Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Пуртов, Константин Викторович

• Пуртов, Константин Викторович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пуртов, Константин Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ.

1.1. Методы разделения белков.

1.2. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода.

1.3. Применение принципов лигандообменной хроматографии при разделении белковых молекул.

1.4. Очистка рекомбинантных белков, включая белки Са -активируемой; фотопротеиновой группы - апообелин и апоакворин.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ И ПРОВЕРКА ЕГО

ПРИМЕНИМОСТИ НА ПРИМЕРЕ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ

МАРКЕРНЫХ БЕЖОВ.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМЕНИМОСТИ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ Са2+-АКТИВИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК E.coli.

4.1. Очистка апообелина.

4.2. Сравнение метода ЛОРБ с хроматографическим методом.

4.3. Сравнение биохимических характеристик апообелина, полученного разными методами.

4.4. Выделение апоакворина.

4.5. Очистка мутантов апообелина и апоакворина.

ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ОЧИСТКИ

РЕКОМБИНАНТНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ ИЗ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК E.coli.

ГЛАВА 6. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ

РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ МЕТОДОМ ЛОРБ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии»

Успехи молекулярной биологии и генной инженерии за последние 15-20 лет предопределили значительный прогресс в биологии в целом и, в частности, в белковой химии. Пожалуй, следует выделить три главных достижения.

Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка [1].

Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов [2].

В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для получения больших количеств изучаемых белков [3].

В значительной мере решение именно этих вопросов позволило экспериментаторам резко активизировать фундаментальные исследования, направленные на изучение не только особенностей строения различных белковых молекул, но и взаимосвязи между структурой белка и выполняемой им специализированной функцией [4]. До недавнего времени, такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

В тоже время, решение проблемы получения больших количеств белков и, прежде всего, белков, обладающих маркерными свойствами, позволило активизировать поиски путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии [5,6].

Одним из примеров такого рода достижений являются успехи в изучении Са -активируемых фотопротеинов. К настоящему времени клонированы и успешно экспрессированы в клетках-реципиентах четыре Са2+-активируемых фотопротеина - акворин, клитин, митрокомин и обелин [7, 8, 9, 10]. Создание штаммов-продуцентов этих белков, а также их мутантных форм, способствовало не только существенному продвижению в понимании функционирования этой группы светоизлучающих белков, но и применению фотопротеинов как биолюминесцентных меток при разработке различных тест-систем [11,12].

Достижения молекулярной биологии и генной инженерии способствовали развитию биотехнологии. Разработка и создание современных высоко эффективных биотехнологий получения белков в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом предполагается, что усилия при разработке новых биотехнологий будут, прежде всего, направлены на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белков [13].

Исходя из этого, основной целью работы являлась обоснование и разработка новой биотехнологии для очистки рекомбинантных белков без применения хроматографии - метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Сформулировать основные, принципиальные положения метода ЛОРБ и провести проверку его пригодности в модельных экспериментах на примере разделения смеси коммерческих белковых препаратов.

2. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки I из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантных Са -активируемых фотопротеинов: апообелина, апоакворина и их мутантных форм.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из бактериальных клеток Е. coli рекомбинантной бактериальной люциферазы

4. Разработать общую технологическую схему выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ.

При решении поставленных задач получены следующие результаты:

1. Многие белковые молекулы способны образовывать хелатные комплексы с ионами металлов в растворе, что приводит к их последующей денатурации. Причем, последовательность денатурации белков, очевидно, определяется размерами белковых молекул, наличием и числом дисульфидных связей в них, количеством доступных аминокислотных остатков, участвующих в координации, природой иона и его концентрацией, а также величиной рН применяемой буферной системы.

2. Из образовавшегося белкового осадка, можно с высокой селективностью экстрагировать нужный белок (белки), подбирая условия для разрушения хелатного комплекса металл-белок. При этом селективность экстракции, будет определяться выбором используемого свободного лиганда, его концентрацией, рН применяемого элюента, или сочетанием этих факторов.

3. Данные координационной химии, молекулярной биологии, лигандного обмена, а также обнаруженный эффект преципитации белков в растворе под действием двухвалентных ионов металлов позволили обосновать, сформулировать и предложить новую технологию разделения и очистки белков - метод «лигандообменного разделения белков» (ЛОРБ).

