ЛИПИД-ЗАВИСИМЫЙ ТОПОГЕНЕЗ ТРАНСПОРТЕРА ЛАКТОЗЫ ESCHERICHIA COLI тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Рябичко Сергей Сергеевич

• Рябичко Сергей Сергеевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Рябичко Сергей Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 Глава 1.1 Внутриклеточная локализация интегральных

мембранных белков

Глава 1.2 Топология мембранных белков

Глава 1.3 Топогенные сигналы и правила топологии

Глава 1.4 Правило положительных зарядов внутри

Глава 1.5 Роль липидов в топогенезе 25 Глава 1.6 Липид-зависимое формирование третичной

структуры мембранных белков 28 Глава 1.7 Участие липидов в определении топологии

мембранных белков 32 Глава 1.8 Изменение ориентации трансмембранных доменов

после сборки 34 Глава 1.9 Свойства липидов, влияющих на топологию и функцию

мембранных белков

Глава 1.10 Гипотеза баланса зарядов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2.1 Оборудование и реагенты

Объекты исследования

Глава 2.2 Использованные микроорганизмы и плазмиды

Методы, использованные в работе

Глава 2.3 Культивирование микроорганизмов

Глава 2.4 Мечение фосфолипидов и экстракция 51 Глава 2.5 Одномерная тонкослойная хроматография

фосфолипидов 51 Глава 2.6 Двумерная тонкослойная хроматография

фосфолипидов

Глава 2.7 Выделение и солюбилизация внутренних

и внешних мембран E. coli

Глава 2.8 Выделение и солюбилизация внутренних мембран

E. coli в инвертированной ориентации

Глава 2.9 Определение КДО в мембранах

Глава 2.10 Денатурирующий электрофорез мембранных белков

в ПААГ и Вестерн-блоттинг

Глава 2.11 Истерн-Вестерн блоттинг

Глава 2.12 Определение топологии мембранных белков методом

анализа доступности замещенных цистеинов

Глава 2.13 Определение скорости транспорта субстрата

транспортера лактозы через внутреннюю мембрану

Глава 2.14 Трансформация клеток E. coli плазмидами

Глава 2.15 Статистическая обработка данных и вычисления

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3.1 Влияние лизофосфатидной кислоты на формирование

третичной структуры и встраивание в мембрану

транспортера лактозы

Глава 3.2 Влияние лизилфосфатидилглицерина на топологию

транспортера лактозы

Глава 3.3 Внутримолекулярное взаимодействие транспортера

лактозы LacY при встраивании в мембрану

Глава 3.4 Распределение фосфолипидов в бислое мембраны

Escherichia coli

Глава 3.5 Анализ распределения заряженных аминокислот

гомологов транспортера лактозы бактерий

с различным липидным составом мембраны

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ФЭ - фосфатидилэтаноламин ФГ - фосфатидилглицерин К - кардиолипин

ЛФГ - лизилфосфатидилглицерин ЛФК - лизофосфатидная кислота ТСХ - тонкослойная хроматография ДДМ - додецилмальтозид ТНФ - тринитрофенил

КДО - 3-дезокси-0-маннооктулозоновый сахар

ЛПС - липополисахарид

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ПААГ - полиакридамидный гель

БССР - пара-трифлуорометоксифенилгидразон

ВВЕДЕНИЕ

Биогенез белков в сопряжении с топографией данных процессов образует понятие топогенеза. Проблема топогенеза мембранных белков имеет ряд открытых вопросов, таких как механизмы маршрутизации мембранных белков к месту их субклеточной локализации, а также их топология, то есть ориентация трансмембранных доменов относительно плоскости мембраны. Принцип маршрутизации мембранных белков бактерий отличается от сортировки мембранных белков эукариот, так как у бактерий отсутствуют соответствующие органеллы и структуры. Субклеточная локализация мембранных белков может определяться их маршрутизацией, например, с помощью новосинтезированной мембраны и мезосом (АЬои^а£а et а1., 2013).

Другой возможный путь передвижения гидрофобных мембранных белков в клетке - с помощью мицелл, состоящих из фосфолипидов с одной жирной кислотой, которые, вероятно, оказывают

возмущающее/дестабилизирующее действие на бислойную структуру мембраны и, как следствие, высвобождение мицелл (с белком внутри или с последующим его встраиванием). Либо транспорт мембранных белков осуществляется посредством встраивания белков в бислойные везикулы с участием транслоконовой системы (Bogdanov et а1., 2013).

Формирование мицелл напрямую связано с липидным составом

мембраны, который в свою очередь может зависеть от изменений условий

окружающей среды. Количество насыщенных и ненасыщенных жирных

кислот, а также распределение и количество зарядов в мембране формирует

степень ее текучести, что может быть критично при стрессовых условиях,

таких как температурное нагревание. Показано, что лизофосфатидная

кислота присутствует в составе мембраны Е.соН в количестве 0,1-0,5% от

общего содержания глицерофосфолипидов (Кооутап et а1., 2005). При этом

малое содержание лизофосфатидной кислоты способно оказывать важное

5

воздействие на бислойную структуру мембраны, внося дестабилизирующее действие за счет наличия одной жирной кислоты вместо двух. Вероятно, увеличение количества лизофосфатидной кислоты в мембране при таких стрессовых ситуациях, как повышение температуры окружающей среды, может быть необходимо бактериальной клетке для солюбилизации мембранных белков с целью сохранения их нативной конформации или для транспортировки.

Липиды принимают непосредственное участие в образовании

третичной структуры мембранных белков, выступая в качестве

молекулярных шаперонов (Bogdanov and Dowhan, 1999). Следует отметить,

что формирование третичной структуры (фолдинг) и топология для

политопных интегральных мембранных белков неразрывно связаны, так как

фолдинг происходит во время трансляции и в то же время происходит

встраивание белков в мембрану. Отсутствие фосфатидилэтаноламина в

мембране E.coli приводит к инверсии ориентации относительно плоскости

мембраны первых шести трансмембранных доменов транспортера лактозы

LacY и полной потере функции белка (Bogdanov et al., 2002). Следовательно,

липидный состав мембраны влияет на топологию мембранных белков и

данный процесс динамичен. Было предположено, что при удалении

цвиттерионных молекул фосфатидилэтаноламина происходит замещение

данного липида двумя другими отрицательно заряженными фосфолипидами

фосфатидилглицерином и кардиолипином, в результате чего мембрана

«разбавляется» отрицательными зарядами, что, в конечном счете,

способствует изменению топологии транспортера лактозы (Bogdanov et al.,

2009). Добавление положительно заряженного лизилфосфатидилглицерина в

подобные клетки может способствовать восстановлению баланса зарядов и

возвращению нативной топологии LacY, либо приводить к неожиданным

другим изменениям. Топология мембранных белков в настоящее время

предсказывается благодаря работам von Heijne и Elofsson, в основе которых

лежит наличие «правила положительных зарядов внутри». Согласно данному

6

правилу положительно заряженные аминокислотные остатки мембранных белков чаще располагаются на цитоплазматической стороне ^оп Неупе, 1992; №1бвоп et а1., 2005; Bemsel et а1., 2008). Однако не принимается во внимание липидный фактор, то есть влияние липидного состава мембраны на топологию мембранных белков. Исходя из полученных сведений о влиянии липидов на топологию белков правило положительных зарядов внутри было расширено до правила баланса зарядов (Bogdanov et а!., 2012). Было предположено, что наличие цвиттерионных молекул

фосфатидилэтаноламина в мембране критично для удерживания положительно заряженных цитоплазматических участков мембранных белков на внутренней стороне. Интерес при этом также представляет распределение фосфолипидов в бислое мембраны и связь данного распределения с правилом баланса зарядов.

Некоторые мембранные белки обладают внутренней латеральной симметрией - последовательность первых трансмембранных доменов имеет высокую степень гомологии с последующими, что, вероятно, связано с эволюционной дупликацией генов этих белков. К таким белкам часто относятся транспортеры сахаров, и в частности, транспортер лактозы LacY Б.соИ, у которой первые шесть трансмембранных доменов формируют N6 блок и расположены относительно друг друга так же, как остальные шесть, формирующие С6 блок (Abramson et а!., 2003). N6 и С6 блоки обладают некоторой подвижностью в мембране, что позволяет им осуществлять транспорт. Вероятно, отдельно экспрессируемые и встраиваемые в мембрану блоки N6 и С6 транспортера лактозы могут иметь иную топологию. Анализ топологии данных блоков при различном фосфолипидном составе мембраны важен для понимаю влияния липидов на процесс встраивания, степени их ассоциации, топологии и процесса формирования третичной структуры в целом.

