Лазерно-индуцированное формирование биосовместимых конструкций из полимерных материалов и лазерная биопечать клеточными агрегатами для тканевой инженерии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Минаева Екатерина Дмитриевна

• Минаева Екатерина Дмитриевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Минаева Екатерина Дмитриевна

Введение

Глава 1. Лазерные технологии формирования биосовместимых трехмерных конструкций

1.1 Формирование трехмерных конструкций методом аддитивных технологий

1.1.1 Методы формирования трехмерных конструкций для тканевой инженерии

1.1.2 Материалы для поверхностно-селективного лазерного спекания

1.2 Лазерная биопечать клеточными сфероидами

1.2.1 Методы лазерной биопечати

1.2.2 Материалы для биопечати

Выводы Главы

Глава 2. Материалы и методы. Описание экспериментальных установок

2.1 Полимерные микрочастицы и нетканые материалы

2.1.1 Полимерные микрочастицы изготовленные методом помола

2.1.2 Полимерные микрочастицы, изготовленные методом испарения растворителя из эмульсий

2.1.3 Нетканые полимерные материалы

2.2 Реализация метода поверхностно-селективного лазерного спекания с использованием воды в качестве сенсибилизатора нагрева

2.2.1 Установка для реализации и исследования процессов ПСЛС

2.2.3 Методика анализ температурных полей в процессе ПСЛС

2.2.3 Анализ полимерных структур, изготовленных ПСЛС

2.3 Установка для лазерно-индуцированного прямого переноса

2.4 Методика расчета плотности мощности лазерного излучения

Выводы Главы

Глава 3. Поверхностно-селективное лазерное спекание полимерных материалов

3.1 Поверхностно-селективное лазерное спекание микрочастиц, полученных методом механического помола

3.1.1 Исследование процесса ПСЛС лиофилизированных микрочастиц

3.1.2 Исследование процесса ПСЛС микрочастиц при естественной влажности

3.1.3 Исследование процесса ПСЛС микрочастиц при дополнительном увлажнении

3.1.4 Исследование процесса ПСЛС микрочастиц с гигроскопичным покрытием на основе хитозана

3.1.5 Исследование процесса ПСЛС многослойной структуры из микрочастиц с гигроскопичным покрытием из биополимера

3.1.6 Анализ процесса поверхностно-селективного лазерного спекания молотых частиц с помощью тепловизионной съемки

3.2 Поверхностно-селективное лазерное спекание сферических микрочастиц

3.2.1 Теоретический анализ температурных параметров спекания сферических микрочастиц

3.2.2 Изготовление и характеризация трехмерных структур на основе микрочастиц

3.2.3 Гибридные сферические микрочастицы полилактида, наполненные наночастицами гидроксиапатита

Выводы Главы

Глава 4. Микроструктурирование нетканых материалов методом поверхностно-селективного лазерного спекания

4.1 Возможные типы модификаций нетканых материалов

4.2 Исследование влияния параметров лазерного воздействия на микроструктурирование нетканых материалов из полилактида

4.3 Исследование влияния параметров лазерного воздействия на микроструктурирование нетканых материалов из поликапролактона

Выводы Главы

Глава 5. Развитие метода лазерно-индуцированного прямого переноса (LIFT)

для реализации процесса биопечати клеточными сфероидами

5.1 Подбор и характеризация режимов лазерного воздействия

5.2 Особенности процесса лазерного переноса клеточных сфероидов

5.3 Анализ выживаемости клеточных сфероидов в результате переноса

Выводы к Главе

Заключение

Благодарности

Список литературы

Приложение

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лазерно-индуцированное формирование биосовместимых конструкций из полимерных материалов и лазерная биопечать клеточными агрегатами для тканевой инженерии»

Актуальность темы

Лазерные технологии представляют собой уникальное сочетание точности и регуляции режимов воздействия, которое широко используется в различных областях науки и техники, включая регенеративную медицину. Тканевая инженерия - подход по восстановлению поврежденных или утраченных фрагментов тканей или органов, альтернативный трансплантации [1]. В настоящее время вызывает интерес применение лазерных технологий для формирования биосовместимой конструкции (каркаса, скаффолда) [2] и последующего заселения её живым клеточным материалом [3; 4] при формировании будущих тканевых эквивалентов. Возможности лазерной техники как прецизионного инструмента позволили перейти к режиму локального воздействия, что является важным условием для формирования и заселения биосовместимых конструкций.

Технологии аддитивного производства, основанные на послойном формировании изделия по компьютерной модели, могут быть использованы для создания медицинских изделий и их прототипов, имплантов, капсул для лекарственных препаратов, а также для изготовления искусственных биосовместимых конструкций [5]. Современные лазерные источники открыли доступ к большим мощностям излучения при меньших габаритах устройств, что положительно сказалось на технологиях резки, сплавления и наплавки [6]. Стали доступны режимы локального воздействия на объекты и материалы благодаря возможности фокусировки лазерного луча в пятно микронного размера. Гальваносканирующие системы с F-theta объективами позволяют достигать необходимых для выполнения широкого круга задач скоростей перемещения лазерного пятна по поверхности, что позволяет проводить

высокоскоростную обработку широкого круга материалов с помощью лазерного излучения [7].

Одним из примеров технологии аддитивного производства является метод селективного лазерного спекания (СЛС), который широко используется для изготовления объектов из металлов (например, титановые импланты) и пластиков (например, протезы). Важным обстоятельством является то, что существуют ограничения по применению метода СЛС для ряда материалов, в том числе биологически совместимых полимеров. В процессе реализации метода СЛС излучение поглощается полимерным материалом во всем объеме, из-за чего происходит перегрев и расплавление. Такой подход к спеканию материала ограниченно применим для биосовместимых полимеров, которые резорбируются (растворяются) в среде организма и со временем из него выводятся. Сильный перегрев приводит к деградации материала и утрате свойств биосовместимости. Также, в процессе формирования трехмерных конструкций методом СЛС из-за переплавления трудно добиться развитой внутренней микропористой структуры, необходимой для лучшего роста и развития клеток, заселенных в сформированные конструкции.

Указанные недостатки могут быть устранены с использованием метода поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС), который является разновидностью СЛС [8; 9]. В отличие от СЛС, при ПСЛС используется эффект локализации поглощения лазерного излучения на поверхности спекаемого полимерного материала за счёт дополнительных покрытий или включений (сенсибилизаторов нагрева), интенсивно поглощающих лазерное излучение. Известно, что в ранних исследованиях в качестве сенсибилизатора нагрева использовались микрочастицы углерода и наночастицы золота [8], однако эти сенсибилизаторы не подходят для решаемых задач. Микрочастицы углерода со временем не выводятся из организма, а наночастицы золота дороги и сложны в производстве. В представляемой работе в качестве

сенсибилизатора нагрева выбрана вода, которая имеет интенсивные полосы поглощения в инфракрасной области. Для реализации процесса поверхностного спекания использовалось излучение тулиевого волоконного лазера с длиной волны 1,96 мкм. Выбор лазерного источника обусловлен достаточно низким коэффициентом поглощения полимера (~0,3 см-1) и высоким коэффициентом поглощения сенсибилизатора нагрева на рабочей длине волны (~130 см-1) [10]. Подход ПСЛС дает возможность переместить область максимального поглощения энергии лазерного излучения из объема микрочастиц на их поверхность, что приводит к спеканию полимерных микрочастиц в твердые трехмерные структуры за счет плавления только приповерхностного слоя. Это особенно важно при изготовлении тканеинженерных конструкций, материал которых может содержать биологически активные вещества, которые разрушаются в результате перегрева.