4. Разработанные и исследованные схемы очистки позволили получить из биомассы бактериальных клеток Е. coli высокоочищенные препараты рекомбинантных апообелина, апоакворина и их мутантов с выходом 35-40%. Из биомассы; бактериальных клеток Е. coli получен препарат рекомбинантной бактериальной люциферазы в практически гомогенном состоянии с выходом 50-60%. Время очистки белков методом ЛОРБ не превышает 2-3 часов.

5. Предложенная технологическая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ, позволяет произвести выбор стратегии в очистке искомого белка. На примере использования ультрафильтрационной ячейки впервые показан вариант технологической; установки для очистки рекомбинантного апообелина, позволяющей вести процесс очистки белка непрерывно.

Проведенные в работе исследования дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет несомненную общебиологическую значимость. Учитывая результаты работы можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий, расширяющая арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул. Отличаясь от известных методов простотой, метод ЛОРБ не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей. Это дает основания полагать, что предложенная в работе технология имеет широкие перспективы практического применения.Разработанный метод успешно применяется в лаборатории фотобиологии НИУБФ СО РАН для выделения рекомбинантных белков.

Материалы диссертации докладывались на IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000), I Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), конференциях молодых ученых и специалистов Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2000-2001), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Пуртов, Константин Викторович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов и использовании данных координационной химии, белковой химии, молекулярной биологии и физхимии ионов двухвалентных металлов в растворе.

2. В модельных экспериментах с использованием смеси коммерческих белковых препаратов, включающих: фосфорилазу Б — 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу - 30 кДа; соевый ингибитор трипсина — 20,1 кДа; лактальбумин - 14,4 кДа, показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул.

3. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серин, а также с делецией; 14 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Процедура очистки белков по данной технологии занимает 2-3 часа и не требует использования хроматографического оборудования и сорбентов.

4. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантного апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот. Получены высокоочищенные препараты этих белков с выходом 35-40%. Время очистки белков данной технологией составляет 2-3 часа и из процесса исключается хроматографическое оборудование и сорбенты.

5. Разработана схема выделения и очистки методом ЛОРБ гетеродимерного белка - рекомбинантной люциферазы из биомассы бактериальных клеток Е. coli. Получен высокоочищенный препарат данного фермента с выходом 50-60%. Время очистки белка составляет не более 1,5 часов, из процесса исключено хроматографическое оборудование и сорбенты.

6. Разработана и предложена общая схема выделения и очистки рекомбинантных белков методом ЛОРБ. Рекомендации, приведенные для каждого этапа схемы, позволяют осуществить выбор стратегии и подбор условий очистки конкретного выделяемого белка с учетом его структурно-функциональных особенностей.

7. На примере использования ячейки для ультрафильтрации показана модель работающей технологической установки для выделения рекомбинантного апообелина, позволяющая проводить процесс очистки белка непрерывно.

108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена разработке и созданию новой высоко эффективной биотехнологии выделения и очистки рекомбинантных белков — метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).

Успехи молекулярной биологии и генной инженерии за последние годы предопределили значительный прогресс в биологии в целом и, в частности, в белковой химии.

Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить пггамм-продуцент практически любого белка.

Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов.

В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для получения больших количеств изучаемых белков.

В значительной мере решение именно этих вопросов позволило экспериментаторам, работающим в области бежовой химии, резко активизировать фундаментальные исследования, направленные на изучение не только особенностей строения различных белковых молекул, но и взаимосвязи между структурой белка и выполняемой им специализированной функцией. До недавнего времени такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

В тоже время, решение проблемы получения больших количеств белков и, прежде всего, белков, обладающих маркерными свойствами, позволило активизировать поиски путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии.

В связи с этим, очевидно, что разработка и создание новых высоко эффективных биотехнологий для решения прикладных задач белковой химии, связанных с получением высокоочищенных белков, в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом; основные усилия исследователей направлены на разработку таких технологий, которые позволяли бы, прежде всего, убыстрять, упрощать и удешевлять процедуры выделения и очистки белков.

