Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Коробова, Мария Владимировна

• Коробова, Мария Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коробова, Мария Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС. АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА.

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИОКСИДАНТНОГО

ДЕЙСТВИЯ

1.1. Свободные радикалы. Определение, классификация и механизмы образования

1.2. Физиологическое значение свободных радикалов

1.3. Патофизиологические эффекты свободных радикалов.Оксидативный стресс как типовой патологический процесс. Система антиоксидантной защиты организма

1.4. TNF-а и Си,гп-супероксиддисмутаза

1.5. Супероксиддисмутаза-структура, биохимия. Супероксиддисмутаза как антиоксидант

1.6. Возможности терапевтического применения препаратов супероксиддисмутазы

1.7. Принципы получения рекомбинантных препаратов

1.8. Принципы промышленного культивирования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторный метод очистки рекомбинантной супроксиддисмутазы

2.1.1. Метод получения белкового дезинтеграта

2.1.2. Метод ионообменной хроматографии

2.1.3. Диализ (обессоливание)

2.1.4. Метод гель-хроматографии

2.1.5. Определение белка по методу Лоури

2.1.6. Количественный метод определения активности супроксиддисмутазы

2.2. Подготовка материала для проведения модельных опытов и исследований групп пациентов

2.3. Оценка параметров свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы

2.3.1. Определение конечных продуктов ПОЛ (ТБК-АП)

2.3.2. Определение окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах периферической крови человека

2.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы набором "Randox" в нейтрофилах и мононуклеарах

2.3.4. Определение активности каталазы

2.3.5. Определение окислительной деструкции белков

2.4. Методы оценки иммунного статуса

2.4.1. Индукция синтеза цитокинов. Определение фактора некроза опухоли - a (TNF - а)

2.4.2. ИФА метод определения TNF- а

2.5. Методы оценки биохимических параметров

2.5.1. Метод определения AJIT

2.5.2. Метод определения общего билирубина

2.5.3. Метод определения ГГТП

2.5.4. Метод определения щелочной фосфатазы

2.5.5. Метод определения холинэстеразы

2.6. Характеристика обследованных больных

2.7. Статистические методы

2.8. Характеристика используемых реактивов и оборудования

ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Действие препарата рексод в модельных системах на окислительную деструкцию белков

3.2. Модифицирование метода определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови

3.3. Действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro

3.4. Изучение влияния экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли а (TNF-а), фактора воспаления обладающего цитотоксичностью в отношении клеток мишеней, в системах с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы

3.5. Оценка клинико-лабораторных параметров у больных с острым гепатитом

В до и после лечения препаратом Рексод.

3.6. Влияние препарата рексод на параметры свободнорадикального статуса и антиоксидантной защиты у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия или сенильная неэксудативная хориоретинальная дистрофия)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека»

Актуальность проблемы.

Как известно, при всех патологических процессах, происходящих в организме человека на клеточном уровне, возникают процессы альтерации с последующей репарацией. В связи с этим, в терапии заболеваний различной природы, большое значение имеют препараты, способствующие защите и репарации клеток (Коган А.Х., 1999; Das U.N., 2000; Guerra Е. I., 2001).

Среди подобных соединений особое внимание привлекают антиоксиданты, способные контролировать и модулировать окислительные процессы в клетке.

Ключевым ферментом антиоксидантной защиты организма является супероксиддисмутаза (СОД). Данный фермент осуществляет дисмутацию супероксидного радикала (Oi)- продукта одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, который образуется практически во всех клетках организма, контактирующих с кислородом и играет ведущую роль в процессах токсичности активных форм кислорода (АФК). Oi действует на все компоненты клеток (белки, липиды, нуклеиновые кислоты), на компоненты соединительных тканей (гиалуроновая кислота), а также является предшественником более токсичного гидроксильного радикала (*ОН).

Каталитический характер инактивации супероксидного радикала определяет преимущество СОД по сравнению с антиоксидантами неферментативной природы. К настоящему времени существует хорошо обоснованная стратегия применения препаратов СОД при самых различных заболеваниях, где патогенетическую роль выполняют активированные фагоциты, а также отмечаются нарушения, связанные с накоплением активных форм кислорода (Трубников Г.А. и соавт.,1998; Скальный А.В. и соавт.,2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Davis J.M. et. al.,2000).

