Липиды мицелиальных грибов\nкак основа для создания биодизельного топлива тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Ивашечкин Алексей Александрович

• Ивашечкин Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Ивашечкин Алексей Александрович

1.1. Актуальность темы

1.2. Степень разработанности проблемы

1.3. Цели и задачи исследования

1.4. Научная новизна

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6. Место проведения работы

1.7. Объем и структура диссертации

1.8. Апробация работы

1.9. Благодарности

1.10. Список публикаций по теме исследования

1.11. Положения, выносимые на защиту

1.12. Обзор литературы

2. Экспериментальная часть

2.1. Объект и методы исследования

2.2. Результаты

Глава

Скрининг олеагенных штаммов грибов и выбор наиболее активного продуцента липидов

Определение состава и содержания жирных кислот липидов у представителей р. Cunninghamella.

I) Изучение состава липидов гомо- и гетероталличных штаммов C.

japónica

Глава

Основные характеристики биодизеля на основе липидов C. japónica.... Глава

Оптимизация среды выращивания с целью удешевления конечного продукта:

I) Замена источника азота

II) Замена источника углерода

III) Использование побочных продуктов производств

IV) Подходы к использованию лигнина

Глава

Оптимизация получения спорового посевного материала

Глава

Улучшение экологии производственного процесса

в) Обсуждение

г) Выводы

3. Заключение

4. Список цитируемой литературы

5. Приложения

6. Список сокращений и условных обозначений

1. Введение

Данная диссертационная работа посвящена проблеме замены ископаемых исчерпаемых источников энергии на возобновляемое биотопливо.

Различают три главных вида биотоплив:

• Твердые (дрова и топливные гранулы)

• Жидкие (биометанол, биоэтанол, биобутанол, диметиловый эфир,

биодизельное топливо)

• Газообразные (биогаз, биоводород, метан)

В данной работе непосредственное внимание будет уделено биодизельному топливу второго и третьего поколения, как топливу наиболее подходящему как по физико-химическим особенностям, так и позволяющему попутно решать проблемы утилизации отходов производств или получения побочных продуктов.

Биодизельное топливо (биодизель) представляет собой смесь моноалкиловых (чаще всего метиловых или этиловых) эфиров жирных кислот, полученных при трансэтерификации возобновляемых биологических ресурсов. (Кга,^7ук, 1996).

Традиционно источниками для получения биодизеля служат масличные культуры и животные жиры, так называемые биотоплива первого поколения. Однако использование этих источников сырья приводит к истощению почв, повышении цен на продукты питания, поэтому в последние 10-15 лет все больше внимания стали уделять таким продуцентам, как микроорганизмы: водоросли, геноинженерные штаммы Е.еоН, дрожжи (АЛош е1 а1., 2007; е1 а1., 2008), мицелиальные грибы. По сравнению с другими возможными продуцентами биодизельного топлива мицелиальные грибы имеют ряд преимуществ:

1. Липиды грибов почти не отличаются по составу основных жирных кислот от липидов высших растений, которые на сегодняшний день являются главными продуцентами биодизеля.

2. Мицелиальные грибы обладают одной из наибольших скоростей накопления биомассы, что возможно благодаря наличию апикального роста.

3. Процесс культивирования грибов лучше отработан с биотехнологической точки зрения, нежели выращивание водорослей, особенно, в высоких широтах, и способен к большему масштабированию, чем выращивание растений.

4. Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и величины посевных площадей.

5. Возможно круглогодичное получение продукта.

6. Имеется возможность варьирования ацильных цепей липидов при помощи изменения параметров среды и других факторов.

Поэтому в качестве продуцента биодизеля в настоящей работе используется высокоолеагенный представитель царства Fungi.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Липиды мицелиальных грибов\nкак основа для создания биодизельного топлива»

1.1. Актуальность темы

Связь с экологией и парниковым эффектом, нет собственных биотехнологий.

Более ста лет назад общество добровольно поставило себя в нефтяную зависимость, и с каждым годом все большее обсуждение вызывает теория "пика нефти", предложенная в 1956 году американским геофизиком Кингом Хаббертом (1), согласно которой предсказывалось, что добыча нефти в материковой части США достигнет пика между 1965 и 1970; и что мировая добыча достигнет пика в 2000 г. Добыча нефти в США достигла максимума в 1971 (2). И хотя модель Хабберта не предсказала наступление пика мировой нефтедобычи, возможно из-за нефтяных эмбарго ОПЕК 1973 и 1979 годов, специалисты International Energy Agency (IEA) прогнозируют наступление нефтяного пика к 2030 году (3).