Как известно из литературы, лазерные технологии являются эффективным инструментом для функционализации биосовместимых конструкций биологически активными веществами или их заселения живыми клетками [11; 12]. Заселение конструкций методом лазерной биопечати быстрее и точнее по сравнению с используемыми до настоящего времени методами.

Одним из успешных подходов лазерной биопечати можно назвать метод лазерно-индуцированный прямой перенос (LIFT - laser induced forward transfer) [13]. Этот метод позволяет переносить в пространстве отдельные клетки или микроорганизмы. Однако этот метод не использовался для переноса крупных живых объектов, например, клеточных агрегатов -сфероидов. Использование лазерного излучения, сфокусированного в пятно диаметром ~30 мкм c Гауссовым распределением интенсивности, приводит к разрушению клеточного агрегата, поэтому необходимо адаптировать

лазерный пучок таким образом, чтобы сохранить разрешающую способность метода и обеспечить высокую выживаемость клеток сфероида после переноса на уровне современных методов биопечати. Клеточные сфероиды - крупные клеточные агрегаты размером 200-300 мкм в диаметре и содержащие в себе порядка 2000 клеток, прочно адгезированных друг к другу за счет белков межклеточной адгезии. Использование сфероидов в качестве объектов биопечати может позволить повысить выживаемость общего числа клеток в результате пространственного переноса и увеличить скорость заселения биосовместимых конструкций по сравнению с используемыми до настоящего времени методами заселением клеточными культурами [14-17].

Таким образом, развитие метода поверхностно-селективного лазерного спекания перспективно для создания и совершенствования качественно новых биосовместимых конструкций, а адаптация метода лазерно-индуцированного прямого переноса для биопечати клеточными сфероидами улучшит процесс заселения этих конструкций. Следует ожидать, что сочетание этих методов формирования биосовместимых конструкций и их заселения клеточными агрегатами приведет к значительному расширению возможностей лазерных технологий в регенеративной медицине.

Цель и задачи работы

Целью работы является разработка и развитие лазерных аддитивных технологий формирования трехмерных биосовместимых структур с помощью технологий поверхностно-селективного лазерного спекания и биопечати живыми клеточными агрегатами - клеточными сфероидами - методом лазерно-индуцированного прямого переноса для задач тканевой инженерии.

В соответствии с поставленной целью, необходимо было решить следующие задачи:

- экспериментальное исследование влияния содержания воды в приповерхностном слое полимерных микрочастиц на основе полилактида, в том числе с нанесенным на поверхность микрочастиц природным полисахаридом, на процесс поверхностной локализации энергии лазерного излучения, определение значений температуры, которые достигаются в процессе лазерного спекания;

- определение диапазона оптимальных параметров инфракрасного лазерного излучения с длиной волны А=1,96 мкм для формирования трехмерных структур из полимерных микрочастиц неправильной формы и из сферических композитных микрочастиц на основе полилактида методом поверхностно-селективного лазерного спекания с использованием воды в качестве сенсибилизатора нагрева;

- экспериментальное исследование возможности лазерного микроструктурирования и изменения морфологии нетканых материалов на основе полилактида и поликапролактона с помощью инфракрасного лазерного излучения с длиной волны А=1,96 мкм в режиме поверхностно-селективного лазерного спекания с использованием воды в качестве сенсибилизатора нагрева;

- разработка экспериментальной лазерной системы для пространственного переноса живых клеточных агрегатов с характерным размером 200-300 мкм методом лазерно-индуцированного прямого переноса;

- экспериментальное исследование возможностей метода лазерно-индуцированного прямого переноса для задачи деликатной биопечати клеточными сфероидами из мезенхимальных стромальных клеток со средней выживаемостью клеток 75%.

Научная новизна

Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем:

1. Продемонстрированы возможности применения метода поверхностно -селективного лазерного спекания с использованием лазерного излучения с длиной волны А=1,96 мкм и воды в качестве сенсибилизатора нагрева для формирования трехмерных конструкций из микрочастиц полилактида:

- полученных методом механического помола и покрытых гидрофильной оболочкой из хитозана.

- сферической формы, покрытых гидрофильной оболочкой на основе хитозана или его сополимера.

- сферической формы, покрытых Р-лактоглобулином, объемно наполненных наночастицами гидроксиаппатита.

2. Впервые проведено микроструктурирование и изменение морфологии нетканых полимерных материалов из алифатических полиэфиров, полученных методом электроформования, в режиме поверхностно-селективного лазерного спекания.

3. Разработан процесс лазерной биопечати методом лазерно-индуцированного прямого переноса с использованием распределения интенсивности в лазерном пятне, близкого к П-образному, для обеспечения пространственного переноса микрообъектов с характерным размером 200300 мкм.

4. Впервые проведен пространственный перенос клеточных сфероидов из мезенхимальных стромальных клеток методом лазерно-индуцированного прямого переноса с использованием распределения интенсивности в лазерном пятне, близкого к П-образному, со средней выживаемостью клеток 75%.

Практическая значимость

Метод поверхностно-селективного лазерного спекания может быть использован для создания пористых биосовместимых структур - скаффолдов - из биосовместимых полимерных материалов. Такие скаффолды применяются для создания тканеинженерных конструкций, которые вживляются в место дефекта и помогают восстанавливать нативную ткань. Метод лазерно-индуцируемого прямого переноса может быть использован для пространственного переноса живых клеточных агрегатов (сфероидов) при задачах биопечати, например, при заселении скаффолдов живыми клетками. Такие тканеинженерные конструкции используются при восстановлении поврежденных фрагментов тканей и органов. Таким образом, результаты диссертационной работы вносят вклад в развитие лазерных аддитивных технологий, применяемых в задачах регенеративной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение метода поверхностно-селективного лазерного спекания с использованием лазерного излучения с длиной волны 1,96 мкм и воды в качестве сенсибилизатора нагрева для формирования трехмерных конструкций из микрочастиц полилактида, с поверхностями, функционализированными биополимерами на основе хитозана, либо сферической формы, либо полученными методом механического помола, а также из сферических микрочастиц полилактида с добавлением наночастиц гидроксиапатита, функционализированных Р-лактоглобулином для задач тканевой инженерии.

2. Контролируемое лазерное изменение морфологии и микроструктурирование материалов, изготовленных методом электроформования из биосовместимых алифатических полиэфиров для задач тканевой инженерии, реализовано методом поверхностно-селективного лазерного спекания с использованием лазерного

излучения с длиной волны 1,96 мкм с плотностью мощности 0,6-11 х103 Вт/см2 и воды в качестве сенсибилизатора нагрева.

3. Метод лазерно-индуцированного прямого переноса при использовании импульсного лазерного излучения с длиной волны 1,05 мкм, с длительностью импульса 7 нс, энергией в импульсе 180-230 мкДж при плотностях энергии 0,16-0,18 Дж/см2 в сочетании с оптической системой формирования распределения интенсивности в лазерном пятне, близком к П-образному обеспечивает пространственный перенос клеточных сфероидов из мезенхимальных стромальных клеток с размером 200-300 мкм целиком без разрушения, с выживаемостью клеток на среднем уровне 78±15%.