Именно этими обстоятельствами объяснялась целесообразность проведения данной работы

В результате проведенных исследований был обнаружен эффект преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта и анализ полученных, результатов позволил обосновать разработать и предложить новый метод выделения и очистки белковых молекул, получивший название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ).

Разработанный метод нашел свою практическую реализацию в решении ряда прикладных задач связанных с выделением и очисткой различных рекомбинантных белков. С помощью метода ЛОРБ были выделены и очищены мономерные белки фотопротеиновой группы - апообелин, апоакворин, а также их различные мутанты. Этот метод оказался столь же эффективен и при очистке гетеродимерного белка — бактериальной люциферазы. На основании анализа полученных результатов была обоснована и предложена общая принципиальная схема выделения и очистки белков технологией ЛОРБ. Была также предложена и продемонстрирована действующая модель технологической установки, показывающая на примере рекомбинантного апообелина возможность проведения процесса очистки белка непрерывно.

Предложенная технология имеет широкие перспективы применения в белковой химии. Метод ЛОРБ прост и не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей.

Суммируя приведенные выше результаты, можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий, расширяющая арсенал методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пуртов, Константин Викторович, 2004 год

1. Ferguson H.A., Goodrich, J. A. Expression and purification of recombinant human c-Fos/c-Jun that is highly active in DNA binding and transcriptional activation in vitro. // Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. P. 98-105.

2. Kidokoro S. Design of protein function by physical perturbation method. // Adv Biophys. -1998. -V. 35. -P. 121-143.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир. — 2002. — 590 с.

4. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Маликова Н.П., Франк Л.А., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина. // Биохимия. 2001. - Т. — 66. - №9. - С.1245-1251.

5. Пуртов К.В., Пузырь А.П., Бондарь B.C. Создание надмолекулярной структуры из частиц наноалмаза и обелина на двумерной подложке. // Доклады РАН. 2001. - Т. - 380. - №3. - С.411-414

6. Jackson R.J., Fujihashi К., Kiyono Н., McGhee J.R. Luminometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. // J. Immunol Methods. 1996. - V. 190. - P. 189-197.

7. Prasher D.C., McCann R.O., Cormier M.J. Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1985. - V. 126. - P. 1259-1268.

8. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-activated photoprotein, clytin. // FEBS Lett. 1993. - V. 315. - P. 343-346.

9. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. // Biochem Biophys Res Commun. 1996. - V. 219. -P. 475-479.

10. Campbell A.K., Dormer R.L., Hallett M.B. Coelenterate photoproteins as1. Ч Iindicators of cytoplasmic free Ca in small cells. // Cell Calcium. 1985. - V. 6. -P. 69-82.

11. Галаев И.Ю. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. 1999. - Т. 64. - С. 1013-1021.

12. Welch P., Scopes R. К. Rapid purification and crystallization of yeast phosphofructokinase // Anat. Biochem. -1981. P. 154-157.

13. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biologicalmembranes / New York: Wiley-Interscience. 1980. - 318 p.

14. Скоупс P. Методы очистки белков. M.: Мир. 1985. - 358 с.

15. Curling J. М. Methods of plasma protein fractionation / New York: AcademicPress. 1980.-297 p.

16. Czok R., Biicher T. Crystallized enzymes from the myogen of rabbit skeletal muscle // Advan. Prot. Chem. 1960. - V. 15. - P. 315-415.

17. Dobry A., Boyer-Kawenoki F. Phase separation in polymer solution // J. Polym. Sci. 1947. - V. 2. - P. 90-100.

18. Albertsson P. A. In: Partition of cell particles and macromolecules / New York: Wiley.-1971.-315 p.

19. Hartman A., Johansson G., Albertsson P. A. Partition of proteins in a three-phase system // Eur. J. Biochem. 1974. - V. 46. - P. 75-81.

20. Chaabouni A., Dellacherie E. Affinity partition of proteins in aqueous two phase systems containing polyoxyethylene glycol bound ligand and charged dextrans // J. Chromatogr. 1979. - V. 171. - P. 135-143.

21. Kula M. R. Extraction and purification of enzymes using aqueous 2-phase systems. In: Applied biochemistry and bioengineering // AcademicPress. 1979. -V. 2.-P. 71-96.

