Координация экспрессии генов, контролирующих метаболизм пуринов и аминокислот у дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Гецова, Мария Леонидовна

• Гецова, Мария Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гецова, Мария Леонидовна

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метаболический стресс, опосредованный изменением концентрации эндо- и экзогенных аминокислот и пуринов у дрожжей БассЬаготусез сегеу'мае-».Ю

1.1. Дрожжи Э. сеге^мае как модель для изучения метаболического стресса.

1.2. Регуляция экспрессии метаболитных генов дрожжей белками Ваэ1р и Ваэ2р (система базального контроля).

1.2.1. Общая характеристика системы базального контроля.

1.2.2. Характеристика белков Ваз1р и Ваз2р.

1.2.3. Адениновая репрессия.

1.3. Система общего контроля биосинтеза аминокислот.

1.3.1. Характеристика системы общего контроля.

1.3.2. Индукторы вС-системы и СС-активируемые гены, непосредственно не связанные с биосинтезом аминокислот.

1.3.3. Регуляция экспрессии гена GCN4 на уровне трансляции.

1.3.4. Пуриновое голодание.

1.3.5. Характеристика белка Осп4р.

1.3.6. Регуляторные белки эукариот, эволюционно родственные белку всп4р.

1.4. Другие ДНК-связывающие белки, участвующие в регуляции экспрессии генов пуринового и гистидинового биосинтеза.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Основные обозначения.

2.2. Материалы.

2.2.1. Штаммы.

2.2.2. Плазмиды.

2.2.3. Реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Условия культивирования штаммов.

2.3.2. Гибридизация, микроманипулирование и тетрадный анализ.

2.3.3. Работа с ДНК in vitro и трансформация Е. coli и дрожжей.

2.3.4. Инактивация (дизрупция) генов.

2.3.5. Мутагенез.

2.3.6. Секвенирование мутантных вариантов промоторной области гена ADE2.-.

2.3.7. Получение дрожжевого белкового экстракта.

2.3.8. Определение активностей САИКАР-синтетазы и АИР-карбоксилазы.

2.3.9. Определение активности ß -галактозидазы.

2.3.10. Методы статистической обработки.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Природные пурины, способные индуцировать пуриновую репрессию.

3.2. Идентификация сигнальной сети, по которой передается информация о наличии экзогенных пуринов и поиск потенциальных эндогенных индукторов.

3.3. Координация экспрессии генов пуринового и аминокислотного метаболизма в условиях пуриновой репрессии и аминокислотного голодания.

3.3.1. Изучение влияния транскрипционных факторов Gcn4p, Baslp и Bas2p на экспрессию генов ADE1 и ADE2 в условиях репрессии и дерепрессии экзогенным аденином.

3.3.2. Изучение влияния экзогенного аденина и белков Bas1, Bas2 и Gcn4p на экспрессию репортерных генов.

3.4. Влияние мутаций adel и ade2 на экспрессию генов пуринового и гистидинового метаболизма.

3.5. Картирование промоторной области гена ADE2.

3.5.1. Делеционное картирование.

3.5.2. Мутагенез промоторной области гена ADE2 при помощи ПЦР.

3.6. Метод селекции красных аденинзависимых мутантов.

3.7. База данных SSE.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

АИКАР - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол риботид

АИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол риботид ак - аминокислота

ЗАТ - З-амино-1,2,4-триазол

ГАП - 6-М-гидроксиламинопурин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДТТ - дитиотреитол

КАИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат ОРС - открытая рамка считывания ПЕП - среда с пептоном без неорганического фосфата ПЕПФО - среда с пептоном и неорганическим фосфатом ПЦР - полимеразная цепная реакция

САИКАР - 5'-фосфорибозил-4-(Л/-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол

Трис - 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФРА - фактор репрессии аденином

