-спектра референтного протеома штамма Vibrio albensis 4MG 4406 THAM, как микроорганизма наиболее близкородственного к Vibrio cholerae, показаны их протеомные различия.

Впервые создана и зарегистрирована масс-спектрометрическая база данных «Коллекция белковых профилей масс-спектров представителей вида Escherichia coli гемолитических и негемолитических штаммов выделенных от человека для программы Biotyper». Свидетельство о государственной регистрации базы данных№2016620877, бюллетень №7 от

Установлено, что значение масс-заряда комплекса белков с самой высокой интенсивностью - 100% (максимальное количество белков) может служить дифференциальным протеомным таксономическим признаком Escherichia coli, по которому без постановки биохимического теста можно определить наличие гемолитических / негемолитических свойств. Так, популяция гемолитических эшерихий, имеет доминантный (100%) комплекс белков с молекулярной массой (m/z) 9064 Да, который является диагностическим маркером вирулентности, чего не наблюдалось у

негемолической популяции, у которой максимальный комплекс белков сосредоточился в диапазоне 5350-5400 Да.

Теоретическая значимость

Прямое протеомное профилирование рибосомальных белков коллекций штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae , охарактеризованных по биохимическим признакам, позволило идентифицировать молекулярные массы белков клеток, характеризующих их таксон - специфическую принадлежность в формате MALDI-ToF-MS для совершенствования диагностики.

С помощью масс-спектрометрического анализа получена новая информация о молекулярных массах белков, составляющих структуру вириона бактериофага El Tor, об изменчивости его протеома при взаимодействии с штаммом Vibrio cholerae El Tor 18507, что в формате компьютерного масс-спектрометрического анализа, расширяет возможности изучения молекулярных аспектов инфекционного процесса микробной клетки.

Возможности снятия белкового масс-спектра с диагностического бактериофага El Tor позволил охарактеризовать рецепторы, вступающие во взаимодействие с клеткой Vibrio cholerae El Tor 18507; установить, что при взаимодействии вириона и клетки, изменения происходят со стороны бактериофага, а не чувствительной клетки, что объясняет феномен «фагоустойчивости». Таким образом, разработана масс-спектрометрическая модель проведения протеомного анализа бактериофагов, с помощью которой, при использовании биохимических принципов можно изучать специфичность лектиновых рецепторов фагов, углеводных лигандов клетки и их изменчивость. Разработанные масс-спектрометрические подходы могут быть полезны для изучения фаговой активности при диагностики и лечении фаговым методом других видов микроорганизмов

Практическая значимость

Создана и зарегистрирована база данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae для программы MALDI Biotyper» Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2013620585, бюллетень №2 от 29.04.2013 года / Чайка И.А., Телесманич Н.Р., Сеина С.О.

Выявленный масс-спектрометрический комплекс белков, ассоциированный с токсигенностью Vibrio cholerae, имеющий молекулярную массу 3202 Да может служить методом экспресс диагностики возбудителя в формате MALDI-ToF.

Издана и зарегистрирована база данных «Коллекция белковых профилей масс-спектров представителей вида Escherichia coli гемолитических и негемолитических штаммов выделенных от человека для программы Biotyper» Свидетельство о государственной регистрации базы данных№2016620877, бюллетень №7 от 28.06.2016 /Телесманич Н.Р., Чайка С.О., Чайка И.А.

Определены маркерные масс-спектрометрические пики Escherichia coli имеющие максимальный уровень белков (100% интенсивности): 9064 Да, характерный для гемолитических штаммов, 5382Да - для негемолитических штаммов; что позволит совершенствовать дифференциальную диагностику, гемолитических вариантов эшерихий масс-спектрометрическим методом с помощью выявленных протеомных маркеров. Что будет полезным для экспресс-диагностики заболеваний, вызванных гемолитическими штаммами Escherichia coli.

Анализ взаимодействия бактериофага El Tor с клеткой Vibrio cholerae El Tor 18507 масс-спектрометрическим методом способствовало созданию модели изучения их биохимических структур, ответственных за формирование фагоустойчивости - чувствительности, что развивает наши представления о структуре вириона и может быть полезным для контроля

эффективности лечения бактериофагами, а также диагностики инфекционных болезней фаговым методом.

Полученные нами результаты по методике проведения протеомного анализа микроорганизмов и способу выявления их маркерных белков с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии вошли в раздел рецензируемого учебного пособия для вузов «Строение и функции белков, аминокислот. Азотистый обмен.» утвержденное экспертной комиссией по работе с учебными изданиями ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздрава России от 19 апреля 2018г. по области образования здравоохранение медицинские науки. Пособие используется на кафедре общей и клинической биохимии РостГМУ Минздрава РФ для проведения семинарских занятий и чтения лекций.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наличие в масс-спектрометрическом профиле V.cholerae белкового комплекса, с молекулярной массой 3202 Да, характеризует вибрион как токсигенный (ctx+), отсутствие его свидетельствует об атоксигенности (ctx) штамма.

2. Гемолитические штаммы Escherichia coli синтезируют белки, имеющие молекулярную массу (m/z) 9064 Да, характеризующуюся масс-спектрометрическим пиком с максимальным уровнем белков (100% интенсивность), который является диагностическим маркером гемолитической популяции.

3. Масс-спектрометрия бактериофага El Tor выявила доминантный для бактериофага комплекс белков, имеющий m/z 4373Да, который участвует во взаимодействии с углеводными лигандами чувствительной клетки. Углеводы, в частности сахароза, введенные в систему фаг-клетка отрицательно влияют на фаговую активность, что отражается в изменении масс-спектрометрического профиля белков бактериофага.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «MALDI-TOF масс-спектрометрический дифференциальный анализ протеома штаммов Escherichia coli, Vibrio cholerae и диагностического бактериофага El Tor»

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на:

Доклады по материалам диссертационной работы были представлены на университетских, региональных, всероссийских и международных конференциях. Их обсуждение проводилось на: Всероссийской конференции «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов 2013, 2014); конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора (Уфа, 2013); II международной научно - практической конференции "Актуальные вопросы современной медицины" (Екатеринбург, 2015); Международной конференции Advanced science "XI international research and practice conference" (Шеффилд 2015, 2017); Межрегиональной научно - практической конференции "Актуальные проблемы диагностики инфекционных заболеваний (Ростов-на-Дону, 2015); XIV Российской научно - практической конференции с международным участием "Обмен веществ при адаптации и повреждении. Дни молекулярной медицины на Дону" (Ростов-на-Дону, 2015-2019); 2-5 итоговой научной сессии РОСТ ГМУ " (Ростов-на-Дону, 2015-2019); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Система медицинского обеспечения в локальных войнах " (Ростов-на-Дону, 2016); Международной конференции Naukowa Prezestrzen Europy. (Przemysl, Poland 2017).

Публикации результатов исследования

По теме диссертационного исследования опубликовано 16 научных работ, из них 5 - в журналах, индексируемых в международных базах цитирования Web of Science, Scopus и рекомендованные ВАК, а также получено 2 свидетельства о регистрации базы данных. Издано учебное пособие Федерального уровня внедрения

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 187 страницах, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, заключение и выводы, иллюстрирована 17 таблицами и 38 рисунками. Библиография представлена 166 источниками, из них 70 зарубежных.

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Основные принципы MALDI масс-спектрометрии

Масс-спектрометрический метод исследования позволяет с высокой точностью определять молекулярную массу вещества как неорганической, так и органической природы в различных агрегатных состояниях -газообразном, жидком, твердом. Для этого нейтральные молекулы и атомы должны быть ионизированы и переведены в газовую фазу. Неорганические вещества подвергаются жестким методам ионизации, которые неприемлемы для органических веществ. В настоящее время для изучения последних используются, в основном, два метода - ионизация при атмосферном давлении, в частности электроспрей (ESI, electrospray ionization) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI). Ионизированные вещества, переведенные в газовую фазу, переносятся в масс - анализатор под действием электрического поля. Находясь в условиях глубокого вакуума, ионы стремятся к детектору, группируясь соответственно значению массы к заряду (m/z). В зависимости от задачи исследования используют различные масс-анализаторы. Времяпролетный масс-анализатор, ионная ловушка и квадрупольный анализатор чаще всего применяют при изучении органических веществ. Тандемная масс-спектрометрия - это одновременное сочетание двух и более анализаторов масс в приборе, что повышает его разрешающую способность (способность разделять ионы с различными значениями m/z, чем выше разрешение прибора, тем больше его способность различить два пика с близкими массами). Необходимость нескольких анализаторов заключается в последовательном снятии спектра с молекулярного иона в одном, и фрагментов данного иона в последующем анализаторе, что позволяет произвести протеомное секвинирование и идентификацию молекулы. Для изучения сложных смесей веществ,

применяются сочетания масс-спектрометрии и хроматогравии, как газовой (хромато-масс-спектрометрия), так и жидкостной (ЖХ/МС, англ. LS/MS). Предварительное использование двумерного электрофореза дает возможность выделить компонент из смеси белков или из клетки, для дальнейшей масс-спектрометрии (Сорокин, Озерянский, 2007; Бочарова и

др., 2016).