Апробация

Изложенные в работе результаты были представлены автором на конференциях:

Международная конференция по фотонике и информационной оптике IX, X, XI, XII (Москва, 2020 - 2023 гг.);

VII Троицкая конференция с международным участием «Медицинская физика» (ТКМФ-7) (Троицк, 2020);

XVII Международная научно-практическая конференция «Новые полимерные композиционные материалы. Микитаевские чтения» (Эльбрус, 2021);

9th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures, (Санкт-Петербург, 2022);

XLIX Международная молодёжная научная конференция «Гагаринские чтения» (Москва, 2023);

VII международная конференция UltrafastLight-2023 (Москва, 2023).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, среди них 6 статей в рецензируемых изданиях, включенных в перечень ВАК РФ и/или индексируемые в базах данных WoS и Scopus, 11 работ в трудах международных конференций, индексируемых в базе данных РИНЦ, 1 работа в трудах всероссийских конференций, индексируемых в базе данных РИНЦ.

Опубликованные статьи в рецензируемых жунралах по теме диссертации

1. Antoshin A., Minaeva E., Koteneva P., et al. LIFT of cell spheroids: Proof of concept // Bioprinting. Elsevier B.V., - 2023. - Vol. 34 - № March. - P. e00297. (Scopus, Web of Science, Q1)

2. Minaeva E.D., Antoshin A.A., Kosheleva N. V., et al. Laser Bioprinting with Cell Spheroids: Accurate and Gentle // Micromachines. - 2023. - Vol. 14 - № 6. - P. 1152. (Scopus, Web of Science, Q2)

3. Minaev N. V., Minaeva S.A., Minaeva E.D., et al. Controlled Structure of Polyester/Hydroxyapatite Microparticles Fabricated via Pickering Emulsion Approach // Polymers (Basel). - 2022. - Vol. 14 - № 20. - P. 4309. (Scopus, Web of Science, Q1)

4. Demina T.S., Popyrina T.N., Minaeva E.D., et al. Polylactide microparticles stabilized by chitosan graft-copolymer as building blocks for scaffold fabrication via surface-selective laser sintering // J. Mater. Res. Springer International Publishing, - 2022. -Vol. 37 - № 4. - P. 933-942. (Scopus, Q2)

5. Minaeva E.D., Kuryanova A.S., Dulyasova et al. Laser Technology of Directional Microstructuring of Biodegradable Nonwovens // High Energy Chem. - 2022. - Vol. 56 - № 2. - P. 138-144. (Scopus, Q3)

6. Minaev N. V., Demina T.S., Minaeva E.D., et al. The Evolution of Surface-Selective Laser Sintering: Modifying and Forming 3D Structures for Tissue Engineering // Bull. Russ. Acad. Sci. Phys. - 2020. - Vol. 84 - № 11. - P. 1315-1320. (Scopus, Q3)

Личный вклад

В части лазерного спекания материалов личный вклад автора в настоящую работу состоит в исследованиях процессов поверхностно-селективного лазерного спекания; модификации, и улучшении ранее собранной экспериментальной установки для обеспечения исследований по диагностики процесса поверхностно-селективного лазерного спекания; для изготовления малых серий экспериментальных образцов. Автором проводились исследования, направленные на подбор оптимальных режимов лазерного воздействия на полимерные микрочастицы для формирования трехмерных конструкций и нетканые материалы для контролируемого микроструктурирования и изменения морфологии; экспериментальное исследование процесса поверхностно-селективного спекания полимерных микрочастиц и нетканых материалов с последующим анализом физических процессов, происходящих при этом; теоретическом исследовании и моделировании процесса поведения микрочастиц при лазерном воздействии.

В части клеточной биопечати личный вклад автора состоит в модификации метода лазерно-индуцированного прямого переноса для пространственного переноса крупных клеточных агрегатов: разработка и сборка экспериментальной установки, проектирование и расчёт оптической схемы; экспериментальное исследование процессов при лазерной биопечати с использованием негауссовых лазерных пучков; отработке алгоритмов по пространственному переносу клеточных сфероидов; экспериментальное исследование пространственного переноса клеточных сфероидов с анализом полученных результатов.

Автор участвовала непосредственно в написании отчетов и статей по теме диссертационного исследования.

Структура и объем

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии. Общий объем диссертации составляет 143 страницы, включая 41 рисунок, 6 таблиц и приложение. Библиография содержит 132 наименования.

Глава 1. Лазерные технологии формирования биосовместимых трехмерных конструкций

В настоящее время аддитивные технологии дают возможность изготавливать трехмерные конструкции из широкого спектра материалов различного функционального назначения [5]. В рамках задач регенеративной медицины при подборе метода формирования трехмерных конструкций необходимо отобрать такие методы, которые сохранят свойство биосовместимости используемого материала, а также позволят избежать негативного влияния на его физические и химические характеристики [18]. Для заселения скаффолдов живыми клетками также целесообразно использовать лазерные технологии, которые обеспечивают возможность провести процесс переноса живых клеток и\или их агрегатов без ущерба функция жизнедеятельности.

Глава 1 посвящена обзору различных лазерных технологий, с использованием которых можно формировать биосовместимые и биорезорбируемые тканеинженерные конструкции и заселить их клетками и клеточными агрегатами.

1.1 Формирование трехмерных конструкций методом аддитивных технологий

Одной из наиболее актуальных задач развития новых аддитивных технологий является разработка методов формирования каркасов из биосовместимых и биорезорбируемых материалов [2]. Скаффолды -разновидность специальных каркасов для задач тканевой инженерии -подхода к восстановления поврежденных или утраченных фрагментов тканей или органов. Скаффолды, заселенные клеточным материалом, называют тканеинженерными конструкциями и именно их помещают в поврежденную область для ее дальнейшего восстановления [19].

В первом разделе рассмотрены методы формирования трехмерных конструкций из биосовместимых материалов, акцент сделан на метод поверхностно-селективного лазерного спекания, который в дальнейшем используется в работе.

1.1.1 Методы формирования трехмерных конструкций для тканевой инженерии

К скаффолдам, которые впоследствии будут использоваться в имплантируемых тканеинженерных конструкциях, предъявляется рад требований. Конструкция скаффолда должна способствовать размножению клеток и образованию клеточно-специфической системы, которая заместит искусственную конструкцию. Для примера на рисунке 1 представлены фотографии скаффолдов из различных полимерных материалов из работы [20]

Рисунок 1. Фотографии скаффолдов из различных полимерных материалов, адаптация иллюстрации из работы [20]

Скаффолд должен обладать внутренним объемом в виде системы связанных пор для роста и жизнедеятельности клеток. Механические свойства скаффолдов должны быть достаточными для выдерживания нагрузок и напряжений, возникающих в области имплантации [18].

С началом активного использования лазерного излучения аддитивные технологии перешли на следующий виток развития [21]. Лазерные аддитивные технологии обладают рядом уникальных свойств, благодаря которым возможно создавать сложные трехмерные структуры с высокой производительностью из различных материалов [6]. Среди лазерных

аддитивных методов формирования структур можно выделить двухфотонную полимеризацию [22], стереолитографию [23] и селективное лазерное спекание [24; 25], которые могут быть использованы для создания скаффолдов из биосовместимых и биорезорбируемых материалов [4; 6].

Среди лазерных аддитивных методов формирования скаффолдов селективное лазерное спекание (СЛС) [24-26] наиболее полно отвечает требованиям, предъявляемым к методам изготовления трехмерных структур для тканевой инженерии. Методом СЛС можно формировать конструкции с внутренней макроструктурой, при формировании которых не будут потеряны свойства биосовместимости, а механические свойства готовых структур будут достаточны для дальнейшего использования в тканеинженерных конструкциях. Основой метода СЛС служит процесс спеканиа частиц материала после нагрева их лазерным излучением. На рисунок 2 схематично изображен принцип работы метода СЛС на примере спекания полимерных микрочастиц.