ЭДТА - этилендиаминтетраэтановая кислота

АА - 8-азааденин

ААН - аденинаминогидролаза

Ade - аденин

AG - 8-азагуанин

АХ - 8-азаксантин

AICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол риботид

AIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол риботид

AmpR - устойчивость к ампициллину

ASL - аденилосукцинатлиаза

ASS - аденилосукцинатсинтетаза

APRT - аденинфосфорибозилтрансфераза

CAIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат

CP - 6-хлорпурин

DMSO - диметилсульфоксид

FAICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол FC - 5-фторцитозин

FGAR - 5'-фосфорибозил-Л/-формилглицинамид FO - фтороротовая кислота

GC-система - система общего контроля биосинтеза аминокислот Gua - гуанин

H(G)PRT - гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза

HOL - гистидинол

HOLP - гистидинол-фосфат

Hyp - гипоксантин

HPRT - гипоксантинфосфорибозилтрансфераза

IAP - имидазол ацетол-фосфат

IGP - имидазол глицерол-фосфат

IMP - инозинмонофосфат

LB - полная среда «Luria Broth»

MD - среда минимальная с глюкозой

PRAMP - М'-5'-фосфорибозил-АМР

PRATP - М'-5'-фосфорибозил-АТР

PRFAR - М'-5'-фосфорибозил-формимино-5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид

PRPP - 5-фосфо-а-0-рибозил-1-пирофосфат

SAICAR - 5'-фосфорибозил-4-(Л/-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол

SAM - S-аденозилметионин

SAMP - сукцинил-АМФ

TetR - устойчивость к тетрациклину

Хап - ксантин

ХМР - ксантозинмонофосфат YAPD, YEPD - полные среды

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Координация экспрессии генов, контролирующих метаболизм пуринов и аминокислот у дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

Поиск ответа на вопрос, как клетка воспринимает сигналы, поступающие из окружающей среды, и отвечает на них модуляцией экспрессии своего генома является одной из важных задач, стоящих перед молекулярной биологией. Решение указанной задачи требует комплексного исследования целого ряда проблем: идентификации внешнего индуктора и сигнальной сети, посредством которой сигнал об индукторе передается в ядро клетки; выявления генов-мишеней, в результате изменения активности которых формируется ответ клетки на внешнее воздействие; исследования молекулярных механизмов, обеспечивающих изменение экспрессии отдельных генов и координацию экспрессии всего генома в ответ на изменение внешних условий.

В настоящее время единственным эукариотическим организмом, для которого удалось получить информацию об интегральном ответе генома на г некоторые внешние воздействия, являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это стало возможным благодаря секвенированию дрожжевого генома и разработке "biochip-технологии" (DeRisi et al., 1997), позволяющей количествённо оценивать транскрипционную активность практически всего генома дрожжей (6400 генов) при заданных условиях культивирования. Использование указанной технологии показало, что, например, при глюкозной репрессии происходит глобальное изменение транскрипционной активности генома. При этом наблюдается координированная регуляция экспрессии сотен генов. Молекулярные механизмы такой координированной регуляции в настоящее время не установлены.

У дрожжей S. cerevisiae известны и другие регуляторные системы, обеспечивающие координацию экспрессии генов, кодирующих ферменты различных биосинтетических цепей в условиях метаболического стресса. Одна из таких систем, получившая название системы базального контроля (Arndt et al., 1987), обеспечивает базальный уровень транскрипции генов, контролирующих метаболизм аминокислот, пуринов, фолатов и фосфата. Одновременно с этим эта система обеспечивает снижение экспрессии целого ряда генов в ответ на увеличение концентрации экзогенного аденина адениновая репрессия"). В условиях аминокислотного или пуринового голодания наблюдается координированная активация экспрессии десятков генов, кодирующих ферменты метаболизма аминокислот и пуринов. За такую активацию отвечает ДНК-связывающий белок Gcn4p. Указанная регуляторная система получила название системы общего контроля биосинтеза аминокислот (Fink, 1982).