Наиболее перспективными для широкого клинического применения являются препараты гомологичных белков, а именно, препараты на основе СОД человека (Черепак JI. Н. и соавт., 1998; Davis J.M., et al., 2000). Одним из них, является Рексод - новый отечественный ферментный лекарственный препарат, обладающий антиоксидантным, антицитолитическим и противовоспалительным действием. Основным действующим веществом Рексода является рекомбинантная супероксиддисмутаза (СОД) человека, выделенная из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae. Доклинические исследования препарата Рексод показали, что он является нетоксичным при однократном (остром) пероральном, а также внутривенном и внутримышечном введении. Опыт применения зарубежными исследователями препаратов СОД человека показал, что экзогенная супероксиддисмутаза обладает широким терапевтическим действием (Yune T.Y.et al., 2004; Akbulut G. et al., 2005; Kamata H et al., 2005).

В связи с выше сказанным, можно сказать, что использование экзогенной супероксиддисмутазы, являющейся ключевым ферментом антиоксидантной системы, будет способствовать защите клеток макроорганизма от альтерации супероксидными радикалами и корректировать состояние оксидативного стресса.

Цель исследования:

Охарактеризовать воздействие экзогенной супероксиддисмутазы, выделенной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, на процессы свободнорадикального окисления in vitro и оценить влияние препарата Рексод на клинико-лабораторные показатели при острых и хронических патологических процессах in vivo.

Задачи исследования

1. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах.

1. Модифицировать метод определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови.

2. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro

3. Изучить влияние экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли -а (TNF-а) в системах in vitro с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы.

4. Охарактеризовать показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса, биохимические и иммунологические параметры у больных с острым гепатитом В до и после лечения препаратом Рексод.

5. Изучить показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия) до и после лечения препаратом Рексод.

Научная новизна.

В результате проведенного научного исследования получены новые данные о механизмах протективного действия экзогенной супероксиддисмутазы на процессы свободно-радикального окисления и оценены механизмы подавления продукции TNF- а, фактора цитотоксичности, непосредственно и необратимо инициирующего апоптоз клеток мишеней по TNF- а - TNF- R пути in vitro. Показано положительное влияние препарата "Рексод", содержащего рекомбинантную Си^п-супероксиддисмутазу, на состояние «окислительного стресса», при остром и хроническом патологических процессах. Обоснован метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, который не только дополняет методы оценки антиоксидантной защиты у человека, а в некоторых случаях может быть более информативным клинико-лабораторным показателем. Научно-практическая значимость работы.

Разработаны подходы к оценке антиоксидантного действия экзогенной супероксиддисмутазы в модельных системах. Спектр методов оценки антиоксидантной защиты расширен за счет разработки метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови.

Доказана эффективность применения препарата супероксиддисмутазы Рексод при остром (гепатит В) и хроническом (возрастная макулодистрофия) патологических процессах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

• Опыты in vitro достоверно доказывают действие экзогенной супероксиддисмутазы на снижение окислительной деструкции белков в системе с постоянной генерацией Ог.

• Метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови может быть использован, как дополнительный показатель при оценке антиоксидантного статуса организма.

• В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.

• Инкубация крови в модельных системах различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли а (TNF-а) мононуклеарами периферической крови и подтверждает, что одним из опосредованных механизмов действия фермента является снижение продукции TNF- а.

• Применение препарата Рексод на фоне базисной терапии при остром патологическом процессе (гепатит В) оказывает положительное влияние на интенсивность процессов свободнорадикального окисления, что выражается в достоверном улучшении биохимических показателей.

• При хроническом процессе (возрастная макулодистрофия) проявляется ингибирующее влияние препарата Рексод на интенсивность процессов свободнорадикального окисления и, прежде всего, на уровень окислительной модификации белка.

Апробация работы и публикации по материалам исследования

Результаты работы были представлены на научной конф. «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию П.МЛльбицкого (9-10 октября 2003 года, Санкт-Петербург), и национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (26-30сентября 2005г, Смоленск). По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Коробова, Мария Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Действие фермента супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах выражается в достоверном снижении содержания карбонильных групп, что подтверждает способность фермента эффективно снижать уровень супероксид-анион радикала.