Целью настоящей работы является оценка влияния фосфолипидов на топогенез транспортера лактозы во внутренней мембране Escherichia coli.

Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние лизофосфатидной кислоты на фолдинг транспортера лактозы LacY E.coli.

2. Оценить влияние лизилфосфатидилглицерина на топологию транспортера лактозы в мембране E.coli.

3. Определить топологию отдельно экспрессируемых фрагментов транспортера лактозы N6 и C6 в мембране E.coli.

4. Проанализировать распределение лизилфосфатидилглицерина и фосфатидилэтаноламина в бислое внутренней мембраны E.coli.

Научная новизна

Обнаружено, что при увеличении лизофосфатидной кислоты в мембране Escherichia coli повышается содержание мембранных белков в цитоплазматической фракции, вероятно, в результате активного образования мицелл, что может быть связано с дестабилизирующим влиянием лизофосфатидной кислоты на бислойную структуру мембраны. Увеличение гидрофильности мембранных белков путем их солюбилизации в мицеллах может быть одним из путей их транспорта в клетке.

Впервые показано, что увеличение содержания

лизилфосфатидилглицерина в мембране E.coli, лишенной фосфатидилэтаноламина, приводит к восстановлению нативной мембраны. Инвертированная ориентация транспортера лактозы приобретает исходное нативное положение в мембране, что подтверждает гипотезу баланса зарядов между заряженными гидрофильными группами фосфолипидов и аминокислотными остатками мембранных белков для детерминирования топологии последних.

Показано, что внутримолекулярные взаимодействия в мембранных белках имеют важное значение для топологии: отдельно экспрессируемые фрагменты N6 и С6 транспортера лактозы димеризуются в мембране, осуществляют транспорт при правильной конформации и взаимно влияют на ориентацию друг друга.

Определено наличие асимметрии в распределении лизилфосфатидилглицерина и фосфатидилэтаноламина в бислое внутренней мембраны Б.соИ, что может быть связано с необходимостью создавать полюса зарядов в мембране в соответствии с правилом положительных зарядов внутри для мембранных белков.

Практическая значимость

Полученные результаты могут быть использованы для поиска способов влияния на фосфолипидный состав мембраны микроорганизмов с целью увеличения их нежизнеспособности, в качестве нового подхода к лечению и дезинфекции.

Результаты могут быть использованы в учебном процесс е в рамках дисциплин «Биотехнология», «Биохимия мембран», «Молекулярная биология».

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ЛИПИД-ЗАВИСИМЫЙ ТОПОГЕНЕЗ ТРАНСПОРТЕРА ЛАКТОЗЫ ESCHERICHIA COLI»

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на международных и региональных конференциях: на ежегодных конференциях Казанского федерального университета - III научно-практической интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, Россия, 2011), и IV научно-практической интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, Россия, 2013), на 17 -й школе-конференции в г. Пущино «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2013), на I международной интернет-конференции «Липидология -

наука XXI века» (Казань, Россия, 2013), на международном симпозиуме «Биохимия - основа наук о жизни» (Казань, Россия, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение количества лизофосфатидной кислоты в мембране E.coli способствует повышению содержания мембранных белков OmpF и LacY в цитоплазматической фракции.

2. Увеличение лизилфосфатидилглицерина в клетках E.coli, не способных синтезировать фосфатидилэтаноламин, приводит к восстановлению нативной ориентации транспортера лактозы, нарушенной вследствие преобладания в мембране отрицательно заряженных фосфолипидов.

3. Лизилфосфатидилглицерин и фосфатидилэтаноламин преимущественно располагаются на внешней стороне бислоя внутренней мембраны Escherichia coli.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1 Внутриклеточная локализация интегральных мембранных белков

В клетках эукариот существует механизм сортировки мембранных белков, который определяет дальнейшую их маршрутизацию и последующую локализацию. Сортировка мембранных белков зависит от сигналов, кодируемых аминокислотной последовательностью белков. Большинство подобных сигнальных последовательностей находятся в N-концевой области, хотя для белков, направляемых в пероксисомы, характерно их расположение в C-терминальном участке. В первую очередь, маршрутизация определяется типом организации третичной структуры синтезируемого мембранного белка, который зависит от сигнальных последовательностей: ко-трансляционный (то есть образование третичной структуры осуществляется уже в процессе синтеза полипептидной цепи) или пост-трансляционный (осуществляется только после завершения синтеза белка). Как правило, пост-трансляционный путь характерен для мембранных белков, которых необходимо транслоцировать через мембрану, например, в митохондриях (Mellman and Nelson, 2008).

Некоторые черты между механизмом маршрутизации мембранных белков у прокариот и эукариот могут быть общими. Например, мембранный белок взаимодействует с транслоконом SecYEG в бактериях, в эндоплазматическом ретикулуме эукариот имеется соответствующий гомолог Sec61. Однако маршрутизация бактерий не может осуществляться идентичным механизмом хотя бы потому, что в прокариотических клетках нет эндоплазматического ретикулума и других органелл эукариот.

Бактерии содержат одну или две клеточные мембраны, а также

различные мембранные органеллы и образования, которые располагаются

внутри или снаружи клетки, например, такие как хроматофоры (в

фотосинтезирующих бактериях), магнетосомы (в железо окисляющих или

11

восстанавливающих бактериях), анаммоксосомы (в аммоний окисляющих), ацидокальцисомы (в кальций-фосфат утилизирующих) и различные везикулы, используемые для внутриклеточного и экстраклеточного транспорта (Saier and Bogdanov, 2013).

Было показано, что при гиперпродукции мембранных белков активно образуется внутриклеточная мембрана и везикулы, что может указывать на наличие определенного соотношения мембранный белок/липид в клетке (Arechaga et al., 2000; Arechaga et al., 2003). Вероятно, при избыточном синтезе мембранных белков возникает необходимость их солюбилизации, что заставляет клеточный гомеостаз использовать регуляцию генов синтаз липидов и активировать или супрессировать их экспрессию в зависимости от сигналов. Возможно, что существует и обратный процесс, при котором увеличенный синтез липидов сопряжен с повышенной продукцией мембранных белков. Гиперпродукция мембранных белков может приводить к их частичному нарушению формирования третичной структуры. Так как встраивание мембранных белков в мембрану происходит не самостоятельно, а задействует работу транслоконовой системы, вероятно, ошибки в третичной структуре являются следствием недостаточно эффективного функционирования системы встраивания, возникающего из-за повышенной нагрузки. Другой возможной причиной является влияние липидов на сворачивание и топологию мембранных белков: нарушение отношения количества мембранных белков к липидам ведет к неправильной структурной организации (Bogdanov et al., 2013).

Избыточно продуцируемые белки включаются в различные

мембранные клеточные образования - цитоплазматические мицеллы и

внутриклеточные везикулы (Aboulwafa and Saier, 2011). Внутриклеточные

образования плазматической мембраны - мезосомы, были обнаружены как у

грам-положительных, так и у грам-отрицательных бактерий, хотя для

последних они наиболее характерны, так как участвуют во внеклеточном

расщеплении (Li et al., 2008). У грам-положительных бактерий мезосомы

12

образуются путем инвагинации плазматической мембраны, которая у E.coli также используется для внутриклеточных мицелл и везикул (Arechaga et al., 2000). Возможно, что внутриклеточные мембраны E.coli имеют схожую структуру и функцию, как и мезосомы у других бактерий (Bogdanov and Dowhan, 2012), а также идентичный механизм биогенеза. Такие белковые комплексы, как светособирающий реакционный центр RC-LH1, периферическая антенна белка LH2 и две фракции сопутствующих белков были выделены из внутриклеточных мембран фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter sphaeroides, которые являются типичными компонентами плазматической мембраны клеток данных бактерий, что доказывает происхождение внутриклеточной мембраны от плазматической (Woronowicz et al., 2013).