Посредствам стандартной MALDI-ToF масс-спектрометрии (линейной) возможно снятие спектра с цельной клетки. На основе данного метода производится идентификация микроорганизмов до вида, заключающаяся в получении белкового профиля клетки и сопоставлении его с электронными протеомоными профилями, заложенными в коммерческую базу данных прибора.

1. Первое предположение, о возможном проведении идентификации микроорганизмов с использованием масс-спектрометрии, было высказано учеными из Университета Джонса Хопкинса (англ. Johns Hopkins University, США) в статье 1975г. (John, 1975). Однако реализовать данную идею не было возможности, так как известные на то время методики не позволяли ионизировать органические вещества, вплоть до 1985 года, когда Японский ученый Коити Танаке (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) изобрел метод мягкой ионизации. Танака обнаружил, что при использовании тонкого металлического порошка в глицерине, в качестве матрикса, макромолекулярный аналит может быть ионизирован без разрушения его структуры. Танака использовал своё открытие для масс-спектрометрии белков. В том же году методика была запатентована и доложена в 1987 году на ежегодной конференции Японского масс-спектрометрического общества в Киото. Методика стала известна как мягкая лазерная десорбция (soft laser desorption, SLD), за что в 2002 году Танака получил Нобелевскую премию по химии. Совместно с ним в 2002г. Нобелевскую премию по химии получил Джон Фенн (Virginia Commonwealth University, Richmond, USA) (URL:https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/) за

разработку методов электроспрея (ESI, electrospray ionization). «Ионные крылья для молекулярных слонов» - так образно назвал предложенные принципы ионизации макромолекул.

В те же годы (1985) немецкие учёные Франц Хилленкамп и Михаель Карас разработали метод с использованием низкомолекулярного органического соединения в качестве матрикса, позволяющего исследовать не только белки, но и нуклеиновые кислоты, названный ими матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) (Karas et. al., 1985), который они, однако, не применяли для ионизации белков до доклада Танаки (Karas et. al., 1988). Метод MALDI оказался более чувствительным, чем SLD, поэтому в настоящее время, для исследования белков, используется именно он, а не методика, разработанная Танакой.

Широкое применение также получила разработка Джона Фенна -электроспрей (ESI) для исследовании биологических молекул, где аналит поддается в жидком виде, например, для испытаний сложных фармакологических соединений.

Тандемная масс-спектрометрия - уникальный метод имеет высокую разрешающую способность, что позволяет исследовать отдельные белки, изучать их конмформации, активные центры, производить сиквенс аминокислотной последовательности, изучать пептиды, нуклеиновые кислоты и многое другое. Основным отличием метода является сложная пробоподготовка материала, требующая наличие большой биохимической лаборатории с штатом высококвалифицированных сотрудников и дорогостоящим оборудованием. Чаще всего используется в сочетании с хроматографией или предварительным двумерным электрофорезом. Очищенный образец подвергается масс-спектрометрическому анализу, полученный спектр отправляется в базу данных Mascot, для сравнения спектров. По окончанию исследования, выдается результат с перечнем

белков наиболее схожих по масс-спектрометрическому профилю с анализируемым.

Метод линейной MALDI-ToF масс-спектрометрии оптимизирован для идентификации микроорганизмов, которая происходит следующим образом.

Исследуемый образец (подозрительная колония суточной культуры микроорганизма) наносится на ячейку металлической подложки (мишень/MSP-чип), поверх чего наслаивается матрица. Матрица позволяет ионизировать органические молекулы без разрушения их структуры, а также обладает оптической абсорбцией в диапазоне используемых длин волн. Различные ее виды используются для разных задач (табл. 1)

Таблица 1 Виды и назначения матрицы, используемые для масс-спектрометрического исследования

Название Английское название (аббревиатура) Растворители для матрицы Типы исследуемых веществ

2,5- Дигидроксибензойная кислота 2,5-Dihydroxybenzoic Acid(DHB) Вода, этанол, метанол, ацетон, ацетонитрил, хлороформ, тетрагидрофуран Пептиды, олигонулеотиды, полисахариды, синтетические полимеры

2-(4- Гидроксифенилазо)-бензойная кислота 2-(4-Hydroxyphenyazo)-benzoic acid (HABA) Диоксан, ацетон, тетрагидрофуран, диметилформамид Пептиды, белки, синтетические полимеры

а-циано-4-гидроксикоричная кислота a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Ацетон, водн. ацетонитрил, ТГФ, ДМФА, этанол Пептиды, синтетические полимеры

Синапиновая кислота Sinapic Acid ТГФ, ДМФА Пептиды, белки, липиды

Феруловая кислота Ferulic Acid ТГФ, ДМФА Пептиды, белки

1,8,9-Антрацентриол 1,8,9- anthracentriol(Dithranol) ТГФ, ДМФА, толуол, хлороформ, хлорбензол Синтетические полимеры, липиды

В качестве матрицы для идентификации микроорганизмов используется а-циано-4-гидроксикоричная кислота. При этом известные коммерческие базы данных микроорганизмов разработаны с применением именно этой матрицы. Она позволяет получить спектр в диапазоне

молекулярных масс 2000-18000 Да, лежащих в основе MALDI биотипирования, так как наилучшим образом подходит для снятия спектра с белка. Далее MSP чип помещается в прибор MALDI-ToF, где в условиях глубокого вакуума производится обстрел по ячейкам мишени, аналит с матрицей вскипают, образуя облако из ионов, каждый из которого имеет заряд -1. Ионы стремятся к детектору под воздействием электрических и магнитных полей, проходя одинаковое расстояние с разной скоростью, прямопропорциональной их массе. Следовательно, ионы с меньшей массой летят быстрее, тяжелые достигают детектора позже. Ударяясь о детектор электрический импульс оцифровывается, выдавая показатель m/z (масса/заряд), что фактически равняется массе белка, т.к. заряд у все одинаков и составляет -1. Второй показатель - интенсивность, он отражает количество ионизированных молекул (в частности белков, в зависимости от используемой матрицы), прилетевших на детектор одновременно (с одинаковой массой), выражается в процентах (%), относительно самого значимого (Баранцевич, 2014).

После каждого удара лазера появляется картинка на экране монитора в виде графика - единичный спектр, где по оси абсцисс масса иона, а по оси ординат интенсивность пиков. Накопление единичных спектров происходит после многократного обстрела ячейки мишени, по итогу чего все они суммируются. При идентификации суммарный спектр преобразуется в генеральный (основной), в нем отражены основные пики характерные для данного представителя, на графике представлены в виде столбцов. Такие же графики заложены в базе данных, по ним и производится сопоставление протеома неизвестного микроорганизма с профилями из базы данных по массе и высоте пиков. Идентификация основывается на количестве совпадений показателей данных столбцов, метод сравним с дактилоскопическим исследованием. Степень совпадения пиков для прибора Vitek Ms (BioMerieux) выражается в %, а Biotyper (Bruker) отражается показателем степени достоверности Score. Показатель Score отражает

степень схожести профиля изучаемого объекта с белковым профилем объекта, внесенного в базу данных. Измеряется в диапазоне от 0 до 3: значения - 2.00-3.00 - указывает на высокое совпадение изучаемого объекта с объектом базы данных; значения - 1.700 - 1.999 - низкая схожесть с объектом из базы данных, менее - 1.700 - отсутствие совпадений. Программа Biotuper 3.0 (Bruker) выдает 10 возможных ближайших к аналиту вариантов, ранжируя их по показателю Score .

Данный метод представляет собой вид масс-спектрометрии в линейном режиме с подачей образца в твердой фазе. Он является наиболее простым, не требует колоссальных затрат, содержания большой лаборатории, чего нельзя сказать о другом методе - тандемной масс-спектрометрии.

Биотипирование микроорганизмов с использованием масс-спектрометрического анализа.