2. Аналитическая надежность модифицированного метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, основанного на изменении формирования красной форма-зановой окраски в присутствии СОД в системе генерирующей 02", позволяет использовать его для оценки активности СОД и состояния "окислительного стресса".

3. В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.

4. Инкубация крови в модельных системах с различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли а (TNF-а) мононуклеарами периферической крови.

5. Эффекты терапии препаратом Рексод при остром гепатите В характеризовались достоверным снижением общего билирубина, АлАТ и ГГТП по сравнению с группой пациентов, получавших стандартную терапию. Отмечалось увеличение активности СОД в мононуклеарах и нейтрофилах, снижение показателей окислительного повреждения липидов (количество ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах) и окислительной деструкции белков (карбонильные группы).

6. Изменения параметров окислительного стресса и антиоксидантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса после лечения препаратом Рексод заключались в снижении окислительной деструкции белков и липидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Постановка цели и задач данного исследования были обусловлены тем, что в течение последнего десятилетия достоверно доказывается физиологическая и регу-ляторная роль свободных радикалов, а также их непосредственное участие в патогенезе многих заболеваний (Трубников ГА. и соавт., 1998; Davis J.M. et. al.,2000; Балаболкин, 2000).

Благодаря открытию механизмов вовлечения активных форм кислорода в развитие различного рода патологических процессов, у ученых мира появилась возможность в разработке новых подходов в антиоксидантной терапии (Скальный А.В. и соавт.,2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Шанин Ю.Н, 2003). Несмотря на то, что характеристика антиоксидантного статуса дает дополнительную, более полную информацию о повреждения организма на клеточном уровне, данные методы диагностики используются в практике довольно редко. Это связано с тем, что в клинической практике, практически не возможно уловить образование свободнорадикальных форм в биологических системах, ввиду их чрезвычайно короткого времени жизни и сложности методов, которые могли бы эту задачу решить. Тем не менее, характеристика антиоксидантного статуса может дать дополнительную и важную информацию о состоянии патологических процессов.

Как известно, клеточная защита от свободных радикалов представляет собой многоуровневую систему биооксидантов. Так называемая первичная защита ослабляет реакции инициации свободнорадикального окисления, уменьшая концентрацию свободных радикалов. В проведенном исследовании была проведена оценка возможностей антиоксидантной защиты первой линии, так называемых "ловушек" свободных радикалов. К ним относятся: супероксиддисмутаза - дисмутирующая супероксидный радикал, каталаза - удаляющая перекись водорода и глутатион, участвующий в детоксикации перекисей. Параллельно с оценкой антиоксидантной защиты проводилось исследование маркеров свободнорадикального окисления, таких как ТБК-активные продукты, а также высокоспецифического маркера окислительного повреждения макромолекул- окислительной деструкции белков.

Для получения максимальной информации о взаимоотношении прооксидант-ных и антиоксидантных систем и увеличения числа информативных показателей антиоксидантного статуса, в ходе исследования был разработан метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови. Результаты экспериментов с использованием предложеннного метода, обработанные методами статистического анализа, доказали аналитическую надежность разработанного метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах. Результаты апробации метода показали, что он может быть использован не только в научных целях, но и как дополнительный клинико-лабораторный показатель до и после лечения антиоксидантами.

В диссертационном исследовании для коррекции про- и антиоксидантных систем была использована рекомбинантная супероксиддисмутаза. Перспективность использования лекарственных препаратов, содержащих гомологичную СОД, получаемую методами генной инженерии является неоспоримой ввиду безопасности использования, возможности наработки достаточных количеств препарата с известной активностью.

Проведенное нами исследование действия фермента на окислительную деструкцию белков в модельных системах, показало достоверное снижение содержания карбонильных групп. Это подтверждает способность фермента эффективно снижать уровень супероксид-анион радикала и действовать на наиболее важное звено патологического процесса.

