Магнитные изотопные эффекты 25Mg и 67Zn в регуляции каталитической активности фосфатидилтрансфераз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Орлов, Алексей Павлович

• Орлов, Алексей Павлович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Орлов, Алексей Павлович

Содержание

I ВВЕДЕНИЕ 4

II ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8

2.1. Магнитный Изотопный Эффект 8

2.1.1. История открытия эффекта 8

2.1.2. Проявление МИЭ в биологических системах 8

2.2. Современные представления о биологической функции магния и 16 цинка.

2.2.1. Биологическая роль магния в организме. 20

2.2.2. Клеточный гомеостаз магния 22

2.2.3. Биологическая роль цинка в организме. 23

2.2.4. Цинк и апоптоз. 25

2.2.5. Цинк-ДНК-полимеразы-апоптоз. 27

2.2.6. Концентрационная зависимость влияния ионов цинка на 27 апоптоз.

2.2.7. Цинк и мозг. 29

2.2.8. Транспортеры цинка в организме. 31

2.3. Опыт фармакологического применения наночастиц. 33

2.3.1. Наночастицы в медицине. 33

2.3.2. Катионообменные наночастицы 33

III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35

3.1. Активность креатинкиназы и пируваткиназы 35

3.2. Полимеразная цепная реакция

3.3. Выделение ДНК- полимеразы ß 35

3.3.1. Культура клеток для выделения ДНК-полимеразы 35

3.3.2. Выделение хроматина 36

3.3.3. Гель-фильтрация 37

3.4. Электрофорез 38

3.4.1. Электрофорез белка 38

3.4.2. Электрофорез ДНК 38

3.4.3. Изоэлектрическое фокусирование белков 38

3.4.4. Измерение активности ДНК-полимеразы 39

db

3.5. Спектрофотометрия 40

3.6. Работа с культурой клеток острого миелоидного лейкоза человека 40

3.6.1. Клетки 40

3.6.2. Получение материала 41

3.6.3. Выделение мононуклеарных клеток из КМ пациентов с ОЛЛ и 41 периферической крови здоровых доноров (стандартная методика)

3.6.4. Наночастицы РМС16 41

3.6.5. МТТ - тест 42

3.6.6. Оценка индукции апоптоза 44

3.6.7. Статистическая обработка полученных результатов 46

IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 47

4.1. Цинк-зависимый магнитный изотопный эффект в ферментативном 47 синтезе АТФ

4.2. Магнитный изотопный эффект в ПЦР 52

4.3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы ß из клеток миелоидного 57 лейкоза человека

4.4. Магнитные изотопные эффекты в регуляции активности ДНК- 64 полимеразы ß

4.5. Влияние магнитного поля на синтез ДНК 69

4.6. Ион-радикальный механизм в синтезе ДНК 70

4.7. Влияние магнитного изотопного эффекта на выживаемость клеток 72 HL-60

4.7.1. Результаты МТТ - теста 75

4.7.2. Результаты оценки индукции апоптоза 76

V ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80

VI ВЫВОДЫ 82

VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83

I. ВВЕДЕНИЕ.

Синтез АТФ является одним из главнейших процессов, регулирующих функционирование человеческого организма, поэтому к его особенностям и нарушениям приковано пристальное внимание ученых. Другим столь же важным объектом является генетическая основа организма, т.е. синтез ДНК. Последние исследования открыли новую страницу, подтвердив более ранние представления биофизиков и, в частности, Л.А.Блюменфельда [1] о том, что ферменты, осуществляющие биохимию клетки в нашем организме, представляют собой молекулярные машины. Магнитный изотопный эффект дает новое понимание работы этой машины, открывая дополнительный канал, роль которого в эволюции и патогенезе заболеваний пока неясен. Однако очевидно, что такие понятия как энергетические запреты и энергетическая память [2] приобретают новый, можно сказать, «спиновый» смысл.

В связи с этим возникает проблема, во-первых, влияния магнитных изотопов (и более всего тех, которые в некотором количестве, содержатся в нашем организме, при этом выполняя активную роль) на синтез ДНК и мутационные процессы. Во-вторых, возникает вопрос о взаимосвязи действия магнитных ядер на синтез АТФ и синтез ДНК. Количество неизвестных на этом поле исследований огромно, поэтому данная работа сконцентрирована на влиянии двух из важнейших микроэлементов, а именно, магния и цинка, на работу ДНК-полимераз. Это связано с тем, что цинк, входя в состав транскрипционных факторов «цинковые пальцы» активно участвует в синтезе ДНК, при этом 4% пула изотопов цинка занимает 67Zn, имеющий магнитное ядро. Количество магнитного 25Mg в его общем пуле еще больше и достигает -10%. Таким образом, данная работа делает первые шаги по направлению установления более общей картины о вкладе магнитных изотопов в работу молекулярных машин нашего организма.

Кроме экспериментов на чистых ферментах чрезвычайно интересной задачей было

также обнаружение влияния магнитного изотопа на клетки in vitro. Современная медицина за

последние 30 лет достигла больших успехов в лечении лейкозов. Детские лейкозы более

благоприятны для лечения и прогноза, чем взрослые: успешно лечатся примерно 70-75%

острых лимфобластных (ОЛЛ) и 30-50% острых нелимфобластных лейкозов. Уровень

пятилетней выживаемости детей с ОЛЛ за последнее время вырос с 58% у детей,

диагностированных в 1975-77 гг, до 87% у детей, диагностированных с 1996 по 2003 гг., а

пятилетняя выживаемость у детей с острыми миелобластными лейкозами (ОМЛ) выросла с

19% до 54% соответственно. Неудовлетворительные результаты лечения отмечаются у

больных с рецидивами, особенно ранними, и рефрактерными формами острых лейкозов. До

4

сих пор остается проблемой достижение полной клинико-гематологической ремиссии у этой группы больных. Таким образом, несмотря на значительные успехи в лечении лейкозов у детей, все еще необходим поиск новых лекарственных форм и методов лечения.

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится отсутствие избирательности действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является важной задачей. Именно в этой связи необходимо было выяснить, как поведут себя раковые клетки при введении в них магнитных изотопов магния и цинка. Все выше сказанное обуславливает актуальность исследования, его цели и задачи.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Магнитные изотопные эффекты 25Mg и 67Zn в регуляции каталитической активности фосфатидилтрансфераз»

Цель работы;

Целью настоящего исследования является поиск и оценка возможностей ядерно-магнитного управления металл-зависимыми процессами репликации ДНК и киназного синтеза АТФ in vitro с помощью магнитных изотопов магния и цинка, а также оценка возможности химиотерапевтического действия данных магнитных изотопов, благодаря их участию в указанных выше процессах.

Задачи исследования:

1. Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов цинка на каталитическую активность креатинкиназы яда V. xanthia и пируваткиназы ретикулоцитов кролика.

2. Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на каталитическую активность термофильной ДНК-полимеразы в ПЦР и ДНК-полимеразы бета из хроматина клеток миелоидного лейкоза человека HL-60.

3. Оценка влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на пролиферацию и параметры метаболизма (синтез белка, ДНК, АТФ) клеток HL-60 in vitro.

4. Создание итоговой модели ион-радикального механизма участия магнитных изотопов в ферментативных реакциях транспорта фосфата при синтезе АТФ и ДНК и в регуляции динамики клеточных популяций

Научная новизна исследования:

1. Впервые обнаружено проявление магнитного изотопного эффекта (МИЭ) 67Zn в регуляции каталитической активности нуклеотидилкиназ.

2. Впервые обнаружена роль МИЭ в регуляции активности ДНК-полимераз

3. Впервые выделена, очищена и охарактеризована уникальная |3-подобная ДНК-полимераза из хроматина клеток HL-60

4. Впервые сформулирован ион-радикальный механизм переноса фосфата в синтезе ДНКВпервые исследовано влияние МИЭ на параметры пролиферации и метаболизма клеток HL-60 in vitro

Начно-практическая ценность:

1. Представленная работа является фрагментом обширной программы исследований магнитного изотопного эффекта, явления в биохимии нового и малоисследованного. Она призвана расширить представления о возможности МИЭ и, следовательно, о перспективах его применения в биохимии и медицине.

2. Обнаруженная и изученная способность магнитных изотопов магния и цинка влиять на ферментативный синтез АТФ и ДНК позволяет задействовать эти изотопы в управлении данными процессами, как в случае чистых ферментах, так и в клетках.

3. Разработана и внедрена новая высокоэффективная методика выделения и очистки гиперэкспрессированого в опухолях фермента ДНК-полимераза Р из клеток острого миелоидного лейкоза человека HL-60.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выход АТФ при ферментативном синтезе с участием нуклеотидилкиназ осуществляется не только ионами магния, но также и ионами цинка, находящимися в активном центре фермента, и процесс сильно зависит от магнитной изотопии этих ионов.

2. Синтез ДНК в полимеразной цепной реакции, а также с помощью фермента ДНК-полимераза Р из клеток линии HL-60 подавляется в присутствии магнитных изотопов магния и цинка, причем эффект зависит от концентрации ионов металлов.

3. Снижение эффективности работы ДНК-полимераз в присутствии магнитных изотопов обусловлен магнитным изотопным эффектом, включающим спин-селективный (ион-радикальный) канал переноса фосфатной группы. Этот механизм работает наряду с классическим нуклеофильным механизмом и при повышении концентрации ионов доминирует над классическим механизмом.