По оценкам разных экспертов объемы разведанных запасов нефти оцениваются величиной от 1,2 трлн. баррелей1 до 4,5 трлн. баррелей углеводородного сырья. Данные различия объясняются тем что, во-первых, сведения такого рода относятся к государственной тайне, а во-вторых - слишком разные мнения существуют у ученых. Так, по оценке американского геологоразведочного агентства USGS, запасы нефти в мире достигают 3 трлн. баррелей. Сюда входят как уже используемые ресурсы, так и остающиеся на будущее, как уже разведанные, так и неразведанные запасы. USGS помещает эти 3 трлн. баррелей в "вилку" между 2,5 и 3,9 трлн. баррелей (4). Для сравнения: со времени начала эксплуатации нефтяных ресурсов человечество уже добыло и потребило в общей сложности около 0,9 трлн. баррелей.

Многочисленные аналитики, учитывая данные по разведанным и предполагаемым запасам нефти, а также данные по росту потребления энергии, сходятся во мнении, что нынешних запасов нефти хватит на срок от 30 до 60 лет. Причем в отдельных странах соотношение "запасы/добыча" может сильно

отличаться, так, например, "резервная жизнь" Венесуэлы составляет больше 200 лет, для Ирака - 100-120 лет, для США - 10 - 15 лет (5).

Истощение запасов горючих ископаемых вынуждает искать пути использования возобновляемых источников энергии, таких как солнечная энергия, энергия ветра, волн, приливно-отливных течений, процессов термоядерного синтеза, а также использование биологического сырья.

Широкое распространение в Европе получил биодизель - смесь моноалкиловых эфиров жирных кислот - полученный из рапсового масла. Но стоимость такого биотоплива сейчас в 2 раза выше, чем минерального дизельного топлива.

Поэтому особую актуальность приобретает проблема поиска подходящего олеагенного продуцента и создание экономически конкурентоспособной биотехнологии получения биодизельного топлива. В последнее время создание такой биотехнологии все теснее связывают с проблемой биоконверсии лигнина, в т.ч. и мицелиальными грибами.

В настоящее время все больше внимания уделяется и экологическому аспекту использования биотоплива. С точки зрения баланса углерода биотопливо является углерод-нейтральным, т.е. в результате его сгорания в атмосферу возвращается столько углерода, сколько было потрачено на образование биомассы, переработанной в топливо (Mathews, 2008).

Таким образом, разработка проблемы получения биотоплива, в частности, дизельного, является актуальной проблемой современной биотехнологии.

1.2. Степень разработанности проблемы.

История использования биодизельного топлива.

Биотопливо известно человечеству со времен открытия огня. Дерево было первым типом биотоплива, которое стал использовать человек для приготовления пищи и обогрева. Этот тип топлива использовался задолго до открытия ископаемых видов топлива. Оливковое масло и животный жир использовали в светильниках задолго до н.э. по всему Средиземноморью. (Sussman, 1983).

В ХХ веке впервые в сознании людей появилась мысль о том, что мировые запасы нефти и газа могут быть исчерпаны, и следует заранее искать возобновляемые источники энергии. В начале XXI века эта мысль стала уже реальной проблемой, и развитие работ в этом направлении стали также значительно стимулировать наблюдения о том, что интенсивное использование нефти и газа являются факторами, приводящими к резкому потеплению (« парниковый эффект») и загрязнению окружающей среды, что может стать причиной мировой катастрофы. Таким образом, возникла проблема поиска иных, альтернативных традиционным, источников энергии и топлива, которые были бы регенерируемыми и экологически безопасными.

Первую попытку использования масел, полученных из растительных источников, предпринял изобретатель двигателя, впоследствии названного его именем, Рудольф Дизель. В 1890 г. он развил теорию «экономичного термического двигателя», который, благодаря сильному сжатию в цилиндрах, значительно улучшает свою эффективность. Дизельный двигатель был разработан как замена неэффективному (КПД~10-12%), громоздкому, а иногда и опасному паровому двигателю. С самого начала проектирования двигателя была возможность использования различных источников энергии, от керосина до угольной пыли.

Ранние эксперименты, проводимые Дизелем по заказу французского правительства, были направлены на выяснение возможности использования чистых растительных масел в качестве топлива, что было важно в отдаленных африканских колониях, где ископаемое топливо не всегда было доступно все время. Опытный образец двигателя, который демонстрировался на Международной выставке 1900 г. в Париже и получивший Гран-при, работал на арахисовом масле (Shay, 1993).

Рудольф Дизель считал, что превращение биомассы в топливо для его двигателя станет реальной перспективой. В 1911 г. он сказал "Дизельный двигатель может использовать растительные масла и значительно помогать развитию сельского хозяйства в тех странах, где он используется", а в 1912 г. в своей речи в Технологическом Институте Великобритании отметил: "Использование растительных масел в качестве топлива для машин может казаться сегодня несущественным, но такие масла, со временем, могут стать столь же важны, как продукты угля и нефти сегодня" (Knothe, 2001).

В Америке же в период с 1890х до 1920х годов работами по созданию дизельных двигателей и продвижению топлива, полученного из биологического сырья, занимались Адольф Буш и Клесси Камминс.