Интересным результатом оказалось достоверное снижение продукции фактора некроза опухоли TNF-a в модельных системах при обработке проб раствором фермента. Данные экспериментов подтверждают данные литературы о взаимоотношениях между СОД и TNF- a (Akbulut G. et al., 2005, Yune T.Y.et al., 2004, Kamata H et al.,2005)

Оценивая клинико-лабораторные показатели пациентов прошедших на фоне базисной терапии, терапию антиоксидантным препаратом Рексод (рекомбинантная супероксиддисмутаза), можно сделать вывод о положительном терапевтическом эффекте. При оценке влияния рекомбинантной СОД на клинико-лабораторные показатели при остром гепатите В (30 человек) отмечалось, что общий билирубин, АлАТ и ГГТП были достоверно ниже в группе пациентов, в схему лечения которых был включен препарат Рексод, по сравнению с группой пациентов, получавших только базисную терапию.

Изменения параметров окислительного стресса и антиоксидантного статуса сопровождалось увеличением активности СОД в мононуклеарах и нейтрофилах, снижением показателей окислительного повреждения липидов (количество ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах) и окислительной деструкции белков (карбонильные группы). По сравнению с группой пациентов, получавших стандартную терапию (без препарата Рексод), в группе пациентов , в схему терапии которых был введен препарат экзогенной СОД, не отмечалось повышение уровня TNF-a , который в свою очередь поддерживает воспаление в печени, вызывает гибель гепатоци-тов и генерирует образование новых продуктов оксидативного стресса.

В группе пациентов с хроническим течением патологического процесса возрастная макулодистрофия) после лечения препаратом Рексод отмечалось снижение окислительной деструкции белков и липидов, вызывающих дегенеративные атеро-склеротические изменения в ретинальной оболочке глаза.

Таким образом, по совокупности проведенных экспериментальных и клинических наблюдений можно говорить об эффективности применения рекомбинантной супероксиддисмутазы, полученной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, для коррекции состояния острого и хронического оксидативного стресса при острых и хронических патологических процессах (Коробова М.В. и соавт., 2005).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коробова, Мария Владимировна, 2005 год

1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: Методические рекомендации,- СПб., «Фолиант»,2000. 104 с.

2. Балаболкин М. И., Клебанова Е. М. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета. // Проблемы эндокринологии, 2000, т. 46, № 6, с. 29-34.

3. Бегдай И.В., Перцева М.Ю., Дацева Т.А., Воробьева Е.Г. Биотехнология восстановления первоначальных свойств питательных сред после культивирования микроорганизмов Ставрополь, Ставропольский гос. ун-т, 2005.

4. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М., «Мир», 1989, т.2, с.345-350.

5. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журн., 2000, №4, с 71-78.

6. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль JI.M. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр. мед. химии, 1987, т.ЗЗ, № 1, с.118-122.

7. Дроздова Ю.И. Выделение и изучение свойств супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae -Автореф. дисс. канд. биол. наук. С-Пб., 1997,20с.

8. Ю.Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса // Вопр. мед.химии, 2001, т.47, №6, с.558-561.

9. П.Егоров Н.С. Промышленная микробиология. Учеб. пособие для вузов по спец. "Микробиология" и "Биология". М., Высш.шк., 1989, 688с.

10. Еремин А.Н. Соиммобилизация супероксиддисмутазы, каталазы. // Прикл.биохимия и микробиология, 2001, т.37, №1, с. 53-62

11. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. СПб, 1998, 156 с.

12. Клебанов Г. И., Теселкин Ю. О., Бабенкова И., Любицкий О. Б., Владимиров Ю. А. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестник РАМН,1999, №2, с. 15-21

13. Коган А. X. Фагоцитзависимые кислородные-свободнорадикальные механизмы аутоагрессии в патогенезе внутренних болезней // Вестник РАМН, 1999, №2, с. 2-10.

14. Кожин С.А., Кожина Т.Н., Латыпов В.Ф., Королев В.Г. RAD29 и RAD31 -новые гены дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвующие в контроле репарации ДНК. Выяснение возможных функций этих генов. // Генетика,2000, №36, с. 1025-1032.

15. Кожина Т.Н., Кожин С.А., Латыпов В.Ф., Королев В.Г. RAD29 и RAD31 -новые гены дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвующие в контроле репарации ДНК. Изоляция и генетическое изучение мутантов. // Генетика, 2000, №36, с. 767-773.

16. Красильников И.В. Перспективы развития рынка рекомбинантных препаратов // Фармацевтический вестник, 2005, №16 (375), с.26.

17. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Соросовский образовательный журн., 1997, № 3, с. 23-31.