22. Fischer L. Gel filtration chromatography // In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H., (eds.). -Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1980. - V. 1. - 213 p.

23. Gordon A. H. Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels // In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H., (eds.). - Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1979. - V. 1. -345p.

24. Pharmacia Fine Chemicals AB Publications . Gel filtration: Theory and practice. -Uppsala. 1980.-257 p.

25. Gribnau Т. C. J., Visser L, Nivard R. J. F. Affinity chromatography and related techniques. Elsevier, Amsterdam.- 1982. 302 p.

26. Lowe C. R., Dean P. D. G. Affinity chromatography. Wiley, London. — 1974. -378 p.

27. Jackoby W. B. Affinity techniques: Enzyme purification // Methods in Enzymology. 1974. - V. 34. - P. 214-221.

28. Peterson E. A., Sober H. A. Chromatography of proteins. I. Cellulose ion exchange adsorbents // J. Amer. Chem. Soc. 1956. - V. 78. - P. 751-755.

29. Affinity chromatography: Principles and methods. Pharmacia Fine Chemicals AB publications. Uppsala. - 1979. - 218 p.

30. Scopes R. K. Quantitative studies of ionexchange and affinity elutiort chromatography of enzymes // Anal. Biochem. — 1981.-V. 114. P. 8-18.

31. Scopes R. K. Techniques for protein purification // Elsevier North-Holland, Amsterdam. 1978. - V. 101. - P. 1-42.

32. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusingon ion-exchange columns. I. General principles // J. Chromatogr. 1978. - V. 150. -P. 17-30.

33. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ion-exchange columns. II. Experimental verification // J. Chromatogr. — 1978. -V. 150.-P. 31-44.

34. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing. III. The properties of a DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981. - V. 206. - P. 429-440.

35. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing. IV. Properties of an agarose polyethyleneimine ion-exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981. - V. 206. - P. 441-447.

36. Pogell B. N. Enzyme purification by selective elution with substrate from substituted cellulose columns // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. - V. 7.-P. 225- 230.

37. Black W. S., van Tol A., Fernando S., Horecker B. L. Isolation of a highly active fructose diphosphatase from rabbit muscle: Its subunit structure and activation by monovalent cations // Arch. Biochem. Biophys. 1972. - V. 151. -P. 576-590.

38. Scopes R. K. Purification of clycolytic enzymes by using affinity elution chromatography // Biochem. J. 1977. - V. 161. - P. 253-263.

39. Scopes R. K. Multiple enzyme purifications from muscle extracts by using affinity elution chromatographic procedures // Biochem. J. 1977. - V. 161. - P. 265-277.

40. Von der Haar F. Affinity elution principles and applications to purification of aminoacyl-tRNA synthetases // Meth. Enzymol. 1974. - V. 34. - P. 163-171.

41. Eisenbarth G. S. Application of monoclonal antibody techniques to biochemical research // Anat. Biochem. 1981. - V. 11. - P. 1-16.

42. Porath J., Flodin P. Gel filtration: A method for desalting and group separation //Nature. 1959.-V. 83. ~P. 1657-1659.

43. Whitaker J. R. Determination of molecular weights of proteins by gel filtration on Sephadex // Anal. Chem. 1963. - V. 35. - P. 1950-1953.

44. Andrews P. The gel filtration behaviour of proteins related to their molecular weight over a wide range // Biochem. J. 1965. - V. 96. - P. 595-606.

45. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: Group variations in the serum proteins of normal human adults // Biochem. J. 1955. — V. 61. - P. 629641.

46. Gordon A. H. Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Work T. S. and Burdon R. H. (eds.). - Elsevier North-Holland, Amsterdam. - 1979. - V. 1. -311p.

47. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory // Ann N. Y. Acad. Sci.- 1964. — V. 121.-P. 321-349.

48. Hofejsi V., Kocourek I. Affinity electrophoresis: Separation of phytohemagglutimns on O-glycosyl polyacrylamide gels // Meth. Enzymol. — 1974.-V. 34.-P. 178-181.

49. Bog-Hansen Т. C. Crossed immuno-affinoelectrophoresis: An analytical method to predict the result of affinity Chromatography // Anal. Biochem. 1973. — V. 56.-P. 480-488.