До лазерного воздействия ^ После лазерного воздействия

гусгул СУСУЛГуО-^1, рсССХлЗСС)

Рисунок 2. Принцип работы метода СЛС.

В результате лазерного воздействия частицы материала нагреваются и спекаются друг с другом по всему объему, образовывая одну крупную равномерную структуру. Метод СЛС позволяет изготавливать трехмерные структуры с индивидуальным дизайном и архитектурой с помощью систем

автоматизированного проектирования/производства (САПР) с высокой производительностью. Стоит отметить, что есть и ограничения, которые связаны с особенностями биомедицинских применений конструкций, изготовленных СЛС. В процессе реализации метода СЛС излучение поглощается полимерными частицами, из-за чего происходит нагрев и расплавление по всему объему частиц. Такой подход к спеканию материала не может быть оптимальным для биорезорбируемых полимеров (в частности, для широко применяемых материалов на основе алифатических полиэфиров, например, полилактида), поскольку при этом может происходить их значительный перегрев, который повлечет за собой деградацию материала и утрату свойств биосовместимости. Также при формировании конструкций методом СЛС трудно добиться внутренней пористости без дополнительного моделирования отверстий на этапе проектирования модели.

Дочерним методом классического СЛС является метод поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС) [8-10], который позволяет избежать перегрева и расплавления полимерного порошка в объеме. Отличием данного метода является то, что спекание происходит не напрямую из-за поглощения полимерного материала, а при поглощении энергии лазерного излучения частицами сенсибилизатора нагрева [27; 28]. Сенсибилизатор нагрева наносится на поверхность спекаемого материала на этапе его синтеза или перед лазерным воздействием. Параметры и компоненты лазерной системы подбираются таким образом, чтоб коэффициент поглощения сенсибилизатора нагрева превышал коэффициент поглощения спекаемого полимерного материала на порядок-два на рабочей длине волны лазерного излучения. Ранее в качестве сенсибилизатора предлагались наночастицы углерода, добавленные в объем полимерных микрочастиц [8; 27], а источником излучения служил диодный лазер с длиной волны 0,97 мкм. В этой работе такое условие достигается за счет использование воды как сенсибилизатора. Преимущество

воды в её нетоксичности: вода испаряется в результате лазерного воздействия, в то время как наночастицы углерода остаются на поверхности трехмерной конструкции. А наличие воды в объеме спекаемого полимера не несет вреда в дальнейшем при процессе вживления. Работы по этой теме велись с 2015 года [10], в результате было предложено математическое обоснование эффективного процесса спекания [29] .

Если в качестве сенсибилизатора нагрева используется мелкодисперсный водяной туман, то эффективный нагрев сенсибилизатора можно проводить с помощью излучения тулиевого волоконного лазера с длиной волны 1,9 мкм, перспективного для применений в области лазерной медицины [30; 31]. При использовании этой длины волны коэффициент поглощения излучения в воде (aH2O ~ 100 см-1) значительно превышает коэффициент поглощения в полилактиде (акъд^ ~ 1 см-1). Такое соотношение коэффициентов поглощения позволяет реализовать механизм ПСЛС без прямого перегрева основного объема полимерного материала.

1.1.2 Материалы для поверхностно-селективного лазерного спекания

Для создания скаффолдов преимущественно используются полимерные материалы. В работе в основном использовался полилактид - экологически чистый, пригодный для вторичной переработки полимер, одобренный для медицинского применения с подходящими механическими свойствами [32]. Благодаря свойствам биосовместимости [33] и биорезорбируемости [34] полилактид является привлекательным материалом [35; 36] для применения в тканевой инженерии [37; 38]. Доказано, что продукты распада полилактида обладают высокой биосовместимостью и низкой цитотоксичностью в тканях в период регенерации костной ткани [39]. В настоящий момент в биомедицине полилактид применяется для изготовления скаффолдов для восстановления костной [40], хрящевой [41] и жировой тканей [42].

Скаффолды на основе полилактида могут быть сформированы с использованием широкого спектра методов, например таких как термически индуцированное разделение фаз [43], электроформование [44] или аддитивные технологии [45]. Но только последние позволяют создавать объемные конструкции различного функционального назначения с четко заданной архитектоникой [46; 47]. Наряду с полилактидом в биомедицине часто используется поликапролактон. Он может использоваться как шовный материал, как саморассасывающийся имплантат - филлер или может выступать в роли материала каркаса для тканеинженерных конструкций [48].

Однако, полилактид достаточно гидрофобен, что не позволяет эффективно использовать мелкодисперсный водяной туман в качестве сенсибилизатора нагрева. Для решения данной проблемы можно функционализировать поверхность полимерных материалов гидрофильным материалом, который также будет биосовместимым и биорезорбируемым [49]. Под функционализацией понимается нанесение на поверхность микрочастиц какого-либо вещества с целью изменения физических или химический характеристик микрочастиц. Одним из допустимых вариантов может стать использование хитозана - продукта деацетилирования природного полисахарида хитина. Этот материал широко используется в тканевой инженерии, т.к. обеспечивает хорошую адгезию и рост клеток [50; 51].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Минаева Екатерина Дмитриевна, 2024 год

Список литературы

1. Adult Stem Cells in Bone and Cartilage Tissue Engineering / A. Salgado [et al.] // Current Stem Cell Research & Therapy. - 2006. - Vol. 1. - № 3. - P. 345364.

2. Additive manufacturing of biomaterials for bone tissue engineering - A critical review of the state of the art and new concepts / M.-M. Germaini [et al.] // Progress in Materials Science. - 2022. - Vol. 130. - P. 100963.

3. Murphy S. V. 3D bioprinting of tissues and organs / S. V Murphy, A. Atala // Nature Biotechnology. - 2014. - Vol. 32. - № 8. - P. 773-785.

4. Virtual Prototyping & Bio Manufacturing in Medical Applications / eds. B. Bidanda, P.J. Bartolo. - Springer Science+Business Media, LLC, 2008. - 307 p.

5. A comprehensive review of emerging additive manufacturing (3D printing technology): Methods, materials, applications, challenges, trends and future potential / P. B.A [et al.] // Materials Today: Proceedings. - 2022. - Vol. 52. -P. 1309-1313.

6. Schmidt V. Laser Technology in Biomimetics : Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering / V. Schmidt, M.R. Belegratis; eds. V. Schmidt, M.R. Belegratis. - Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2013. - 281 p.

7. High-throughput machining using high average power ultrashort pulse lasers and ultrafast polygon scanner / J. Schille [et al.] // eds. U. Klotzbach, K. Washio, C.B. Arnold. - 2016. - P. 97360R.

8. Three-Dimensional Bioactive and Biodegradable Scaffolds Fabricated by Surface-Selective Laser Sintering / E.N. Antonov [et al.] // Advanced Materials. - 2005. - Vol. 17. - № 3. - P. 327-330.

9. Biocompatibility and osteogenic potential of human fetal femur-derived cells on surface selective laser sintered scaffolds / J.M. Kanczler [et al.] // Acta

Biomaterialia. - 2009. - Vol. 5. - № 6. - P. 2063-2071.

10. Surface-selective laser sintering of thermolabile polymer particles using water as heating sensitizer / E.N. Antonov [et al.] // Quantum Electronics. - 2015. -Vol. 45. - № 11. - P. 1023-1028.

11. Koch L. Laser-Based Cell Printing / L. Koch, A. Deiwick, B. Chichkov // 3D Printing and Biofabrication. - Cham: Springer International Publishing, 2016. -P. 1-27.