Первая работа по успешной бактериальной идентификации целых клеток, на основе соответствия биохимических MALDI-ToF MS признаков, была проведена американскими учеными из Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (англ. Food and Drug Administration, FDA, USFDA). Ими получены профили микроорганизмов, которые впервые были внесены и сохранены в виде базы данных. Для чистоты эксперимента бактериальным клеткам присваивали номера без указания вида. Дальнейшее снятие спектров, с тех же микроорганизмов, приводило к их распознаванию (Holland et. al., 1996). Данная работа положила начало направлению в масс-спектрометрии -методу идентификации микроорганизмов, при этом требовалось накопить достаточное количество их профилей, для создания баз данных, с которыми проводятся сравнения неизвестных культур. С тех пор метод успел показать себя как точный и надежный. Среди отечественных ученых, одними из первых применили и описали данный метод, группа Московских ученых, в работе по идентификации N. gonorrhoeae. Также ими была

продемонстрирована гетерогенность регистрируемых для гонококка белковых масс-спектров, что позволило выделить в исследованной группе штаммов три протеомных типа. Тем самым свидетельствуя о потенциальной возможности использования прямого белкового профилирования с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF не только для идентификации, но внутривидовой классификации (Кубанова и др., 2006). Базы данных микроорганизмов для приборов различных производителей пополняется с каждым годом, в данный момент база данных Vitek Ms (BioMerieux) насчитывает 750 клинически значимых видов, а Biotyper (Bruker) включает в себя более 7300 штаммов и 2500 видов. Отсутствие микроорганизмов I-II группы патогенности, т.е. особо опасные инфекции (ООИ), является препятствием для обнаружения данных агентов. Также отсутствуют и другие микроорганизмы, представляющие высокую опасность, например патогенная гемолитическая Escherichia coli, которая привела к катастрофическим последствиям в мае 2011 году в Германии (Кафтырева и др., 2011). Пополнение баз данных такими представителями высоко актуально, так как это способствует более точной идентификации до вида и расширяет область изучаемых объектов, также способствует изучению микроорганизмов внутри вида и все это за крайне короткие сроки, что является немаловажным для принятия своевременных мер.

Стандартный набор программ для идентификации позволяет проводить кластерный анализ в виде дендрограмм, который применяется для выделения пространственно однородных по белковому спектру групп организмов, сообществ. При помощи него можно обнаружить близкородственные по белковому составу микроорганизмы, так и отдельные объекты, не вписывающиеся ни в один из кластеров, ориентируя на более детальное изучение объекта. Крупные кластеры дробятся на более мелкие, те в свою очередь дробятся ещё мельче, и т.д. Построение дендрограммы происходит при заданных штаммах из коммерческой базы данных в программе Biotuper 3.0, а также при внесении спектра микроорганизма в персонафицированную

базу данных, что также возможно сделать в рамках предустановленных программ. Внесение спектров штаммов микроорганизмов сопровождается детальным описанием их таксономических и фенотипических характеристик, что позволяет оценивать родство тех или иных представителей (штаммов) из коммерческой базы данных, или аналитов, или и тех и других вместе взятых. Ученые из Германии одними из первых заинтересовались возможностью кластерного анализа, масс-спектрометрических дендрограмм, которые сравнили с деревьями построенных на основе 16S rRNA. Компьютерному анализу подвергались микроорганизмы рода Erwinia. Оба метода, как на основе протеома, так и генома, зеркально отражали основные тенденции идентичности и различий внутри рода, что показало идентичность двух вариантов кластерного анализа (Sauer et al., 2008).

В рамках предустановленной программы можно посмотреть молекулярную массу белка, оценить его интенсивность (количество белка), но определить различия между штаммами или их охарактеризовать по наличию пиков невозможно.

В последнее время в литературе стали появляться статьи посвященные изучению отдельных белковых спектров молекулярных масс микроорганизмов, с описанием биохимических характеристик штаммов. Так недавно опубликован материал анализа различий между белковыми масс-спектрами различных штаммов бифидобактерий. С 57 клинических изолятов были сняты спектры в линейном режиме прибора со стандартным протоколом пробоподготовки. Выявлена группа маркерных белков 9282-9901 m/z, характерная для всех штаммов вида Bifidum bifidum (Бухарин и др., 2015).

Протеомный и метаболомный анализ свойств холерных

вибрионов

Возбудители холеры, а их на сегодня известно три (Vibrio cholerae O1 biotype cholerae. V. cholerae O1 biotype El Tor, V. cholerae O139 «Бенгал»),

обладают большим набором ферментов. Они образуют индофенолоксидазу, декарбоксилируют лизин и орнитин, расщепляют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты без газа, ферментируют маннит, сахарозу, мальтозу, левулезу, галактозу, разлагают крахмал и декстрин. В отдельных случаях холерные вибрионы расщепляют маннозу только в анаэробных условиях ( под ред. Онищенко, 2013).

Лактозу холерные вибрионы не разлагают. Арабинозу, дульцит, раффинозу, рамнозу, инозит, салицин - не расщепляют. По данным классической литературы, холерные вибрионы также не расщепляют сорбит (под ред. Лабинской и др., 2010), однако применение современных технологий, при использовании масс-спектрометрического метода с использованием 2-D электрофореза показано, что Vibrio cholerae способны расщеплять сорбит с помощью индукции новых белков. Токсигенные штаммы продуцируют 15 белков, участвующих в ферментации сорбита и атоксигенные - 11 белков. Среди них 4 белка были общими для токсигенных и атоксигенных штаммов. Потенциальные функции этих белков ассоциировались с поглощением сахара, поглощением аминокислот, переносом электронов, переносом сульфата и тиосульфата (Zou et al., 2006).

Предложенное в 1934 г. Хейбергом, а в 1965 — Смитом и Гуднером разделение вибрионов на восемь биохимических групп позволяет определить принадлежность V. cholerae к I - способность к ферментации (манноза +, сахароза +, арабиноза - ) и II (манноза- , сахароза +, арабиноза -) группам. Остальные биохимические группы представлены другими видами вибрионов (V mimicus, V. metschnikovii, V. fluvialis и др.) При росте в глюкозофосфатном бульоне Кларка при 20-37оС вибрионы биовара El Tor и V. cholerae О139, как правило, образуют ацетилметилкарбинол, а классические холерные вибрионы такой способностью не обладают (под ред. Лабинской и др., 2010).

Благодаря наличию протеолитических ферментов разжижают желатину, фибрин, свернутый куриный белок, казеин и другие белки ( под ред. Онищенко, 2013). Кроме протеаз вибрионы вырабатывают и другие

экзоферменты: лецитиназу (фосфолипазу С) (Fiore et al., 1997), липазу, РНКазу, муциназу, нейраминидазу, аденнлатциклазу (Осипов и др., 2013). Описано, что представители рода Vibrio продуцируют липазу, которая по многим свойствам близка к лицетин-холистерол-ацилтрансферазе млекопитающих. В полипептиде HlyC холерных вибрионов, состоящем из 312 аминокислотных остатков, выявлен основной мотив липазы (Ogierman et. al., 1997), которая имеет высокую степень гомологии с панкреатической триацилглицероллипазой, липопротеинлипазой, лингвальной липазой млекопитающих, а также имеет высокую степень гомологии 93% с липазой Pseudomonas spp. (Casanova et. al., 1995). Основной функцией полипептида липазы является катализ синтеза лактонов в безводных органических растворах, с помощью компьютерного анализа были обнаружены 4 основных домена а^-гидролазный домен; активный сайт эстеразы / липазы / тиоэстеразы; домен гемпероксидазы. Предполагается, что множество обнаруженных коротких мотивов гена hlyC свидетельствуют, что он способен проявлять себя по фенотипу в зависимости от природы и структуры липидов, находящихся в окружающей среде Описано, что атоксигенные холерные вибрионы продуцируют триацилглицероллипазу, что выражается в способности к ферментации подсолнечного и оливкового масел, а также глицерина - (а, ß гидролазная активность) (Телесманич и др., 2004).

Холерные вибрионы имеют О соматический (термостабильный) и H-жгутиковый (термолабильный) антигены. О-антиген расположен в клеточной стенке вибриона. Основой его является а-липополисахаридный комплекс клеточной стенки, H-антиген является неспецифическим, общим для всего рода Vibrio. A.D. Gardner. K.V. Venkatraman (1935), (цитирование по Лабинской, 2010) обнаружили в вибрионах видовые термостабильные О-антигены: I, II, III, IV, V и VI. Из них OI-антиген является видовым для холерных вибрионов. Все серовары (Огава, Инаба, Гикошима) относятся к одной О1 серогруппе. Модификации в структуре О-антигена, прежде всего липополисахарида (ЛПС) с редукцией полисахаридных цепей,

обусловливают переход холерных вибрионов в R-вариант (Karaolis et. al., 2001). В настоящее время известно более 200 серологических О-групп холерных вибрионов.