4. Включение ион-радикального пути переноса фосфата влияет на ключевые процессы метаболизма и пролиферации клеток (синтез АТФ и ДНК). Адресная доставка магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка в клетки миелоидного лейкоза человека с помощью катионообменных наночастиц на основе порфирин-фуллерена позволяет управлять популяциями этих клеток, что говорит о перспективности использования таких комплексов в качестве химиотерапевтических агентов in vivo.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 2.1. Магнитный Изотопный Эффект

2.1.1. История открытия эффекта.

Магнитным изотопным эффектом (МИЭ) называется зависимость скорости реакции (или вероятности рождения молекулы) от ядерного спина, его проекции, магнитного момента и энергии электрон-ядерного (сверхтонкого) взаимодействия. Это явление было открыто А.Л. Бучаченко, Р.З. Сагдеевым и Ю.Н. Молиным в 1976 году на примере фотолиза дибензилкетона, содержащего атомы углерода с магнитными ядрами 14С. Впоследствии, магнитные изотопные эффекты были обнаружены для таких элементов, как кислород, кремний, уран, ртуть.

В начале XXI века спиновая химия стремительно вторглась в биологию в виде так называемой спиновой биохимии. Детальное исследование биохимических реакций, катализируемых различными ферментами, через призму МИЭ открыло новые, несовместимые с традиционными, подходы к пониманию их механизма. Среди всего многообразия биокатализаторов существует группа ферментов, значение которой трудно переоценить. Это ферменты, отвечающие в организме за синтез универсального биологического энергоносителя —- аденозинтрифосфата (АТФ). Благодаря новейшим методам исследования удалось достигнуть существенного успеха в понимании механического функционирования таких ферментов. Классическим примером может служить работа такой «молекулярной машины», как АТФ-синтаза [3].

2.1.2. Проявление МИЭ в биологических системах

Впервые тяжелые изотопы были использованы для изучения АТФ-синтезирующих ферментов в 1953 году. Было показано, что

180/1б0

изотопный обмен между О неорганического фосфата и 160 воды происходит только во время производства АТФ, а при подавлении этого процесса исключением из него ионов магния, изотопный обмен не наблюдался. Однако из этого наблюдения не было сделано каких-то определенных выводов.

18 33 32

Когда митохондрии инкубировали с пирофосфатом, меченным О, Р, Р и немеченым АТФ, между пирофосфатом и водой был обнаружен быстрый обмен кислородом. [4,5] С помощью

1 о

измерений изотопного эффекта О было показано, что диссоциация Р-0 связи является лимитирующей стадией гидролиза ГТФ. [6,7]

Первым примером магнитного (не зависящего от массы) изотопного эффекта в

биохимической системе была реакция ингибирования креатинкиназы метилхлоридом ртути.

[8] Эффект проявлялся как в ядерно-спиновой зависимости активности фермента, так и во

фракционировании магнитных и немагнитных изотопов ртути. Эти наблюдения показывают,

что взаимодействие метилхлорида ртути с креатинкиназой является радикальным спин-

8

селективным процессом, а обладая зависимостью от спина электрона, этот процесс непременно будет обладать и ядерной спин-селективностью. Тем не менее, метилхлорид ртути не вмешивается в процесс ферментативного транспорта фосфата; он лишь химически изменяет структуру активного центра фермента, что приводит к подавлению каталитической активности креатинкиназы. Этот магнитный (масс-независимый) изотопный эффект впоследствии был обнаружен во многих более поздних исследованиях.

При изучении реакции захвата СОг в фотосинтезе, катализируемом ферментом рубилозо-5-дифосфат карбоксилаза/оксидаза, было обнаружено, что введение 251у^С12 сильно активирует данный процесс. [9] Эти результаты стали толчком к разработке новых техник препаративного электрофореза, позволяющих заменять ионы с природным изотопным составом ионами магнитного 25М§2+. [10] Интерес к изотопу был неслучаен. Дело в том, что этот изотоп, представленный в природном пуле магния лишь десятью процентами от общей массы, единственный из всех изотопов магния обладает некомпенсированным магнитным ядерным спином (таблица 1), то есть, по сути, некомпенсированным угловым моментом вращения ядра.

Таблица 1. Изотопы магния, кальция и цинка [11].

Изотоп Спин Магнитный Природное содержание, %

момент ядра, цВ

^МЁ 0 0~~

25Ме 5/2 0.85

2вМё 0 0

40Са 0 0

43Са 7/2 1.317

мЪъ 0 0

67гп 5/2 0.875

79 10 11 96.94 0.135 48.6 4.1

С помощью этого метода были получены образцы креатинкиназы из яда 1'/¡репа ХатЫа с высоким содержанием ионов 25Ь^2+ (86% вместо 10% в природном пуле). По итогам эксперимента оказалось, что полученные образцы обладают чрезвычайно высокой АТФ-синтезирующей ферментативной активностью: восьмикратное увеличение доли 25М§2+ в общем пуле ионов магния сопровождалось 2-4-кратным увеличением выхода АТФ. (рис. 1). Эти невероятные результаты показали, что присутствие магнитных ядер 25М§ в каталитическом сайте фермента каким-то образом способствует увеличению синтеза АТФ.

120 100 80 н 60 40 20

-20

У-10

I

10

I

20

30

40 50

[\^СЬ], тМ

Рис. 1. Выход АТФ, синтезированного 25М§-СК (темные круги) и *Г^-СК (полые

25 25

круги) в зависимости от концентрации М§СЬ- Доля изотопа в \1g-CK составляла 78%. У представляет собой количество произведенного АТФ за 40 минут и выражается в ммоль/г СК [154].

Помимо экспериментов с креатинкиназами в литературе также присутствуют

1С

исследования, показывающие, что магнитный изотопный эффект можно назвать

универсальным для реакций синтеза АТФ. Так, например, были проведены эксперименты с ферментами фосфоглицераткиназой и пируваткиназой. Фермент пируваткиназа отвечает за реакцию, обеспечивающую транспорт фосфатной группы от фосфоенолпирувата на АДФ с образованием АТФ и пирувата.

С02" С02"

\ 2 I

С—ОРОз2" + АЭР -С=0 + АТР

II I

СН2 СНз

Как и в случае с креатинкиназой, перенос фосфатной группы осуществляется при непосредственном участии ионов магния. Скорость синтеза АТФ пируваткиназой в зависимости от концентрации ионов магния показана на рис. 2.

[М^Ы, тм

Рис. 2. Скорость синтеза АТФ Мё-РК в зависимости от концентрации М§СЬ- У -радиоактивность произведенного 32Р-АТФ, выраженная в имп./мин/мг РК. Содержание 25Мё2+ указано в верхнем левом углу рисунка [12].

Представленные данные демонстрируют две интересных особенности. Во-первых, зависимость активности пируваткиназы от концентрации ионов магния имеет два максимума. Во-вторых, наблюдается необычная зависимость от изотопного состава магния. При низких концентрациях ионов Мё2+ (10—50 мМ) не наблюдается какой-либо зависимости от изотопного состава ионов, тогда как при высоких концентрациях \lg-PK выход АТФ демонстрирует чрезвычайно высокую ядерно-спиновую зависимость. [12] Постепенная замена в каталитическом сайте фермента немагнитных изотопов 24Мё и 26М% на магнитный изотоп 25Мё приводит к плавному повышению выхода АТФ. Пируваткиназа, в отличие от других АТФ-синтезирующих ферментов, демонстрирует достаточно странное поведение. Не исключено, что при высоких концентрациях ее структура каким-то образом деформируется, что, однако, не мешает ей функционировать. Кроме того, как следует из рис.2, чем выше

содержание М§, тем выше стабильность фермента. Это говорит не только о высокой устойчивости пируваткиназы, но и о том, что она может быть увеличена введением изотопа 25Мё. Функционирование пируваткиназы при высоких концентрациях ионов магния, конечно, не имеет никакого значения с точки зрения биохимии и физиологии, однако этот факт интересен с химической точки зрения и является еще одним примером действия МИЭ.

При исследовании других ферментов, осуществляющих транспорт фосфата наблюдалась похожая картина. Так, например активность фосфоглицераткиназы, аналогично предыдущим ферментам, зависит от изотопного состава магния. Максимальный выход АТФ,

25

полученный при участии Mg-PGK и концентрации [М§С1г] > 20 мМ, примерно в 1.7 раза выше, чем с участием 24М§-РОК [154].

Существует также линейная корелляция между выходом АТФ и долей магнитного изотопа в общем пуле магния (рис. 3) [13]

25Мд, %

25 25

Рис. 3. Y/Y0 отношение каталитических активностей Mg-CK и Mg-PGK к 24Mg-CK и 24Mg-PGK, соответственно, в зависимости от доли 25Mg в общем пуле магния [13].

Так как магнитные изотопные эффекты в синтезе АТФ являются неожиданным и необычным явлением для классической биохимии, необходимо обозначить некоторые моменты, подтверждающие именно их изотопную природу. Во-первых, при использовании изотопов из разных источников не наблюдалось серьезной разницы между активностями фермента в присутствии немагнитных изотопов 24Mg и 26Mg, в отличии от магнитного

25

изотопа Mg. Чистота использованных для экспериментов образцов различных изотопов была определена методом атомно-адсобционной спектроскопии. Полученные результаты показали содержание очень небольшого количества примесей порядка 10-30 ррмМ. [12] Столь малое содержание посторонних веществ в образцах по отношению к содержанию искомого изотопа не может внести какой-либо ощутимый вклад в изменение выхода при синтезе АТФ, поэтому им можно пренебречь. Среди всех примесей наиболее подозрительными выглядели бы примеси марганца, так как все его изотопы являются магнитными, то есть, как и Mg, обладают некомпенсированным ядерным спином, однако в образцах марганец содержался в следовых количествах, и можно смело утверждать, что никакого ощутимого вклада в синтез АТФ он внести не мог.