50. Tichd M., Hofejsi V., Barthovd J. Affinity electrophoresis of proteins interacting with blue dextran // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - V. 534. - P. 58-63.

51. Baumann G., Chrambach A. Gram-preparative protein fractionation by isotachophoresis: Isolation of human growth hormone isohormones // Proc. Nat. Acad. Sci. 1976. - V. 73. - P. 732-736.

52. Tsuji A., Sekiguchi K. Adsorption of nicotine acid hydrazide on cation exchanger of various metal forms // Nippon Kagaku Zasshi. 1960. - V. 81. - P. 847-852.

53. Helfferich F. Ligand exchange. A novel separation technique // Nature. 1961. — V.189.-P. 1001-1005.

54. Helfferich F. Ligand exchange. I. Equilibria I I J. Am. Chem. Soc. 1962. -V. 84. -P. 3237-3241.

55. Helfferich F. Ligand exchange. II. Separation of ligands having different coordinative valencies //J. Am Chem. Soc. 1962.- V. 84. - P. 3242-3248.

56. Даванков B.A., Рогожин C.B. Хроматография лигандов новый метод изучения смешанных комплексов. // ДАН СССР. - 1970. - Т. 193. - С. 94111.

57. Wagner F.W., Shepherd S.L. Ligand exchenge amino acid analysis resolution of some amino sugars and cysteine derivatives. // Anal. Biochem. - 1971. - V. 41. -P. 314-320.

58. Sampson В., Barlow G.B, Separation of peptides and amino acids by ion exchenge chromatography of their copper complexes. // J: Inst. Brew. 1980. - V. 77.-P. 9-23.

59. Даванков В.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир. -1989. -294 с.

60. Fazakerley S., Best D.R. Separation of amino acids, as copper chelates, from amino acid protein, and peptide mixtures. // Anal. Biochem. 1965. - V. 12. - P. 290- 297.

61. Rothenbuhler E., Waibel R., Solms J. An improved method for the separation of peptides and a-amino acids on copper Sephadex. // Anal. Biochem. 1979. - V. 97.-P. 367-373.

62. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation // Nature. — 1975. — V. 258.-P. 598-564.

63. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. М.: Мир, 1970. - 567 с.

64. Cooke N. Н. С., Viavattene R. L., Eksteen R., Wong W. S., Davies G., Karger B. L. Use of metal ions for selective separations in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1978. - V. 149. - P. 391-403.

65. Yoneda H. Baba Т. Studies of thin layer chromatography of inorganic salts. V. Resolution of the racemic tris-ethy.ene-diamine-cobalt(III) complex by means of thin layer chromatography on silica gel. // J. Chromalogr. 1970. — V. 53. - P. 610-614;

66. Yoneda H., Miura T. Complete resolution of the racemic tris-ethylenediamine-cobalt(III) complex into its optical antipodes by means of electrophoresis. // Bull. Chern. Soc. Jpn. -1970. -V. 43. P. 574-580.

67. Kobayashi K., Shibata M. Ion exchange chromatographic studies of the Co(N)4(0)2.+ type complexes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1975. - V. 48. - P. 2561-2567.

68. Gaal J., Inszedy J. Chromatographic separation of optical isomers by means of outer sphere complex formation reactions. // Talanta. 1976. - V. 23. - P. 78-82.

69. Lindner W., LePage J. N., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Reversed-phase separation of optical isomers of Dns-amino acids and peptides using chiral metal chelate additives // J. Chromatogr. 1979. - V. 185. - P. 323-329.

70. LePage J. N., Lindner W., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Resolution of the optical isomers of dansyl amino acids by reversed-phase liquid chromatography with optically active metal chelae additives // Anal. Chem. 1979. - V. 51. — P. 433-438.

71. Davankov V.A., Navratil J.D., Walton H.F. Ligand exchange chromatography. CRC Press, Inc. Boca Raton.: Florida. 1988. - 294 p.

72. Maeda M., Tsuji A., Ganno S., Onishi Y. Fluorophotometric assay of amino acids by using automated ligand-exchange chromatography and pyridoxalzinc(II) reagent // J. Chromatogr. 1973. - V. 77. - P. 434-438.