Следует отметить, что в настоящее время сигнальные сети, отвечающие за индукцию перечисленных регуляторных систем, и молекулярные механизмы координации экспрессии генов интенсивно изучаются. Это обусловлено тем, что исследования механизмов координации экспрессии генов в условиях метаболического стресса являются актуальными как в плане получения фундаментальных знаний о сигнальных сетях и механизмах регуляции экспрессии генома эукариот, так и в практическом аспекте. Хорошо известно, что ряд тяжелейших наследственных заболеваний человека связан с нарушением нормального функционирования пуринового (синдром Леша-Найхана, гиперурикемия, подагра, некоторые формы иммунной недостаточности) и аминокислотного (фенилкетонурия, гомоцистинурия) метаболизма. Существенно отметить, что питание человека в значительной мере определяет его здоровье, работоспособность и продолжительность жизни: как неполноценное, так и избыточное питание приводит к снижению сопротивляемости различным заболеваниям и целому ряду патологий. Исследование механизмов метаболического стресса представляет несомненный интерес и для частной генетики дрожжей. Это обусловлено тем, что большинство лабораторных штаммов маркировано мутациями в генах аминокислотного и пуринового метаболизма. Поэтому очень часто в условиях эксперимента клетки дрожжей находятся в состоянии метаболического стресса.

Настоящее исследование было предпринято с целью идентификации сигнальных сетей и механизмов, обеспечивающих координацию экспрессии генов, контролирующих пуриновый и аминокислотный метаболизм у дрожжей S. cerevisiae, в условиях адениновой репрессии и пуринового и аминокислотного голодания. В соответствии с этим работа предусматривала решение следующих основных задач: 9

1. Выявление природных пуринов, способных индуцировать адениновую репрессию.

2. Идентификация генов, кодирующих белки сигнальной сети адениновой репрессии.

3. Изучение механизмов координации экспрессии генов пуринового (АйЕ1 и ЛОЕ2) и аминокислотного (Н/Э4 и /У52) метаболизма в условиях метаболического стресса, индуцированного экзогенными пуринами и аминокислотным и пуриновым голоданием.

4. Изучение влияния мутаций аа(е7 и ас/е2 (индуцирующих пуриновое голодание) на экспрессию генов пуринового и гистидинового метаболизма.

5'. Картирование промоторной области гена АОЕ2 с целью выявления цис-элементов, отвечающих за базальную экспрессию и регуляцию в условиях метаболического стресса.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Гецова, Мария Леонидовна

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы экзогенные индукторы, вызывающие пуриновую репрессию генов аминокислотного и пуринового биосинтезов. Наряду с охарактеризованным ранее аденином, такими индукторами являются гипоксантин, гуанин и S-аденозилметионин.

2. Идентифицированы гены, кодирующие белки сигнальной сети передачи информации об экзогенных пуринах, основными компонентами которой являются ферменты утилизации и взаимопревращений пуринов и транскрипционные факторы Baslp и Bas2p. Клонированы гены НРТ1, ХРТ1, AD01 и охарактеризованы кодируемые ими ферменты утилизации пуринов.

3. Генетический анализ мутантов по генам пути взаимопревращений пуриновых нуклеотидов дает основание предполагать, что эндогенный сигнал, вызывающий пуриновую репрессию, формируется в результате изменения пула ADP и АТР.

4. Установлено, что экспрессия генов ADE1, ADE2 пуринового биосинтеза и генов LYS2 и HIS4 аминокислотного биосинтеза координируется белком Gcn4p в условиях аминокислотного голодания. При пуриновой репрессии наблюдается координация экспрессии генов ADE1, ADE2 и HIS4, опосредованная белками Baslp и Bas2p.

5. В условиях пуринового голодания, индуцированного мутациями в генах ADE1 и ADE2, наблюдается Осп4-независимое изменение активности генов пуринового (ADE1, ADE2) и гистидинового (HIS4) биосинтезов.

6. Картированы цис-регуляторные участки промоторной области гена ADE2, ответственные за базальную экспрессию и адениновую регуляцию.

7. На основании полученных данных по координированной регуляции генов пуринового и гистидинового биосинтезов разработан метод селекции спонтанных adel и ade2 мутантов для штаммов дрожжей, несущих делецию в гене GCN4. Появление красных аденинзависимых мутантов на средах с 3-аминотриазолом обусловлено активацией биосинтеза гистидина в условиях пуринового и аминокислотного голодания.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гецова, Мария Леонидовна, 2000 год

1. Аленин В.В. Регуляция экспрессии генов ADE1 и ADE2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях аминокислотного голодания // Микробиол. журн. -1988. -Т. 50, N 2.-С. 84-85.