С помощью MALDI-ToF-ToF были изучены особенности метаболизма дыхательной цепи и переноса электронов у представителей Ogava и Inaba. Олигосахариды (три - гексамеры), представляющие собой концевые эпитопы о-антигенов Vibrio cholerae О1, серотипов Ogawa и Inaba, были изучены методом тандемной матрично-активированной лазерной

десорбцией/ионизацией время пролетной масс-спектрометрией (MALDI ToF/ToF MS). Выявлено образование ионов и солей [M - H(+)](-) . Несколько солей аммония (хлорид, нитрат, гидрокарбонат и гидрогенсульфат) были использованы в качестве добавок для увеличения образования отрицательных ионов из сахаридов. Наиболее эффективным было добавление гидрокарбоната аммония, который увеличил количество ионов [M - H(+)](-) более чем в шесть раз. Между тремя путями фрагментации был обнаружен новый сопряженный перенос электронов во второй нисходящей единице олигосахаридов, что характеризовало отличия олигосахаридов серотипов Огава от Инаба (Chmelík et al., 2007).

С помощью наножидкостной хроматографии и электроспрейной квадрупольной и тандемной масс - спектроскопии выявлены рецепторные углеводсвязывающие пептиды - мест гликозилирования моносахарида V. cholerae O1, составляющего ЛПС. Описаны три участка гликозилирования лизина: Lys 235, Lys 437 и Lys 455. Все остатки гликозилированного лизина расположены в основном вблизи внешней поверхности белка (Jahouh et. al., 2012).

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: первую (большую 2960 т.п.н.) и вторую (или малую 1070т.п.н.) (Heidelberg et al., 2000).

Значительная часть генов вирулентности входит в состав мобильных генетических элементов (МГЭ): двух профагов СТХф и RS19; двух островов патогенности - VPI-1 и VPI - 2, а также острова О- антигена, локализованные

на большой хромосоме. Кроме области СТХф , помимо ctxAB, кодирующего биосинтез холерного токсина, содержит гены Zot, Ace. Zot и Ace являются дополнительными токсинами (Faruque et. al., 1998; Karaolis et. al., 2001; Смирнова и др., 2010).

К настоящему времени холерный токсин изучен довольно полно. Он представляет собой мультимерный термолабильный белок, состоящий из одной А-субъединицы (мол. массой 27 кД) и В-субъединиц (мол.массой 11.6 кД). Субъединица А содержит два пептида А1 и А2, а субъединица В состоит из пяти ковалентно связанных цепей и имеет высокую степень сродства к олигосахаридным остаткам ганглиозида GM 1 (Бароян и др., 1971.Faruque et. al., 1998).

Оперон ctxAB, кодирующий холерный токсин у V. cholerae, находится в геноме филаментозного фага СТХф, специфичного для каждого из биотипов V. cholerae О1, инфицирует классические и El Tor штаммы; соответственно они обозначаются как СТХс1а^ф и СТХЕ1ф (Waldor, Mekalanos, 1996). Однако описано, что холерную эпидемию в Мозамбике в 2004г. вызвал необычный гибрид СТХс1а^ф (Halder K et al., 2010).

В настоящее время известно 4 гибридных варианта ctxB гена Vibrio cholera El Tor.

1. Матлабский вариант, отличающийся тем, что не поддавался фенотипическому биотипированию, т.к. ctxB ген представлял собой смешанный вариант классического и El Tor биовара;

2. Другой вариант, имеющий профаг биовара El Tor СТХЕ1ф, но продуцирующий холерный токсин классического типа;

3. Мозамбикский вариант - обладатель типичного генома для вибрионов El Tor , но содержащий тандемный повтор классического профага CTxc1así^ на малой хромосоме.

4. Варианты возбудителя холеры, содержащие в геноме одновременно и классического, и El Tor биоваров (СТХЕ1ф и СТХс1а^ф) (Смирнова идр., 2010).

Однако измененные биохимические признаки таких штаммов продолжают оставаться малоизученными. Поэтому масс-спектрометрический анализ измененных штаммов может помочь сформировать новые подходы для экспресс-диагностики и анализа филогенетического родства.

Для детекции генетически измененных вариантов холерного вибриона Эль Тор, характеризующихся наличием однонуклеотидных полиморфизмов в гене ctxB, предложен метод минисеквенирования с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии. Получены белки гена ctx, соответствующие значениям молекулярных масс зондов (ctxB115, ctxB203) и достроившихся комплементарно к точкам соответствующих замен (T/C) дидезонуклеотидов (ddTTP, ddCTP). Для исследуемых штаммов V. cholerae El Tor, изолированных в 70-х годах XX столетия, установлена элонгация обоих зондов дидезокситимидином, что свидетельствует о присутствии в их геноме характерной для типичных представителей V. cholerae El Tor ctxB3 аллели с тимином в 115 и 203 позициях. Для V. cholerae El Tor, изолированных в 90-х годах, установлен отжиг к точкам замен дидезоксицитозина и наличие ctxB1 аллели с цитозином в анализируемых позициях, характерной для вибриона классического биовара, и обнаруживаемая в геноме одного из вариантов атипичных генетически измененных клонов V. cholerae El Tor. Что позволяет дать протеомную характеристику холерному токсину ctxB с помощью MALDI масс-спектрометрии (Хунхеева и др., 2017).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чайка Софья Олеговна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агафонов Д.А. Молекулярно-генетический анализ геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, полученных путем конъюгационных скрещиваний / Д.А. Агафонов, У.Ю. Щелканова, Л.Ф. Ливанова // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов -на-Дону: ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, 2013. -№26. - С. 115-118.

2. Баранцевич Е.П. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии в клинической микробиологии. / Е.П. Баранцевич, Н.Е. Баранцевич // Трансляционная медицина. - 2014. - № 3. - С. 23-28.

3. Бароян О. В. Холера Эль-Тор / О. В. Бароян, А. В. Павлов - М.: Медицина, 1971. -254c.

4. Березов Т.Т. Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - 3-е изд., стер. - М.: Медицина, 2008. - 704 с.

5. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации / В.М. Бондаренко. - Тверь: Триада, 2011. - 84с.

6. Бочарова Ю. А. Возможности, проблемы и перспективы масс-спектрометрических технологий в медицинской микробиологии:обзор литературы / Ю. А. Бочарова, И. В. Чеботарь, Н. А. Маянский // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - Т. 61, № 4. - С. 249-256.

7. Водяницкая С.Ю. MALDI-TOF протеомный анализ в исследовании судовых балластных вод в портах ростовской области / С.Ю. Водяницкая [и др.]. // Жизнь Без Опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. Москва. - 2014. - Т.4, № 9. - Стр.82 -89

8. Водяницкая С.Ю. MALDI-TOF протеомный анализ в исследовании судовых балластных вод в портах Ростовской Области / С.Ю. Водяницкая [и др.]. // Региональные проблемы окружающей среды,

здоровья населения и сан.-эпид. благополучия. Ростов-на-Дону. - 2013. -№3. - Стр. 129-131.

9. Времяпролетная масс-спектрометрическая внутривидовая диагностика штаммов эшерихий, выделенных от человека / М.Н. Гапон [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - Т.61, №6. - С. 371374.

10. Вспышки острой кишечной инфекции, вызванные Escherichia coli 0104:Н4, зарегистрированные в странах Европы, и биологические особенности возбудителя / Л.А. Кафтырева [и др.] // Вестник Санкт-Петербургского Университета. Медицина. - 2011. - №4. - С. 119-126.

11. Гапон М.Н. Времяпролетная масс-спектрометрическая внутривидовая диагностика штаммов эшерихий, выделенных от человека / М.Н. Гапон [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016- Т.61, №6. - С.371-374.

12. Гапон М.Н. Показатели местной неспецифической резистентности при дисбактериозе толстой кишки / М.Н. Гапон // Журнал микробиологии. - 2010. - № 5. - С.53-57.

13. Гапон М.Н. Протеомный масс-спектрометрический анализ свежевыделенных штаммов патогенных эшерихий / М.Н. Гапон [и др.] // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2015. - №3. -Стр. 83-88.

14. Гапон М.Н. Создание коллекций MALDI-TOF паспортов клинических штаммов эшерихий / М.Н. Гапон [и др.] // Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания: Материалы II всероссийской научно - практической конференции с международным участием. Сочи. - 2015. - Стр. 43 -44.

15. Гоглева А.А. CRISPR-системы: механизм действия и применения / А.А. Гоглева, И.И. Артамонова // Природа. - 2014. - №6. -С.3-9.

16. Головин С. Бактериофаги: убийцы в роли спасителей / С. Головин // Наука и жизнь. - 2017. - № 6. - С. 26-33.

17. Гончаренко Е.В. MALDI масс-спектрометрическое профилирование в изучении диагностического бактериофага эльтор / Е.В. Гончаренко, Н.Р. Телесманич, С.О. Сеина // Сборник научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора. - 2013. - Стр. 274-278.