18. Лебедев Л. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И., Рязанкин И. А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология, 2001, №1, с. 3-12.

19. Морозов В.И. Участие активных форм кислорода в регуляторных процессах. В кн.: Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. Тр. науч. конф., посвященной 100-летию каф. биохимии СПбГМУ им. ак. И.П. Павлову.- СПб., 1998, с.398-400.

20. Нагоев Б. С., Иванова М. Р. Роль системы антиоксидантной защиты организма в патогенезе острых вирусных гепатитов // Терапевтический архив, Кабардино-Балкарский гос. ун-т им. X. М. Бербекова, 2003, №11, с. 37-41.

21. Пасечник И.Н., Азизов Ю.М., Никушин Е.В.и др. Роль окислительного стресса как компонента критических состояний в генезе нарушений гемостаза. // Анестезиология и реаниматология, 2001, №3, с. 41-43.

22. Скальный А. В., Кудрин А. В. Радиация, микроэлементы, антиоксиданты и иммунитет. М., 2000,427с.

23. Сойфер В.Н. Международный проект "Геном человека" // Соросовский образовательный журн, 1998, № 12, с. 4-11.

24. Соловьева Л.Я., Чурилова И.В., Княжев В.А., Калошин В.Г., Антипова Т.О., Федорова Н.М. Способ выделения супероксиддисмутазы. Патент РФ № 2186848, от 10 августа 2002 г.

25. Трубников Г.А., Журавлев Ю.И. Антиоксиданты в комплексной терапии больных хроническим бронхитом. // Росс. мед. журн., 1998, №2, с.38-41.

26. Чекнев С. Б. Активные метаболиты кислорода в обеспечении и контроле естественных цитотоксических реакций. // Вестник РАМН, 1999, № 2, с. 1015.

27. Черепак Л. Н., Деримедведь Л. В., Николенко В. В. Хронологическая зависимость противовоспалительного действия супероксиддисмутазы. // Провизор, 1998, №5, с. 41-43.

28. Шанин Ю.Н., Шанин В.Ю., Зиновьев Е.В. Антиоксидантная терапия в клинической практике. СПб., ЭЛБИ-СПб, 2003, 128 с.

29. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 2-е изд., испр. и доп. -Новосибирск, 2004,496 с.

30. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы. СПб., «Игра», 2000,294 с.

31. Abachi Т., Nakamura М., Yamada Н., Futemna A. Quantitative and qualitative change of extracellular-superoxide dismutase in patients with various deseases. // Clinica Chimica Acta, 2004, №6, p.123-131.

32. Adams, D. O., HamiltonT.A. The cell biology of macrophage activation. // Annu. Rev. Immunol., 1984, №2, p.283-286.

33. Adler, К. В., Fischer B.M., Wright D.T., Cohn L.A., Becker S. Interactions between respiratory epithelial cells and cytokines: relationships to lung inflammation. // Ann. NY Acad. Sci., 1994, №725, p.128-130.

34. Aebi H. Catalase in vitro // Methods. Enzymol., 1984, Vol.2, №9, p.673 684.

35. Aggarwal, В. В., Natarajan K. Tumor necrosis factors: developments during the last decade. // Eur. Cytokine Network, 1996, №7, p.93-96.

36. Alekseev S.Y., Kovaltzova S. V., Fedorova I. V., Gracheva L.M., Evstuhina T.A., Peshehonov V.T., Korolev V.G. HSM2 (HMOl) gene participates in mutagenesis control in yeast Saccharomyces cerevisiae. // DNA Repair, 2002, №1, p.287-297.

37. Alvarez, S., Boveris A. Antioxidant adaptive response in human blood mononuclear cells exposed to UVB. // J. Photochem. Photobiol., 1997, № 38, p.152-156.

38. Bast A., Haenen G. Oxidants and antioxidants: State of the Art. Symposium on oxidants and antioxidants. // The Am. J. of Med., Vol.91, №3, p. 10.

39. Betteridge D. J. What is oxidative stress? // Metabolism, 2000, Vol. 49, №2, p.3-8.

40. Bogdan, C., Nathan C. Modulation of macrophage function by transforming growth factorp, interleukin-4, and interleukin-10. // Ann. NY Acad. Sci., 1993, №685, p.713-715.