В отличие от мембранных хроматофор, магнетосомы содержат уникальный состав мембранных белков, то есть не все белки магнетосом содержатся в плазматической мембране (Murat et al., 2010), но, несмотря на это, по ряду признаков считается, что мембрана магнетосом имеет схожий с плазматической мембраной биогенез.

Однако неизвестно, у всех ли прокариот биогенез внутриклеточных мембран и плазматической мембраны носит схожий характер. Например, цитоплазматическая мембрана бактерий, относящихся к типу Planctomycetes, имеет характерные для внешней мембраны грам-отрицательных бактерий свойства. У некоторых представителей этого рода имеются анаммоксосомы, органеллы, в которых осуществляется окисление аммония для использования в качестве энергетического источника. Данные органеллы содержат ладдераны, липиды с жесткой структурой, которые не встречаются нигде более (van Teeseling et al., 2013). Имеет ли мембрана анаммоксосом схожую структуру, а главное, механизм биогенеза с клеточной мембраной этих бактерий - не выяснено.

Вопрос о биогенезе мембран бактерий важен для понимания

внутриклеточного транспорта и локализации интегральных мембранных

13

белков. Если в эукариотических клетках мембранные белки достигают плазматической мембраны путем слияния везикул с мембраной благодаря различным белковым факторам, участвующим в данном процессе, например, таким как SNARE, COPI, COPII, адапторный белок - клатриновый комплекс (Mellman and Nelson, 2008), то механизм слияния везикул с мембраной и транспорт везикул внутри клетки у прокариот изучен слабо. Гидрофобность мембранных белков осложняет их транспорт в цитоплазме вне липидного окружения, необходима их солюбилизация. Было показано, что мембранные белки могут быть солюбилизированы в цитоплазме. При этом физико-химические свойства мембранных белков и их состав могут сильно отличаться от мембранных ассоицатов (Bogdanov and Dowhan, 1998; Ito and Akiyama, 1991; Aboulwafa and Saier, 2011).

Таким образом, существует несколько возможных путей транспорта мембранных белков. Белки могут перемещаться в пределах клетки, будучи включенными в участок мембраны, который затем используется для построения мезосом или везикул. Таким образом, мезосомы или везикулы содержат в составе своей мембраны белки, которые изначально были встроены в плазматическую мембрану. Другим возможным механизмом транспорта может быть их солюбилизация в мицеллах, формируемых, например, бислой-дестабилизирующими липидами. При этом белки могут быть включены в данные мицеллы, находясь в составе плазматической мембраны, при формировании мицеллы из мембраны, либо могут быть встроены в уже сформированную мицеллу. Однако при встраивании в мицеллу необходимо, очевидно, участие транслоконовой системы (Bogdanov et al., 2013). Было найдено, что внутриклеточные везикулы содержат в составе мембраны компоненты SecYEG транслокона (Eriksson et al., 2009).

Было показано, что количество мицелл и внутриклеточных везикул в

клетках бактерий может значительно варьировать при различных стрессовых

условиях роста, таких как увеличение температуры инкубации, либо

изменение степени аэрации среды (Kooijman et al., 2005). Если при

14

увеличении температуры происходит интенсивное образование мицелл, то в окислительных условиях происходит обратный процесс (Woronowicz et al., 2013). При формировании мицелл и везикул мембранные белки, которые оказываются в их составе, меняют свою начальную локализацию в плазматической мембране и транспортируются в каком-либо направлении. Необходимость формирования мицелл и везикул в условиях стресса остается невыясненным.

Определенный интерес представляет биогенез везикул, формируемых внешней мембраной для внеклеточных функций. Известно, что они используются для осуществления следующих процессов: 1) доставка токсинов в эукариотические клетки; 2) обмен молекулами белков и ДНК между бактериальными клетками; 3) передача межклеточных сигналов; 4) секреция протеаз и антибиотиков; 5) удаление белков с нарушениями в структурной организации, которые могут быть вредны для клетки (Saier and Bogdanov, 2013). Было также отмечено, что в условиях стресса происходит интесивное формирование не только внутриклеточных везикул, но и экстраклеточных (McBroom and Kuehn, 2007). Возможно, что в условиях стресса образование третичной структуры белков и, в частности, мембранных белков частично нарушается. Таким образом, накопление белков может подвергать клетки дополнительным нежелательным воздействиям, поэтому белки с неправильной конформацией элиминируются путем их везикулярного или мицеллярного транспорта (Manning and Kuehn, 2011).

Липидный состав мембраны не только определяет локализацию

мембранных белков, но и участвует в их транспорте. Формирование мицелл

и везикул может быть сопряжено с локальным изменением физико-

химических свойств мембраны благодаря изменению липидного состава

(Steponkus et al., 1995). Бислой-дестабилизирующие фосфолипиды, такие как

лизолипиды, содержащие один остаток жирной кислоты вместо двух, могут

способствовать формированию мицелл. Было отмечено, что в стрессовых

15

условиях наряду с активным образованием мицелл происходит увеличение содержания фосфатидной и лизофосфатидной кислот в клетках E.coli (Kooijman et al., 2005). Возможно, что стрессовые условия ведут к изменению липидного состава клетки и формирования мицелл и везикул, в состав которых входят мембранные белки. Также есть вероятность, что данный процесс может существовать в нормальных условиях, но наблюдаться менее выраженно.

Глава 1.2 Топология мембранных белков

Фундаментальной архитектурной особенностью мембранных белков является наличие топологической организации, то есть количество трансмембранных доменов и их ориентация относительно плоскости липидного бислоя. а-спиральная организация трансмембранных доменов формируется благодаря контакту преимущественно гидрофобных аминокислот непосредственно с фазой липидного бислоя мембраны, а водородные связи полипептидного остова обращены внутрь а-спирали. Таким образом, формирование а-спирали является термодинамически выгодным процессом для трансмембранных доменов интегральных мембранных белков и поэтому характерно для их большинства (Popot and Engelman, 2000).

Менее встречающиеся аминокислотные последовательности образуют водородные связи между полипептидными цепями, расположенными в антипараллельных в-слоях, что приводит к формированию структуры по типу бочонка, при этом гидрофильные остатки аминокислот обращены внутрь в сторону водной фазы, в то время как гидрофобные аминокислоты - в сторону наружной гидрофобной фазы (Galdiero et al., 2007). Топологическая организация изучена достаточно хорошо или может быть относительно легко определена, однако процесс топогенеза мембранных белков и влияющие на данный процесс факторы практически не изучены.

Биогенез политопных мембранных белков требует координации нескольких событий: узнавание и связывание растущей полипептидной цепи транслоконовой системой, расположенной в мембране; сборка и ориентация трансмембранных доменов с одновременным фолдингом немембранных доменов; образование спирали внутри липидного бислоя; правильное формирование четвертичной структуры белка, встроенного в липидный бислой (Dowhan and Bogdanov, 2009).

Принцип структурной организации интегральных мембранных белков определяется бислойной мембраной. Подавляющее большинство прокариотических и эукариотических интегральных мембранных белков встраиваются ко-трансляционно и расположены в мембране в том порядке, который определяют транслоконовая система и сигнал распознающая частица (Driessen and Nouwen, 2008; Rapoport, 2007). Однако существуют многочисленные примеры реорганизации, происходящей уже посттрансляционно (Pitonzo and Skach, 2006; von Heijne, 2006). Гидрофобные участки белков сперва входят в транслокон, а затем последовательно и латерально встраиваются в липидный бислой (Sadlish et al., 2005) или располагаются вне мембраны в границах раздела фаз, что определяется в основном термодинамическими параметрами (Hessa et al., 2005; Hessa et al., 2005).

Топогенез мембранных белков, механизм которого доступен для

предсказания некоторых из белков, обусловлен сочетанием нескольких

факторов (von Heijne, 2006; Elofsson and von Heijne, 2007). Топология

политопных мембранных белков определяется взаимодействием между

топогенными сигналами, расположенными в цепи аминокислотной

последовательности белка (Monne et al., 2005; Nilsson and von Heijne 1990;

Rutz et al., 1999), взаимодействием белка с транслоконовой системой (Goder

and Spiess, 2003; Goder et al., 2004), внутренним белковым взаимодействием

(Norholm et al., 2011; Hedin et al., 2010) и липид-белковым взаимодействием

во время сворачивания до конечной структуры мембранного белка ( Bogdanov

17

et al., 2002; White and von Heijne, 2005; Zhang et al., 2003). В топогенезе белков данные факторы оказывают воздействие на конечную топологическую организацию одновременно или последовательно (Pitonzo and Skach, 2006), что приводит в большинстве случаев к уникальной топологии.