Но вследствие открытия месторождений нефти в Техасе и Пенсильвании и быстрого развития нефтедобывающей промышленности во всем мире, цены на ископаемое топливо упали, и идея использования растительных масел в качестве источника энергии на какое-то время потеряла свою актуальность.

Биодизельное топливо в современном понимании данного термина появилось в 1930х годах в Бельгии. Тогда возник интерес в разделении растительных масел на жирные кислоты и глицерин, который использовался, в частности, для получения взрывчатых веществ. В 1937 г. Шаванн получил бельгийский патент на способ получения этиловых эфиров пальмового масла и предложил использовать их в качестве замены дизельному топливу (Chavanne, 1937). А уже в 1938 г. первый автобус на биодизеле, полученном

из пальмового масла, совершил маршрут из Брюсселя в Лёвен (Chavanne, 1942).

К развитию этой темы вернулись в некоторых странах, в частности, Аргентине, Бразилии, Индии, Китае и Японии, во время второй мировой войны, когда поставки топлива резко сократились, и возникла необходимость замены ископаемому топливу (Ma, Hanna, 1999). Например, в Бразилии во время войны был запрещен экспорт хлопкового масла, которое могло быть использовано в качестве замены дизельному топливу (Anonymous, 1943). В Китае масло из тунга (Aleurites) и других видов растений использовалось для получения заменителей газолина и керосина (Cheng, 1945.; Chang, Wan, 1947). В Индии проводились исследования по получению дизельного топлива из различных растительных масел (Chowhury et al., 1942). Однако с окончанием войны и возобновлением поставок данная идея была забыта.

В 1973-1979 годах разразился нефтяной кризис и Организация стран-экспортеров нефти (Organization of the Petroleum-Exporting Countries; OPEC) наложила эмбарго на поставки нефти в страны не входящие в OPEC. Также на добычу нефти негативно повлияла Иранская революция 1978-1979 годов.

В 1978 году при поддержке Организации экономического сотрудничества и развития (Organization for Economic Co-operation and Development; OECD) было основано Международное энергетическое агентство по биоэнергии (International Energy Agency (IEA) Bioenergy), главной целью которого являлось развитие сотрудничества и информационного обмена между странами по вопросам разработки, развития и внедрения биоэнергетических исследований. В 2007 г. при ООН был основан Международный форум по биотопливу в который вошли Бразилия, Китай, Индия, Южная Африка, США и Европейский Союз (Press Conference Launching International Biofuels Forum, 2007).

К началу двадцать первого века идея использования биотоплива становится популярной (Hill, 2000) по многим причинам. По мере истощения запасов нефти и газа вопрос энергетической безопасности приобретает все

большую значимость для развития биотопливной индустрии, хотя при нынешней технологии биотопливо лишь весьма незначительно удовлетворяет потребность в моторном топливе. Дело в том, что пока объем внутреннего производства сырьевых культур покрывает малую толику потребности в транспортном топливе, но есть несколько исключений: например, этанол в Бразилии. (Доклад о мировом развитии, 2008). Также вносят свою лепту колебания цены на нефть, используемые часто как средство давления и общая политическая нестабильность. В настоящее время все больше внимания уделяется и экологическому аспекту использования биотоплива: поскольку с каждым днем появляется все больше доказательств того, что интенсивное использование нефти и газа являются факторами, приводящими к резкому потеплению (« парниковый эффект») и загрязнению окружающей среды. С учетом сказанного очень существенным является тот факт, что любое топливо является углерод-нейтральным.

1.3. Цели и задачи исследования

Цель работы:

1. Разработать способ получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов. Задачи:

1. Учитывая собственные и литературные данные о липогенной активности мицелиальных грибов, провести скрининг штаммов с целью отбора наиболее продуктивного организма-продуцента.

2. Определить основные характеристики биодизельного топлива полученного из липидов организма-продуцента и их соответствие международным нормам.

3. Оптимизировать схему получения биодизельного топлива в плане снижения себестоимости его производства:

а) Выяснить возможность замены источников азота и углерода более дешевыми веществами и отходами различных производств.

б) Оптимизировать схему получения посевного материала путем: изучения его олеагенной способности и связи этого процесса с липогенной активностью мицелия; установить активаторы прорастания спор организма-продуцента для интенсификации процесса.

в) Обеспечить экологическую безопасность процесса экстракции липидов путем замены растворителей на сверхкритический углекислый газ.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая ценность проведенных исследований состоит в установлении новых закономерностей в области липидообразования:

1) установлена связь этого процесса со стадиями цитодифференцировки, в частности, с особенностями спорообразования, с возрастом спор, количеством и составом их липидов, установлена прямая зависимость между содержанием липидов в спорах и выросшем из них мицелии.