2. Аленин В.В., Домкин В.Д., Ковалева A.A., Смирнов М.Н. Регуляция экзогенным аденином экспрессии генов ADE1 и ADE2, кодирующих структуру двух ферментов пуринового биосинтеза у дрожжей S. cerevisiae II Биополимеры и клетка.-1987.-Т. 3. N 6.-С. 325-326.

3. Аленин В.В., Останин К.В., Домкин В.Д. О методе биохимической идентификации мутаций у красных аденин-зависимых штаммов дрожжей// Прикладная биохимия и микробиология.-1989. -Т. 25. Вып. 1.-С. 135-141.

4. Белова И.В., Самбук Е.В., Падкина М.В., Смирнов М.Н. Активаторы транскрипции РН02 и GCN4 в регуляции синтеза кислых фосфатаз дрожжей S. cerevisiae/l Генетика.-1992.-Т. 28, N 5.-С. 11-18.

5. Беккер М.Л., Лучкина Л.А., Смолина B.C. Действие экзогенных пуринов на биосинтез и взаимопревращение пуриновых нуклеотидов в дрожжевых клетках// Биохимия. -1971.-Т. 3. N 6.-С. 898-907.

6. Гловер Д. (под редакцией) Клонирование ДНК. Методы. М.:Мир. 1988.

7. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия. ЛГУ. 1982. 262 с.

8. Гядвилайте A.A. Исследование экспрессии гена ADE2 Saccharomyces cerevisiae. Автореферат канд. дисс. Вильнюс. 1992.

9. Дрейлиня Д.Э. Изучение активности АИР-карбоксилазы и ФРПФ-амидотрансферазы у штаммов дрожжей, несущих мутации, затрагивающие биосинтез пуринов de novo. Автореферат канд. дисс. Ленинград. 1984.

10. Дрейлиня Д.Э., Фундули А.Х., Тюлякова Т.С., Домкин В.Д., Сойдла Т.Р., Смирнов М.Н. Изучение регуляции биосинтеза пуринов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник ЛГУ. -1981 .-N 9. -С. 93-97.

11. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

12. Инге-Вечтомов С.Г., Карпова Т.С. Частная генетика дрожжей-сахаромицетов. -СПб: Изд-во СП6ГУ.-1993.-252 с.

13. Инге-Вечтомов С.Г., Кожин С.А. Сравнение специфичности действия ультрафиолетовых и рентгеновских лучей на мутабильность дрожжей.// Исследования по генетике. -Л., 1964. -Сб. 2. -С. 77-85

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

15. Мантсала П. Клонирование гена ADE4 Saccharomyces cerevisiae, кодирующего глютаминфосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу.// В.сб.: XVI конференция ФЕБО. Тез. докл. М., 1984.-С. 382.

16. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ.-М.: Мир.-1976.-436 с.

17. Саснаускас К.В., Гядвилайте A.A., Янулайтис A.A. Клонирование гена ADE2 Saccharomyces cerevisiae и локализация АР-1 последовательности//Генетика.-1987.-Т. 23, N 7.-С. 1141-1147.

18. Холлендер М., Вулф Д. Непараметрические методы статистики. М.: Финансы и статистика, 1983. -518 с.

19. Abastado J.-P., Miller P.F., Jackson В.М., Hinnebusch A.G. Supression of ribosomal reinitiation at upstream open reading frames in amino acid-starved cells forms the basis for GCN4 translational control// Mol. Cell. Biol.-1991.-V. 11, N 1.-P. 486-496.

20. Adams A., Gottschling D.E., Kaiser C., Steams T. Methods in Yeast Genetics. A laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Lab., 1998.-177 p.

21. Affolter M., Schier A., Gehring M.J. Homeodomain proteins and the regulation of gene expression// Curr. Genet.-1990.-V. 2. -P. 485-495.

22. Alenin V.V., Nikolaeva Z.K., Kovaliova A.A., Kapitonov D.E., Hetzova M.L. The regulation of yeast metabolism by the general control system// Thesis of the 15th Int. Spec. Symp. on yeasts. Riga: 1991 .-P. 15.

23. Alexandraki D., Thireos G. Isolation of a new gene (TAR1) involved in the translation of the HIS3 mRNA in S. cerevisiaeИ Yeast.-1988.-V. 4 (spec.issue) -P. 507.