18. Гончаренко Е.В. Изучение углеводной специфичности рецепторов диагностического бактериофага эльтор посредством MALDI масс-спектрометрии / Е.В. Гончаренко, С.О. Чайка, К.Г. Медведева // Холера и патогенные для человека вибрионы материалы совещания специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой. - 2014. - №27. - Стр. 139-141.

19. Гриценко В.А. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека / В.А. Гриценко, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии. - 2000. - №3. - С.93-99.

20. Дерябин Д.Г., Антилизоцимная активность бактерий, как фактор их фагорезистентности: автореф. дис. ...канд. мед.наук: 03.00.07 /Дерябин Дмитрий Геннадьевич; [Челябинский гос. мед. ин-т ] -Челябинск, 1989. - 20с.

21. Дифференциация представителей Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus / О.А. Рыковская [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - Т.12, № 59. - С. 50-55.

22. Завоз холеры в Краснодарский край: II сб. науч. тр. / Г.В. Гальцева [и др.] // Новороссийск. - 1994. - Вып. 1. - С. 106-110.

23. Заявка 2013620585 Российская Федерация. Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Белковые профили масс-спектров представителей вида Vibrio cholerae для программы MALDI Biotyper» от29.04.2013 года 2013620585 Рос. Федерация / Чайка И.А.,

Телесманич Н.Р., Сеина С.О.; заявитель и правообладатель Рост. гос. мед. ун-т. - заявл. 26.02.2013; регистр.: 29.04.2013; опубл. 20.06.2013, Бюллетень №2.

24. Заявка 2016620591 Российская Федерация. Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Коллекция белковых профилей масс-спектров представителей вида Escherichia coli гемолитических и негемолитических штаммов выделенных от человека для программы Biotyper: заявка 2016620591 Рос. Федерация / Телесманич Н.Р., Чайка С.О., Чайка И.А.; заявитель и правообладатель Рост. гос. мед. ун-т. - № 2016620877; заявл. 05.04.16; опубл. 07.20.16, Бюллетень №7.

25. Использование реакции минисеквенирования с MALDI-ToF масс-спектрометрической детекции для обнаружения генетически измененных вариантов возбудителя холеры / Ж.Ю. Хунхеева [и др.] // Клин. лаб. диагностика. - 2017. - Т. 62, № 2. - С.116-120.

26. Использование стандартных методических подходов для определения эпидемической значимости холерных вибрионов / B.B. Агафонова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №5. - С. 42-46.

27. Использование холерных бактериофагов для дифференциации эпидемически опасных и неопасных штаммов V.cholerae ElTor / Ю.М. Ломов [и др.] // Проблемная комиссия. Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону. - 2007. - вып. 20. - С.53-55.

28. Каттер Э. Бактериофаги: биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус.изд. А.В. Летаров. - М.: Научный мир, 2012.

29. Кокс М. Основы биохимии Ленинджера / М. Кокс, Д. Нельсон; под ред. акад. РАН А.А.Богданова, чл.-кор. РАН С.Н. Кочетова. М.: Лаборатория знаний, 2017. - С. 60-63.

30. Комплексный метод оценки вирулентности парагемолитических вибрионов / О.А. Рыковская [и др.] // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2013. - № 2. - С.38-41.

31. Кубанова А.А. Первый опыт применения метода прямого профилирования для идентификации и типирования N. gonorrhoeae. / А.А. Кубанова, В.М. Говорун, Е.Н. Ильина // Вестник дерматологии и венерологии. - 2006. - №5. - С. 25-29.

32. Кудрякова, Т.А. Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практическое значение: автореф. дис. ... д-ра мед. наук: 03.00.07 / Кудрякова Татьяна Александровна; [Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб" МЗ РФ]. - Ростов-на-Дону, 1996. - 42 с.

33. Лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней: практическое руководство / под ред. акад. Г.Г. Онищенко, акад. РАМН В.В. Кутерива. - изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Шико, - 2013.- 560с.

34. Лектины / М.Д. Луцик [и др.] - Львов: Вища школа. - 1981. -

155с.

35. Лысак В.В. Микробиология: учеб.пособие / В.В. Лысак -Минск: БГУ, 2007. — 430 с.

36. Масс-спектрометрический анализ межвидовой и внутривидовой дифференциации микроорганизмов Yersinia spp. и Vibrio spp. / М.В. Афанасьев [и др.] // Молекулярная диагностика. - 2014. - №1. -С. 477-478.

37. Методы поиска лектинов (фитогемагглютининов) и определение их иммунохимической специфичности: метод.рекомендации / М.Д. Луцик [и др. ]. - Львов. - 1980. - 20с.

38. Монахова Е. В. Факторы патогенности нехолерогенных штаммов Vibrio cholerae: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.02.03 / Монахова Елена Владимировна; [Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб" МЗ РФ]. - Ростов-на-Дону, 2012.-46с.

39. Онищенко Г.Г. Вибрионы не 01 серологической группы и их значение в патологии человека. / Г.Г. Онищенко, В.С. Ганин, Е.П. Голубинский // - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. - 2001. - 354 с.

40. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии роспотребнадзора, 2010. -51 с.

41. Осипов Г.А. Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике / Г.А. Осипов, Г.Г. Родионов // Лабораторная диагностика. - 2013. - №2. - С. 68-73.

42. Особенности микробиоценоза толстой кишки людей с дисфункциональными расстройствами билиарного тракта / Л.Н. Терновская [и др.] // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 2009. - №3 - С. 89-92.

43. Пептидогликан лизирующие ферменты бактериофагов как потенциальные противобактериальные препараты. / К.А. Мирошников [и др.] // Успехи биологической химии. - 2006. - Т.46. - С. 65-96.

44. Подойницына О. А. Генотипическая характеристика штаммов V. parahaemolyticus, циркулирующих на территориях России и сопредельных государств:автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.02.03; / Подойницына Оксана Андреевна; [Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб" МЗ РФ ]- Ростов-на-Дону, 2013. - 22с.

45. Поздеев О.К. Бактериофаги: учебное пособие / О.К. Поздеев, Е.Р. Федорова, Ю.В. Валеева. - Казань : КГМУ - 2012. - 50 с.

46. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации Brucella spp / Д.В. Ульшина [и др.] // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2014. - №25. - С.111-113.

47. Пустовалова Л.М. Количественный аминокислотный состав холерных и холероподобных вибрионов / Л.М. Пустовалова // Биохимия. -1961. - Т. 26, Вып. 6. - с. 970 - 974.

48. Пустовалова Л.М. Аминокислотный состав холерных и холероподобных вибрионов / Л.М. Пустовалова // Вопросы медицинской химии. - 1961. - Т. 7, Вып. 3. - с. 265 - 270.

49. Применение масс-спектрометрического метода MALDI-TOF для межвидовой дифференциации близкородственных видов / Н.Р. Телесманич [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - Т.8, №59. - С.27-28, 37-38.

50. ПЦР-генотипы штаммов Vibrio parahaemolyticus, выделенных от людей на территориях СНГ /О.А. Шалу [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы совещания специалистов Роспотребнадзора и проблемной комиссии. Ростов-на-Дону. - 2010. - С. 99-105.

51. Роль галактозоспецифического рецептора - лектина в бактерицидной активности гемолизина Vibrio cholerae не О1/О139 / Н.Р. Телесманич [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. ииммунол. - 2010. - № 1. - С.10-14.

52. Роль лектина (HLY А) в гемолитической и гемма-гютинирующей активности Vibrio cholerae / Н.Р. Телесманич [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. - № 5. - С. 12 - 16.

53. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II. / под ред.А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, С.М. Ивановой. -М.: БИНОМ, 2010. - 1152с.

54. Рыковская О. А. Дифференциация представителей Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus / О.А. Рыковская [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - Т.12, №59. - Стр. 50-55.

55. Рыковская О.А. Молекулярный анализ гетерогенных популяций клинических штаммов Vibrio parahaemolyticus/ О.А. Рыковская [и др.] // Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения: Материал Всерос. науч.-практич. конференции, посвященной 95 летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. - Н.Новгород. -2014. - Стр. 119-123.

56. Смирнова Н.И. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология / Н.И. Смирнова, А.А. Горяев, В.В. Кутерев. - 2010. - №4. - С.

II-19.

57. Сорокин В.И. Масс-спектрометрия. Методы ионизации и разделения ионов:метод.пособие к спецкурсу «Спектральная идентификация органических соединений» /В.И. Сорокин, В.А. Озерянский. - Ростов- на -Дону. / Д: ЮФУ. - 2007. - С.39

58. Спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии холерных вибрионов не О1/не О139 серологических групп / Н.Р. Телесманич [и др.] // Медицинский вестник Юга России. - 2013. - №2. - С.