Помимо экспериментов на чистых ферментах известны также и эксперименты на изолированных митохондриях миокарда in vitro. Для того чтобы оценить вклад окислительного фосфорилирования в синтез АТФ были использованы метилникотинамид и KCN. Несмотря на различные механизмы своего воздействия на митохондрии, оба ингибитора, тем не менее, подавляют синтез АТФ ферментом АТФ-синтаза. Скорости синтеза АТФ изолированными митохондриями (рис. 4), инкубированными в средах, содержащих отдельно 24Mg2+ (99.6% 24Mg), 25Mg2+ (95.8% 25Mg), и 26Mg2+ (96.3% 26Mg), сильно зависели от спина и магнитного момента. Митохондрии, содержащиме магнитные ядра 25Mg производили в 2 раза больше АТФ, чем митохондрии с бесспиновыми, немагнитными ядрами 24Mg и 26Mg [14,15]. Когда окислительное фосфорилирование избирательно блокируется метилникотинамидом, выход АТФ резко уменьшается. Оставшаяся часть синтезированного АТФ зависит от субстратного фосфорилирования и определяется работой креатинкиназы, которая также зависит от МИЭ (в случае 25Mg выход АТФ примерно в 2 раза больше). Разницы же между действием ионов 24Mg и 26Mg не наблюдалось ни при окислительном, ни при субстратном фосфорилировании. Более того, изменение активности митохондриальной креатинкиназы было почти идентично изменению активности креатинкиназы из яда Vípera Xanthia. [14] Эти наблюдения показали, что ферментативный синтез АТФ в митохондриях является спин-селективным процессом, зависимым от магнитного состояния ядер.

Рис. 4. Скорость синтеза АТФ митохондриями, как функция изотопии магния. 1-неповрежденная митохондрия, 2 — митохондрия, подвергнутая избира-рательной блокаде окислительного фосфорилирования метилникотинами-дом. Выход АТФ приведен в мкмоль/мин/г на общее количества белка; концентрация ионов магния во всех случаях равнялась 15 мМ, а температура 370 С [154].

Помимо экспериментов с ионами магния, в литературе присутствуют данные об изучении влияния различных изотопов кальция на синтез АТФ [16]. Описанные данные о выходе АТФ, синтезированного ферментом креатинкиназа в присутствии изотопа 40Са и магнитного изотопа 43Са в зависимости от концентрации СаСЬ, показали, что магнитная изотопия ионов Са также влияет на активность фермента креатинкиназа.

Нетрудно заметить, что эксперименты с ионами кальция показали картину, очень похожую на случай использования изотопов магния. При повышении концентрации ионов металла повышалась величина МИЭ, и в максимуме, при концентрации [СаСЬ] = 120 мМ, наблюдалось увеличение выхода реакции примерно в 1,8 раза.

Были проведены эксперименты по сравнению выхода АТФ в митохондриях, обогащенных *]У^С1г и М§СЬ. (табл. 2), которые показали увеличение эффективности митохондриальной 25М§-АТФ-синтазы, пропорциональное содержанию

Таблица 2. Митохондриальный синтез АТФ

МёС12 У-103

*MgCl2 (20 мМ, 10% "Мб) 6.7

25МвС12 (20 мМ, 92% 25Мв) 9.8

25К^С12 (20 мМ, 95.8% 11.1

У - выход АТФ на мкмоль/мин/г белка; точность составляет 10%.

2.1.3. Ядерная спин-зависимая химия синтеза АТФ

В целом, можно с уверенностью говорить, что ферментативный синтез АТФ является высоко-зависимым от магнитного момента ядра атома иона, входящего в состав каталитического сайта фермента: наличие некомпенсированного ядерного спина увеличивает активность АТФ-синтаз и различных видов киназ в 2-3 раза. Это явление четко и однозначно показывает, что синтезом АТФ в гораздо большей степени управляет масс-независимый магнитный изотопный, а не классический масс-зависимый эффект. [17]

Зависимость синтеза АТФ от ядерного спина атома металла в активном центре фермента является новым, меняющим парадигмы биохимии явлением. Очевидно, что механизм синтеза АТФ включает в себя этапы образования парамагнитных интермедиатов и, следовательно, помимо классического нуклеофильного механизма, имеется и другой, который должен отвечать следующим позициям:

(1) Синтез АТФ — радикальный, а точнее ион-радикальный процесс

(2) Ключевой реакцией синтеза АТФ является перенос электрона с АДФ на ион металла М2+, который генерирует образование ион-радикальных пар, состоящих из М+ и фосфатного анион-радикала АДФ

(3) Из-за спиновой конверсии химическая реакционная активность синглетного и триплетного состояний ион-радикальных пар различна. Это приводит к рзличию в величинах выхода АТФ по синглетному и триплетному каналу фосфорилирования

(4) Относительный вклад этих спиновых каналов в синтез АТФ конторолируется сверхтонкими магнитными электрон-ядерными взаимодействиями между неспаренными электронами с магнитными ядрами атомов металлов и фосфат-АДФ радикалом. Это рождает синглет-триплетную конверсию и, как результат, ядерно-спиновую зависимость синтеза АТФ.

Для объяснения этого необычного, но объективно установленного явления были предложены

схемы 1 таблица 2. [12]. На них представлены механизмы МИЭ, процесс образования

промежуточных парамагнитных интермедиатов и синглет-триплетная конверсия для АТФ-

15

синтазы (окислительное фосфорилирование) и креатинкиназы (субстратное фосфорилирование).

Схема 1. Механизм синтеза АТФ ферментом АТФ-синтаза [154].

о О- м§2+ 0-

\ / I

но— р О— Р— о— АМР

1 О

о

-О О- ^ о-

\/ • 1

НО-р о-р-

О О

25

Mg

"О о

\/

НО-р

о

2'

Мё+

о б-р о

-о О" о

\/ I

НО—Р — о—Р

-I 8

о-

о

Mg-

О О- о \/ I но—Р —о—Р

О-

3'

о

[НО Ме+]8 + АТР

[НО Мё+]Т +АТР

Таблица 3. Механизм синтеза АТФ ферментом креатикиназа [154].

Са2+

СН3 Д р О

Н02С—СН2^~ С—1ЧН-Р

И II

+ын2 о

40,42,44Са

"О—^—О—АМР О

~от>

\/

-ын—р

II

о

Са

О"

. I

о—р—

о

43Са

С а

-О О" О

\/ I -ЫН—Р — о—Р-

о.

о

Са+]

-N4 Са+ + АТР

+

Са

"Я? . ?■

-ьш—Р о—р-

т

о

о

С а

"О О" О \/ I —ын—Р—О—Р-

о.

о

3'

-ин Са+

Т

+ АТР

Схемы приведены для ионов магния и кальция. В качестве первого шага схема 1 подразумевает перенос электрона с концевой фосфатной группы на ион Mg , который рождает первичную ион-радикальную пару, состоящую из катион-радикала М£+ и оксирадикала АДФ (реакция 1). Из-за сохранения общего спина в процессе, эта пара находится в синглетном спиновом состоянии. Следующим шагом является само фосфорилирование, в котором окси-радикал АДФ атакует Р=0 связь неорганического фосфата (реакция 2). Далее оксирадикал разлагается путем разрыва химической связи Р-0 (реакция 3), образуя АТФ и конечную ион-радикальную пару (НО М§+); последняя регенирирует ион Mg с помощью обратного переноса электрона. Скорость фосфорилирования по синглетному каналу (схема 1, таблица 3, реакции 1-3) подавляется спин-разрешенным обратным переносом электронов в первичной ион-радикальной паре, который приводит к восстановлению исходных реагентов и уменьшает выход АТФ. Однако

присутствие ионов магнитных изотопов магния и кальция обуславливает сверхтонкое взаимодействие неспаренных электронов с магнитными ядрами ионов, что, в свою очередь, стимулирует синглет-триплетную конверсию первичной ион-радикальный пары в триплетное состояние. Здесь обратный перенос электрона запрещен по спину. Этот новый триплетный канал фосфорилирования (реакции 2' и 3') обеспечивает дополнительный выход АТФ и именно он увеличивает общее количество произведенного АТФ в 2-3 раза. Финальная ион-радикальная пара, образовавшаяся по триплетному каналу, подвергается триплет-синглетной конверсии за счет спиновой релаксации электронов (в ОН время спиновой релаксации составляет 10"11 с) и, с помощью обратного переноса электронов, восстанавливает ионы магния и кальция, аналогично процессу, наблюдаемому в синглетном канале.

Таким образом, схемы 1 и 2 показывают, что ядерно-спиновый контроль является важнейшей особенностью синтеза АТФ. Однако схемы не могут адекватно, с точки зрения химической энзимологии, объяснить процесс синтеза АТФ до тех пор, пока не показана роль ионов магния и кальция, как катализаторов.

Многочисленные исследования показывают, что существование ферментов группы киназ возможно лишь при наличии двух ионов Мё2+ в составе активного центра фермента. [18-21] Так, фермент фосфоглицераткиназа содержит в своем каталитическом сайте два иона магния; первый тесно связывается в комплекс Мё-АДФ, а второй, «свободный», не связан с фосфатными группами, однако сольватирован молекулами воды и белковыми группами [22] . Даже синтез РНК ферментами РНКазами нуждается в двух ионах магния [23].