12. Chichkov B. Laser printing: trends and perspectives / B. Chichkov // Applied Physics A. - 2022. - Vol. 128. - № 11. - P. 1015.

13. LIFT-bioprinting, is it worth it? / A.A. Antoshin [et al.] // Bioprinting. - 2019. - Vol. 15. - P. e00052.

14. Formation of Adipose Stromal Vascular Fraction Cell-Laden Spheroids Using a Three-Dimensional Bioprinter and Superhydrophobic Surfaces / B.C. Gettler [et al.] // Tissue Engineering Part C: Methods. - 2017. - Vol. 23. - № 9. -P. 516-524.

15. 3D bioprinting of liver spheroids derived from human induced pluripotent stem cells sustain liver function and viability in vitro / E. Goulart [et al.] // Biofabrication. - 2019. - Vol. 12. - № 1. - P. 015010.

16. Scaffold-free bioprinting of mesenchymal stem cells using the Regenova printer: Spheroid characterization and osteogenic differentiation / I.N. Aguilar [et al.] // Bioprinting. - 2019. - Vol. 15. - P. e00050.

17. The acoustic droplet printing of functional tumor microenvironments / K. Chen [et al.] // Lab on a Chip. - 2021. - Vol. 21. - № 8. - P. 1604-1612.

18. Leong K.F. Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs / K.F. Leong, C.M. Cheah, C.K. Chua // Biomaterials. - 2003. - Vol. 24. - № 13. - P. 2363-2378.

19. Additive manufacturing of tissues and organs / F.P.W. Melchels [et al.] // Progress in Polymer Science. - 2012. - Vol. 37. - № 8. - P. 1079-1104.

20. Microbial Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) Scaffold for Periodontal Tissue Engineering / S. Phuegyod [et al.] // Polymers. - 2023. - Vol. 15. - №2 4.

- P. 855.

21. Design for Additive Manufacturing: Trends, opportunities, considerations, and constraints / M.K. Thompson [et al.] // CIRP Annals - Manufacturing Technology. - 2016. - Vol. 65. - № 2. - P. 737-760.

22. Two-photon polymerization initiators for three-dimensional optical data storage and microfabrication / B.H. Cumpston [et al.] // Nature. - 1999. - Vol. 398. -№ 6722. - P. 51-54.

23. Melchels F.P.W. A review on stereolithography and its applications in biomedical engineering / F.P.W. Melchels, J. Feijen, D.W. Grijpma // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31. - № 24. - P. 6121-6130.

24. Deckard C.R. United States Patent 4,863,538 / C.R. Deckard. - 1986. - № 19.

25. Selective laser sintering of porous tissue engineering scaffolds from poly(L-lactide)/carbonated hydroxyapatite nanocomposite microspheres / W.Y. Zhou [et al.] // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. - 2008. - Vol. 19.

- № 7. - P. 2535-2540.

26. Development of a 95/5 poly(L-lactide-co-glycolide)/hydroxylapatite and ß-tricalcium phosphate scaffold as bone replacement material via selective laser sintering / R.L. Simpson [et al.] // Journal of Biomedical Materials Research -Part B Applied Biomaterials. - 2008. - Vol. 84. - № 1. - P. 17-25.

27. Fabrication of polymer scaffolds for tissue engineering using surface selective laser sintering / E.N. Antonov [et al.] // Laser Physics. - 2006. - Vol. 16. - №2 5.

- P. 774-787.

28. Biocompatibility of Tissue Engineering Constructions from Porous Polylactide Carriers Obtained by the Method of Selective Laser Sintering and Bone Marrow-Derived Multipotent Stromal Cells / T.B. Bukharova [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. - Vol. 149. - № 1. - P. 148153.

29. Temperature field distribution in polymer particles during surface-selective laser sintering / E.N. Antonov [et al.] // Laser Physics. - 2020. - Vol. 30. - №2 5. - P. 055601.

30. Минаев В.П. Лазерные Аппараты Для Хирургии И Силовой Терапии: Вчера, Сегодня, Завтра / В.П. Минаев // Лазерная Медицина. - 2012. -Vol. 16. - № 3. - P. 57-65.

31. A randomized trial comparing thulium laser resection to standard transurethral resection of the prostate for symptomatic benign prostatic hyperplasia: Four-year follow-up results / D. Cui [et al.] // World Journal of Urology. - 2014. -Vol. 32. - № 3. - P. 683-689.

32. Lunt J. Large-scale production, properties and commercial applications of poly lactic acid polymers / J. Lunt // Polymer Degradation and Stability. - 1998. -Vol. 59. - № 1-3. - P. 145-152.

33. Biodegradable and biocompatible polymers for tissue engineering application: a review / F. Asghari [et al.] // Artificial Cells, Nanomedicine and Biotechnology. - 2017. - Vol. 45. - № 2. - P. 185-192.

34. Polysaccharide-Based Conjugates for Biomedical Applications / A. Basu [et al.] // Bioconjugate Chemistry. - 2015. - Vol. 26. - № 8. - P. 1396-1412.

35. 3D printing of PLA composites scaffolds reinforced with keratin and chitosan: Effect of geometry and structure / L.E. Rojas-Martinez [et al.] // European Polymer Journal. - 2020. - Vol. 141. - № October. - P. 110088.

36. Wu N. Mechanical properties and phase morphology of super-tough PLA/PBAT/EMA-GMA multicomponent blends / N. Wu, H. Zhang // Materials Letters. - 2017. - Vol. 192. - P. 17-20.

37. Fabrication of polylactic acid (PLA)-based porous scaffold through the combination of traditional bio-fabrication and 3D printing technology for bone regeneration / X. Zhou [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2021.

- Vol. 197. - № June. - P. 111420.

38. Designing of PLA scaffolds for bone tissue replacement fabricated by ordinary commercial 3D printer / A. Gregor [et al.] // Journal of Biological Engineering.

- 2017. - Vol. 11. - № 1.

39. Manufacture and Characterisation of Porous PLA Scaffolds / N. Rodrigues [et al.] // Procedia CIRP. - Elsevier B.V., 2016. - Vol. 49. - P. 33-38.

40. Bose S. Bone tissue engineering using 3D printing / S. Bose, S. Vahabzadeh, A. Bandyopadhyay // Materials Today. - 2013. - Vol. 16. - № 12. - P. 496-504.

41. 3D-printed ABS and PLA scaffolds for cartilage and nucleus pulposustissue regeneration / D.H. Rosenzweig [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2015. - Vol. 16. - № 7. - P. 15118-15135.

42. Additive manufacturing in biomedical sciences and the need for definitions and norms / M.P. Chhaya [et al.] // Expert Review of Medical Devices. - 2015. -Vol. 12. - № 5. - P. 537-543.

43. Aram E. A review on the micro- and nanoporous polymeric foams: Preparation and properties / E. Aram, S. Mehdipour-Ataei // International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. - 2016. - Vol. 65. - № 7. -P. 358-375.

44. Li D. Electrospinning of Nanofibers: Reinventing the Wheel? / D. Li, Y. Xia // Advanced Materials. - 2004. - Vol. 16. - № 14. - P. 1151-1170.

45. Fabrication of scaffolds in tissue engineering: A review / P. Zhao [et al.] // Frontiers of Mechanical Engineering. - 2018. - Vol. 13. - № 1. - P. 107-119.

46. Additive manufacturing: Challenges, trends, and applications / O. Abdulhameed [et al.] // Advances in Mechanical Engineering. - 2019. - Vol. 11. - № 2. -P. 168781401882288.