III-115.

59. Страйер Л. Биохимия /Л. Страйер; под ред. акад. С.Е.Северина, М. : Мир 1984. - Т. 1-3.

60. Телесманич Н.Р. MALDI масс- спектрометрический анализ в типировании и внутривидовой дифференциации холерных вибрионов на основе создания референс-библиотеки протеомных профилей / Н.Р. Телесманич [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора. Ростов-на-Дону. -2013. - №26. - Стр.143-147.

61. Телесманич Н.Р. MALDI масс-спектрометрический анализ в типировании и внутривидовой дифференциации холерных вибрионов на основе создания референс - библиотеки протеомных профилей / Н.Р.

Телесманич [и др.] // Медицинский Вестник Юга России. - 2014. - №2. -Стр. 88-91.

62. Телесманич Н.Р. MALDI-TOF протеомное профилирование в изучении бактериофагов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Е.В. Гончаренко, С.О. Сеина // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора. Ростов - на - Дону. - 2013. - №26. - Стр. 158-161.

63. Телесманич Н.Р. Анализ масс - спектрометрических коллекций представителей Escherichia coli в формате MALDI-TOF / Н.Р. Телесманич [и др.] // Сборник материалов 2-ой Итоговой научной сессии молодых ученых РостГМУ. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2015. - Стр.19-21.

64. Телесманич Н.Р. Возможности применения MALDI-TOF масс-спекрометрии для изучения углевод - специфических рецепторов диагностического бактериофага эльтор / Н.Р. Телесманич [и др.] // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2016. - №2. -Стр. 85-90.

65. Телесманич Н.Р. Времяпролетный масс-спектрометрический анализ для выявления маркеров транскрипции возбудителей инфекционных заболеваний / Н.Р. Телесманич [и др.] // Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону: материалы XIV Российской научно - практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону 15-16 мая 2015г) / под ред. З.И. Микашинович. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2015. - Стр. 3-7.

66. Телесманич Н.Р. Использование времяпролетной масс -спектрометрии и протеомного анализ для разработки прогностического и диагностического алгоритма инфекционных заболеваний / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, И.А. Чайка // Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону: материалы XV

Российской научно - практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону 13 мая 2016г.) / под ред. З.И. Микашинович. -Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2016. - Стр. 66-69.

67. Телесманич Н.Р. Лектины холерных вибрионов как основные факторы патогенности и персистенции (биотехнологические аспекты использования) / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Журн. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол. - 2012. - №2. - С. 93-99.

68. Телесманич Н.Р. Линейная масс-спектрометрия клеточных белков / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, И.А. Чайка // Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону: материалы XVI Российской научно - практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону 12-13 мая 2017г) / под ред. З.И. Микашинович. - Ростов-на-Дону: ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России. - 2017. - Стр. 76-79.

69. Телесманич Н.Р. Масс-спектрометрический анализ MALDI-T0F в идентификации и типировании штаммов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. -Т.61, №6. - Стр. 375-379.

70. Телесманич Н.Р. Метод линейной масс-спектрометрии для создания и анализа протеомных паспортов энтеробактерий / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, З.И Микашинович // Materialsofthe XI international research and practice conference "CUTTING - EDGESCIENCE" (Sheffield, England. 30 April - 7 May 2015г) // Biologicalsciences. Chemistry and chemical technology. Science and education LTD. - 2015. - Volume 24. - Р.25-26 .

71. Телесманич Н.Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.07 /Телесманич Наталья Робертовна; [Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб" МЗ РФ ] — Ростов-на- Дону, 2006. — 38с.

72. Телесманич Н.Р. Перспективы идентификации и типирования холерных вибрионов с помощью прямого белкового профилирования методом MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа / Н.Р. Телесманич [и др.] // Диагностика и профилактика инфекционных болезней: материалы научно-практической конференции. Новосибирск. -2013. - Стр. 156-158

73. Телесманич Н.Р. Перспективы протеомного профилирования MALDI-TOF для изучения бактериофагов / Н.Р. Телесманич, Е.В. Гончаренко, С.О. Сеина // Диагностика и профилактика инфекционных болезней: материалы научно-практической конференции. Новосибирск. - 2013. - Стр.153-155

74. Телесманич Н.Р. Применение масс-спектрометрического метода MALDI-TOF для межвидовой дифференциации близкородственных видов / Н.Р. Телесманич [и др.] //Клиническая лабораторная диагностика.

- 2014. - Т.8, № 59. - Стр. 27-28, 37-38.

75. Телесманич Н.Р. Применение масс-спектрометрического протеомного анализа для создания прогностического и диагностического алгоритма / Н.Р. Телесманич [и др.] // Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону: материалы XIV Российской научно - практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону 15-16 мая 2015г) / под ред. З.И. Микашинович. -Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2015. - Стр. 115-117

76. Телесманич Н.Р. Протеомный анализ таксонспецифических признаков клеток V. albensis / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, М.А. Потешкина // News of science and éducation (30.03- 7.04. 2017): Biological sciences. Veterinary. Ecology. Medicin. Agriculture. - Sheffield, England. -2017. - Vol.10, No.4. - P.70-72

77. Телесманич Н.Р. Протеомный анализ углевод -специфических рецепторов фагов бактерий, применяющихся для

диагностики и лечения инфекционных болезней / Н.Р. Телесманич [и др.] // Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону: материалы XV Российской научно - практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону 13 мая 2016г.) / под ред. З.И. Микашинович. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2016. - Стр. 72-76

78. Телесманич Н.Р. Прямое белковое масс-спектрометрическое MALDI-TOF профилирование для быстрой и точной идентификации видов рода Vibrio / Н.Р. Телесманич [и др.] // Сборник научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора. - 2013. - Стр. 334-338.

79. Телесманич Н.Р. Расширение возможностей линейной MALDI масс-спектрометрии для анализа протеома микроорганизмов на основе создания референс - библиотеки виртуальных профилей / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, И.А. Чайка // Актуальные вопросы современной медицины. Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции. г.Екатеринбург. - 2015. - №2. - Стр. 34-37

80. Телесманич Н.Р. Создание баз данных виртуальных коллекций протеомных профилей клеток и тканей для идентификации маркеров оценки тяжести заболеваний инфекционной и соматической этиологии / Н.Р. Телесманич [и др.] // Система медицинского обеспечения в локальных войнах в 2-х т.: материалы Всероссийской науч.-практич. конф. с международным участием (Ростов-на-Дону 14-15 апр. 2016). - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2016. - Т. 1. - Стр. 149-152

81. Телесманич Н.Р. Создание баз данных протеомных профилей коллекций патогенных микроорганизмов / Н.Р. Телесманич [и др.] // Новые методы экспресс - диагностики микроорганизмов в медицине, фармации, ветеренарии и экологии: Сборник материалов

Всероссийской научно-практической конференции (СПб 15-16 октября 2015г.). - СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье». - 2015. - Стр. 143-147.

82. Телесманич Н.Р. Создание базы данных масс-спектрометрических профилей клинических штаммов E.coli / Н.Р. Телесманич [и др.] // Актуальные проблемы диагностики инфекционных заболеваний (микробиология, биотехнология, эпидемиология, паразитология): сб. науч.-практич. работ Межрегиональной науч.-практич. конф. / под общ. ред. Г.Г. Харсеевой; ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2015. - Стр. 162-166

83. Телесманич Н.Р. Создание персональной базы данных масс-спектрометрических профилей холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич [и др.] // Гетерогенность популяций бактерий и вирусов и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней: Материалы Первой Всероссийской конференции — Владивосток.- 2013. - Стр. 98-100.

84. Телесманич Н.Р. Характеристики маркеров вирулентности холерных вибрионов в формате MALDI - TOF с использованием персональной базы данных / Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, И.А. Чайка // Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания: Материалы II всероссийской научно - практической конференции с международным участием. Сочи. - 2015. - С.147 - 148.

85. Телесманич Н.Р., Сеина С.О., Водяницкая С.Ю. [и др.] MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ в дифференциальной диагностике представителей рода Vibrio // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора. - Ростов-на-Дону. - 2013. - №26. - Стр.148-152.

86. Телесманич Н.Р., Чайка С.О., Чайка И.А. Использование персональной базы данных виртуальной коллекции холерных вибрионов для характеристики маркеров вирулентности в формате MALDI - TOF /

Н.Р. Телесманич, С.О. Чайка, И.А. Чайка // Актуальные проблемы диагностики инфекционных заболеваний (микробиология, биотехнология, эпидемиология, паразитология): сб. науч.-практич. работ Межрегиональной науч.-практич. конф. / под общ. ред. Г.Г. Харсеевой; ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2015. - Стр. 159-162.