24. Alfonzo, J.D., Sahota A., Deeley M.C., Ranjekar P., Taylor M.W. Cloning and characterization of the adenine phosphoribosyl transferase-encoding gene {APT1) from Saccharomyces cerevisiae!I Gene.-1995.-V. 161 .-P. 81-85.

25. Appling D.R., Rabinowitz J.C. Regulation of expression of the ADE3 gene for yeast C1-tetrahydrofolate synthase, a trifunctional enzyme involved in one-carbon metabolism//J. Biol. Chem. -1985.-V. 260, N 2.-P. 1248-1256.

26. Arndt K., Fink G.R. GCN4 protein, a positive transcriptional factor in yeast, binds general control promoter at all 5TGACTC3' // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-V. 83.-P. 8516-8520.

27. Arndt K.T., Styles C., Fink G.R. Multiple global regulators control HIS4 transcription in yeast// Science.-1987.-V. 237. -P. 874- 880.

28. Barclay B.J., Huang Т., Nagel M.J., Misener V.L., Came J.C., Wahl G.M. Mapping and sequencing of the dihydrofolate reductase gene (DFR1) of S. cerevisiae// Gene.-1988.-V. 63, N 2.-P. 175-185.

29. Barnes D.A., Thorner J. Genetic manipulation of S.cerevisiae by use LYS2 gene// Mol. Cell. Biol.-1986.-V. 6, N 8.-P. 2828-2838.

30. Berben G., Dumont J., Gilliquet V., Bolle P.A., Hilger F. The YDp plasmids: a uniform set of vectors bearing versatile gene disruption cassettes for Saccharomyces cerevisiaell Yeast.-1991.-V. 7.-P. 475-477.

31. Bisson L.F. High-affinity glucose transport in Saccharomyces cerevisiae is under general glucose repression control // J. Bacteriol.-1988.-V. 170.-P. 48384845.

32. Boeke J.D., Lacroute F., Fink G.R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance// Mol. Gen. Genetics.-1984.-V. 197.-P. 345-346.

33. Brandl C.J., Struhl K. Yeast GCN4 transcriptional activator protein interact with RNA polymerase 11 in vitro// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1989.-V. 86. -P. 2652-2656.

34. Braus G., Mosch H.H., Vogel K., Hinnen A., Hutter R. Interpathway regulation of the TRP4 gene of yeast// EMBO J.-1989.-V. 8, N 3.-P. 939945.

35. Brazas R.M., Stillman D.J. Identification and purification of a protein that binds DNA cooperatively with the yeast SWI5 protein // Mol. Cell. Biol.-1993.-V. 13.-P. 5524-5537.

36. Burridge B.W., Woods R.A., Henderson J.F. Purine metabolism in Saccharomyces cerevisiae// Can. J. Biochem.-1977.-V. 55.-P. 935-941.

37. Busch S.J., Sassone-Corsi P. Dimers, leucine zippers and DNA-binding domains//Trends in Genet.-1990.-V. 6, N 2.-P. 36-40.

38. Carlson M. Regulation of sugar utilization in Saccharomyces cerevisiae.//J. Bacterid.-1987.-V. 169.-P. 4873-4877.

39. Chevallier M R., Jund R., Lacroute F. Characterization of cytosine permeation in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacterid.-1975.-V. 122, №2.-P. 629-641.

40. Daignan-Fornier B., Fink G.R. Coregulation of purine and histidine biosynthesis by the transcriptional activators BAS1 and BAS2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.-V. 89.-P. 6746-6750.

41. Daignan-Fornier B., Reisdorf P., Nguyen C.C., Lemeignan B., Bolotin-Fukuhara M. MBR1 and MBR3, two related yeast genes that can supress the growth defect of hap2, hap3 and hap4 mutants // Mol. Gen. Genetics.-1994.-V. 243.-P. 575-583.

42. Dang V.-D., Valens M., Bolotin-Fukuhara M., Daignan-Fornier B. A genetic screen to isolate genes regulated by the yeast CCAAT-box protein Hap2p // Yeast.-1994.-V. 10.-P. 1273-1283.