Детальные исследования кинетики синтеза АТФ АТФ-синтазой показывают, что наличие двух ионов магния просто необходимо: один тесно связан с АДФ, а второй находится в состоянии гидратированного комплекса Мё(Н20)п2+ [24]. Таким образом, первичные реакции переноса электрона в схеме 1 должны выглядеть следующим образом:

Мё(Н20)„2+ + Мё(Н20)т2+(АВР3") Мё(Н20)„+ + Мё(Н20)т2+(А0Р2") (1)

Мё(Н20)„2+ + Мё(Н20)ш2+(А0Р2") — Мё(Н20)„+ + Мё(Н20)т2+(А0Р") (2)

Следовательно, комплекс Мё-АДФ тоже должен быть гидратирован ш молекулами воды. Реакция (1) относится к полностью депротонированной форме АДФ, а реакция (2) к частично протонированной форме, поскольку при физиологических значениях рН в клетках и митохондриях обе эти формы представлены примерно в одинаковых соотношениях.

2.2.. Современные представления о биологической функции магния и цинка.

2.2.1. Биологическая роль магния в организме.

Биологическая роль магния в организме наиболее хорошо изучена и этот микроэлемент ничуть не уступает по значимости цинку. Общее содержание обменного магния в организме взрослого человека составляет 1.5-1.7 моль, причем половина этого количества находится в костной ткани. В клетках поперечно-полосатых мышц концентрация магния составляет 10 ммоль л-1, в эритроцитах - 17,5 ммоль л-1, в клетках остальных тканей - до 20 ммоль л-1, а концентрация магния в сыворотке плазмы крови - 0,9 ммоль/л (1% его общего содержания в организме) [25]. Суточная физиологическая потребность в магнии для взрослого человека составляет 350-400 мг [26]. Большое количество магния в крови связано с альбумином и а2М, которые выступают его транспортерами. В самом общем виде достаточный уровень магния способствует нормальному течению обменных процессов и находится в некотором антагонизме с ионами кальция, снижая нервную и мышечную возбудимость. Если содержание магния снижается в крови ниже 0.7-1 ммоль л-1, то ставится диагноз гипомагниемии [27], а это по заключению ВОЗ фактор риска смертности от инсульта и сердечно-сосудистой патологии [28]. Распределение магния в организме схематично представлено на рис.5 [29].

Механизмы развития дефицита магния и калия при остром инфаркте миокарда в настоящее время хорошо изучены. К ним относят специфическое действие гиперкатехоламинемии, гиперкортицизма и гиперальдостеронизма — закономерных реакций организма на стресс. Выведение магния и калия с задержкой натрия — филогенетически закрепленный механизм удержания воды на случай кровопотери [29]. Сам магний способствует нормализации внутриклеточного содержания калия и кальция и тем самым снижает тонус сосудов, предотвращает некроз клеток и их электрическую нестабильность.

Кости, зубы •*■ 60 %

Магний-*■ мышцы

/ Ч 20 %

Мозг, сердце, печень, почки и др. 19%

Внеклеточная жидкость 1 %

Рис. 5. Схема распределения магния в организме [29].

Положительное значение магния предлагается разделить на следующие группы [30]:

1. Влияние на энергетические процессы в клетке. Активизация работы более 300 ферментов. Участие в процессах гликолиза, цикла Кребса, окислительного фосфорилирования и др.

2. Связь с синтезом ДНК и РНК. Воздействие на анаболические процессы.

3. Усиление метаболизма универсального регулятора тонуса и спазмолитика сосудистой стенки оксида азота.

4. Физиологический антагонизм с кальцием. Предупреждение активации кальция как основного патогенетического звена гипертонии и дислипидемии.

5. Предотвращение токсических эффектов ксенобиотиков. Повышение резистентности организма. Кардиопротектор.

Клинические проявления дефицита магния делятся соответственно на сердечнососудистые (ангиоспазм, артериальная гипертензия, тахикардия, склонность к тромбозам, развитие атеросклероза), неврологические (синдром хронической усталости, вегетативная дисфункция, снижение внимания, депрессия, страх, тревога, головокружение, мигрень, нарушения сна), мышечные (судороги скелетных мышц) и висцеральные (бронхоспазм, ларингоспазм, тошнота, рвота, дискинезия желчевыводящих путей, образование камней в почках).

Дефицит магния в организме связывают и с феноменом эксайтотоксичности. На рис.6 представлена роль магния в её подавлении [31 ].

Рис. 6. Феномен эксайтотоксичности и роль ионов магния в его предупреждении [31].

2.2.2. Клеточный гомеостаз магния.

После всасывания из кишечника, магний переносится к тканям, где он принимается только в случае его необходимости. Магний поступает в клетки до достижения нормальной концентрации внутриклеточного ионизированного магния [32]. Потери внутриклеточного магния происходят в связи с выпуском связанного магния (АТР недостаточность, ацидоз). Это приводит к увеличению внутриклеточной концентрации свободного магния, которая нормализуется благодаря истечению магния через Na+/Mg2+ антипорт [33]. Внутриклеточная концентрация магния подвергается интенсивному регулированию, так как многие внутриклеточные системы могут находиться под влиянием значительных изменений внутриклеточной концентрации, и никакого целевого эффекта не может быть достигнуто. Это является причиной, почему магний не может работать в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера. Однако он может служить вспомогательным агентом, слегка изменяя направление метаболизма, только с небольшими изменениями внутриклеточной концентрации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Орлов, Алексей Павлович, 2013 год

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Блюменфельд, J1.A. (1974) Проблемы биологической физики, Наука Москва.

[2] Бучаченко, A.JI. (2007) Новая изотопия в химии и биохимии, Наука, Москва

[3] Бучаченко, A.J1. ; Кузнецов, Д.А. (2008) Коэффициент полезного действия АТФ-синтазы как молекулярной машины, Биофизика, 53: 451.

[4] Boyer, P. D., Falcone, A. S., Harrison, W. Н. (1954) Reversal and Mechanism of Oxidative Phosphorilation. Nature, 174: 401.

[5] Berkich, D.A.; Williams, G.D., Masiakos, P.T., Smith, M.B., Boyer, P.D., LaNoue, K.F. (1991) Rates of various reactions catalyzed by ATP synthase as related to the mechanism of ATP synthesis. J. Biol. Chem., 266: 123.

[6] Du, X., Ferguson, K., Sprang, S. (2008) A Method to Determine Kinetic Isotope Effects in the Hydrolysis of Nucleotide Triphosphates. Anal. Biochem., 372: 213.

[7] Du, X., Black, G. E., Lecchi, P., Abramson, F. P., Sprang, S. R. (2004) Kinetic isotope effects in Ras-catalyzed GTP hydrolysis: Evidence for a loose transition state, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 101: 8858.

[8] Buchachenko, A. L.; Kouznetsov, D. A.; Shishkov, A. V. (2004) Spin Biochemistry: magnetic isotope effect in the reaction of creatine kinase with methylmercury chloride. J. Phys. Chem. A, 108: 707.

[9] Ivanov, A. A., Baglioni, T. (2000) In Advances in Archaeological Biomaterials Research. University Press: Turin, Italy.

[10] Kouznetsov, D.A., Arkhangelsky, S.E. Berdieva, A.G., Khasigov, P.Z., Orlova, M.A. (2004) A novel electrophoretic technique designed to modify the ratio of magnesium isotopes inside the active sites. Isot. Environ. Health Stud.,, 40: 221.

[11] Emsley, J. (1991) The Elements. Clarendon Press, Oxford, U.K.

[12] Buchachenko, A. L.; Kouznetsov, D. A.; Breslavskaya, N. N.; Orlova, M. A. (2008) Magnesium isotope effects in enzymatic phosphorylation, J. Phys. Chem. B, 112: 708.

[13] Buchachenko, A. L., Kuznetsov, D. A., Arkhangelsky, S. E., Orlova, M. A., Markaryan, A. A. (2005) Magnetic isotope effect of magnesium in phosphoglycerate kinase posphorylation, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 102: 10793.

[14] Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A., Arkhangelsky, S.E., Orlova, M.A., Markaryan,

A.A. (2005) Dependence of mitochondrial ATP synthesis on the nuclear magnetic

83

moment of magnesium ions. Cell Biochem. Biophys., 43: 243.

[15] Buchachenko, A. L., Kouznetsov, D. A., Arkhangelsky, S. E., Orlova, M. A., Markaryan, A.A. (2005) Spin biochemistry: intramitochondrial phosphorylation is a magnesium nuclear spin controlled process. Mitochondrion, 5: 67.

[16] Buchachenko, A. L., Kouznetsov, D. A., Breslavskaya, N. N., Shchegoleva, L. N., Arkhangelsky S.E. (2011) Calcium induced ATP synthesis: Isotope effect, magnetic parameters and mechanism. Chem. Phys. Lett., 505: 130.

[17] Buchachenko, A. L. (2009) Magnetic Isotope Effect in Chemistry and Biochemistry. Nova Science Publishers: New York, U.S.A.

[18] Vinogradov A.D. (2000) Steady-state and pre-steady-state kinetics of the mitochondrial F(l)F(o) ATPase: is ATP synthase a reversible molecular machine? J. Exp. Biol., 203: 41.

[19] Valiev, M., Kawai, R., Adams, J. A., Weare, J. H. (2003) The Role of the Putative Catalytic Base in the Phosphoryl Transfer Reaction In a Protein Kinase: First Principles Calculations. J. Am. Chem. Soc., 125: 9926.

[20] Valiev, M„ Yang, J., Adams, J. A., Taylor, S. S., Weare, J. H. (2007) Phosphorylation reaction in cAPK protein kinase-free energy quantum mechanical/molecular mechanics simulations. J. Phys. Chem. B, 111: 13455.

[21] Cherepanov, A., DeVries, S. (2002) Kinetic Mechanism of the Mg2+-dependent Nucleotidyl Transfer Catalyzed by T4 DNA and RNA Ligases. J. Biol. Chem., 277: 1695.