2) выяснено действие ингибиторов и стимуляторов прорастания спор, установлен тип покоя спор C. japónica ВКМ F-1204(-) и скорость их прорастания.

3) впервые изучено влияние такого продукта вторичного метаболизма как трегалоза на процесс липидообразования. Установлен концентрационный эффект действия экзогенной трегалозы на рост, липогенную активность и состав липидов C. japónica.

4) впервые получены данные, свидетельствующие о ряде отличий грибов рода Cunninghamella от других мукоровых грибов в отношении липидообразования гетероталличных штаммов, в частности способность (+) и (-) штаммов C. japónica синтезировать линоленовую кислоту (C18:3), что, вероятно, может свидетельствовать о другом типе гормональной регуляции полового процесса.

С практических позиций новизна настоящей работы определяется

следующим:

1) найден активный продуцент липидов, способный образовывать до 50% липидов и предложен способ получения биодизельного топлива.

2) установлены основные характеристики биодизеля полученного на основе липидов организма-продуцента и установлена их идентичность принятым международным стандартам.

3) для оптимизации среды выращивания с целью снижения ее стоимости апробирована замена источника азота на легкодоступный и дешевый нитрат аммония, а глюкоза заменена на ряд отходов других производств, в том числе, отход от производства биодизеля - глицерин.

4) Обсуждаются подходы к использованию лигнина. Впервые исследуется роль антиоксидантов в биодеградации лигнина в сравнении с грибами неспособными использовать лигнин и высказывается предположение о смене основного мессенджера при росте гриба на лигнине.

5) на основании теоретических исследований найдены новые подходы к подготовке посевного материала, предложено внесение 0,5% глюкозы для улучшения прорастания спор.

6) впервые изучено влияние экзогенной трегалозы при внесении ее в среду выращивания на рост, липидный состав гриба и выход конечных продуктов.

7) для создания экологически чистого производства рекомендуется заменить извлечение липидов растворителями, в т.ч., канцерогенным хлороформом, на сверхкритический CO2.

8) получен патент на изобретение RUS 2468077 "Способ получения липидов" 11.02.2011г.

9) разработана принципиальная схема получения биодизельного топлива на основе липидов C. japónica, позволяющая получать одновременно с этим глицерин и ряд противоожоговых препаратов на основе обезжиренных клеточных стенок.

1.5. Место проведения работы

Работа была проведена в лаборатории экспериментальной микологии ФГБУН института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН с октября 2011 г. по сентябрь 2014 г.

1.6. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов,_глав собственных результатов, обсуждения результатов,

выводов и списка цитируемой литературы, включающего_источников, в том

числе _ иностранных источников Работа выполнена на _ страницах

машинописного текста, имеет иллюстрированное приложение с_таблицами и

_рисунками.

1.7. Апробация работы

Основные результаты работы были представлены в виде докладов и публикации тезисов на научных конференциях и молодежных научных школах, среди которых: 7ая всероссийская научная молодежная школа с международным участием "Возобновляемые источники энергии" (Москва, 2010 г.), XXIII международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 7-10 февраля 2011г.), конкурс молодежных инновационных научно-технических проектов "УМНИК -2013", конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН 2014 г.

Диссертационная работа апробирована _ на совместном заседании

1.8. Благодарности

Феофиловой Елене Петровне, Сергеевой Яне Эдуардовне, Андрияновой Диане Алексеевне, Галаниной Людмиле Алексеевне, Меморской Анне Сергеевне, Маргарите Дмитриевне, Лунину Валерию Васильевичу, Богдану Виктору Игнатьевичу, Кочкиной Галине Александровне.

1.9. Список публикаций по теме исследования

По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России и 7 тезисов, получен патент на изобретение.

Участие в научных конференциях:

1. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Меморская А.С., Ивашечкин А.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Новые биотехнологии получения биодизеля на основе липидов мицелиальных грибов, материалы Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов " (Москва, 15-17 марта, 2010 г.), стр. 295-296.

2. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Биотехнология получения нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Материалы седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием "Возобновляемые источники энергии" (24-26 ноября 2010 года, Москва), стр. 168-171.

3. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Новая биотехнология получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (7-10 февраля 2011 г., Москва), стр. 147.

4. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Ивашечкин А.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Производство биодизеля на основе инновационной биотехнологии и получение активного посевного материала, Материали за VII международна научна прктична конференция "Найновите постижения на европейската наука - 2011" (17-25 юни 2011), Том 32. Ветеринарна наука. Биологии, София "Бял ГРАД-БГ" ООД, 2011, стр. 41-43.

5. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Получение нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., т.ХП, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

6. Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Богдан В.И., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Ьепйпш й^пш, , Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., т.ХП, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

7. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Изучение закономерностей липидообразования у мицелиальных грибов, как основа для создания новой отрасли биотехнологии - микробной олеобиотехнологии, Липидология - наука XXI века, I международная научно-практическая Интернет-конференция: материалы конф. (Казань, 26 ноября 2013 г.), 2014

Научные статьи в рецензируемых журналах:

1. Феофилова Е.П., Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Биодизельное топливо: состав, получение, продуценты, современная биотехнология (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2010, т. 46, №4, с. 405-415.