43. De Winde J.H., Grivell L.A. Global regulation of mitochondrial biogenesis in yeast Saccharomyces cerevisiae II Nucl. Acid. Res. -1993.-V. 46.-P. 51-91.

44. Deeley M.C. Adenine deaminase and adenine utilization in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol.- 1992.-V. 174, №10.-P. 3102-311.0.

45. Denis V., Daignan-Fornier B. Synthesis of glutamine, glycine and 10-formyltetrahydrofolate is coregulated with purine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genetics.-1998. -V. 259, №3.-P. 246-255.

46. Denis V., Boucherie H., Monribot C., Daignan-Fornier B. Role of the myb-like protein Baslp in Saccharomyces cerevisiae: a proteome analysis //Molecular Microbiol.-1998.-V. 30,- №3.-P. 557-566.

47. DeRisi J.L., Iyer V.R., Brown P.O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale // Science.- 1997.-V. 278.-P. 680-686.

48. Dever T.E., Feng L., Wek R.C., Cigan A.M., Donahue T., Hinnebusch A.G. Phosphorylation of initiation factor 2 by protein kinase GCN2 mediates gene-specific translational control of GCN4 in yeast// Cell.-1992.-V. 68.-P. 585-596.

49. Devlin C., Tice-Baldwin K., Shore D., Arndt K.T. RAP1 is required for BAS1/BAS2 and GCA/4-dependent transcription of the yeast gene HIS4II Mol. Cell. Biol.-1991 .-V. 11, N 7. P. 3642-3651.

50. Donahue T.F., Daves R:, Lucchini G., Fink G.R. A short nucleotide sequence required for regulation of HIS4 by the general control system of yeast// Cell.-1983.-V. 32.-P. 89-98.

51. Dorfman B. The isolation of adenylosuccinate synthetase mutants in the yeast by the selection for constitutive behavior in pigmented strains // Genetics.-1969.-V. 61.-P. 377-389.

52. Engelberg D., Klein C.,artinetto H., Struhl K., Karin M. The UV response involving the Ras signaling pathway and AP-1 transcriptional factors is conserved between yeast and mammals // Cell.-1994.-V. 77.-P. 381-390.

53. Erickson J.R., Johnston M. Genetic and molecular characterization of GAL83: Its interaction and similarities with other genes involved in glucose repression in Saccharomyces cerevisiae II Genetics.-1993.-V. 136.-P. 1271-1278.

54. Fantino E., Marguet D., Lauquin G.J.-M. Downstream activating sequence within the coding region of a yeast gene: specific binding in vitro of RAP1 protein// Mol. Gen. Genetics.-1992.- V. 236.-P. 65-75.

55. Fernandes L., Rodrigues-Pousada C., Struhl K. Yap, a novel family of eight bZIP proteins in Saccharomyces cerevisiae with Distinct biological functions // Mol. Cell. Biol. -1997.-V. 17, N 2.-P. 6982-6993.

56. Fling M.E., Kopf J., Richards C.A. Nucleotide sequence of the dihydrofolate reductase gene of S. cerevisiae// Gene.-1988.-V. 63, N 2.-P. 165-174.

57. Foley J.M., Giles N.H., Roberts C.F. Complementation at the adenylosuccinase locus in Aspergillus nidulans II Genetics.-1965.-V. 52.-P. 1247-1263.

58. Fox I.H., Kelley W.N. Human phosphoribosylpyrophosphate synthetase: kinetic mechanism and end-product inhibition // J. Biol. Chem.-1972.-V. 247.-P. 21262131.

59. Gallert K.C., Ohanjan T., Daidnan-Fornier B., Lottspeich F., Krauss G. Enzymatic properties and inhibition by single-stranded ARS sequences of adenylosuccinate synthetase from Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem. -1996.-V. 239.-P. 487-493.

60. Gedvilaite A., Sasnauskas K. Control of the expression of the ADE2 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet.-1994.-V. 25.-P. 475-479.

61. Gietz R.D., Sugino A. New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites // Gene.-1988.-V. 74.-P. 527-534.

62. Gill G., Tjian R. Eukaryotic coactivators associated with the TATA-box binding protein // Curr. Opin. Genet. Dev.-1992.-N 2.- P. 236-242.