[22] Flachner, В., Kovari, Z., Varga, A., Gugolya, Z., Vonderviszt, E, Naray-Szabo, G., Vas., M. (2004) Role of phosphate chain mobility of MgATP in completing the 3-phosphoglycerate kinase catalytic site: Binding, kinetic and crystallographic studies with ATP and MgATP. Biochemistry, 43: 3436.

[23] Sosunov, V., Sosunova, A., Mustaev, A., Bass, I., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBOJ., 22: 2234.

[24] Галкин, M.A., Сыроешкин, А.В. (1999) Кинетический механизм реакции синтеза. АТФ, катализируемый митохондриальной FO-Fl-АТФазой. Биохимия, 64:1393

[25] Герасименко, Н.В.. (2001) Дефицит магния и его коррекция с помощью препарата Магне-Вб у детей с функциональной и органической патологией сердца.

Здравоохранение, №12: 4

Ярош, А.К. (2010) Магний и оротовая кислота - два наиболее важных компонента для регуляции функций нервной системы. Межд. Эндокринол. Ж., 8, 32

Савустьяненко, А.Б.. (2007) Биологическая роль магния в организме. Нов. мед. Фармации, №18 (225), 24

Романов, В.Ю. (2007) Опыт применения препарата Магнерот у пациентов с метаболическим синдромом. Нов. мед. Фармации. №15 (221), 24

Семиголовский, Н.Ю.. (2007) Непрямые антикоагулянты в кардиологии. Трудный пациент, №7, 21

Cernak, I., Savic, V., Kotur, J., Prokic, V., Kuljic, В., Grbovic, D., Veljovic, M.. (2000) Alterations in magnesium and oxidative status during chronic emotional stress. Magnes. Res., №3, 34.

Кудрин, А.В., Громова, O.A.. (2006) Микроэлементы в неврологии. ГЭОТАР-Медиа, Москва

Vormann, J., (2003) Magnesium: nutrion and metabolism. Mol. Aspects Med.,24, 27

Vormann, J., Geunther, Т., (1993) Magnesium transport mechanisms Magnesium and the Cell. Ed. N.J.Birch. Academic Press, London, pp. 137-1565.

Vormann, J., Anke, M., (2002) Dietary magnesium: supply, requirements and recoMMendations - results from duplicate and balance studies in man. J. Clin. Basic Cardiol., 5, 49 .

Parkin, G., (2004) Chemistry. Zinc-zinc bonds a new frontier. Science, 305, 1117

Maret, W., (2010) Metalloproteomics, metalloproteomes, and the annotation of metalloproteins. Metallomics, 2, 117

Rana, S.V.. (2008) Metals and apoptosis: recent developments. J. Trace Elements Med. Biol., 22, 262

Maret, W., (2011) Metals on the move: zinc ions in cellular regulation and in the

85

coordination dynamics of zinc proteins. Biometals, Doi: 10.1007/s 10534-010-9406-1

[39] Zalewski, P.D., Truong-Tran, A.T., Grosser, D., Jayaram, L., Murgia, C., Ruffin, R. (2005) Zinc metabolism in airway epithelium and airway inflaMMation: basic mechanisms and clinical targets. Pharmacol. Therap.,. 105, 127

[40] Hajnal, A. (2002) Fine-time the RAS signalling pathway: Zn2+ makes the difference. Mol. Cell., 2002, 9, 927

[41] Korichneva, I., Hoyos, B., Chua, R., Levi, E., HaMMerling, U., (2002) Zinc release from protein kinase C as the coMMon event during activation by lipid second messenger or reactive oxygen. J. Biol. Chem., 277, 7 .

[42] Wu, W., Wang, X., Zhang, W., Reed, W., Samet, J.M., Whang, Y.E. (2003) Zinc-induced PTEN protein degradation through the proteasome pathway in human airway epithelian cells. J. Biol. Chem., 278, 28258 .

[43] Maret, W., (2009) Coordination dynamics of zinc in proteins. Chem. Rev., 109, 4682

[44] Oteiza, P.I., Mackenzie, G.G. (2005) ), Zinc, oxidant-triggered cell signaling and human health. Mol. Aspects Med., 2005, 26, 245 .

[45] Tapler, R., Perini, G., Green, M.R., (2001) Expressing the human genome. Nature, 409, 832 .

[46] Dumay, A., Rincheval, V., Trotot, P., Mignotte, B., Vayssiere, J.L. (2006) The superoxide dismutase inhibitor diethyldithiocarbamate has antagonistic effects on apoptosis by triggering both cytochrome C release and caspase inhibition. Free Radic. Biol. Med., 40, 1377.

[47] Palmiter, R.D., Cole, T.B., Findley, S.D. (1996) ZnT2, a maiuMalian protein that confers to zinc by facilitating vesicular sequestration. EMBO J., 15, 1784 .

[48] Frederickson, C.J., Koh, J.Y., Bush, A.I. (2005) The neurobiology of zinc in health and disease. Nat. Rev. Neurosci., 6, 449 .

[49] Ward, A.D., Lincoln, S.F., Betts, W.H., Zalewski, P.D., Forbes, I.J., Mahadevan, I. (2000) Zinquin ester - a reagent for the investigation of the role of available Zn II in

living systems. Trace elements in man and animals Ed. M.Roussel, R.A.Anderson, A.E.Favier,.

[50] Frederickson, C.J. (2003) Imaging zinc: old and new tools. Sci. STKE, 182, 18 .

[51] Ho, L.H., Ruffin, R.E., Murgia C„ Li, L„ Krilis, S.A., Zalewski, P.D. (2004) Label zinc and zinc transporter ZnT4 in mast cell granules role in regulation of caspase activation andNF-kB translocation. J. ImMunol., 172, 7750 .

[52] Ding, W.Q., Yu, H.J., Lind, S.E. (2008) Zinc-binding compounds induce cancer cell death via distinct modes of action. Cancer Lett., 271: 251 .

[53] Ding, W.Q., Lind, S.E. (2009) Metal ionophores - an emerging class of anticancer drugs. IUBMB Life, 61: 1013 .

[54] Colvin, R.A., Holmes, W.R., Fontainea, C.P., Maret, W. (2010) Cytosolic zinc buffering and muffling: Their role in intracellular zinc homeostasis. Metallomics, 2: 306

[55] Kim, H.E., Du, F., Fang, M., Wang, X. (2005) Formation of apoptosome is initiated by cytochrome C-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Araf-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 17545.

[56] Riedl, S.J., Salvesen, G.S. (2007) The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat. Rev .Mol. Cell Biol., 8: 405 .

[57] Fadeel, B., Ottosson, A., Pervaiz, S. (2008) ), Big wheel keeps on turning: apoptosome regulation and its role in chemoresistance. Cell Death Differ, 15: 443 .

[58] Chao, B.N., Cheng E., Kerr, D.A., Hardwick, J.M. (2000) Aven, a novel inhibitor of caspase activation binds Bcl-xl and Apaf-1. Mol. Cell, 6: 31

[59] Chipuk, J.E., Green, D.R. (2008) How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permeabilization? Trends Cell Biol., 18: 157 .

[60] Portt, L., Norman, G., Clapp, C., Greenwood, M., Greenwood, M.T. (2011) Anti-apoptosis and cell survival: Areview. Biochim. Biophys. Acta, 1813: 238

[61] Brunelle, J.K., Letai, A. (2009), Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2

family. J. Cell Sci., 122: 437 .

[62] Фильченков, A.A. (2009) Развитие Fas/Fas-лиганд системы в регуляции гомеостаза и функции иммунных клеток. Аллергология и иммунология, 10: 37 .

[63] Fulda, S., Gorman, A.M., Hori, О., Samali, A. (2010) Cellular stress responses: cell survival and cell death. Int. J. Cell Biol., 214 .

[64] Wyllie, A.H. (2010) Where, о death, is thy sting? - a brief review of apoptosis biology. Mol. Neurobiol., 42: 4.

[65] Suda, Т., Nagata, S. (1994) Purification and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis. J. Exp. Med., 179: 873 .

[66] Loh, S.N. (2010) The missing Zinc: p53 misfolding and cancer. Metallomics, 2: 442 .

[67] Slater, J.P., Mildvan, A.S., Loeb, L.A. (1971) Zinc in DNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. СомМип., 44: 37.

[68] Slaby, I., Lind, В., Holmgren, A. (1984) T7 DNA polymerase is not a zinc-metalloenzyme and the polymerase and exonuclease activities are inhibited by zinc ions. Biochem. Biophys. Res. СомМип., 122: 1410.

[69] Sekimoto, Т., Oda, Т., Pozo, F.M., Murakumo, Y., Masutani, C., Hanaoka, F., Yamashita, T. (2010) The Molecular Chaperone Hsp90 Regulates Accumulation of DNA Polymerase h at Replication Stalling Sites in UV-Irradiated. Mol. Cell, 37: 79 .

[70] Bomar, M.G., Souza, S.D, Bienko, M., Dikic, I., Walker, G.C., Zhou, P. (2010) Unconventional Ubiquitin Recognition by the Ubiquitin-Binding Motif within the Y Family DNA Polymerases i and Revl. Mol. Cell, 37: 408.

[71] Masuda, Y„ Piao, J., Kamiya, K. (2010) DNA Replication-Coupled PCNA Mono-Ubiquitination and Polymerase Switching in a Human In Vitro System. J. Mol. Biol., 396:487 .

[72] Chang, K.-L., Hung, T.-C., Hsieh, B.-S., Chen, Y., Chen, T.F., Cheng, H.L. (2006) Zinc at pharmacologic concentrations affects cytokine expression and induced apoptosis of human peripheral blood mononuclear cells. Nutrition, 22: 465.