41. Bosinski S.N., Krasnogorskaia V.N., Solomina E.V. Efficacy of direct revascularization of choroids in the treatment of atherosclerotic macular dystrophies // Vest Oftalmol., 1997, Vol.l 13, №4, p.35-37.

42. Chepurnaya O.V., Kozhina T.N., Peshekhonov V.T., Korolev V.G. The REC41 gene of Saccharomyces cerevisiae: isolation and genetic analysis. // Mutation Res., 2001, №486,41-52.

43. Collins, Т., Read M.A., Neish A.S., Whitley M.Z., Thanos D.A., Maniatis T. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-кВ and cytokine-inducible enhancers. // FASEB J., 1995, №9, p.899-901.

44. Culotta V.C., Klomp L.W., Strain J.H., Casareno R.L., Krems B.I., Gitlin J.D. The copper chaperone for superoxide dismutase. // J. Biol. Chem., 1997, №272(38), p. 23469-23472.

45. Cuzzocrea S., Pisano В., Dugo L., Ianaro A., Ndengele M., Salvemini D. Superoxide- rel;ated Sigmnaling Cascade Mediates nuclear factor -kappa В activation in acute inflammation. // Antioxid. Redox. Signal., 2004, №6(4), p.699-704.

46. Das U.N. Beneficial effect(s) of n-3 fatty acids in cardiovascular diseases: but, why and how? // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids., 2000, Vol. 63, №6, p. 351-621.

47. Fedorov A.A., Stoliarenko G.E. A pathological study of newly formed subpignent epithelial tissue in patients with senile macular dystrophy. // Vest. Oftalmol., 1998, Vol.114, №5, p.51-55.

48. Forman H. J., Torres M. Redox signaling in macrophages. // Mol. Aspects Med., 2001, №22, p.189-195.

49. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. // Science, 1978, №201, p.875-878.

50. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase. // Biochemie., 1975, Vol. 57, p.657-660.

51. Froh M., Wheeler M.D., Smutney O., Zhong Z., Bradford B.U., Thurman R.G. New method of delivering gene-altered Kupffer cells to rat liver: studies in an ischemia-reperfusion model. // Gastroenterology, 2003, №124(1), p.172-83.

52. Gao В., Flores S.C., Leff J.A., Bose S.K., McCord J.M. Synthesis and antiinflammatory activity of a chimeric recombinant superoxide dismutase: SOD2/3. //Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2003, №284(6), p.917-925.

53. Guerra E. J. I. Oxidative stress, diseases and antioxidant treatment. // An. Med. Interna., 2001, № 6, p.326 335.

54. Gui S.Y., Wei W., Wang H., Wu L., Sun W.Y., Chen W.B., Wu C.Y. Effects and mechanisms of crude astragalosides fraction on liver fibrosis in rats. // J. Ethnopharmacol., 2005, №27, p.46-49.

55. Gutteridge J.M.C., Tickner T.R. The characterization of thiobarbituric acid reactivity in human plasma and urine. // Anal. Biochem., 1978, Vol. 91, p.250-257.

56. Gutteridge J.M., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. // Ann. NY Acad. Sci., 2000, №899, p.136-47.

57. Halliwell В. Reactive Oxygen Species in Living Systems Source, Biochemistry, and Role in Human Disease. // The Am. J. of Medicine, Vol.91, p.3-14.

58. Ibelgaufts H. Dictionary of cytokines. // VCH, 1995, №6, p.710-715.

59. Internotional conference on «Superoxide dismutases: Recent Advanses and Clinical Applications", May 14-15, 1998, Institut Pasteur. Paris, 1998, 125 p.

60. Fedorova I.V., KovaltzovaS.V., Korolev V.G. The Yeast HSM3 Gene Is Involved in DNA Mismatch Repair in Slowly Dividing Cells. // Genetics, 2000, №154, p. 495-496.

61. Jennings P. E. Vascular benefits of gliclazide beyond glycemic control // Metabolism, 2000, Vol.49, №10, p.17-20.

62. Kahl R., Kampkotter A., Watjen W., Chovolou Y. Antioxidant enzymes and apoptosis // Drug. Metab. Rev., 2004, Vol.36, №3-4, p.747-762.

63. Kamata H., Honda S., Maeda S., Chang L., Hirata H., Karin M. Reactive oxygem Species Promote TNF-alpha-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. // Cell., 2005, №120(5), p.649-661.