87. Триацилглицероллипазная активность гемолитических холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. - №2. - С.11-14.

88. Фенотипические и генотипические характеристики пробиотического штамма E. coli M-17 / И.В. Белова [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2017. - № 3. - С. 153.

89. Чайка С.О. MALDI-TOF масс-спектрометрическая идентификация маркера токсигенности Vibrio cholerae / С.О. Чайка, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - №2. - Стр. 108-109.

90. Чайка С.О. Изучение протеомного профиля клеток и тканей в формате MALDI-TOF для идентификации маркеров патологии / С.О. Чайка, И.А. Чайка // Приднепровский научный вестник. - Украина, г.Днепр : «Наука и образование». - 2017. - Т.10., №1 . - Стр. 43-46.

91. Чайка С.О. Компьютерный анализ MALDI масс-спектрометрических паспортов коллекции Vibrio cholerae и поиск таксон -специфических маркерных белков / С.О. Чайка, И.А. Чайка // Сборник материалов 4-ой Итоговой научной сессии молодых ученых . - Ростов-на-Дону: ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России. - 2017. - Стр.

92. Чайка С.О. Масс-спектрометрический маркер вирулентности Vibrio cholerae / С.О. Чайка, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2018. - Т.63, №7. - Стр. 445-449.

93. Чайка С.О. Роль углеводов в формировании фагоустойчивости / чувствительности при диагностике и лечении инфекционных заболеваний в формате MALDI TOF масс-спектрометрии / С.О. Чайка, И.А. Чайка // Сборник материалов 4-ой Итоговой научной сессии молодых ученых. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - 2016. - Стр.155-158.

94. Чемисова О.С. Масс-спектрометрический анализ как метод идентификации и внутривидовой дифференциации Vibrio parahaemolyticus. / О.С. Чемисова [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора. - Ростов-на- Дону. - 2013. - №26. - Стр. 153-157.

95. Штаммоспецифичность белкового профиля представителей рода Bifido bacterium / О. В. Бухарин [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2015. - №2. - С. 3-9.

96. MALDI -TOF масс-спектрометрический анализ c молекулярно-генетической идентификацией Vibrio spp. в системе мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов / Л.В. Миронова [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2014. - Т.19, № 6. - С. 27-36.

97. Ackermann H.-W. Bacteriophage observations and evolution / H.W. Ackermann // Res. Microbiol. - 2003. - Vol. 154. - P. 245-251.

98. Amino-terminal domain of the El Tor haemolysin of Vibrio cholerae O1 is expressed in classical strains and is cytotoxic / R.A. Alm [et al.] // Vaccine. - 1991. - Vol. 9, No.8. - P. 588-594

99. Analysis of exoproteins of El Tor Vibrio cholerae by 2DE and MALDI-TOF-MS/MS / X. Yan [et al.] // Wei Sheng Wu Xue Bao. - 2009. -Vol.49, N6. - P.746-758.

100. Arnold R.J. Fingerprint Matching of E. coli Strains with MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry of

Whole Cells Using a Modified Correlation Approach / R.J. Arnold, J.P. Reilly // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 1998. - Vol.12, No.10. - P.630-636.

101. Bacteriophage receptors, mechanisms of phage adsorption and penetration into host cell / D.V. Rakhuba [et al.] // Pol. J. Microbiol. - 2010. -Vol.59, N3. - P.145-155.

102. Basic phage biology, In: Bacteriophages: Biology and Applications. Eds. / B. Guttman [et al.] // USA, Boca Raton FL: CRC Press. - 2005. — P. 2966;

103. Benitez J.A. Vibrio cholerae hemagglutinin (HA) /protease: an extracellular metalloprotease with multiple pathogenic activities / J.A. Benitez, A.J. Silva // Toxicon. - 2016. - Vol.115. - P. 55-62. URL: https://doi: 10.1016/j .toxicon.2016.03.003.

104. Bergey's Mannal of Systematic Bacteriology. Garrity-2nd. - New York: Springer. - Vol.2B. - 2005. - P.1108.

105. Casanova T.B. The Vibrio cholera hlyC gene encodes a protein that is related to lipases of Pseudomonas species. // T.B. Casanova, K.M. Peterson // DNA Seq. - 1995. Vol.5, No.3. - P.181-184.

106. Characterization of bacteria in ballast water using MALDI-TOF mass spectrometry / K. Emami [et. al.] // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7, No.6. -P.38515.

107. Charactrization of the Vibrio cholera eltor lipase operon lip AB and protease gene down-stream of the hly region / M.A. Ogierman [et. al.] // J. Bacteriol. - 1997. -Vol. 179, N22 - P.7072-7080.

108. Cholera toxin production induced upon anaerobic respiration is suppressed by glucose fermentation in Vibrio cholerae / Y.T. Oh [et al.] // J. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - Vol.26, No.3. - P.627-636.

109. Classification and identification of bacteria by mass-spectrometry and computation analysis. / S. Sauer [et al.] // PLoS ONE. - 2008. - Vol. 3, No7. - P. 2843.

110. Cloning, characterization and chromosomal mapping of a phospholipas (lecitinase) produced by Vibrio cholera / E. Fiore [et al.] // Infect Immun. - 1997. - Vol.65, No.8. - P. 3112-3117.

111. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicty islands in sixth and seventh pandemic strains / D.K. Karaolis [et. al.] // Infect. Immun. - 2001. -Vol.69, No.3. - P.1947-1952.

112. Cytotoxicity and enterotoxicity of the thermostable direct hemolysin - deletion mutans of Vibrio parahaemolyticus / Park K.S. [et al.] // Microbiol. Immunol. - 2004. - Vol.48,No.4. - P.313-318.

113. Di Pinto A. Collagenase-targeted bultiplexpcr assay for identifiation of Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, and Vibrio parahaemolyticus / A. Di Pinto, G.Ciccarese, G. A. Tantillo // J. Food Protection. - 2005. - Vol.68, No.1. - P.150-153.

114. Differential Thiol-Based Switches Jump-Start Vibrio cholerae Pathogenesis / Z. Liu [et. al.] // Cell Rep. - 2016. - Vol.14, No.2. - P.347-354.

115. Distribution of zonula occludens toxin (zot) gene among clinical isolates of Vibrio cholerae O1 from Bangladesh and Africa / S.M. Faruque [et al.] // J. Diar. Dis. - 1994. - Vol.12, No.3. - P.222-224.

116. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae / J.F. Heidelberg [et al.] // Nature. - 2000. - Vol.406. - P. 477483.

117. Faruque S.M. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae / S.M. Faruque, M.J. Albert, J.J. Mekalanos // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol.62 - P.1301-1314. (3 раза повторяется)

118. Ganguly N.K. Mechanism of action of cholera toxins and other toxins / N.K. Ganguly, T. Kaus // Indian J. Med. Res. - 1996. - Vol.104 - P.28-37.

119. Genetic analysis of the capsule polysaccharide (K antigen) and exopolysaccharide genes in pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 / Y.

Chen [et al.] // BMC Microbiol. - 2010. - Vol.10. - P.274. - URL: https//doi: 10.1186/1471-2180-10-274.

120. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae 01 that are hybrids between classical and El Tor biotypes / A. Safa [et al.] // J. Med. Microbiol. - 2006. - Vol. 55. - P. 1563 - 1569.

121. Genomic sequence and for the Vibrio cholerae phage KSF-lphi: evolutionary divergence among filamentous vibriophag mediating lateral gene transfer / Sh.M. Faruque [et al.] // J. Bacteriol. - 2005. - Vol.185, No.12. -P.4095 - 4103.

122. Gonzales-Escalona N. Characterization of a Vibrio alginolyticus strain, isolated from alaskan oysters, carrying a hemolysin gene similar to the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus / N. Gonzales-Escalona, G.M. Blackstone, A. Depaola // Appl.Environ. Microbiol. - 2006. - Vol.72, No.12. - P.7925-7929.

123. Gratia A. Des relations nu-m6riques entre bacteries lysogfcnes et parti-cules de bacteriophage //Ann. Inst. Pasteur. - t. 57, p. 652. - 1936.

124. Gratia A. Methods in medical research // J. H. Comroe. - 1953.

- Vol. 2. - P. 7.

125. GroEL PCR- RFLP - An efficient tool to discriminate closely related pathogenic Vibrio species / R. Silvester [et al.] // Microb. Pathog. - 2017.

- Vol.105. - P.196-200.