[73] Schrantz, N., Anffredon, M.T., Bourgeade, M.F., Besnault, L., Leca, G., Vazquez, A. (2001) Zinc mediated-regulation of caspases activity dose dependent inhibition or activation of caspase-3 in the human Burkitt lymphoma B cells Cell Death Differ, 8: 152.

[74] Wood, G.P., Osborne, N.N. (2001) The influence of zinc on caspase-3 and DNA breakdown in cultured human retinal pigment epithelial cells. Arch Ophtamol, 119: 81.

[75] Hamatake, M., Iguchi, K., Hirano, K., Ishida, R. (2000) Zinc induces mixed types of celldeath, necrosis and apoptosis, in molt-4 cells J. Biochem (Tokyo), 128: 933.

[76] Fraker, P.J., Telford, W.G. (1997) A reappraisal of the role of zinc in life and death decisions of cells. Proc Soc Exp Biol Med, 215: 229.

[77] Seve, M., Chimienti, F., Favier, A. (2002) Role du zinc intracellulaire dans la mort cellulaire prograMMee Pathol Biol, 50:212.

[78] Truong-Tran, A.Q., Ruffin, R.E., Zalewski, P.D. (2001) The role of zinc in caspase activation and apoptotic cell death Biometah, 14: 315.

[79] Provinciali, M., Di Stefano, G., Fabric, N. (1995)), Dose-dependent opposite effect of Zn on apoptosis in mouse thymocytes. Int J hviMunopharmacol, 17: 735.

[80] Torriglia, A., Chaudun, E., Courtois, Y., Counis, M.F. (1997) ), On the use of Zn2+ to discriminate endonucleases activated during apoptosis Biochimie , 79: 435.

[81] Henning, B., Meerarani, P., Ramadass. P., Toborek, M., Malecki, A., Slim, R. (1999) Zinc nutrition and apoptosis of vascular endothelial cells implications in atherosclerosis. Nutrition, 10: 744.

[82] Kozlowski, H., Janicka-Klos, A., Brasun, J., Gaggelli, E., Valensin, D., Valensin, G. (2009) Copper, Iron and zinc ions homeostasis and their role in neurodegenerative disorders (metal uptake, transport, distribution and regulation). Coord Chem Rev, 253: 2665.

[83] Takeda, A. (2000) Movement of zinc and its functional significance in the brain Brain Res Brain Res Rev, 34: 137.

[84] Weiss, J.H., Sensi, S.L., Koh, J.Y. (2000) Zn2+ a novel ionic mediator of neuronal injury in brain disease. Trends Pharmacol. Sci., 21: 395.

[85] Frazzini, V., Rockabrand, E., Mocchegiani, E., Sensi, S.L. (2006) Oxidative stress and brain aging: is zinc the link? Biogerontol., 7: 307.

[86] Orlova, M.A., Orlov, A.P. (2011) Role of Zinc in an Organism and Its Influence on Processes Leading to Apoptosis. Br. J. Med. Med. Res., 1: 239.

[87] Frederikson, C.J., Suh, S.W., Silva, D., Thompson, R.B. (2000) Importance of zinc in the central nervous system: the zinc containing neuron. J. Nutr.. 130: 14715.

[88] Takeda, A., Hirate, M., Tamano, H., Oku, N. (2003) Release of glutamate and GABA in the hippocampus under zinc deficiency. J. Neitrosci., 72: 537.

[89] Laube, B. (2002)), Potentiation of inhibitory glycinergic neurotransmission by Zn2+ a synergistic interplay between presynaptic P2X2 and post-synaptic glycine receptors. Eur. J. Neurosci., 16: 1025.

[90] Mocchegiani, E., Bertoni-Freddari, C., Marcellini, F., Malavolta, M. (2005) Brain, aging and neurodegeneration. Role of zinc ion availability. Prog. Neurobiol., 75: 367.

[91] Осипова, E.B. (2005) Роль химических элементов в функции центральной нервной системы. Бюлл. Вост.-Сиб. НЦ СО РАМН, 1: 79.

[92] Spahl, D.U., Berendji-Green, D., Suschek, C.V., Kolb-Bachofen, V., Kroncke, K.D. (2003) Regulation of zinc homeostasis by inducible NO-synthase derived NO nuclear metallothionein translocation and intranuclear Zn2+ release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:13952.

[93] Lyubartseva, G., Smith, J.L., Markesbery, W.R., Lovell, M.A. (2009) Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathol., 20: 343.

[94] Adlard, P.A., Parncutt, J.M., Finkelstein, D.I., Bush, A.I. (2010) Cognitive loss in zinc transporter-3 knock-out mice: a phenocopy for the synaptic and memory deficits of Alzheimer's disease? J. Neurosci., 30: 1631.

[95] Skvortsova, V.I., Limborska, S.A., Slominski, P.A., Levitskaya, N.I., Levitsky, G.N., Shadrina, M.I. (2001) Sporadic amyotrophic sclerosis assosiated with the D90A Cu/Znsuperoxide dismutase mutations in Russia. Eur. J. Neurol., 8: 167.

[96] Barbosa, L.F., Cerqueira, F.M., Macedo, A.F., M.Garcia, C.C., Angeli, J.P.F., Schumacher, R.I., Sogayar, M.C., Augusto, O., Carri, M.T., Mascio, P., Medeiros, M.H.G. (2010) Increased SOD1 association with chromatin, DNA damage, p53 activation, and apoptosis in a cellular model of SODl-linked ALS. Biochim. Biophys. Acta, 1802: 462.

[97] Mulligan, V.K., Kerman, A., Ho, S., Chakrabartty, A. (2008) Zinc-Deficient Monomers of Cu/Zn-superoxide dismutase: Implications for Pathogenesis in amyotrophic lateral sclerosis. J. Mol. Biol, 383: 424.

[98] Minami, Т., Miyata, E., Sakamoto, Y., Kohama, A., Yamazaki, H., Ishida, S. (2009) Expression of metallothionein mRNAs on mouse cerebellum microglia cells by merosal and its metabolites. Toxicol., 261: 25.

[99] Krezel, A., Maret, W. (2007) Different redox states of metallothionein/thionein in biological tissue. Biochem. J., 402: 551.

[100] Laity, J.H., Lee, B.M., Wright, P.E. (2001) Zinc finger proteins new insights into structural and functional oliversity. Curr. Opin. Struct. Biol., 11: 39.

[101] Zalzman, M., Falco, G., Sharova, L.V., Nishiyama, A., Thomas, M., Lee, S.-L., Stagg, C.A., Hoang, H.G., Yang, H.-T., Indig, F.E., Wersto, R.P., Ко, M.S.H. (2010) Zscan4 regulates telomere elongation and genomic stability in ES cells. Nature, 464: 858.

[102] Franklin, R.B., Mai, J., Zou, J., Guan, Z., Kukoyi, B.J., Feng, P. (2003) Human ZIP1 is a major zinc uptake transporter for the accumulation of zinc in prostate cells. J. Inorg. Biochem., 96: 435 .

[103] Иванова, O.M. (2008) Значение альфа-макроглобулина для патогенеза заболеваний коронарной артерии. Вести, нов. мед. Технол., 15: 109.

[104] Santon, A., Formigari, A., Albergoni, V., Irato, P. (2006) Effect of Zn treatment on wild type and MT-null cell lines in relation to apoptotic and/or necrotic processes and MT isoform gene expression. Biochem. Biophys. Acta, 1763: 305.

[105] Malsh, N.H. (2005) Biomedical Nanotechnology. CRS Press/Taylor & Francis Group: Boca Raton, FL-London.

[106] Mamouth, G.K., Lekhan, B.D., Volobrinsky, R.S. (2003) A perfectionized graph design for biomed lab use. Algorithmic manual. Science Tools, 19: 447-456.

[107] Setton, R., Bernier, P., Lefrant, S. (2002) Carbon Molecules and Materials. CRS Press/ Taylor & Francis Group: Boca Raton, FL-London.

[108] Vylkov, S., Rochev, S., Lambreva, T., Milochev, G., Georgiev, A. (2006) Gold nanoparticles are to prevent the macroergic metabolism damage promoted by cocaine in the M. rhesus olphactory nerve cells. Folia Biologica et Medica, 7: 609-617.

[109] Oberdorster, G., Oberdorster, E., Oberdorster, J. (2005) Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies on ultrafine particles. Environmental Health Perspectives, 113: 823-839.

[110] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Orlova, M.A., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2008) Porphyrin-fullerenes. A novel trend in medicinal chemistry and nanopharmacology. Abstracts, J63, 3~ North Europe's Meeting on Nanotechnology in Medicine, Copenhagen, Denmark.

[111] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Rezayat, S.M., Sarkar, S., Orlova, M.A., Orlov, A.P., Poloznikov, A.A., Kuznetsov, D.A. (2008) The fullerene-interfaced porphyrin ligand in affinity chromatography of membrane proteins. Chromatographia, 68: 708-712.

[112] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Rezayat, S.M., Sarkar, S., Orlova, M.A., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2007) PMC 16 nanoparticles to treat and prevent the chemical-induced ATP depletion in myocardium. Abstracts, B48, 9~ Central Asia Congress on Biochemistry and Molecular Biology, Shiraz, Iran.

[113] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Sarkar, S., Rezayat, S.M., Orlova, M.A., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2006) Porphylleren-MC16: a new family of the fullerene-based medicinal nanoparticles for the heart local hypoxia cases. Abstracts, R17-R18, 2— Pan-Asian Meeting on Nanobiotechnology, Al-Ain, U.A.E.