64. Knight J.A. Free radicals: their history and current status in aging and disease. // Ann. Clin. Lab. Sci., 1998, №28, p.331-346.

65. Landeghem G.F., Tabatabaie P., Beckman G., Beckman L., Andersen P. Manganese-containing superoxide dismutase signal sequence polymorphism associated with sporadic motor neuron disease. // Europ. J. of Neurol., 1999, №6, p.639-644.

66. Lee Kum-Tatt, Tan It-Koon. A new colorimetric method for the determination of glutathione in erythrocytes // Clinica Chimica Acta., 1974, Vol.53, p. 153-161.

67. Li Т., Huang X., Zhou R., Liu Y., Li В., Nomura C., Zhao J. Differential expression and localization of Mn and Fe superoxide dismutases in the heterocystous cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. // J. Bacterid., 2002, №184(18), p.5096-50103.

68. Lindberg M.J., Normark J., Holmgren A., Oliveberg M. Folding of human superoxide dismutase: disulfide reduction prevents dimerization and produces marginally stable monomers. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2004, №101(45), p.15893-15898.

69. Chen S., Wang H.T., Yang В., Fu Y.R., Ou Q.J. Protective effects of recombinant human growth hormone on cirrhotic rats. // World J. Gastroenterol., 2004, №10(19), p.2894-2897.

70. Liochev S.I., Fridovich I. Copper- and zinc-containing superoxide dismutase can act as a superoxide reductase and a superoxide oxidase. // J. Biol. Chem., 2000, №275(49), p.38482-28485.

71. Loguercio C., Federico A. Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis. // Free Radic. Biol. Med., 2003, №34 (1), p.1-10.

72. Luk E., Yang M., Jensrn L.T., Bourbonnais Y., Culotta V.C.Marganese activation of Superoxide dismutase 2 in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. // J.Biol.Chem., 2005, №25, p.38-41.

73. Malmstrom, B. G. Enzymology of oxygen. // Annu. Rev. Biochem., 1982, №51, p.21-25.

74. Marikovsky M., Ziv V., Nevo N., Harris-Cerruti C., Mahler O. Cu/Zn superoxide dismutase plays important role in immune response. // The J. of Immunology, 2003, №170, p. 2993-3001.

75. Mates J.M., Gomez C.P., Blanca M. Chemical and biological activity of free radical scavengers in allergic diseases. // Clin. Chim. Acta, 2000, №296, p.1-15.

76. Maytin M., Leopold J., Loscaizo J. Oxidant stress in the vasculature. // Curr. Atheroscler. Rep., 1999, Vol.2, №l,p.56-64.

77. Morrison, D. C., Ryan J.L. Endotoxins and disease mechanisms. // Annu. Rev. Med. 1987, №38, p.417-419.

78. Mruk D.D., Silvestrini В., Mo M.Y., Cheng C.Y. Antioxidant superoxide dismutase a review: its function, regulation in the testis, and role in male fertility. // Contraception., 2002, №65(4), p.305-11.

79. Ndengele M.M., Muscoli C., Wang Z.Q., Doyle T.M, Matuschak G.M., Salvemini D. Superoxide potentiates NF-kappa В activation and modulates endotoxin-induced cytokine production in alveolar mascrophages. // Shock, 2005, Vol.23, №2, p.186-193.

80. Ookawara Т., Eguchi H., Nishimura M., Kizaki Т., Takayama E., Saitoh D., Ohno H., Suzuki K. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation ofextracellular superoxide dismutase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №303(3), p.914-924.

81. Pabst M. J., Johnston R.B. Increased production of superoxide anion by macrophages exposed in vitro to muramyl dipeptide or lipopolysaccharide. // J. Exp. Med., 1980, №151, p.101-104.

82. Paolisso G., Esposito R., DAlessio M.A., Barbieri M. Primary and secondary prevention of atherosclerosis: is there a role for antioxidants? // Diabetes Metab., 1999, №25(4), P.298-306.

83. Pawlak K., Pawlak D., Mysliwiec M. Hepatitis intensified Oxidative Stress, MIP-1 beta and RANTES plasma levels in uraemic patients. // Cytokine., 2004, №28(6), p. 197-204

84. Petrunia A.M., Iasid Abu Ebeid .Clinical and immunological characteristics of dystrophic diseases of the retina in cleaners up after Chernobyl AES accident. // Vest. Oftalmol., 2001, Vol.l 17, №2, p.25-27.