73. Wagner F. W., Shepherd S. L. Ligand exchange amino acid analysis: resolution of some amino sugars and cysteine derivatives // Anal. Biochem. 1971. - V. 41. -P. 314-319.

74. Скороход О. P., Варрава А. Г. Комплексы тиомочевины с кадмием в сульфокатионитах КУ-2 // ЖФХ. — 1972. V. 46. - Р. 1708-1715.

75. Shimomura К., Walton Н. F. Thin-layer chromatography of amines by ligand exchange // Sep. Sci. -1968. V. 3. - P. 493-496.

76. Yasuda K. Thin-layer chromatography of aromatic amines on cadmium sulphate-impregnated silica gel thin layers // J. Chromatogr. 1971. - V. 60. - P. 144-149.

77. Kunzru D., Frei R. W. Separation of aromatic amine isomers by high-pressure liquid chromatography on cadmium-impregnated silica gel columns // J. Chromatogr. Sci. 1974.-V.12.-P. 191-205.

78. Vogt C. R., Ryan T. R:, Baxter J. S. High-speed liquid chromatography on cadmium-modified silica gel // J. Chromatogr. 1977. - V. 136. - P. 221-227.

79. Frci R. W., Beall K., Cassidy R. M. Determination of aromatic nitrogen heterocycles in air samples by high-speed liquid chromatography / Mikrochim. Acta.- 1974.-859 p.

80. Guha О. K., lanak J. Charge transfer complexes of metals in the chromatographic separation of organic compounds // J. Chromatogr. 1972. - V. 68.-P. 325-330.

81. Houx N. W. H., Voerman S., Jongen W. M. F. Purification and analysis of synthetic insect sex attractants by liquid chromatography on a silver-loaded resin // J. Chromatogr. 1974. - V. 96. - P. 25-33.

82. Snyder L. R. Nitrogen and oxygen compound types in petroleum // Anal. Chem. 1969.-V. 41.-P. 314-319.

83. Funasaka W., Hanai Т., Fujimura K., Ando T. Nonaqueous solvent chromatography // J. Chromatogr. 1973. - V. 78. - P. 424-428.

84. Petronio В. M., DeCaris Е., lannuzzi L. Some applications of ligand-exchange // Talanta. 1982. -V. 29.-P. 691-705.

85. Shahwan G. J., Jezorek J. R. Liquid chromatography of phenols on an 8-quinolinol silica gel-iron(III) stationary phase // J. Chromatogr. 1983. -V. 256. -P. 39-47.

86. Maslowska J., Pietek; W. The use of ligand exchange for the separation of aromatic acids on synthetic cation exchangers // Chromatographia. 1985. - V. 20.-P. 46-52.

87. Webster P. V., Wilson J. N., Franks M. C. Macroreticular ion-exchange resins: some analytical applications to petroleum products // Anal. Chim. Acta. — 1967.— V. 38.-P. 193-200.

88. Funasaka W., Fujimura K., Kuriyama S. Ligand exchange chromatography. I. Separation of phenylaminediamne isomers // Bunseki Kagaku. 1969. - V. 18. - P. 19-26.

89. Fujimura К., Коуата Т., Tanigawa Т., Funasaka W. Studies in ligand-exchange chromatography. IV. Separation of hydroxybenzoic and hydroxy-naphthoic acid isomers // J. Chromatogr. 1973. - V. 85. - P. 101-106.

90. Kothari R. M. Some aspects of the fractionation of DNA on an IR-120-A1(III) column//J. Chromatogr.- 1971.-V. 57.-P. 83-87.

91. Otto J., de Hernandez С. M., Walton H. P. Chromatography of aromatic acids on La-loaded ion-exchange resins // J. Chromatogr. 1982. - V. 247. - P. 91-103.

92. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation // Nature. - 1975. - V. 258.-P. 598-600.

93. Lonnerdal В., Keen C. L. Metal chelate affinity chromatography of proteins // J. Appl. Biochem. -1982. V. 4. - P. 203-207.

94. Davankov V. A. Review of ligand exchange chromatography / Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides, and Proteins. V. 1, Hancock W. S. (ed.). - CRC Press, Boca Raton, Fla. - 1984. - 393 p.