[114] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Sarkar, S., Rezayat, S.M., Orlova, M.A.,

Trushkov, I.V., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2008) Magnesium-carrying

92

porphyrinated fullerenes. Using the 25Mg2+ effect for the treatment of hypoxia-induced mitochondrial dysfunction in rat myocardium. Archives of Medical Research, 39: 549556.

[115] Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Sarkar, S., Rezayat, S.M., Orlova, M.A., Trushkov, I.V., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2008) New porphyrin adduct of fullerene-Сбо: a promising nano-tool for medicinal use in the heart muscle hypoxia cases. International Journal ofNanoScience, 8: 947-956.

[116] Kuznetsov, D.A., Buchachenko, A.L., Alyautdin, R.N., Amirshahi, N., Orlova, M.A. (2006) Magnesium-25 related overactivation of the ATP synthesis in 1-methylnicotinamide affected myocardiocytes. The cation nanocarrier application. Abstracts, SI09, 31- Congress of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS-2006), Budapest, Hungary.

[117] Rezayat, S.M., Boushehri, S.V.S., Samanian, В., Omidvari, A.O., Tarighat, S., Esmaeli, S., Sarkar, S., Amirshahi, N., Alyautdin, R.N., Orlova, M.A., Trushkov, I.V., Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2008) The porphyrin-fullerene nanoparticles to

9 S 9+

promote the ATP overproduction in myocardium. Mg -Magnetic isotope effect. European Journal of Medicinal Chemistry, 36: 833-844.

[118] Амиршахи, H., Аляутдин, PH., Орлов, А.П., Полозников, A.A., Кузнецов, Д.А. (2008) Фуллерен-Сбо в основе лиганда стационарной фазы для аффинной хроматографии мембранных порфирин-связывающих белков. Журнал физической химии, 82: 1-7.

[119] Амиршахи, Н., Аляутдин, Р.Н., Саркар, С., Резаят, С.М., Орлова, М.А., Трушков, И.П., Бучаченко, А.Д., Кузнецов, Д.А. (2008) Порфирин-фуллереновые наночастицы для лечения гипоксических нарушений метаболизма в миокарде. Российские нанотехнологии, 3: 967-975.

[120] Begg, E.J. (2004) Instant Clinical Pharmacology. Blackwell Publ.: Oxford.

[121] Лущенко, B.K. (2004) Молекулярная патофизиология. Наука/Интерпериодика: Москва.

[122] Spandidos, А., Wang, X., Wang, Н., Seed, В. (2010) PrimerBank: a resource of human

and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucl. Acids Res., 38: 792.

[123] Olins, A.L., Hermann, H., Lichter, P. (2000) Retinoic acid differentiation of HL-60 cells promotes cytoskeleton polarization. Exp. Cell Res. 254: 130.

[124] Roy, M.R., Thalang, V.N., Trakoontivakom, G. (2004) Mechanism of mahanine -induced apoptosis in human leukemia cells (HL-60). Biomed. Pharmacol., 67: 41.

[125] Griffin, J. P., Linch, D., Sabbath, K., Larcom, P., Schlossman, S.F. (1984) A monoclonal antibody reactive with normal and leukemic myeloid progenitor cells. Leukemia Res., 8: 521.

[126] Voss, D.O., Plaut, G.W.E., Hagihara, H. (1967) Fractionation of chromatin compounds isolated from the MaMMalian neoplastic cell nuclei. Meth. Enzymol., 10: 326.

[127] Lerman, M.I., Abakumova, E.V., Podobed, O.V. Isolation and properties of the DNP-and RNP-particles from the Ehrlich ascite carcinoma cells. (1976) Advanced Methods in Biochemistry, 1: 74 - 89.

[128] Matsumoto, Y., Kim, K. (1995) The nuclear DNA polymerases beta: activity shifts and the DNA gaps beta - elimination control. Science, 269: 699.

[129] Piersen, C.E., Prasad, R., Wilson, S.H. (1996) On the 5',3'-deoxynucleotidyl transferase catalytic activity expressed by the nuclear DNA polymerase beta in MaMMalian cells. J. Biol. Chem., 271: 1781.

[130] Bradford, M.M. (1976) An improved colorimetric technique for protein measurement. Analyt. Biochem. 72: 348.

[131] LaeMMli, U.L. (1970) An efficient polyacrylamide gel electrophoresis system for proteins separation. Nature, 227: 690.

[132] Reichman, M.E., Rice, S.A., Thomask, C.A. (1957) Further examination of the molecular weight and size of deoxyribonucleic acid. J. Amer. Chem. Soc., 76: 3047.

[133] Walker, J.M. (1994) Isoelectric focusing of proteins in polyacrylamide gels. Methods in Molecular Biology B. 32: 59 - 65.

[134] Katoh, R. (2011) Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Springer. Berlin - Dortrecht - Heidelberg.

[135] Gorg, A., Postel, W., Westermeyer, R. (1978) Ultrathin-layer isoelectric focusing in polyacrylamide gels on cellophane. Analyt. Biochem., 89: 60.

[136] Rule, G.S. (1984) Quantitative assay of deoxyribonuclease activity after isoelectric focusing in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem., 138: 99.

[137] Sakaguchi, K., Boyd, J.B. (1985) Techniques for purification and characterization of DNA polymerase beta. J. Biol. Chem., 260: 10406.

[138] Mikami, T., Satoh, N., Hatayama, I. (2004) The inhibition effect of buthionine sulfoximine on cytopathic effect and apoptosis induced by human echovirus 9. Arch. Virol., 149: 1117.

[139] Haratian, K., Shahrabadi, M.S., Sardari, S. (2007) Buthionine sulfoximine inhibits cytopathic effects and apoptosis induced by infection with AIK-HDC strain of measles virus. Iran. Biomed. J., 11: 229.

[140] Fukami, T., Uchiyama, K., Yoshimura, Y. (1996) Ultramicroanalysis by use of light-scanning photoacoustic densitometry of electrophoresed protein in human hair. Analyt. Biochem., 238: 60.

[141] Muller, W.E., Obermeyer, J., Totsuka, A. fl974) Influence of template inactivators on the binding of DNA polymerases to DNA. Nucl. Acids Res., 1: 63.

[142] Burlakova, E.V., Varfolomeyev, S.D. (2005) Enzymatic catalysis: kinetics, catalytic site structures, bioinformatics. Chemical and Biological Kinetics. 2: 175.

[143] Kuznetsov, D.A., Govorkov, A.V., Zavijalov, N.V. (1986) Estimation of the nucleotide contents and ratios in a cell-free translation system. J. Biochem. Biophys. Methods, 13: 53.

[144] Kuznetsov, D.A., Buchachenko, A.L., Orlova, M.A., Resayat, S.M., Sarkar, S., Yurovskaya, M.A., Trushkov, I.V. (2007) Use of magnesium isotope for treating and a medicament comprising the same. Eur. Patent EP., 199, 26-27A1.

[145] Veerman, A.J.P., Pieters, R. (1990). Drug sensitivity assays in leukemia and kymphoma. Br. J. Hematol., 74: 381.

[146] Kaspers, G.J.L., Pieters, R., Twentyman, P.R., Weisenthal, M. (1993). Drug resistance in leukemia and lymphoma I, Harwood Acad. Publ.,\: 329.

[147] Rezayat, S.M., Boushehri, S.V.S., Salmanian, B., Omidvari, A.H., Tarighat, S. (2009) The porphyrin-fullerene nanoparticles to promote the ATP overproduction in myocardium: 25Mg2+ magnetic isotope effect. Eur. J. Med. Chem., 44: 1554.

[148] Kuznetsov, D.A., Buchachenko, A.L., Arkhangelsky, S.E. (2010) Magnetic isotope effects in the metalloenzymes function control. Proceedings of the 4th SCO Congress on Applied Biochemistry and Biophysics (ABB'10), Ekatherinbourg, Ural Science Press, 202.

[149] Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A., Breslavskaya, N.N. (2010) Ion-radical mechanism of enzymatic ATP synthesis: DFT calculations and experimental control. J. Phys. Chem. B., 114: 2287.

[150] Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A. (2008) Magnetic field affects enzymatic ATP synthesis. J. Am. Chem. Soc., 130: 12868.

[151] Wu, F. Y.-H., Wu, C.-W. (1987) Zinc in DNA replication and transcription. Ann. Rev. Nutr., 7: 251.

[152] Yang, L., Arora, K., Beard, W. A., Wilson, S. H., Schlick, T. (2004) Critical Role of Magnesium Ions in DNA Polymerase Beta's Closing and Active Site Assembly. J. Amer. Chem. Soc. 126: 8441.

[153] Bojin, M.D., Schlick, T. (2007) A quantum mechanical investigation of possible mechanisms for the nucleotidyl transfer reaction catalyzed by DNA polymerase beta. J. Phys. Chem. B, 111: 11244.

[154] Buchachenko, A.L., Kuznetsov, D.A, Breslavskaya, N.N. (2011) Chemistry of enzymatic ATP synthesis: an insight through the isotope window. Chem. Rev., 9: 16.

[155] Dianov, G.L., Parsons, J.L. (2007) Coordination of DNA single strand break repair. DNA Repair, 6: 457.

[156] Parsons, J.L., Dianova, 1.1., Khoronenkova, S.V. (2011) USP47 is a deubiquitylating enzyme that regulates base excision repair by controlling steady-state levels of DNA polymerase beta. Mol. Cell 41: 609.

[157] Grieseking, S., Bergen, K., Di Pasquale, F. (2011) Human DNA polymerase beta mutations allows efficient abasic site bypass. J. Biol. Chem., 286: 4011.