2. Феофилова Е.П., Ивашечкин А.А., Алехин А.И., Сергеева Я.Э., Споры грибов: покой, прорастание, химический состав и значение для

биотехнологии (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2012, т.48, №1, с. 5-17

3. Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Мысякина И.С., Ивашечкин А.А., Богдан В.И., Феофилова Е.П., Получение биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Прикладная биохимия и микробиология, 2013, т. 49, №1, с. 1-8.

4. Богдан В.И., Коклин А.Е., Красовский В.Г., Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Феофилова Е.П., Получение метиловых эфиров жирных кислот - основы биодизельного топлива - из липидов мицелиальных грибов, экстрагированных сверхкритическим CO2, Сверхкритические флюиды: теория и практика, 2013, т.8, №4, стр. 46-52

5. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Сорокин В.В., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П. Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Lentinus tigrinus, Прикладная биохимия и микробиология, 2014, т. 50, № 3, с. 318-323.

6. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние антиоксиданта на рост и липидообразование базидиомицетного гриба Lenthinus tigrinus, растущего на среде с лигнослуфонатом. В печати.

Патент на изобретение:

1. Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Алехин А.И., Андриянова Д.А., Мысякина И.С., Гальченко В.Ф., Галанина Л.А., Феофилова Е.П., Лунин В.В., Патент на изобретение RUS 2468077 Способ получения липидов 11.02.2011

1.10. Положения, выносимые на защиту

1) В качестве продуцента для создания биотехнологии производства биодизельного топлива найден олеагенный штамм, относящийся к пор. Mucorales, Cunninghamella japónica F-1204, накапливающий до 50% липидов от сухой биомассы, основной частью которых являются триацилглицериды.

2) Обнаружены отличия в липидном составе гетероталличных штаммов р. Cunninghamella: все гетероталличные штаммы Cunninghamella синтезировали линоленовую кислоту, при этом содержание данной кислоты в липидах (+) штаммов превышало соответствующий показатель (-) штаммов более чем в 2 раза. Таким образом, впервые показано, что существуют различия в метаболизме липидов у грибов порядка Mucorales. В отличие от других Choanephoraceae, у представителей рода Cunninghamella не только не увеличивался выход нейтральных липидов при копуляции разнополых штаммов, но (+) и (-) штаммы имели практически идентичный состав жирных кислот.

3) Проведено сравнение липидного и жирнокислотного состава Cunninghamella japónica и Brassica napus. Получены образцы биодизеля и определены его основные характеристики. Биодизель, полученный из липидов мицелиального гриба, соответствует принятым международным стандартам.

4) Проведена работа по оптимизации среды культивирования, в частности источник азота - аспарагин - замене на более дешевый и доступный нитрат аммония без потери качества продукта, исследованы различные отходы в качестве замены источника углерода, проведена работа по оптимизации посевного материала: установлено, что использование 5 сут спор обеспечивало наиболее высокий выход липидов.

5) Показано, что процесс биодеградации лигнина грибами белой гнили можно модифицировать аэрацией среды культивирования. Опыты с антиоксидантами показали, что начальные этапы разложения лигнина связаны с процессами СРО.

6) Предложено использовать для извлечения липидов критический CO2 с целью создания экологически чистой биотехнологии получения биодизеля.

1.11. Обзор литературы

Влияние физико-химических факторов в процессе культивирования на образование липидов и их жирнокислотный состав.

При рассмотрении микроорганизмов в качестве потенциальных источников липидов необходимо принять во внимание тот факт, что на накопление липидов, на их жирнокислотный состав и на распределение жирных кислот в липидных фракциях влияет ряд различных факторов. Количество липидов и их состав у грибов зависят от стадии роста: процесс образования липидов совпадает по времени с накоплением биомассы и заканчивается в стационарныю фазу роста культуры, после чего содержание липидов начинает уменьшаться. На рис. _ представлена схема накопления липидов у микроорганизмов, которая является типичной для олеагенных видов дрожжей и грибов, и показывает, что накопление липидов в биомассе не начинается до тех пор, пока не истощаются запасы азота.

Одним из важных факторов, определяющих процесс липидообразования, является температура культивирования. Для каждого гриба существует температурный оптимум развития культуры. Однако он не всегда соответствует наиболее интенсивному образования липидов. Обычно повышение температуры в определенных пределах сопровождается увеличением общего количества липидов (Wassef, 1977).

Кроме того, для мицелиальных грибов наблюдается прямая зависимость между степенью ненасыщенности липидов и температурой культивирования.. Так культивирование при пониженных температурах приводит к увеличению

активности _12 и _ 15 десатураз, ответственных за синтех ПНЖК.