95. Gozdzicka-Josefiak A., Augustyniak J. Preparation of chelating exchangers with a polysaccharide network and low cross-linkage // J. Chromatogr. 1977. -V. 131.-P. 91-98.

96. Moroux Y., Boschetti E., Egly J. M. Preparation of metal-chelating trisacryl gels for chromatographic applications // Sci. Tools. 1985. - V. 32. - P. 1-9.

97. Варламов В. П., Лопатин С. А., Рогожин С. В. Лигандообменная хроматография ферментов. I. Синтез хелатирующих сорбентов и очистка экзонуклеазы А5 от актиномицинов // Биоорг. Химия. 1984. —Т. 10. - С. 927934.

98. Fanou Ayi L., Vijayalakshmi M. Metal-chelatc affinity chromatography as a separation tool // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - V. 413. - P. 300-305.

99. Sulkowski E. Purification of Proteins by IMAC // Trends Biotechnol. 1985.-V.3.-P. 1-10.

100. Nexo E. A new principle in biospecific affinity chromatography used for purification of cobalamin-binding proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 379.-P. 189-192.

101. Nexe E., Purification of rabbit transcobalamin II by labile ligand; affinity chromatography // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1977. - V. 55. - P. 923-926.

102. Nexe E., Olesen H., Backer D., Thomsen J. Purification and characterization of rabbit transcobalamin // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V. 494. - P. 395399.

103. Nexe E. Transcobalamin I and other human R-binders purification, structural, spectral, and physiological studies // Scand. J. Haemotol. - 1978. - V. 20. - P. 221226.

104. Lindemans J., Van Kapel J., Abels I. Purification of human transcobalamin II cyanocobalamin by affinity chromatography using thermolabile immobilization of cyanocobalamin // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V. 579. - P. 40-47.

105. Van Kapel J., Loef B. G., Lindemans J., Abels J. An improved method for large scale purification of human holo-transcobalamin II // Biochim. Biophys Acta. -1981. -V. 676.-P. 307-311.

106. Jacobsen D. W., Montejano Y. D., Huennekens F. M. Rapid purification of cobalamin-binding proteins using immobilized aminopropylcobalamin // Anal. Biochem. -1981. -V. 113. P. 164-170.

107. Nexe E., Olesen H. Purification and characterization of rabbit haptocorrin // Biochim. Biophys. Acta. -1981. -V. 667. P. 370-377.

108. Backer D., Thomsen J., Nexe E. Amino terminal sequence of hog intrinsic factor//Biochem. Physiol. 1979.-V. 628.-P. 175-179.

109. Rudolf R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. // FASEB J. -1996.-V. 10.-P. 49-56.

110. Doonan S. Protein purification protocols. General strategies. // Methods Mol Biol. 1996. - V. 59. - P. 1-16.

111. Doonan S. Bulk purification by fractional precipitation. // Methods Mol Biol. -1996. -V. 59.-P. 135-144.

112. Fischer В., Sumner I., Goodenough P. Isolation and renaturation of bio-active proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. // Arzneimittelforschung. 1992. - V. 42. - P. 1512-1515.

113. Hockney R.C. Recent developmets in heterologous protein production in Escherichia coli J/ TIBTECH. 1994. - V. 12. - P. 456-463.

114. Gupta M.N., Kaul R., Guoqiang D., Dissing U., Mattiasson B. Affinity precipitation of proteins. // J Mol Recognit. 1996. - V. 9. - P. 356-359.

115. Teotia S., Lata R., Khare S.K., Gupta, M.N. One-step purification of glucoamylase by affinity precipitation with alginate. // J Mol Recognit. 2001. -V. 14.-P. 295-299.

116. Roy I., Gupta, M.N. Purification of alkaline phosphatase from chicken intestine by expanded- bed affinity chromatography on dye-linked cellulose. // Biotechnol Appl Biochem. 2000. -V. 32. - P. 81-87.

117. Roy I., Gupta M.N. Three-phase affinity partitioning of proteins. // Anal Biochem. 2002. - V. 300. - P. 11-14.

118. Gupta M.N., Jain S., Roy I. Immobilized metal affinity chromatography without chelating ligands: purification of soybean trypsin inhibitor on zinc alginate beads. II Biotechnol Prog. 2002. - V. 18. - P. 78-81.