158] Kidane, D., Jonason, A.S., Gorton, T.S. (2010) DNA polymerase beta is critical for mouse meiotic synapsis. EMBOJ., 29: 410.

159] Aves, S.J., Liu, Y., Richards, T.A. (2012 ) Evolutionary diversification of eukaryotic DNA replication machinery. Subcellular Biochemistry Series 62: 19.

160] Falcieri, E., Cataldi, A., Di Baldassarre, A. (1996) Morphological patterns and DNA polymerase regulation in apoptotic HL-60 cells. Cell Struct. Fund., 21:213.

161] Bergoglio, V., Pillare, M.J., Lacroix-Triki, M. (2002) Deregulated DNA polymerase beta induced chromosome instability in tumorogenesis. Cancer Res., 62: 3511.

162] Albertella, S., Lau, A., O'Connor, M.J. (2005) The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer. DNA Repair, 4:583.

163] Lang, T., Dalai, S., Chikova, A. (2007) The E29K DNA polymerase beta gastric cancer - associated variant interferes with base excision repair and induces cellular transformation. Mol. Cell Biol., 27: 5587.

164] Dalai, S., Chikova, A., Jaeger, J. (2008) The Leu22PRO tumor - associated of DNA polymerase beta is DRP lyase deficient. Nucl. Acids Res. 36:411.

165] Yang, J., Parsons, J., Nikolay, N.H. (2010) Cells deficient in the base excision repair protein, DNA polymerase beta. Oncogene, 29: 463.

166] Ljungmann, M. (2010) The DNA damage response - repair or despair? Environ. Mol. Mutat., 51: 879.

167] Kodvanj, L., Aranyi, J., Fesus, N. (2004) Chromatin associated DNA polymerases and their inhibitors. Protocols in MaMMalian Genome Research, 2: 449.

168] Mizushina, Y. (2009) Specific inhibitors of MaMMalian DNA polymerases. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73: 1239.

169] Ljungmann, M. (2009) Targeting in the DNA damage response in cancer. Chem. Rev., 109:2929.

170] Martin, S., McCabe, N., Mullarkey, M. (2010) DNA polymerases as potential therapeutic targets in cancers. Cancer Cell, 17: 235.

171] Sanjeev, B., Aneja, R., Sarkar, F.N. (2011) DNA polymerase beta as a novel target for chemotherapeutic intervention of colorectal cancer. PLoS ONE, 6: 16691.

172] Rechkunova, N.I., Lavrik, O.J. (2010) Nucleotide excision repair in higher eucaryotes. Subcell. Biochem., 50: 251.

173] Roettger, M.P., Bakhtina, M., Kumar, S. (2010) Catalytic mechanism of DNA polymerases. Comprehensive Natural Products. 2: 349.

174] Sobol, R.W., Horton, J.K., Kohn, R. (1996) Requirement of maMMalian DNA polymerase beta in base - excision repair. Nature, 379: 183.

[175] Podulitsky, A.J., Dianova, I.T., Podust, V.N. (2001) Human DNA polymerase beta inhibits DNA synthesis during long-patch repair of reduced AP sites in DNA. EMBOJ., 20: 1477.

[176] De Recondo, A.M., Frayssient, C. (1975) High molecular weight DNA polymerase of LF hepatoma. Purification and properties. Biochim. Biophys. Acta, 407: 133.

[177] Btard, W.A., Willson, S.H. (2006) Structure and mechanism of DNA polymerase beta. Chem. Rev., 106: 361.

[178] Finkelstein, A.V., Ptitsyn, O.V. (2005) Physics of Proteins. University Publishing House (UPB), Moscow.

[179] Kornberg A., Baker, T.A. ( 2005) DNA Replication. 2nd Edition. Nucleic Acids Research Science Books Publ., New York.

[180] Nunthawarasilp, P., Petmitr, S., Chavalitshewinkoon - Petmitr, P. (2007) Partial purification and characterization of DNA polymerase beta - like enzyme from Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol., 154: 141.

[181] Sungchul, J. (2012) Molecular Theory of a Living Cell. Springer, New York -Dordrecht - Berlin.

[182] Dolgikh, D.A., Abaturov, L.V., Bolotina, I.A. (1985) Compact state of a protein molecule with pronounced small - scale mobility. Biophys. J., 13: 109.

[183] Dolgikh, D.A., Lebedev, Y.O., Tiktopulo, E.I. (2000) Spectroscopy methods in protein structure studies. Advanced Techniques in Molecular Biology and Biophysics 1: 101.

[184] Carr, A.C., Moor, S.D. (20120 Robust quantification of polymerase chain reaction using global fitting. PLoS One 7(5): 376402012.

[185] Alberts, I., Wang, Y., Schlick, Т. (2007) DNA polymerase ß catalysis: are different mechanisms possible? J. Am. Chem. Soc., 129: 11100.

[186] Steitz, T.A., Steitz, J.A. (1993) A general two-metal-ion mechanism for catalytic RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90: 6498.

[187] Steitz, T.A. (1999) DNA polymerases: structural diversity and сомМоп mechanisms. J. Biol. Chem., 274: 17395.

[188] Осипова, Е.Ю., Астрелина, Т.А., Румянцев, С.A. (2003) Прогностическое значение уровня спонтанного апоптоза лимфобластов при оценке ответа на индукционную терапию ОЛЛ у детей. Гематология и трансфузиология, 3:16.

[189] Buchachenko, A. L., Chekhonin, V. P., Orlov, А. P., Kuznetsov, D. А. (2010) Zinc-Related Magnetic Isotope Effect in the Enzymatic ATP Synthesis: A Medicinal Potential of the Nuclear Spin Selectivity Phenomena. Intern. J. Mol. Med. Adv. Sei., 6 (3): 34.

[190] Орлов, А. П., Кузнецов, Д. А., Чехонин, В. П., Бучаченко, A. JI. (2011) Изотопные эффекты двухвалентных металлов в регуляции активности ферментов транспорта фосфата. Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине (ред. Кудинова А. П. и Крылова Б. В.), 3: 92.

[191] Buchachenko, A.L., Breslavskaya, N.N., Chekhonin, V.P., Arkhangelsky, S.E., Orlov, A.P., Kuznetsov, D. A.(2011) Phosphate transfer enzymes as the nuclear spin selective nanoreactors. Intern. Res. J Pure Appl. Chem., 1:1.

[192] Orlov, A. P., Kuznetsov, D. A., Chekhonin, V. P., Buchachenko, A. L. (2011) Nuclear spin selective biochemistry: magnetic isotope effect of Zinc-67 in the ATP synthesis.

Proceedings of the International Conference on Chemistry and Biology of Isotope Effects (ISOTOPES-2011), 7: 27.

[193] Орлов, А. П., Кузнецов, Д. А.Л Чехонин, В. П., Берсенев, И. С., Немер-Гергели, Л.Дж., Удварди, Ш. (2011) Бета - подобная ДНК-полимераза клеток HL-60. Онкогематология, 2: 47.

[194] Kuznetsov, D. A., Orlov, А. P., Chekhonin, V. P., Udvardi, S., Niemer-Gergeli, L. J. (2011) An unusual member of the DNA polymerase beta family expressed in HL60

cells. Abstracts of the 3n^ International Symposium on Metallomics, R98, Munster University Press, Munster.

[195] Kuznetsov, D. A., Orlov, A. P., Chekhonin, V. P., Udvardi, S. (2011) Chromatin associated beta-like DNA polymerase from human acute lymphoblast leukemia cells. Abstracts of the Annual EMBO Meeting, SI 16, Schoenbaum & Klughe Verlag GmbH, Vienna.

[196] Orlov, A.P. (2011) Magnetic isotopy effect in the enzymatic synthesis of ATP. Abstracts

of the International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Russian National Research Medical University, Moscow

[197] Bukhvostov, A.A., Orlov, A.P. (2012) A unique beta-like DNA polymerase from the

human lymphoblast leucosis cells. Abstracts of the 7^ International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Russian National Research Medical University, Moscow

[198] Kuznetsov, D.A., Shatalov, O.A., Orlov, A.P., Bukhvostov, A.A. (2012) An atypical beta-like DNA polymerase in AML cells. A new target for cytostatic attack. OMICS Group Congress on Cancer Science (CANCER SCIENCE - 2012), San Antonio, USA

[199] Бухвостов, А. А., Шаталов, О. А., Орлов, А. П., Кузнецов, Д. А. (2013) Об уникальности ДНК-полимеразы бета клеток острого миелоидного лейкоза человека как возможной мишени для действия спин-селективных ингибиторов-цитостатиков. Онкогематология, №1: 28.

[200] Bukhvostov, A.A., Shatalov, О.A., Orlov, А.Р., Kuznetsov, D.A. (2013) An atypical DNA polymerase beta overexpressed in human AML/HL-60 malignant cells. Journal of Cancer Science & Therapy, 5(2): 94 - 99

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям академику РАМН, д.м.н., проф. В. П. Чехонину (РНИМУ им. Н.И. Пирогова) и д.б.н., проф. Д. А. Кузнецову (РНИМУ им. Н.И. Пирогова, ИХФ им. Н. Н. Семёнова РАН) за предоставление темы и руководство работой.

Особую признательность автор выражает академику РАН А. Л. Бучаченко (ИХФ РАН) за интерес к работе, ценные критические замечания и участие в обсуждении данных.

Кроме того, за неоценимую помощь в работе по математическому моделированию автор выражает благодарность к.х.н. H.H. Бреславской (ИХФ РАН).

За помощь в организации и проведении высокотехнологичных экспериментов автор благодарен д.м.н., профессору С.А. Румянцеву, а также к.м.н. К.А. Павлову, д-ру В.П. Удварди и к.б.н. Берсеневу.