126. Haola H.S., Stemmler Y., Yrossbarol M.L. // List Appl. Microbiol.

- 1985. - Vol.6, №11. - P.203-209.

127. Hayes C.A. Systematic genetic dissection of PTS in Vibrio cholerae uncovers a novel glucose transporter and a limited role for PTS during infection of a mammalian host / C.A. Hayes, T.N. Dalia, A.B. Dalia // Mol. Microbiol. -2017. - Vol.104, No.4. - P.568-579. - URL: https// doi: 10.1111/mmi.13646.

128. Hendrix R.W. Bacteriophages: evolution of the majority / R.W. Hendrix // Theor. Popul. Biol. - 2002. - Vol.61. - P. 471-480.

129. Hinton D.M. Transcriptional control in the prereplicative phase of T4 development / D.M. Hinton // Virology J. - 2010. - No.7. - P. 289.

130. Identification of an enveloped phage, mycoplasma virus L172, that contains a 14-kilobase single-stranded DNA genome. / K. Dybvig [et al.] // J. Virol. - 1985. - Vol. 53, No.2. - P. 384-390.

131. Identification of different respiratory viruses, after a cell culture step, by matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) / A. Calderaro [et al.] // Scientific Reports. -2016. - Vol.6. - P.36082. - URL: https//doi: 10.1038/srep36082.

132. Identification of new protein complexes of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase using pull-down assay / E. Rodina [et al.] // Biochimie. - 2011. - Vol.9, No.93. - P.1576-1583.

133. Identification of Vibrio isolates by a Multiplex PCR Assay and rpoB Sequence Determination / C.L. Tarr [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2007. -Vol.45, No.1. - P.134-140.

134. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements / F.J. Mojica [et. al.] // J. Mol. Evol. -2005. - Vol.60, No.2. - P. 174-182.

135. Investigation of MALDI-TOF and FT-MS techniques for analysis of Escherichia coli whole cells / J. J. Jones [et. al.] // Anal. Chem. - 2003. -Vol.75, No.6. - P.1340-1347.

136. John P. Identification of bacteria using mass spectrometry. / P. John , C. Fenselau // Anal. Chem. - 1975. - Vol. 47, No.2. - P. 219-225.

137. Karas M. Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules. / M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp // Anal. Chem. - 1985. - No.57. - P.2935-2939.

138. Karas M. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons / M. Karas, F. Hillenkamp // Anal. Chem. -1988. - Vol. 60, No.20 - P. 2299-2301.

139. Kariisa A.T. The RNA domain Vc1 regulates downstream gene expression in response to cyclic diguanylate in Vibrio cholerae / A.T .Kariisa, K. Weeks, R. Tamayo // PLoS One. - 2016. - Vol.11, No.2. - URL: https//doi: 10.1371/journal.pone.0148478.

140. Koonin E.V. The ancient Virus World and evolution of cells / E.V. Koonin, T.G. Senkevich, V.V. Dolja // Biol. Direct. - 2006. - No.1. - P.29.

141. Lenneman B.R. Structural and biochemical investigation of bacteriophage N4-encoded RNA polymerases / B.R. Lenneman, L.B. Rothman-Denes // Biomolecules. - 2015. - Vol.5, No.2. - P. 647-667.

142. MALDI-TOF mass spectrometry-based serotyping of V. parahaemolyticus isolated from the Zhejiang province of China / L. Ping [et al.] // BMC Microbiol. - 2018. - Vol.18, No.1. - P.185.

143. MALDI-TOF MS based procedure to detect KPC-2 directly from positive blood culture bottles and colonies / R. Figueroa-Espinosa [et al.] //J Microbiol Methods. - 2019. - Vol.159. - P.120-127. - URL: https//doi: 10.1016/j.mimet.2019.02.020. Epub 2019 Mar 5.

144. Mekolanos J.J. Cholerae: Molecular basis for emergence and pathogenrsis / J.J. Mekolanos, M.K. Waldor, E.Y. Rubun // FEMS Immunol. med. Microbiol. - 1997. - Vol. 18, No.4. - P. 241-248]

145. Molecular evidences favouring step-wise evolution of Mozambique Vibrio cholerae O1 El Tor hybrid strain / Halder K [et al.] // Microbiology. -2010. - Vol.156, Pt 1. - P.99-107.

146. Negative matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry fragmentation of synthetic analogs of the O-specific polysaccharide of Vibrio cholerae O:1 in the presence of anionic dopants / J. Chmelik [et al.] // Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). - 2007. - Vol.13, No.5. - P.347-53. - URL: https//doi:10.1255/ejms.891.

147. Nishibuchi M. Thermostable direct hemolysin gene and of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium / M. Nishibuchi, J.B. Kaper // Infect. Immun. - 1995. - Vol.63, No.6. - P.2093-2099.

148. Nucleotide binding by the widespread high-affinity cyclic di-GMP receptor MshEN domain / Y.C. Wang [et al.] // Nat. Commun. - 2016. - Vol.31; No.7. - P.12481.

149. OmpU as a biomarker for rapid discrimination between toxigenic and epidemic Vibrio cholerae O1/O139 and nonepidemic Vibrio cholerae in a modified MALDI-TOF MS assay / A. Paauw [et al.] // BMC Microbiol. - 2014.

- Vol.14, No.1. - P. 158.

150. Pribil P. Characterization of Enterobacteria using MALDI-TOF mass spectrometry / P. Pribil, C. Fenselau // Anal. Chem. - 2005. - Vol.77, No.18. - P.6092-6095.

151. Proteins involved in difference of sorbitol fermentation rates of the toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae El Tor strains revealed by comparative proteome analysis / W. Ruibai [et al.] // BMC Microbiology. -2009. - No.9. - P.135-144

152. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific protein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS / Q. Zou [et al.] // Proteomics. - 2006. - Vol. 6, No. 6.

- P.1848-1855.

153. Rapid and generic identification of influenza A and other respiratory viruses with mass spectrometry / J. A. Majchrzykiewicz-Koehorst [et. al.] // J Virol Methods. - 2015. -Vol.213. - P.75-83.

154. Rapid Identification of Intact Whole Bacteria Based on Spectral Patterns using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Time-of-flight Mass Spectrometry / R. D. Holland [et. al.] // Rapid Commun. MassSpectrom. -1996. - No.10. - P.1227-1232.

155. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli / M. Christner [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol.9, No.7. - URL: https//doi: 10.1371/journal.pone.0101924.

156. Revealing the glycation sites in synthetic neoglycoconjugate models formed by conjugation of the antigenic monosaccharide hapten of Vibrio cholerae O1, serotype Ogawa with the BSA protein carrier using LC-ESI-

QqTOF-MS/MS / F. Jahouh [et. al.] // J Mass Spectrom. - 2012. - Vol.47, No.7.

- P.890-900. - URL: https//doi: 10.1002/jms.2974.

157. Robert-Pillot A. Usefulness of R72H PCR assay for diferentiation between Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus species: validation by DNA-DNA hybridization / A. Robert-Pillot, A. Guenole, J. Fournier // FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - Vol.215, No.1. - P.1-6.

158. Serum peptide profiling for potential biomarkers in early diagnosis of Escherichia coli bloodstream infection / Y Ma [et. al.] // Cytokine. - 2019. -Vol.23, No.120. - P.71-77.

159. Staerk J. Neuraminidase, a virulence factor in Vibrio cholerae infection / J.Staerk, H.J. Ronneberger, H. Wiegandt // Behring Inst. Mitt. - 1974.

- Vol. 55. - P. 145-146.

160. The diversity-generating benefits of a prokaryotic adaptive immune system / S. van Houte [et al.] // Nature. - 2016. - Vol.532, N7599. - P. 385-388.

161. Three-dimensional structure of different functional form of Vibrio cholerae Hemolysin oligomer: a cryo-electron microscopic study / S. Dutta [et al.] // J.Bactriol. - 2009. - Vol.192, No.1. - P. 169-178.

162. URL:https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/

2002/

163. Venkateswaran K. Cloning and nucleotide sequence of the gyrB gene of Vibrio parahaemolyticus and its application in detection of this pathogen in shrimp / K. Venkateswaran, N. Dohmoto, S. Harajama // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol.64, No.2. - P.681-687.

164. Vibrio cholerae strains from seafood and clinical samples collected in Italy / D. Ottaviani [et. al.] // Int. J. Food Microbiol. - 2009. - Vol.132, No.1.

- P. 47-53.

165. Waldor M.K. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin / M.K. Waldor, J.J. Mekalanos // Science. - 1996. - Vol. 272, N 5270. - P.1910-1914.

166. Ward L.N. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan florescent probes / L.N. Ward, K. Beja // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol.72, No.3. - P. 2031-2042.