Первичное предопределение топологии мембранного белка происходит при взаимодействии с транслоконом, который обеспечивает благоприятную среду для встраивания трансмембранных доменов в мембрану и расположения гидрофильных областей по разные стороны мембраны в соответствии с правилом положительных зарядов внутрь и/или правилом разницы зарядов (Goder et al., 2004; Hessa et al., 2005; Hessa et al., 2007). Находясь в транслоконе, участки крупных белков, содержащие трансмембранные домены с экстрамембранными последовательностями (Ismail et al., 2008; Kida et al., 2007), могут «перебирать» возможные варианты топологии в зависимости от различных топогенных сигналов, пока синтез белка остается незавершенным (Goder and Spiess, 2003), либо до последующей переориентации, терминируемой неизвестным механизмом в какой-либо промежуток времени (Monne et al., 2005; Higy et al., 2004).

Трансмембранные домены могут принимать начальную топологию в

соответствии с правилом положительных зарядов внутри благодаря

непосредственному взаимодействию зарядов белка и транслокона (Goder et

al., 2004). Однако вклад транслокона в определение топологии белка

ограничен временем (Monne et al., 2005; Goder and Spiess, 2003), размером

синтезируемого белка (Ismail et al., 2008; Kida et al., 2007), и эффективным

размером поры транслокона, который является предметом обсуждения до сих

пор (van der Berg et al., 2004; Hamman et al., 1997). Таким образом,

независимо от количества трансмембранных доменов, находящихся в

пределах транслоконовой поры, конечная топология и организация белка

после выхода из транслокона должна следовать термодинамически

опосредованному маршруту, диктуемому непосредственным

18

взаимодействием трансмембранных доменов и упорядоченных экстрамембранных участков как в самом белке, так и с липидным бислоем (Hessa et al., 2005; Hessa et al., 2005).

В эукариотических клетках данный процесс динамической переориентации может блокироваться гликозилированием (Goder et al., 1999), который происходит в эндоплазматическом ретикулуме одновременно со встраиванием, таким образом, обеспечивая правильность ориентации и необратимость после встраивания. Задержка в транслокации положительно заряженных экстрамембранных доменов по отношению к отрицательно заряженным может вносить определенный вклад в предпочтительное гликозилирование последних (Monne et al., 2005).

Однако прокариоты потеряли данную первоначальную способность контролировать топологию и вместо этого могут определять правильность топологии белков в мембране после выхода белковой последовательности из транслокона (Pitonzo and Skach, 2006; von Heijne, 2006; Bogdanov et al., 2002; Mackenzie, 2006).

Как правило, принято считать, что топология большинства политопных мембранных белков определяется ко-трансляционно во время встраивания в мембрану и, однажды сформировавшись, сохраняется в течение последующих этапов биогенеза, клеточного транспорта и функционирования. Согласно простейшей модели встраивания мембранных белков, большинство N-концевых трансмембранных доменов определяют собственную ориентацию самостоятельно, также как и ориентацию последующих трансмембранных доменов, которые далее просто последовательно встраиваются в бислой (Rapoport, 1985). Однако делеция отдельных трансмембранных доменов транспортера лактозы LacY и транспортера мальтозы бактерии Escherichia coli (Bibi et al., 1992; Ehrmann and Beckwith, 1991) или нарушение ориентации N-концевого участка тетрациклин/Н+ антипортера (Guo et al., 1996) не влияло на топологию последующих

трансмембранных доменов, что указывает на вероятность механизма непоследовательной вставки и ориентации доменов уже после встраивания.

Обладая гидрофобными свойствами, трансмембранные домены свободно располагаются в бислое, а остатки заряженных аминокислот располагаются на границе раздела фаз мембраны и воды (White and von Heijne, 2005; White and von Heijne, 2008). Таким образом, физические свойства липидного бислоя могут оказывать влияние на организацию мембранных белков после встраивания (Pitonzo and Skach, 2006; von Heijne, 2006; Bogdanov et al., 2002; Mackenzie, 2006).

Глава 1.3 Топогенные сигналы и правила топологии

Топогенез мембранных белков определяется набором топогенных сигналов, кодируемых аминокислотной последовательностью, при этом процесс распознавания сигналов остается невыясненным. Комбинации сигналов достаточно для того, чтобы белок приобрел уникальную ориентацию трансмембранных доменов, но роль таких факторов, как транслокон и среда липидной мембраны в декодировании данных сигналов только предстоит выяснить. Общая гидрофобность отдельного трансмембранного домена является первичной энергетически выгодной силой для встраивания в мембрану (Lee and Manoil, 1994). Ориентация коррелирует более с общей гидрофобностью, нежели с длиной (Wahlberg and Spiess, 1997), но характеризуется сильной зависимостью от градиента гидрофобности в трансмембранном участке (Harley et al., 1998). Большинство гидрофобных концевых участков преимущественно транслоцируется через мембрану. Транслокация N-концевого участка требует наличия, как правило, длинной гидрофобной последовательности, а C-конца - короткой гидрофобной (Sakaguchi et al., 1992).

В большинстве случаев гидрофобность трансмембранного сегмента

достаточно сильна для того, чтобы транслоцировать экстрамембранные

участки. Однако согласно расчетам изменения свободной энергии при

20

встраивании в бислой, общая гидрофобность не является единственной причиной встраивания в мембрану; позиции аминокислотных остатков также оказывают важное влияние на эффективность и вероятность встраивания (Hessa et al., 2005; White and von Heijne, 2008). Триптофан и тирозин в отличие от фенилаланина и лейцина статистически чаще встречаются возле обоих концов трансмембранных участков и последние два значительно снижают вероятность встраивания при нахождении в центре участка, который, таким образом, вытесняется из мембраны.

Трансмембранные домены, содержащие заряженные аминокислоты, или домены с недостаточной степенью гидрофобности могут быть встроены синергично благодаря взаимодействию с другими участками (Cao et al., 1994; Carveth et al., 2002; Heinrich and Rapoport, 2003). Хотя гидрофобность является основным фактором, определяющим эффективность встраивания, полногеномный анализ распределения аминокислот в участках белков выявил перекрывание трансмембранных и растворимых участков в «полугидрофобном» диапазоне (Zhao and London, 2006). Данный факт увеличивает вероятность того, что значительное количество белков имеют последовательности, близкие к равновесию между встраиванием и исключением, что дает возможность трансмембранный участок элиминировать из мембраны и встраивать обратно при изменении условий среды.

Количество интегральных мембранных белков, содержащих

трансмембранные домены с необычно низкой гидрофобностью, довольно

ограничено. Наличие двух заряженных аминокислотных остатков в

трансмембранном домене, как правило, требует нейтрализации с

образованием солевых мостиков путем взаимодействия с другими доменами,

содержащими противоположные заряды (Engelman et al., 2003). Были

исследованы нехарактерные или смешанные топологии с гидрофобными

доменами, исключенными из мембраны бактерий (Gafvelin and von Heijne,

1994) и эукариот (Kanki et al., 2002; Sato and Mueckler, 1999; Tector and Hartl,

21

1999). Делеция, дупликация или изменения аминокислотной последовательности белка, приводящие к тому, что четное количество трансмембранных доменов становится нечетным, как правило, приводит к инверсии топологии белка (Saier, 2003).

Белок ChrA Pseudomonas aeruginosa, содержащий 13 доменов, синтезируется из двух гомологичных 6 доменов, разделенных одним (седьмым) гидрофобным сегментом и при этом они ориентированы наоборот относительно друг друга. Однако у 12-доменного белка ChrA Cupriavidus metallidurans 2 гомологичных фрагмента, содержащих по 6 доменов ориентированы в одинаковом порядке (Jimenez-Mejia et al., 2006). Сравнение последовательностей ChrA P. aeruginosa и C. metallidurans показало, что седьмой домен первого не имеет заряженных аминокислот, в то время как последовательность C. metallidurans (20-аминокислотный трансмембранный домен) полярен и содержит два положительно заряженных аминокислотных остатка.