47. Polylactides in additive biomanufacturing. Vol. 107 / P.S.P. Poh [et al.]. -Elsevier B.V., 2016.

48. Multicomponent Non-Woven Fibrous Mats with Balanced Processing and Functional Properties / T.S. Demina [et al.] // Polymers. - 2020. - Vol. 12. -№ 9. - P. 1911.

49. Polylactide microparticles stabilized by chitosan graft-copolymer as building blocks for scaffold fabrication via surface-selective laser sintering / T.S. Demina [et al.] // Journal of Materials Research. - 2022. - Vol. 37. - № 4. - P. 933-942.

50. Chitin and chitosan in selected biomedical applications / A. Anitha [et al.] // Progress in Polymer Science. - 2014. - Vol. 39. - № 9. - P. 1644-1667.

51. Chitosan as biomaterial in drug delivery and tissue engineering / S.M. Ahsan [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - Vol. 110.

- P. 97-109.

52. Physics O. d M us pt / O. Physics // On certain distance and degree based topological indices of Zeolite LTA frameworks. - 2018. - № December 2016.

- P. 11-14.

53. Novel biodegradable star-shaped polylactide scaffolds for bone regeneration fabricated by two-photon polymerization / P. Timashev [et al.] // Nanomedicine.

- 2016. - Vol. 11. - № 9. - P. 1041-1053.

54. Wu T. Moving Electrospun Nanofibers and Bioprinted Scaffolds toward Translational Applications / T. Wu, X. Mo, Y. Xia. - 2020. - Vol. 1901761. -

P. 1-7.

55. Kishan A.P. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review / A.P. Kishan, E.M. Cosgriff-Hernandez // Journal of Biomedical Materials Research - Part A. - 2017. - Vol. 105. - №2 10. - P. 2892-2905.

56. Non-woven bilayered biodegradable chitosan-gelatin-polylactide scaffold for bioengineering of tracheal epithelium / O.A. Romanova [et al.] // Cell Proliferation. - 2019. - Vol. 52. - № 3. - P. e12598.

57. Zhong S. Fabrication of Large Pores in Electrospun Nanofibrous Scaffolds for Cellular Infiltration: A Review / S. Zhong, Y. Zhang, C.T. Lim // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2012. - Vol. 18. - № 2. - P. 77-87.

58. The Influence of Pulsed Electron Beam Treatment on Properties of PLLA Nonwoven Materials Produced by Solution Blow Spinning / V.L. Kudryavtseva [et al.] // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8. - № 1. - P. 131-139.

59. Jenness N.J. Fabrication of three-dimensional electrospun microstructures using phase modulated femtosecond laser pulses / N.J. Jenness, Y. Wu, R.L. Clark // Materials Letters. - 2012. - Vol. 66. - № 1. - P. 360-363.

60. Wettability modification of electrospun poly(e-caprolactone) fibers by femtosecond laser irradiation in different gas atmospheres / L. He [et al.] // Applied Surface Science. - 2011. - Vol. 257. - № 8. - P. 3547-3553.

61. Laser Ablation Imparts Controlled Micro-Scale Pores in Electrospun Scaffolds for Tissue Engineering Applications / S.D. McCullen [et al.] // Annals of Biomedical Engineering. - 2011. - Vol. 39. - № 12. - P. 3021-3030.

62. Microstructuring of electrospun mats employing femtosecond laser / E. Adomaviciûtè [et al.] // Materials Science. - 2015. - Vol. 21. - №2 1. - P. 44-51.

63. O'Donnell P.B. Preparation of microspheres by the solvent evaporation

technique / P.B. O'Donnell, J.W. McGinity // Advanced Drug Delivery Reviews. - 1997. - Vol. 28. - № 1. - P. 25-42.

64. Chitosan-poly(lactide-co-glycolide) microsphere-based scaffolds for bone tissue engineering: In vitro degradation and in vivo bone regeneration studies / T. Jiang [et al.] // Acta Biomaterialia. - 2010. - Vol. 6. - № 9. - P. 3457-3470.

65. Proteins, polysaccharides, and their complexes used as stabilizers for emulsions: Alternatives to synthetic surfactants in the pharmaceutical field? / E. Bouyer [et al.] // International Journal of Pharmaceutics. - 2012. - Vol. 436. - № 1-2. -P. 359-378.

66. Pickering emulsions stabilized by naturally derived or biodegradable particles / V. Calabrese [et al.] // Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry. -2018. - Vol. 12. - P. 83-90.

67. Polysaccharides as Stabilizers for Polymeric Microcarriers Fabrication / T.S. Demina [et al.] // Polymers. - 2021. - Vol. 13. - № 18. - P. 3045.

68. Features of Polymeric Structures By Surface—Selective Laser Sintering of Polymer Particles Using Water as Sensitizer / S.N. Churbanov [et al.] // KnE Energy. - 2018. - Vol. 3. - № 2. - P. 64.

69. Enhanced photocatalytic degradation of organic pollutants mediated by Zn(II)-porphyrin/poly(acrylic acid) hybrid microparticles / H.P. Mota [et al.] // Applied Catalysis B: Environmental. - 2020. - Vol. 277. - P. 119208.

70. Fabrication of PLA/CaCO3 hybrid micro-particles as carriers for water-soluble bioactive molecules / V.L. Kudryavtseva [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2017. - Vol. 157. - P. 481-489.

71. Kawaguchi H. Functional polymer microspheres / H. Kawaguchi // Progress in Polymer Science. - 2000. - Vol. 25. - № 8. - P. 1171-1210.

72. Biodegradable Microparticles for Regenerative Medicine: A State of the Art and

Trends to Clinical Application / A.A. Sherstneva [et al.] // Polymers. - 2022. -Vol. 14. - № 7. - P. 1314.

73. Aligned PLGA/HA nanofibrous nanocomposite scaffolds for bone tissue engineering / M. JOSE [et al.] // Acta Biomaterialia. - 2009. - Vol. 5. - № 1. -P. 305-315.

74. Trzaskowska M. The Impact of Hydroxyapatite Sintering Temperature on Its Microstructural, Mechanical, and Biological Properties / M. Trzaskowska, V. Vivcharenko, A. Przekora // International Journal of Molecular Sciences. -2023. - Vol. 24. - № 6. - P. 5083.

75. Alper J. Biology and the Inkjets / J. Alper // Science. - 2004. - Vol. 305. -№ 5692. - P. 1895-1895.

76. Calvert P. Printing Cells / P. Calvert // Science. - 2007. - Vol. 318. - № 5848.

- P. 208-209.

77. Wilson W.C. Cell and organ printing 1: Protein and cell printers / W.C. Wilson, T. Boland // The Anatomical Record. - 2003. - Vol. 272A. - №№ 2. - P. 491-496.

78. Concise Review: Bioprinting of Stem Cells for Transplantable Tissue Fabrication / A.N. Leberfinger [et al.] // Stem Cells Translational Medicine. -2017. - Vol. 6. - № 10. - P. 1940-1948.

79. Application of laser printing to mammalian cells / J.A. Barron [et al.] // Thin Solid Films. - 2004. - Vols. 453-454. - P. 383-387.

80. Aspiration-assisted bioprinting of co-cultured osteogenic spheroids for bone tissue engineering / D.N. Heo [et al.] // Biofabrication. - 2021. - Vol. 13. - №2 1.

- P. 015013.

81. Aspiration-assisted freeform bioprinting of pre-fabricated tissue spheroids in a yield-stress gel / B. Ayan [et al.] // Communications Physics. - 2020. - Vol. 3.