85. Rosen P., Xuellang Du, Guang-Zhi Sui. Antioxidants in diabetes managemen /Eds/ L. Parker et a. New York, 2000, p. 17-32.

86. Roversi F.M., Galdieri L.C., Grego B.H., Souza F.G., Micheletti C., Martins A.M., D'Almeida V. Blood oxidative stress markers in Gaucher disease patients. // Clin. Chim. Acta., 2005, № 23, p. 41-44.

87. Hernandez-Saavedra D., Zhou H., McCord J.M. Anti-inflammatory properties of a chimeric recombinant superoxide dismutase: SOD2/3 // Biomed. Pharmacother., 2005, № 59(4), p.204-208.

88. Ken C.F., Lin C.T., Shaw J.F., Wu J.L. Characterization of fish Cu/Zn-superoxide dismutase and its protection from oxidative stress. // Mar. Biotechnol. (NY), 2003, №5(2), p. 167-173.

89. Liu Y., Borchert G.L., Donald S.P., Surazynski А., Ни C.A., Weydert C.J., Oberley L.W., Phang J.M. MnSOD inhibits proline oxidase-induced apoptosis in colorectal cancer cells. // Carcinogenesis., 2005, №26(8), p.1335-1342.

90. Ryzhova L.S. The hemodynamics of the brain and eye in patients with presenile and senile nonexudative central chorioretinal dystrophy during health resort treatment. // Vest. Oftalmol., 1992, Vol.108, №4-6, p.21-23.

91. Sakashita A., Epstein C.J., Carlson E., Koeffler H.P. Hematopoietic progenitor cells of transgenic mice with increased copper/zinc-superoxide dismutase activity are resistant to tumor necrosis factor. // J. Cell. Physiol., 1994, №160, p.233-235.

92. Sanches-Campos S., Alvares M., Culebras J.M, Gonzales-Gallego J, Tunon M.J. Pathogenic molecular mechanisms in an animal model of fulminant hepatic failure: rabbit hemorrhagic viral disease. // J. Lab. Clin. Med., 2004, №144(4), p.215-222.

93. Saugstad O.D. Chronic lung disease: the role of oxidative stress. // Biol. Neonate., 1998, №74, p.21-28.

94. Shirshikov Iu.K., Eliseeva E.G., Perchikova O.I. Ultrasound in the diagnosis of macular pathology of the eye. //Vest. Oftalmol., 1991, Vol.107, №4, p.42-46.

95. Chung J., Yang H., De Beus M.D., Ryu C.Y., Cho K., Colon W. Cu/Zn superoxide dismutase can form pore-like structures. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №312(4), p.873-876.

96. Sindhu R.K., Koo J.R., Roberts C.K., Vaziri N.D. Dysregulation of hepatic superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in diabetes: response to insulin and antioxidant therapies. //.Clin. Exp. Hypertens., 2004, №26(1), p.43-53.

97. Solas A.B., Kalous P., Davis J.M., Saugstad O.D. Effects of recombinant human superoxide dismutase during reoxygenation with 21% or 100% oxygen after cerebral asphyxia in newborn piglets. // Matern. Fetal. Neonatal. Med., 2003, №14(2)6 p.96-101.

98. Soldatova A.M., Voskresenckii O.N. Antioxidant vitamins and age-related retinal dystrophy. // Vopr. Med. Khim., 1994, №40(2), p.2-6.

99. Suzuki K. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation of extracellular superoxide dismutase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №303(3), p.914-919.

100. Toyokuni S. Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology. // Pathol. Int., 1999, №49(2), p.91-102

101. Wang Z., He Z., Shen Q., Gu Y., Li S., Yuan Q. Purification and partial characterization of recombinant Cu, Zn containing superoxide dismutase of Cordyceps militaris in E.coli. // J. Chromatogr. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., 2005, № 5, p.826.

102. Zhang Y., Wang J.Z., Wu Y.J. Gene cloning, expression and purification of its production of recombinant human superoxide dismutase. // Sheng. Wu. Gong. Cheng. Xue Bao., 2000, №16(5), p.557-560.