Данный факт говорит о том, что оба ChrA белка произошли путем схожей внутренней дупликации предкового гена 6-доменного белка с последующей вставкой промежуточной последовательности, определяющей положение дуплицированных доменов. Другая топологически важная особенность политопных мембранных белков заключается в стадии фолдинга гидрофильных экстрамембранных участков (Granseth et al., 2005). Транслокация экстрамембранных доменов происходит в то время, пока белок не свернут. Таким образом, быстрый фолдинг гидрофильных доменов в цитоплазме может предотвращать транслокацию домена, в то время как фолдинг после транслокации закрепляет положение данного домена снаружи.

Глава 1.4 Правило положительных зарядов внутри

Конечная топология трансмембранных доменов политопных

мембранных белков детерминируется закодированной последовательностью,

22

которая взаимодействует с транслоконовой системой и уникальным липидным составом организма. Общая топология белка, по всей видимости, определяется расположением заряженных аминокислотных остатков между гидрофобными участками и в большинстве случаев подвергается действию правила положительных зарядов внутри (Nilsson et al., 2005), которое выражается в том, что на цитоплазматической стороне мембраны положительно заряженные аминокислоты мембранных белков встречаются в четыре раза чаще по сравнению с периплазматической стороной (von Heijne, 1989).

Замена положения даже одного остатка положительно заряженной аминокислоты с цитоплазматической стороны трансмембранного домена на противоположную приводит к инверсии топологии. Мутации, нарушающие правило положительных зарядов внутри, могут приводить к предотвращению вставки трансмембранного домена для того, чтобы данное правило соблюдалось (Gafvelin and von Heijne, 1994). В большинстве случаев точная позиция аминокислоты в последовательности не имеет значения, вклад зарядов носит аддитивный характер и важную роль играет плотность зарядов в последовательностях, находящихся между трансмембранными доменами (Andersson et al., 1992).

Однако правило положительных зарядов внутри имеет и исключения, так как были обнаружены цитоплазматические участки мембранных белков с суммарным отрицательным зарядом ( Allard and Bertrand, 1992; Pi et al., 2002).

Транслокон определяет первичную топологию белка, обеспечивая

пермиссивную гидрофильную среду, необходимую для транслокации

экстрамембранных участков в соответствии с правилом положительных

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рябичко Сергей Сергеевич, 2017 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Aboulwafa M. Biophysical studies of the membrane-embedded and cytoplasmic forms of the glucose-specific Enzyme II of the E. coli phosphotransferase system (PTS) / M. Aboulwafa, M.H.Jr. Saier // PLoS One. - 2011. - V.6:e24088.

2. Abramson J. Lactose permease as a paradigm for membrane transport proteins / J. Abramson, S. Iwata, H.R. Kaback // Mol. Membr. Biol. - 2004. - V.21. - pp.227-236.

3. Abramson J. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli / J. Abramson, I. Smirnova, V. Kasho et al. // Science. -2003. - V.301. - pp.610-615.

4. Acehan D. Cardiolipin affects the supramolecular organization of ATP synthase in mitochondria / D. Acehan, A. Malhotra, Y. Xu et al. // Biophys. J. - 2011. - V.100. - pp.2184-2192.

5. Allard J.D. Membrane topology of the pBR322 tetracycline resistance protein. TetAPhoA gene fusions and implications for the mechanism of TetA membrane insertion / J.D. Allard, K.P. Bertrand // J. Biol. Chem. -1992. - V.267. - pp.17809-17819.

6. Andersson H. Different positively charged amino acids have similar effects on the topology of a polytopic transmembrane protein in Escherichia coli / H. Andersson, E. Bakker, G. von Heijne // J. Biol. Chem. - 1992. - V.267. -pp.1491-1495.

7. Andersson H. Membrane protein topology: effects of A^H+ on the translocation of charged residues explain the 'positive inside' rule / H. Andersson, G. von Heijne // EMBO J. - 1994. - V.13. - pp.2267-2272.

8. Andersson H. Position-specific Asp-Lys pairing can affect signal sequence function and membrane protein topology / H. Andersson H, G. von Heijne // J. Biol. Chem. - 1993. - V.268. - pp.21389-21393.

9. Arechaga I. Characterisation of new intracellular membranes in Escherichia coli accompanying large scale over-production of the b subunit of F1F0 ATP synthase / I. Arechaga, B. Miroux, S. Karrasch et al. // FEBS Lett. - 2000. -V.482. - pp.215-219.

10. Arechaga I. Over-expression of Escherichia coli F1F0-ATPase subunit a is inhibited by instability of the uncB gene transcript / I. Arechaga, M. Miroux, M.J. Runswick, J.E. Walker // FEBS Lett. - 2003. - V.547. - pp.97-100.

11. Bay D.C. Membrane composition influences the topology bias of bacterial integral membrane proteins / D.C. Bay, R.J. Turner // Biochimica et Biophysica Acta. - 2013. - V.1818. - pp.260-270.

12. Bibi E. The N-terminal 22 amino acid residues in the lactose permease of Escherichia coli are not obligatory for membrane insertion or transport activity / E. Bibi, S.M. Stearns, H.R. Kaback // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - V.89. - pp.3180-3184.

13. Bogdanov M. A phospholipid acts as a chaperone in assembly of a membrane transport protein / M. Bogdanov, J. Sun, H.R. Kaback, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271. - pp.11615-11618.

14. Bogdanov M. A polytopic membrane protein displays a reversible topology dependent on membrane lipid composition / M. Bogdanov, P.N. Heacock, W. Dowhan // EMBO J. - 2002. - V.21. - pp.2107-2116.

15. Bogdanov M. Lipid-assisted protein folding / M. Bogdanov, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1999. - V.274. - pp.36827-36830.

16. Bogdanov M. Lipid-dependent generation of dual topology for a membrane protein / M. Bogdanov, W. Dowhan // J Biol Chem. - 2012. - V.287. -pp.37939-37948.

17. Bogdanov M. Lipids in the assembly of membrane proteins and organization of protein supercomplexes: implications for lipid-linked disorders / M. Bogdanov, E. Mileykovskaya, W. Dowhan // Subcell Biochem. - 2008. -V.49. - pp.197-239.

18. Bogdanov M. Phosphatidylethanolamine is required for in vivo function of the membrane-associated lactose permease of Escherichia coli / M. Bogdanov, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1995. - V.270. - pp.732-739.

19. Bogdanov M. Phospholipid-assisted protein folding: phosphatidylethanolamine is required at a late step of the conformational maturation of the polytopic membrane protein lactose permease / M. Bogdanov, W. Dowhan // EMBO J. - 1998. - V.17. - pp.5255-5264.

20. Bogdanov M. Phospholipid-assisted refolding of an integral membrane protein: minimum structural features for phosphatidylethanolamine to act as a molecular chaperone / M. Bogdanov, M. Umeda, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1999. - V.274. - pp.12339-12345.

21. Bogdanov M. Subcellular localization and logistics of integral membrane protein biogenesis in Escherichia coli / M. Bogdanov, M. Aboulwafa, M.H.Jr. Saier et al. // J Mol Microbiol Biotechnol. - 2013. - V.23(1-2). -pp.24-34.

22. Bogdanov M. To flip or not to flip: protein-lipid charge interactions are a determinant of final membrane protein topology / M. Bogdanov, J. Xie, P. Heacock, W. Dowhan // J. Cell Biol. - 2008. - V.182. - pp.925-935.

23. Bogdanov M. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAMTM): application to lipid-specific membrane protein topogenesis / M. Bogdanov, W. Zhang, J. Xie, W. Dowhan // Methods. - 2005. - V.36. - pp.148-171.

24. Bogdanov M. Lipids and topological rules governing membrane protein assembly / M. Bogdanov, W. Dowhan, H. Vitrac // Biochimica et Biophysica Acta. - 2014. - V.1843(8). - pp.1475-1488.

25. Böttinger L. Phosphatidylethanolamine and cardiolipin differentially affect the stability of mitochondrial respiratory chain supercomplexes / L. Böttinger, S.E. Horvath, T. Kleinschroth et al. // J. Mol. Biol. - 2012. -V.423-248(5). - pp.677-686.