Увеличение температуры приводит к снижению относительного содержания ПНЖК, и сопровождается увеличением доли 08:1 08:2. Температура влияет и на фракционный состав как нейтральных, так и полярных лпидов, что

указывает на наличие механизма адаптации к низким температурам (Феофилоа и др., 1996).

Как фракционный состав липидов, так и содержание отдельных ЖК изменяется при синтезе de novo в зависимости от качественного состава питательной среды на которой был выращен микроорганизм (Rose, 1989).

Важной характеристикой является соотношение углерода и азота (C/N) в среде культивирования (Галанина и др., 1989, Rose, 1989, Stredanska, 1993). Как уже отмечалось, накопление липидов преимущественно происходит в конечных фазах роста культуры, когда количество азота в среде культивирования очень мало или данный компонент питательной среды почти исчерпан. Низкое содержание азота в среде способствует синтезу липидов, приводя у ряда мицелиальных грибов к преимущественному синтезу ненасыщенных ЖК. Следовательно, высокое значиние показателя соотношения C/N в среде способствует усилению синтеза липидов.

Также следует подчеркнуть, что фракционный состав липидов изменяется в зависимости от типа соединений азота в питательной среде. Согласно (Stredanska, 1993), еслив среде азот присутствует в ивде нитратов, то увеличивается содержание полярных липидов, тогда как доля ТАГ уменьшается. Надо отметить, что для каждого микроорганизма характерны специфические требования к форме и содержанию азота в среде. Среди наиболее распространенных соединений азота, используемых в качестве компонента питательной среды, можно назвать дрожжевой экстракт, нитрат натрия, хлорид аммония, мочевина, нитрат аммония, сульфат аммония.

Характеристика биодизельного топлива.

Биодизельное топливо (биодизель) представляет собой смесь моноалкиловых (чаще всего метиловых или этиловых) эфиров жирных кислот,

полученных при трансэтерификации возобновляемых биологических ресурсов. [Krawczyk, 1996].

Основными компонентами растительных и животных жиров являются триацилглицерины (ТАГ) (до 80%). При получении биодизельного топлива происходит реакция этерификации ТАГ со спиртом (чаще всего используются метанол и этанол) в присутствии катализатора. В результате из одной молекулы ТАГ образуются три молекулы сложных эфиров жирных кислот и одна молекула глицерина (рис.1). Реакция протекает поэтапно: сначала триглицериды последовательно превращаются в ди- , моноглицериды, и, в результате, в глицерин. Процесс проводится при нагревании и атмосферном давлении. Параметры протекания реакции зависят от состава исходного сырья. Массовый выход метиловых эфиров, т.е. биодизеля, превышает 98% [Fukuda et al., 2001]. В качестве катализаторов реакции применяются кислоты, щелочи [Fukuda et al., 2001; Meher et al., 2006], в последнее время большое внимание уделяется использованию липаз, в т.ч. грибного происхождения [Enoch, Masashiro 2005; Funda et al., 2007; Masaru et al., 2007; Sulaiman Al-Zuhair, 2007].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ивашечкин Алексей Александрович, 2015 год

Список литературы:

1. Большая советская энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия, 1969— 1978.

2. Дебабов В.Г., Биотопливо, Биотехнология, 2008, №1, c.3-14.

3. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Андриянова Д.А., Феофилова Е.П. Липиды мицелиальных грибов как основа для получения биодизельного топлива, Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т.44, №5, с.1-6.

4. Ткачевская Е.П., Конова И.В., Галанина Л.А., Сергеева Я.Э.// Современные наукоемкие технологии, 2005, №1, с.19-20.

5. Топлива, смазочные материалы, технические жидкости. Ассортимент и применение. Справочник под ред. В.М.Школьникова. Издательский центр "Техинформ", 1999.

6. Huguenard, C. M. Dual fuel for diesel engines using cottonseed oil, M.S. Thesis, Ohio State University; 1951.

7. Kalscheuer R., Stölting T., Steinbüchel A., Microdiesel: Escherichia coli engineered for fuel production, Microbiology, 2006, v.152, p.2529-2536.

8. Knothe G.H. // The Biodiesel Handbook/ Eds. G. Knothe, J.V. Gerpen, J.Krahl. Illinois: AOCS Press, 2005.

9. Meng X., Yang J., Xu X., Zhang L., Nie Q., Xian M., Biodiesel production from oleaginous microorganisms, Renewable Energy, 2009, v.34, p.1-5.

10.Zverlov V., Berezina O., Velikodvorskay G.A., Schwarz W.H. //Appl. Microbiol. Biotechnolol., 2006, v.71, p.587-597.

11.Potocnik J. // Science, 2007, v. 315, p.310-311.

12.Ratledge C., Lipid and fatty acids, Primary products of metabolism, NY-London, 1978, p.263-296.