- № 1. - P. 183.

82. Moldovan N.I. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting / N.I. Moldovan, N. Hibino, K. Nakayama // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2017. - Vol. 23. - № 3. -P. 237-244.

83. Odde D.J. Laser-guided direct writing for applications in biotechnology / D.J. Odde, M.J. Renn // Trends in Biotechnology. - 1999. - Vol. 17. - № 10. -P. 385-389.

84. Laser printing of cells into 3D scaffolds / A. Ovsianikov [et al.] // Biofabrication. - 2010. - Vol. 2. - № 1. - P. 014104.

85. Laser Printing of Gel Microdrops with Living Cells and Microorganisms / N. V Minaev [et al.] // KnE Energy. - 2018. - Vol. 3. - № 3. - P. 23.

86. Laser-induced transfer of gel microdroplets for cell printing / V.I. Yusupov [et al.] // Quantum Electronics. - 2017. - Vol. 47. - № 12. - P. 1158-1165.

87. Chrisey D.B. The Power of Direct Writing / D.B. Chrisey // Science. - 2000. -Vol. 289. - № 5481. - P. 879-881.

88. Laser-induced transfer of gel microdroplets for cell printing / V.I. Yusupov [et al.] // Quantum Electronics. - 2017. - Vol. 47. - № 12. - P. 1158-1165.

89. Tepidiforma bonchosmolovskayae gen. nov., sp. nov., a moderately thermophilic Chloroflexi bacterium from a Chukotka hot spring (Arctic, Russia), representing a novel class, Tepidiformia, which includes the previously uncultivated lineage OLB14 / T. V. Kochetkova [et al.] // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2020. - Vol. 70. - № 2. -P. 1192-1202.

90. Zhigarkov V.S. Destruction of absorbing metal films during laser printing with gel microdroplets / V.S. Zhigarkov, N.V. Minaev, V.I. Yusupov // Quantum Electronics. - 2020. - Vol. 50. - № 12. - P. 1134-1139.

91. Physical processes affecting the survival of microbiological systems in laser printing of gel droplets / V.P. Zarubin [et al.] // Quantum Electronics. - 2019. -Vol. 49. - № 11. - P. 1068-1073.

92. Hydrodynamic effects in laser cutting of biological tissue phantoms / V.S. Zhigarkov [et al.] // Quantum Electronics. - 2017. - Vol. 47. - № 10. - P. 942948.

93. Laser induced forward transfer isolating complex-shaped cell by beam shaping / P. Liang [et al.] // Biomedical Optics Express. - 2021. - Vol. 12. - № 11. -P. 7024.

94. Classification, processing, and applications of bioink and 3D bioprinting: A detailed review / S. Raees [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. - 2023. - Vol. 232. - P. 123476.

95. Collagen-alginate as bioink for three-dimensional (3D) cell printing based cartilage tissue engineering / X. Yang [et al.] // Materials Science and Engineering: C. - 2018. - Vol. 83. - P. 195-201.

96. 3D Bioprinting of Highly Thixotropic Alginate/Methylcellulose Hydrogel with Strong Interface Bonding / H. Li [et al.] // ACS Applied Materials & Interfaces.

- 2017. - Vol. 9. - № 23. - P. 20086-20097.

97. 3D bioprinted functional and contractile cardiac tissue constructs / Z. Wang [et al.] // Acta Biomaterialia. - 2018. - Vol. 70. - P. 48-56.

98. Loo Y. Bioprinting synthetic self-assembling peptide hydrogels for biomedical applications / Y. Loo, C.A.E. Hauser // Biomedical Materials. - 2015. - Vol. 11.

- № 1. - P. 014103.

99. Introduction to 3D-bioprinting: the history, principles and stages / Y.D. Khesuani [et al.] // Genes & Cells. - 2018. - Vol. 13. - № 3. - P. 38-45.

100. Natural Biomaterials and Their Use as Bioinks for Printing Tissues / C.

Benwood [et al.] // Bioengineering. - 2021. - Vol. 8. - № 2. - P. 27.

101. Cell sheet based bioink for 3D bioprinting applications / E. Bakirci [et al.] // Biofabrication. - 2017. - Vol. 9. - № 2. - P. 024105.

102. Applications of 3D bioprinting in tissue engineering: advantages, deficiencies, improvements, and future perspectives / B. Tan [et al.] // Journal of Materials Chemistry B. - 2021. - Vol. 9. - № 27. - P. 5385-5413.

103. Cell Aggregate Assembly through Microengineering for Functional Tissue Emergence / G. Eke [et al.] // Cells. - 2022. - Vol. 11. - № 9. - P. 1394.

104. Advances in Hybrid Fabrication toward Hierarchical Tissue Constructs / P.D. Dalton [et al.] // Advanced Science. - 2020. - Vol. 7. - № 11. - P. 1902953.

105. Fabrication of core-shell spheroids as building blocks for engineering 3D complex vascularized tissue / E.M. Kim [et al.] // Acta Biomaterialia. - 2019. -Vol. 100. - P. 158-172.

106. Cartilage and bone tissue engineering using adipose stromal/stem cells spheroids as building blocks / G.S. Kronemberger [et al.] // World Journal of Stem Cells. - 2020. - Vol. 12. - № 2. - P. 110-122.

107. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks / V. Mironov [et al.] // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30. - № 12. - P. 2164-2174.

108. Flores-Jiménez M.S. Review on Porous Scaffolds Generation Process: A Tissue Engineering Approach / M.S. Flores-Jiménez, A. Garcia-Gonzalez, R.Q. Fuentes-Aguilar // ACS Applied Bio Materials. - 2023. - Vol. 6. - № 1. - P. 123.

109. Rogovina S.Z. Investigation of properties of chitosan obtained by solid-phase and suspension methods / S.Z. Rogovina, T.A. Akopova, G.A. Vikhoreva // Journal of Applied Polymer Science. - 1998. - Vol. 70. - № 5. - P. 927-933.

110. Coating of polylactide films by chitosan: Comparison of methods / T.S.

Demina [et al.] // Journal of Applied Polymer Science. - 2020. - Vol. 137. -№ 3. - P. 48287.

111. Развитие метода поверхностно-селективного лазерного спекания: модификация и формирование 3D структур для тканевой инженерии / Н.В. Минаев [et al.] // Известия Российской академии наук. Серия физическая. - 2020. - Vol. 84. - № 11. - P. 1530-1536.

112. Polylactide-based microspheres prepared using solid-state copolymerized chitosan and d , l -lactide / T.S. Demina [et al.] // Materials Science and Engineering: C. - 2016. - Vol. 59. - P. 333-338.

113. Chitosan- g -oligo/polylactide copolymer non-woven fibrous mats containing protein: from solid-state synthesis to electrospinning / T.S.S. Demina [et al.] // RSC Advances. - 2019. - Vol. 9. - № 64. - P. 37652-37659.

114. Лазерная технология направленного микроструктурирования биодеградируемых нетканых материалов / Е.Д. Минаева [et al.] // Химия высоких энергий. - 2022. - Vol. 56. - № 2. - P. 159-165.

115. Bradley D. Adaptive Thresholding using the Integral Image / D. Bradley, G. Roth // Journal of Graphics Tools. - 2007. - Vol. 12. - № 2. - P. 13-21.

116. Time-resolved imaging of hydrogel printing via laser-induced forward transfer / C. Unger [et al.] // Applied Physics A. - 2011. - Vol. 103. - № 2. -P. 271-277.