26. Brambillasca S. Transmembrane topogenesis of a tail-anchored protein is modulated by membrane lipid composition / S. Brambillasca, M. Yabal, P. Soffientini et al. // EMBO J. - 2005. - V.24. - pp.2533-2542.

27. Brambillasca S. Unassisted translocation of large polypeptide domains across phospholipid bilayers / S. Brambillasca, M. Yabal, N. Borgese // J. Cell Biol. - 2006. - V.175. - pp.767-777.

28. Calamia J. lac permease of Escherichia coli: topology and sequence elements promoting membrane insertion / J. Calamia, C. Manoil // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - V.87. - pp.4937-4941.

29. Cao G. Synergistic insertion of two hydrophobic regions drives Sec-independent membrane protein assembly / G. Cao, S. Cheng, P. Whitley et al. // J. Biol. Chem. - 1994. - V.269. - pp.26898-26903.

30. Cao G. The translocation of negatively charged residues across the membrane is driven by the electrochemical potential: evidence for an electrophoresis-like membrane transfer mechanism / G. Cao, A. Kuhn, R.E. Dalbey // EMBO J. - 1995. - V.14. - pp.866-875.

31. Cao G. Translocation of N-terminal tails across the plasma membrane / G. Cao, R.E. Dalbey // EMBO J. - 1994. - V.13. - pp.4662-4669.

32. Carveth K. Cooperativity and flexibility of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator transmembrane segments participate in membrane localization of a charged residue / K. Carveth, T. Buck, V. Anthony, W.R. Skach // J. Biol. Chem. - 2002. - V.277. - pp.39507-39514.

33. Chen C.C. The phospholipid requirement for activity of the lactose carrier of Escherichia coli / C.C. Chen, T.H. Wilson // J. Biol. Chem. - 1984. - V.259. - pp.10150-10158.

34. Corcelli A. The cardiolipin analogues of Archaea / A. Corcelli // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - V.1788. - pp.2101-2106.

35. DeChavigny A. Sequence and inactivation of the pss gene of Escherichia coli. Phosphatidylethanolamine may not be essential for cell viability / A.

DeChavigny, P.N. Heacock, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1991. - V.266.

- pp.5323-5332.

36. Delgado-Partin V.M. The proton motive force, acting on acidic residues, promotes translocation of amino-terminal domains of membrane proteins when the hydrophobicity of the translocation signal is low / V.M. Delgado-Partin, R.E. Dalbey // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. - pp.9927-9934.

37. Dowhan W. Diversity and versatility of lipid-protein interactions revealed by molecular genetic approaches / W. Dowhan, E. Mileykovskaya, M. Bogdanov // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V.1666. - pp.19-39.

38. Dowhan W. Functional roles of lipids in membranes / W. Dowhan, M. Bogdanov, E. Mileykovskaya // In Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes, ed. D.E. Vance, J.E. Vance. - 2008. - pp.1-37. San Diego, CA: Elsevier. 5th ed.

39. Dowhan W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: Why are there so many phospholipids? / W. Dowhan // Annu. Rev. Biochem. - 1997.

- V.66. - pp.199-232.

40. Driessen A.J. Protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane / A.J. Driessen, N. Nouwen // Annu. Rev. Biochem. - 2008. -V.77. - pp.643-667.

41. Ehrmann M. Proper insertion of a complex membrane protein in the absence of its amino-terminal export signal / M. Ehrmann, J. Beckwith // J. Biol. Chem. - 1991. - V.266. - pp.16530-16533.

42. Elofsson A. Membrane protein structure: prediction versus reality / A. Elofsson, G. von Heijne // Annu. Rev. Biochem. - 2007. - V.76. - pp.125140.

43. Engelman D.M. Membrane protein folding: beyond the two stage model / D.M. Engelman, Y. Chen, C.N. Chin et al. // FEBS Lett. - 2003. - V.555. -pp.122-125.

44. Eriksson H.M. Massive formation of intracellular membrane vesicles in

Escherichia coli by a monotopic membrane-bound lipid glycosyltransferase

95

/ H.M. Eriksson, P. Wessman, C. Ge et al. // J. Biol. Chem. - 2009. -V.284(49). - pp.33904-33914.

45. Gafvelin G. Topological "frustration" in multispanning E. coli inner membrane proteins / G. Gafvelin, G. von Heijne // Cell. - 1994. - V.77. -pp.401-412.

46. Goder V. Glycosylation can influence topogenesis of membrane proteins and reveals dynamic reorientation of nascent polypeptides within the translocon / V. Goder, C. Bieri, M. Spiess // J. Cell Biol. - 1999. - V.147. - pp.257-266.

47. Goder V. Molecular mechanism of signal sequence orientation in the endoplasmic reticulum / V. Goder, M. Spiess // EMBO J. - 2003. - V.22. -pp.3645-3653.

48. Goder V. Sec61p contributes to signal sequence orientation according to the positive-inside rule / V. Goder, T. Junne, M. Spiess // Mol. Biol. Cell. -2004. - V.15. - pp.1470-1478.

49. Gouffi K. Dual topology of the Escherichia coli TatA protein / K. Gouffi, F. Gerard, C.L. Santini, L.F. Wu // J. Biol. Chem. - 2004. - V.279. -pp.11608-11615.

50. Granseth E. Astudy of the membrane-water interface region of membrane proteins / E. Granseth, G. von Heijne, A. Elofsson // J. Mol. Biol. - 2005. -V.346. - pp.377-385.

51. Guo D. Efficient insertion of odd-numbered transmembrane segments of the tetracycline resistance protein requires even-numbered segments / D. Guo, J. Liu, A. Motlagh et al. // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271. - pp.30829-30834.

52. Haines T.H. A new look at cardiolipin / T.H. Haines // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - V.1788. - pp.1997-2002.

53. Hamman B.D. The aqueous pore through the translocon has a diameter of 40-60 Â during cotranslational protein translocation at the ER membrane / B.D. Hamman, J.C. Chen, E.E. Johnson, A.E. Johnson // Cell. - 1997. -V.89. - pp.535-544.

54. Harley C.A. Transmembrane protein insertion orientation in yeast depends on the charge difference across transmembrane segments, their total hydrophobicity, and its distribution / C.A. Harley, J.A. Holt, R. Turner, D.J. Tipper // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. - pp.24963-24971.

55. Hartmann E. Predicting the orientation of eukaryotic membranespanning proteins / E. Hartmann, T.A. Rapoport, H.F. Lodish // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. - V.86. - pp.5786-5790.

56. Heinrich S.U. Cooperation of transmembrane segments during the integration of a double-spanning protein into the ER membrane / S.U. Heinrich, T.A. Rapoport // EMBO J. - 2003. - V.22. - pp.3654-3663.

57. Hessa T. Membrane insertion of a potassium-channel voltage sensor / T. Hessa, S.H. White, G. von Heijne // Science. - 2005. - V.307. - pp.1427.

58. Hessa T. Molecular code for transmembrane helix recognition by the Sec61 translocon / T. Hessa, N.M. Meindl-Beinker, A. Bernsel et al. // Nature. -2007. - V.450. - pp.1026-1030.

59. Hessa T. Recognition of transmembrane helices by the endoplasmic reticulum translocon / T. Hessa, H. Kim, K. Bihlmaier et al. // Nature. -2005. - V.433. - pp.377-381.

60. Higy M. Topogenesis of membrane proteins at the endoplasmic reticulum / M. Higy, T. Junne, M. Spiess // Biochemistry. - 2004. - V.43. - pp.1271612722.

61. Ikeda M. Manipulation of membrane protein topology on the endoplasmic reticulum by a specific ligand in living cells / M. Ikeda, Y. Kida, S. Ikushiro, M. Sakaguchi // J. Biochem. - 2005. - V.138. - pp.631-637.

62. Ismail N. Specific transmembrane segments are selectively delayed at the ER translocon during opsin biogenesis / N. Ismail, S.G. Crawshaw, B.C. Cross et al. // Biochem. J. - 2008. - V.411. - pp.495-506.

63. Ito K. In vivo analysis of integration of membrane proteins in Escherichia coli / K. Ito, Y. Akiyama // Mol. Microbiol. - 1991. - V. - pp.2243-2253.