13.Russell, L. S., 2003, A Heritage of Light: Lamps and Lighting in the Early Canadian Home, University of Toronto Press.

14.Stahl P.D., Klug M.J., Characterization and differentiation of filamentous fungi based on fatty acid composition, Appl.. Environ. Microbiol., v.62, No.11, p.4136-4146.

15.Wang, 1988 Wang R. Development of biodiesel fuel. Taiyangneng Xuebao 9: 434-436; 1988.

16.Wei D., Wey Li., Twing S., Xin C., Dehua L. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, v.79, p.331-337.

Приложения

Методика.

Рисунок._. Типичная хроматограмма НЛ Рисунок._. Типичная хроматограмма ПЛ. Рисунок._. Типичная ГЖХ

Глава4

Табл. 2. Состав и содержание жирных кислот ОЛ мицелия C. japonica, выращенного в присутствии различных концентраций экзогенной трегалозы.

^""-вариант опыта жирная кислоГа^ концентрация Тге, %

0 0,25 1

2 с 4 с 2 с 4 с 2 с 4 с

С12:0 0,17

С14:0 1,05 0,96 0,99 0,95 1,04 0,99

С16:0 25,16 23,54 24,54 23,84 23,44 25,07

С16:1 0,83 0,87 0,84 0,94 0,8 1,14

С18:0 8,33 7,06 8,73 6,99 7,63 6,01

С18:1п9с 46,31 44,95 46,07 46,01 45,53 44,12

С18:2п6с 12,41 14,51 12,48 13,39 12,85 15,42

С18:3п6 5,73 8,11 6,35 7,34 7,02 7,25

С22:1п9с 1,68

1,5

0,0

0 7 14 21 28

сутки

Рис.. Изменение степени ненасыщенности липидов спор гриба C.japonica в зависимости от возраста спор.

40

0 24 48 72 96 120

Время культивирования, часы

Рис.9. Динамика содержания липидов в зависимости от возраста спор.

Рис.23. Изменение соотношения различных ЖК при старении спор.

Табл. . Состав ЖК общих липидов C. japonica в зависимости от возраста посевного материала.

ЖК 7|0 7|3 7|4 7|5 14|0 14|3 14|4 14|5 21|0 21|3 21|4 21|5 28|0 28|3 28|4 28|5

С14:0 1,19 0,90 0,80 0,71 1,97 0,68 0,53 0,66 2,59 0,59 0,52 0,63 3,13 0,64 0,57 0,58

С16:0 16,49 22,17 20,62 19,49 20,35 19,47 16,42 17,75 22,36 16,56 18,96 20,75 24,70 17,58 17,46 18,34

С16:1 0,59 0,77 0,70 0,70 1,22 0,61 0,63 0,67 1,76 0,63 0,70 0,78 3,40 0,63 0,63 0,66

С18:0 4,95 8,88 7,99 8,16 7,95 8,93 9,67 10,61 7,04 7,90 8,28 9,30 7,39 8,48 8,30 8,65

С18:1 35,67 51,05 51,02 51,98 33,04 47,01 46,65 44,45 33,49 43,36 38,93 34,02 30,83 46,45 45,46 45,00

С18:2 24,98 8,75 10,04 9,77 22,09 15,06 15,67 17,36 25,55 20,25 25,64 26,45 21,72 16,44 18,57 19,63

С18:3 ю6 14,91 6,54 7,95 8,20 10,34 6,08 5,78 3,98 5,00 6,35 4,89 3,43 7,24 6,71 6,44 6,09

С18:3 ю3 0,52 0,84 0,86 0,91 1,01 0,00 0,48 0,46

Прочие 1,22 0,94 0,89 1,00 1,88 1,64 3,81 3,41 2,22 3,47 2,08 3,65 1,59 2,58 1,98 0,66

сумма насыщ 23,13 32,37 29,79 28,77 32,15 30,16 29,41 31,45 31,99 27,43 29,42 33,41 36,80 28,56 27,58 28,22

сумма ненасыщ 76,88 67,63 70,22 71,23 66,70 69,84 70,59 68,30 65,79 72,57 70,58 66,59 63,20 71,44 72,28 71,38

ПНЖК 39,89 15,29 17,99 17,97 32,43 21,65 22,45 22,20 30,54 27,79 30,53 30,88 28,96 23,81 25,66 25,72

ПНЖК (% от НЖК) 51,89 22,61 25,62 25,23 48,62 31,01 31,81 32,50 46,43 38,29 43,26 46,38 45,83 33,33 35,50 36,03

СН 1,32 0,89 0,96 0,97 1,09 0,98 1,00 0,95 1,01 1,08 1,06 1,02 0,99 1,02 1,05 1,03

Табл. . Процентное содержание основных фракций ОЛ C. japonica в зависимости от возраста посевного материала.