119. Hefti M.H., Van Vugt-Van der Toorn C.J., Dixon R:, Vervoort J. A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site. // Anal Biochem. -2001. -V. 295. -P. 180-185.

120. Morin J.G. Coelenterate biology: Reviews and Perspectives / Eds. Muscatine L., Lenhoff H.M. New York: Academic Press. 1974. - P. 397-438.

121. Shimomura O., Johnson F.H, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. II J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59. - P. 223-240.

122. Shimomura O., Jolinson F.H., Saiga Y. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura. II J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. - V. 62. - P. 9-15.

123. Бондарь B.C., Трофимов К.П., Высоцкий E.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima // Биохимия. 1992. - Т.57. - С.1481-1490.

124. Levine L.D., Ward W.W. Isolation and characterization of a photoprotein, "phialidin", and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phialidmm gregarium II Сотр. Biochem. Physiol. -1982.-V. 72.-P. 77-85.

125. Ward W.W., Seliger H.H. Extraction and purification of calcium-activated photoprotein from ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata. II Biochemistry. 1974.-V. 13.-P. 1491-1499.

126. Blinks J.R. Intracellular Ca2+ measurements //The Heart and Cardiovascular System. Eds. Fozzard H.A. et al. /Raven Press, New York. 1986. - P. 671-701.

127. Cormier M.J., Prasher D.C., Longiaru M., McCann R.O. The enzymology and; molecular biology of the Ca -activated photoprotein, aequorin. // Photochem. Photobiol. 1989. - V. 49. - P. 509-512.

128. Inouye S., Noguchi M., Sakaki Y., Takagi Y., Miyata Т., Iwanaga S., Miyata Т., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. - V. 82. - P. 3154-3158.

129. Илларионов Б.А., Маркова C.B., Бондарь B.C., Высоцкий E.C., Гительзон И.И. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima. // Докл. АН СССР. — 1992.-Т.326.-С. 911-913.л ,

130. Blinks J.R. Use of calcium-regulated photoproteins as inlracellular Ca indicators // Methods in Enzirnology. 1989. - V. 174. - P. 164-203.

131. Campbell A.K., Dormer R.L., Hallett M.B. Coelenterate photoproteins asл iindicators of cytoplasmic free Ca in small cells. // Cell Calcium. 1985. - V. 6. -P. 69-82.

132. Bondar V.S., Sergeev A.G., Illarionov B.A. et al. Cadmium-induced luminescence of recombinant photoprotein obelin. // Biochim. biophys. acta. -1995.-V. 1231.-P. 29-32.

133. Галаев И.Ю., Маттиасон Б. Новые методы аффинной очистки белков. Аффинное осаждение. // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 669-676.

134. Bondar V.S., Purtov K.V. Nonchromatographic ligand exchange separation of proteins as exemplified by isolation of recombinant apoobelin and apoaquorin from Escherichia coli. //Dokl Biochem. 2000. -V. 373. - P. 142-144.

135. Bondar V.S., Puzyr A.P. Use of nanodiamond particles for rapid isolation of recombinant apoobelin from Escherichia coli. // Dokl Biochem. 2000. - V. 373. -P. 129-131.

136. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA purification, and characterization as a calcium indicator. // Methods Enzymol. 2000. - V. 305.-P. 223-249.

137. Бондарь В. С., Высоцкий Е. С., Заворуев В. В., Межевикин В.В., Райбекас А.А. Получение препарата бактериальной люциферазы для биолюминесцентного анализа. // Прик. Биох. и Микроб. 1988. - Т. 24. - С. 745-753.

138. Illarionov В. A, Protopopova М. V. Cloning and expression of genes of the luminescence system in Photobacterium leiognathi. // Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1987. -V. 8.-P. 41-46.

139. Дарбре А. Практическая химия белка. M.: Мир. 1989. - 621с.

140. Evangelista J., Suttnar. Separation used for purification of recombinant proteins // J. Chromatogr. -1997. V. 699. - P. 383-401.

141. Kricka L. J., Stanley P. E., Thorpe G., Whitehead T. P. Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluminescence. / London. Acad. Press. 1984. -602 p.