64. Jimenez-Mejia R. Membrane topology of the chromate transporter ChrA of Pseudomonas aeruginosa / R. Jimenez-Mejia, J. Campos-Garcia, C. Cervantes // FEMS Microbiol. Lett. - 2006. - V.262. - pp.178-184.

65. Kanki T. The tenth membrane region of band 3 is initially exposed to the luminal side of the endoplasmic reticulum and then integrated into a partially folded band 3 intermediate / T. Kanki, M. Sakaguchi, A. Kitamura et al. // Biochemistry. - 2002. - V.41. - pp.13973-13981.

66. Kida Y. Two translocating hydrophilic segments of a nascent chain span the ER membrane during multispanning protein topogenesis / Y. Kida, F. Morimoto, M. Sakaguchi // J. Cell Biol. - 2007. - V.179. - pp.1441-1452.

67. Kikuchi S. Viability of an Escherichia coli pgsA null mutant lacking detectable phosphatidylglycerol and cardiolipin / S. Kikuchi, I. Shibuya, K.J. Matsumoto et al. // J. Bacteriol. - 2000. - V.182. - pp.371-376.

68. Kooijman E.E. Spontaneous curvature of phosphatidic acid and lysophosphatidic acid / E.E. Kooijman, V. Chupin, N.L. Fuller et al. // Biochemistry. - 2005. - V.44(6). - pp.2097-2102.

69. Krishtalik L.I. On the physical basis for the cis-positive rule describing protein orientation in biological membranes / L.I. Krishtalik, W.A. Cramer // FEBS Lett. - 1995. - V.369. - pp.140-143.

70. Lee E. Mutations eliminating the protein export function of a membrane-spanning sequence / E. Lee, C. Manoil // J. Biol. Chem. - 1994. - V.269. -pp.28822-28828.

71. Li X. Mesosome formation is accompanied by hydrogen peroxide accumulation in bacteria during the rifampicin effect / X. Li, H.Q. Feng, X.Y. Pang, H.Y. Li / Mol Cell Biochem. - 2008. - V.311. - pp.241-247.

72. Lopez C.S. Role of anionic phospholipids in the adaptation of Bacillus subtilis to high salinity / C.S. Lopez, A.F. Alice, H. Heras et al. // Microbiology. - 2006. - V.152. - pp.605-616.

73. Lopez F. Light-dependent and biochemical properties of two different bands

of bacteriorhodopsin isolated on phenyl-sepharose CL-4B / F. Lopez, S.

98

Lobasso, M. Colella et al. // Photochem. Photobiol. - 1999. - V.69. - pp.599604.

74. Lu Y. Reorientation of aquaporin-1 topology during maturation in the endoplasmic reticulum / Y. Lu, I.R. Turnbull, A. Bragin et al. // Mol. Biol. Cell. - 2000. - V.11. - pp.2973-2985.

75. Lundin M. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B / M. Lundin, M. Monne, A. Widell et al. // J. Virol. - 2003. - V.77. -pp.5428-5438.

76. Mackenzie K.R. Folding and stability of a-helical integral membrane proteins / K.R. Mackenzie // Chem. Rev. - 2006. - V.106. - pp.1931-1977.

77. Manning A.J. Contribution of bacterial outer membrane vesicles to innate bacterial defense / A.J. Manning, M.J. Kuehn // BMC Microbiol. - 2011. -V.11. - pp.258.

78. McBroom A.J. Release of outer membrane vesicles by Gram-negative bacteria is a novel envelope stress response / A.J. McBroom, M.J. Kuehn // Mol Microbiol. - 2007. - V.63. - pp.545-558.

79. Mellman I. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells / I. Mellman, W.J. Nelson // Nature Rev. Mol. Cell Biol. -2008. - V.9. - pp.833-845.

80. Monne M. Competition between neighboring topogenic signals during membrane protein insertion into the ER / M. Monne, T. Hessa, L. Thissen, G. von Heijne // FEBS J. - 2005. - V.272. - pp.28-36.

81. Murat D. Comprehensive genetic dissection of the magnetosome gene island reveals the step-wise assembly of a prokaryotic organelle / D. Murat, A. Quinlan, H. Vali, A. Komeili // Proc Natl Acad Sci USA. - 2010. - V.107. -pp.5593-5598.

82. Nagamori S. In vitro synthesis of lactose permease to probe the mechanism of membrane insertion and folding / S. Nagamori, J.L. Vazquez-Ibar, A.B. Weinglass, H.R. Kaback // J. Biol. Chem. - 2003. - V.278. - pp.1482014826.

83. Nilsson I. Fine-tuning the topology of a polytopic membrane protein: role of positively and negatively charged amino acids / I. Nilsson, G. von Heijne // Cell. - 1990. - V.62. - pp.1135-1141.

84. Nilsson J. Comparative analysis of amino acid distributions in integral membrane proteins from 107 genomes / J. Nilsson, B. Persson, G. von Heijne // Proteins. - 2005. - V.60. - pp.606-616.

85. Palsdottir H. Structure of the yeast bcj complex with a hydroxyquinone anion QO site inhibitor bound / H. Palsdottir, C.G. Lojero, B.L. Trumpower, C. Hunte // J. Biol. Chem. - 2003. - V.278. - pp.31303-31311.

86. Parks G.D. Role of NH2-terminal positively charged residues in establishing membrane protein topology / G.D. Parks, R.A. Lamb // J. Biol. Chem. -1993. - V.268. - pp.19101-19109.

87. Patil V.A. Loss of cardiolipin leads to perturbation of mitochondrial and cellular iron homeostasis/ V.A. Patil, J.L. Fox, V.M. Gohil et al. // J. Biol. Chem. - 2013. - V.288. - pp.1696-1705.

88. Pebay-Peyroula E. Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside / E. Pebay-Peyroula, C. Dahout-Gonzalez, R. Kahn et al. // Nature. - 2003. - V.426. - pp.39-44.

89. Pfeiffer K. Cardiolipin stabilizes respiratory chain supercomplexes / K. Pfeiffer, V. Gohil, R.A. Rosemary et al. / J. Biol. Chem. - 2003. - V.278. -pp.52873-52880.

90. Pi J. Study of second-site suppression in the pheP gene for the phenylalanine transporter of Escherichia coli / J. Pi, H. Chow, A.J. Pittard // J. Bacteriol. -2002. - V.184. - pp.5842-5847.

91. Pitonzo D. Molecular mechanisms of aquaporin biogenesis by the endoplasmic reticulum Sec61 translocon / D. Pitonzo, W.R. Skach // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V.1758. - pp.976-988.

92. Pomerleau V. Lipid-protein interactions in the purple membrane: structural specificity within the hydrophobic domain / V. Pomerleau, G. Harvey, F.

Boucher // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - V.1234(2). - pp.221-224.

100

93. Raetz C.R. Biosynthesis and function of phospholipids in Escherichia coli / C.R. Raetz, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 1990. - V.265. - pp.1235-1238.

94. Rapoport T.A. Extensions of the signal hypothesis-sequential insertion model versus amphipathic tunnel hypothesis / T.A. Rapoport // FEBS Lett. -1985. - V.187. - pp.1-10.

95. Rapoport T.A. Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial plasma membranes / T.A. Rapoport // Nature. -2007. - V.450. - pp.663-669.

96. Ratledge. Microbial lipids / ed. S. Ratledge, S.G. Wilkinson // Microbial lipids. Academic press. London. - 1988. - P.726.

97. Romantsov T. Cardiolipin and the osmotic stress responses of bacteria / T. Romantsov, Z. Guan, J.M. Wood // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. -V.1788. - pp.2092-2100.

98. Rutz C. A single negatively charged residue affects the orientation of a membrane protein in the inner membrane of Escherichia coli only when it is located adjacent to a transmembrane domain / C. Rutz, W. Rosenthal, R.J. Schulein // Biol. Chem. - 1999. - V.274. - pp.33757-33763.

99. Sadlish H. Sequential triage of transmembrane segments by Sec61a during biogenesis of a native multispanning membrane protein / H. Sadlish et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2005. - V.12. - pp. 870-888.

100. Saier M.H. Jr. Tracing pathways of transport protein evolution / M.H. Jr. Saier // Mol. Microbiol. - 2003. - V.48. - pp.1145-1156.