Вещество ЯГ 7|0 7|3 7|4 7|5 14|0 14|3 14|4 14|5 21|0 21|3 21|4 21|5 28|0 2813 2814 28|5

ПЛ 0,000,01 7,2 5,4 5,4 4,9 14,0 6,8 7,6 11,4 7,1 6,0 9,1 7,5 7,3 6,6 9,4 7,3

МАГ 0,040,05 3,4 3,2 1,2 1,5 1,9

1,2-ДАГ 0,080,10 3,3 4,4 1,4 1,0 1,1 1,7 4,4

1,3-ДАГ 0,110,13 5,3 9,5 9,4 7,4 3,4 13,2 12,6 9,5 4,4 6,7 5,6 5,5 3,4 15,0 13,8 12,8

ССт 0.150,18 6,0 4,8 5,6 5,8 12,6 6,0 9,5 9,6 14,7 8,6 8,2 8,5 13,6 6,7 6,9 7,5

Высшие спирты 0,230,24 3,3 2,1 2,7 2,4 2,1 2,2 3,2

СЖК 0,260,33 12,5 10,5 6,6 4,0 5,7 9,2 11,4 10,3 25,0 10,5 10,7 11,4 18,1 13,7 14,4 15,4

X 0,43 1,6 1,2 1,9 2,3

ТАГ 0,540,62 56,8 65,0 69,2 73,8 45,1 56,2 51,0 51,4 32,8 57,4 56,0 53,9 39,5 54,7 52,7 52,9

ЭСт 0,840,87 2,1 4,8 4,3 4,1 6,7 6,0 5,5 5,8 7,7 7,5 6,0 7,3 9,7 3,2 2,8 4,1

УВ 0,98 6,1

ЭСт/ССт 0,35 1,00 0,77 0,71 0,53 1,00 0,58 0,60 0,52 0,87 0,73 0,86 0,71 0,48 0,41 0,55

Табл. . Состав и содержание (% от суммы ПЛ) основных фракций ПЛ C. japonica в зависимости от возраста посевного материала.

Вещество 7|0 7|2 7|3 7|4 14|0 14|2 14|3 14|4 21|0 21|2 21|3 21|4 28|0 28|2 28|3 28|4

ФЭА 24,80 26,30 34,92 36,74 14,94 49,17 36,93 28,61 14,62 29,04 31,62 13,66 7,54 31,63 44,51 33,07

ФК 13,34 53,22 49,44 19,55 3,78 1,81 7,16 15,24 6,55 36,07 12,97 33,15 7,23 18,32 7,75 22,64

ФГ 1,54 1,65 3,50 0,59 0,35 0,23 0,83 12,00 1,40 1,41

ФХ 27,06 9,00 3,48 13,58 22,32 35,07 24,00 15,11 27,12 14,83 13,82 7,21 15,16 14,48 18,24 20,92

ФС 2,43 0,36 4,68 1,63 3,86 3,36 3,05 2,23 3,54 1,73 0,85 4,05 3,54

СМ 1,53 1,66 5,58 4,56

ФИ 1,80 2,30 1,08 1,74 3,92 3,28

Гл1 3,34 0,95 7,05 0,6 8,55 16,77 1,81 7,59 13,68 16,97 5,53 3,79 2,84 4,8

Гл2 15,57 9,71 10,14 10,44 25,55 7,73 7,96 6,56 23,44 4,27 7,34 8,64 38,99 7,84 11,91 13,23

Гл3 10,4 1,77 6,84 12,56 1,76 5,03 9,96 1,85 0,71 10,6 6,85 12,21 7,92 5,34

Гл4 1,87 2,54 2,11 4,53 4,44 1,64

ФХ/ФЭА 1,09 0,34 0,10 0,37 1,49 0,71 0,65 0,53 1,85 0,51 0,44 0,53 2,01 0,46 0,41 0,63

Список принятых сокращений

1.2-ДАГ (1,2-DAG) - 1,2-диацилглицерины

1.3-ДАГ (1,3-DAG) - 1,3-диацилглицерины ГЖХ (GLC) - газожидкостная хроматография ГЛ (GL) - гликолипиды

ЖК (FA) - жирные кислоты

КС (CW) - клеточная стенка

ЛСН - лигносульфонат натрия

МАГ (MAG) - моноацилглицерины

ПЛ (PL) - полярные липиды

СЖК (FFA) - свободные жирные кислоты

СМ (SM) - сфингомиелин

Ст - свободные стерины

ТАГ (TAG) - триацилглицерины

ТСХ (TLC) - тонкослойная хроматография

ФК (PA) - фосфатидная кислота

ФЛ (PL) - фосфолипиды

ФС (PS) - фосфатидилсерин

ФХ (PC) - фосфатидилхолин

ФЭА (PEA)- фосфатидилэтаноламин

ЭПР (ER) - эндоплазматический ретикулум

ЭСт - этерифицированные стерины