117. Time-resolved imaging of the laser forward transfer of liquids / M. Duocastella [et al.] // Journal of Applied Physics. - 2009. - Vol. 106. - № 8. -P. 084907.

118. Laskin A. Achromatic refractive beam shaping optics for broad spectrum laser applications / A. Laskin // eds. A. Forbes, T.E. Lizotte. - 2009. - P. 743003.

119. Golipour H. The fabrication and characterization of a novel antibacterial

curcumin and TiO 2 loaded gelatin/silk fibroin: polycaprolactone scaffolds for skin tissue engineering / H. Golipour, E. Ezzatzadeh, A. Sadeghianmaryan // International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. -2023. - P. 1-13.

120. A review of key challenges of electrospun scaffolds for tissue-engineering applications / S. Khorshidi [et al.] // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2016. - Vol. 10. - № 9. - P. 715-738.

121. Laser Technology of Directional Microstructuring of Biodegradable Nonwovens / E.D. Minaeva [et al.] // High Energy Chemistry. - 2022. - Vol. 56.

- № 2. - P. 138-144.

122. Park S.Y. Fabrication of Cell Spheroids for 3D Cell Culture and Biomedical Applications / S.Y. Park, H.J. Hong, H.J. Lee // BioChip Journal. - 2023. -Vol. 17. - № 1. - P. 24-43.

123. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine / S. Kim [et al.] // Advanced Healthcare Materials. -2020. - Vol. 9. - № 23.

124. Laser-induced Forward Transfer Hydrogel Printing: A Defined Route for Highly Controlled Process / V. Yusupov [et al.] // International Journal of Bioprinting. - 2020. - Vol. 6. - № 3. - P. 271.

125. Laser microsampling of soil microbial community / M. V. Gorlenko [et al.] // Journal of Biological Engineering. - 2018. - Vol. 12. - № 1. - P. 27.

126. Laser printing of microbial systems: effect of absorbing metal film / V.S. Cheptsov [et al.] // Letters in Applied Microbiology. - 2018. - Vol. 67. - № 6.

- p. 544-549.

127. Theoretical and Experimental Assay of Shock Experienced by Yeast Cells during Laser Bioprinting / E. V. Grosfeld [et al.] // International Journal of

Molecular Sciences. - 2022. - Vol. 23. - № 17. - P. 9823.

128. Laser Bioprinting with Cell Spheroids: Accurate and Gentle / E.D. Minaeva [et al.] // Micromachines. - 2023. - Vol. 14. - № 6. - P. 1152.

129. Metal Nanoparticles in Laser Bioprinting / V. Zhigarkov [et al.] // Nanomaterials. - 2021. - Vol. 11. - № 10. - P. 2584.

130. LIFT of cell spheroids: Proof of concept / A. Antoshin [et al.] // Bioprinting.

- 2023. - Vol. 34. - № March. - P. e00297.

131. A virtual scalpel system for computer-assisted laser microsurgery / L.S. Mattos [et al.] // 2011 IEEE/RSJ International Conference on Intelligent Robots and Systems. - IEEE, 2011. - P. 1359-1365.

132. Ke D. Current Challenges of Bioprinted Tissues Toward Clinical Translation / D. Ke, S. V. Murphy // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2019. - Vol. 25.

- № 1. - P. 1-13.

Приложение.

Материалы для лазерной биопечати.

Клеточные сфероиды.

Клеточные сфероиды, использованные для лазерной биопечали, созданы на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК), полученных из пуповины человека. Первичные культуры МСК получали из образцов пуповины, как описано в патенте СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОЧНОГО КАНАТИКА НОВОРОЖДЕННОГО / А. Свистунов [et al.]. -Россия, 2020, с разрешения Локального этического комитета Сеченовского университета. Полученные МСК культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM)/F12 (1:1, Биолот, Санкт-Петербург, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) инсулин-трансферрин-селенит натрия (1:100, Биолот, Россия), основного фактора роста фибробластов (20 нг/мл, ПроСпец, Израиль), гепарина 5000 МЕ/мл (Белмедпрепараты, Беларусь) и гентамицина (50 мкг/мл, Панеко, Россия) при 37°С, 5% СО2. Морфологию и жизнеспособность клеток проверяли с помощью фазово-контрастного микроскопа Axio Vert A1 (Carl Zeiss, Мюнхен, Германия). Клеточные сфероиды (2000 клеток на сфероид) изготовляли, как подробно изложено в работе Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model / N. V. Kosheleva [et al.] // Scientific Reports. - 2020. - Vol. 10. - № 1. - P. 12614. Клеточную суспензию (3,4x106 клеток/мл) помещали в агарозные неадгезивные микропланшеты, созданные с помощью 3D-форм для чашек Петри (Microtissues, США), оставляли при 37°С, 5% CO2 для застывания, а затем покрывали для полного роста средой в 12-луночных культуральных планшетах. На рис. 1 представлена фотография агарозного микропланшета, в котором находятся клеточные сфероиды.

Рис. 1. Оптическая фотография агарозного микропланшета, в лунках которого находятся клеточные сфероиды.

Культивация сфероидов проводилась на протяжении 7 дней при 37oC, 5% CO2 перед биопечатью.

Гидрогель для размещения клеточных сфероидов.

Гидрогелевая компонента биочернил сознана на основе высокомолекулярного порошка гиалуроновой кислоты с ММ = 1,6-1,8 МДа («Контипро», Чехия). Процесс стерилизации порошка проводили при 121°С на протяжении 15 мин, разводили в клеточной среде (DMEM)/F12 («Биолот», Россия) и перемешивали с клеточными сфероидами до концентрации гиалуроновой кислоты 2 или 4 мг/мл и концентрации клеточных сфероидов 1600 ед./мл. Для принимающего слоя гидрогеля, который находится на акцепторной пластинке, фибриноген (Sigma-Aldrich, Германия) смешивали с ПЭГ-НХС (PEG-NHS; Sigma-Aldrich, Germany) в мольном соотношении 5:1 в фосфатно-солевом буфере. Смесь, полученную в итоге этих манипуляций, инкубировали 2 ч при 37 °C и добавляли к ней гиалуроновой кислоты так, чтобы концентрация необходимых компонентов в итоге была следующей: ПЭГ фибриноген - 25 мг. /мл, гиалуроновой кислоты - 5,6 мг/мл. После лазерной биопечати акцепторную пластину, на которую переносились

142

клеточные сфероиды вместе с гидрогелевой компонентой, отверждали распылением раствора тромбина 33 ед/мл (Sigma-Aldrich, Германия).

Для определения оптимальной концентрации гиалуроновой кислоты в биочернилах были протестированы две концентрации для переноса клеточных сфероидов: 4 мг/мл и 2 мг/мл. В случае биопечати с гиалуроновой кислоты 4 мг/мл перенос сфероида не осуществлялся, и после воздействия лазерного импульса он поднимался обратно к изначальному положению. Когда концентрация гиалуроновой кислоты уменьшалась вдвое (2 мг/мл), происходил точный перенос сфероида на акцепторную подложку. Это объясняется уменьшением вязкости биочернил в два раза, что, несомненно, позволило использовать меньшую энергию лазерного импульса, чтоб стало возможным инициирование струи гидрогеля и переноса сфероида. При биопечати без гиалуроновой кислоты (только DMEM) сфероид быстро хаотично переносился в стороны, находящиеся за пределами поля зрения камеры, и точного режима переноса подобрать не удавалось. По этой причине концентрация гиалуроновой кислоты в биочернилах 2 мг/мл была признана оптимальной для осуществления всей последующей работы.