101. Saier M.H.Jr. Membranous organelles in bacteria / M.H.Jr. Saier, M. Bogdanov // J. Mol. Microb. Biotech. - 2013. - V.23. - pp.5-12.

102. Sakaguchi M. Functions of signal and signal-anchor sequences are determined by the balance between the hydrophobic segment and the N-terminal charge / M. Sakaguchi, R. Tomiyoshi, T. Kuroiwa et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - V.89. - pp.16-19.

103. Salzberg L.I. Phenotypic and transcriptomic characterization of Bacillus subtilis mutants with grossly altered membrane composition / L.I. Salzberg, J.D. Helmann // J. Bacteriol. - 2008. - V.190. - pp.7797-7807.

104. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition / J. Sambrook, D.W. Russel // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2001.

105. Sato M. A conserved amino acid motif (R-X-G-R-R) in the Glut1 glucose transporter is an important determinant of membrane topology / M. Sato, M. Mueckler // J. Biol. Chem. - 1999. - V.274. - pp.24721-24725.

106. Schagger H. Phospholipid specificity of bovine heart bc1 complex / H. Schagger, T. Hagen, B. Roth et al. // Eur. J. Biochem. - 1990. - V.190(1). -pp.123-130.

107. Schlame M. The role of cardiolipin in the structural organization of mitochondrial membranes / M. Schlame, M. Ren // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - V.1788. - pp.2080-2083.

108. Shinzawa-Itoh K. Structures and physiological roles of 13 integral lipids of bovine heart cytochrome c oxidase / K. Shinzawa-Itoh, H. Aoyama, K. Muramoto et al. // EMBO J. - 2007. - V.26. - pp.1713-1725.

109. Slatin S.L. Translocation of a functional protein by a voltagedependent ion channel / S.L. Slatin, A. Nardi, K.S. Jakes et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - V.99. - pp.1286-1291.

110. Springer A. Protons migrate along interfacial water without significant contributions from jumps between ionizable groups on the membrane surface / A. Springer, V. Hagen, D.A. Cherepanov et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2011. - V.108. - pp.14461-14466.

111. Steponkus P.L. Freeze-induced destabilization of cellular membranes and lipid bilayers / P.L. Steponkus, M. Uemura, M.S. Webb // Chapter 4 in Permeability and stability of lipid bilayers ed. by E.A. Disalvo and S.A. Simon. - 1995. - pp.77-104.

112. Sugai R. Topology inversion of SecG is essential for cytosolic SecA-

dependent stimulation of protein translocation / R. Sugai, K. Takemae, H.

102

Tokuda, K.I. Nishiyama // J. Biol. Chem. - 2007. - V.282. - pp.2954029548.

113. Sun J. Identification of the epitope for monoclonal antibody 4B1 which uncouples lactose and proton translocation in the lactose permease of Escherichia coli / J. Sun, J. Wu, N. Carrasco, H.R. Kaback // Biochemistry.

- 1996. - V.35. - pp.990-998.

114. Tector M. An unstable transmembrane segment in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator / M. Tector, F.U. Hartl // EMBO J. -1999. - V.18. - pp.6290-6298.

115. Tsai M. Staphylococcus aureus requires cardiolipin for survival under conditions of high salinity / M. Tsai, R.L. Ohniwa, Y. Kato et al. // BMC Microbiol. - 2011. - V.11, 10.1186/1471-2180-11-13.

116. van den Berg B. X-ray structure of a protein-conducting channel / B. van den Berg, W.M. Jr. Clemons, I. Collinson et al. // Nature. - 2004. - V.427. -pp.36-44.

117. van Klompenburg W. Anionic phospholipids are determinants of membrane protein topology / W. van Klompenburg, I. Nilsson, G. von Heijne, B. de Kruijff // EMBO J. - 1997. - V.16. - pp.4261-4266.

118. van Teeseling M.C. The anammoxosome organelle is crucial for the energy metabolism of anaerobic ammonium oxidizing bacteria / M.C. van Teeseling, S. Neumann, L. van Niftrik // J Mol Microbiol Biotechnol. 2013.

- V.23(1-2). - pp.104-117.

119. Vartak R. Respiratory supercomplexes. Structure, function and assembly / R. Vartak, C.A. Porras, Y. Bai // Protein Cell. - 2013. - V.4. - pp.582-590.

120. von Heijne G. Control of topology and mode of assembly of a polytopic membrane protein by positively charged residues / G. von Heijne // Nature.

- 1989. - V.341. - pp.456-458.

121. von Heijne G. Membrane-protein topology / G. von Heijne // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2006. - V.7. - pp.909-918.

122. Wahlberg J.M. Multiple determinants direct the orientation of signal-anchor proteins: the topogenic role of the hydrophobic signal domain / J.M. Wahlberg, M. Spiess // J. Cell Biol. - 1997. - V.137. - pp.555-562.

123. Wang X. Topology of polytopic membrane protein subdomains is dictated by membrane phospholipid composition / X. Wang, M. Bogdanov, W. Dowhan // EMBO J. - 2002. - V.21. - pp.5673-5681.

124. White S.H. Do protein-lipid interactions determine the recognition of transmembrane helices at the ER translocon? / S.H. White, G. von Heijne // Biochem. Soc. Trans. - 2005. - V.33. - pp.1012-1015.

125. White S.H. How translocons select transmembrane helices / S.H. White, G. von Heijne // Annu. Rev. Biophys. - 2008. - V.37. - pp.23-42.

126. Wikstrom M. Lipid-engineered Escherichia coli membranes reveal critical lipid head-group size for protein function / M. Wikstrom, A. Kelly, A. Georgiev et al. // J. Biol. Chem. - 2009. - V.284. - pp.954-965.

127. Wikstrom M. Monoglucosyl diacylglycerol, a foreign lipid, can substitute for phosphatidylethanolamine in essential membrane-associated functions in Escherichia coli / M. Wikstrom, J. Xie, M. Bogdanov et al. // J. Biol. Chem. - 2004. - V.279. - pp.10484-10493.

128. Woronowicz K. Structural and functional proteomics of intracytoplasmic membrane assembly in Rhodobacter sphaeroides / K. Woronowicz, J.W. Harrold, J.M. Kay, R.A. Niederman // J Mol Microbiol Biotechnol. - 2013. -V.23(1-2). - pp.48-62.

129. Xie J. Phosphatidylethanolamine and monoglucosyl diacylglycerol are interchangeable in supporting topogenesis and function of the polytopic membrane protein lactose permease / J. Xie, M. Bogdanov, P. Heacock, W. Dowhan // J. Biol. Chem. - 2006. - V.281. - pp.19172-19178.

130. Yankovskaya V. Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation / V. Yankovskaya, R. Horsefield, S. Törnroth et al. // Science. - 2003. - V.299(5607). - pp.700-704.

131. Zhang M. Cardiolipin is essential for organization of complexes III and IV into a supercomplex in intact yeast mitochondria / M. Zhang, E. Mileykovskaya, W. Dowhan / J. Biol. Chem. - 2005. - V.280. - pp.2940329408.

132. Zhang W. Phospholipids as determinants of membrane protein topology. Phosphatidylethanolamine is required for the proper topological organization of the y-aminobutyric acid permease (GabP) of Escherichia coli / W. Zhang, H.A. Campbell, S.C. King, W. Dowhan // J. Biol. Chem. -2005. - V.280. - pp.26032-26038.

133. Zhang W. Reversible topological organization within a polytopic membrane protein is governed by a change in membrane phospholipid composition / W. Zhang, M. Bogdanov, J. Pi et al. // J. Biol. Chem. - 2003. - V.278. -pp.50128-50135.

134. Zhang X. Cardiolipin-deficiency in Rhodobacter sphaeroides alters the lipid profile of membranes and of crystallized cytochrome oxidase, but structure and function are maintained / X. Zhang, B. Tamot, C. Hiser et al. // Biochemistry. - 2011. - V.50(19). - pp.3879-3890.

135. Zhao G. An amino acid "transmembrane tendency" scale that approaches the theoretical limit to accuracy for prediction of transmembrane helices: relationship to biological hydrophobicity / G. Zhao, E. London // Protein Sci. - 2006. - V.15. - pp.1987-2001.