63. Gots J.S., Benson C.E., Jochimsen B., Koduri K.R. Microbial models and regulatory elements in the control of purine metabolism. In: Ciba foundation Symposium «Purine and pyrimidine metabolism». Elsevier, 1977.-P. 23-41.

64. Gross T.S., Woods R.A. Identification of mutants defective in the first and second steps of de novo purine synthesis in Saccharomyces cerevisiae II Biochem. Biophys. Acta.-1971.-V.273.-P.13-18.

65. Gross T.S., Woods R.A. Regulation of de novo purine nucleotide synthesis by enzyme repression in Saccharomyces cerevisiae // Heredity.-1972.-V. 28.-P. 275.

66. Guarente L., Bermingham-McDonogh O. Conservation and evolution of transcriptional mechanisms in eukaryotes // Trends in Genet.- 1992.-V. 8,-N 1.-P. 27-31.

67. Hahn S. Efficiency in activation // Nature.-1993.-V. 363. N 6431.- P .672-673.

68. Harashima S., Hinnebusch A.G. Multiple GCD genes required for repression of GCN4, a transcriptional activator of amino-acid biosynthetic genes in S. cerevisiaell Mol. Cell. Biol.-1986.-V. 6, N 11.-P. 3990-3998.

69. Hawker K.L., Pintzas A., Hennigan R.F., Gillespie D.F., Ozanne B. Transformation by the fos or jun oncogene does not increase AP-1 DNA-binding activity// J. Virol.-1993.-V. 67, N 9.-P. 5487-5495.

70. Hershey H.V., Taylor M.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Escherichia coli adenine phosphoribosyl-transferase and comparison with other analogous enzymes // Gene.-1986.-V. 43.-P. 287-293.

71. Hinnebusch A.G. Novel mechanisms of translational control in Saccharomyces cerevisiae// Trends in Genet.-1988.-V. 4, N 6. P. 169-174.

72. Hinnebusch A.G. Transcriptional and translational regulation of gene expression in S. cerevisiae.// Progress in Nucleic Acids Res. and Mol. Biol.-1990.-V. 38.-P. 195-240.

73. Hope I.A., Struhl K. GCN4 protein,synthesized in vitro, binds HIS3 regulatory sequences: implications for General Control of amino acid biosynthetic genes in yeast// Cell.-1985.-V. 43. P. 177-188.

74. Hope I.A., Struhl K. Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activator protein GCN4 in yeast// Cell.-1986.-V. 46. -P. 885-894.

75. Johnson P.F., McKnight S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins// Annu. Rev. Biochem.-1989.-V. 58.-P. 799-839.

76. Kammann M., Laufs J., Schell J., Gronenborn B. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR) // Nucleic Acids Res.-1989.-V. 17.-P. 5404.

77. Kanasawa S. et al. ATR1, a S. cerevisiae gene, encoding a transmembrane protein required for the 3-aminotriasole resistance// Mol. Cell. Biol.-1988.-V. 8, N 2.-P. 664-673.

78. Kelley W.N., Rosenbloom F.M., Henderson J.F., Seegmiller J.E. A specific enzyme defect in gout associated with overproduction of uric acid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967.-V. 57.-P. 1735-1739.

79. Khromov-Borisov N.N. Chemical names: Galateas of mutation research (exemplified with mutagenic nucleic acid bases analogs) // Mutation Res.-1997.-V. 379.-P. 95-103.

80. Kilberg M.S., Hutson R.G., Laine R.O. Amino acid-regulated gene expression in eukaryotic cells// FASEB J.-1994.-V. 8,- P. 13-19.

81. Kippert F. A rapid permeabilization procedure for accurate quantitative determination of b-galactosidase activity in yeast cells.// FEMS Microbiol. Lett. -1995.-V. 128.-P. 201-206.

82. Konig P., Richmond T.J. The X-ray structure of the GCN4-bZIP bound to ATF/CREB site DNA shows the complex depends on DNA flexibility// J. Mol. Biol.-1993.-V. 233. N 1.-P. 139-154.

83. Konrad M. Cloning an expression of the essential gene for guanylate kinase from yeast.//J. Biol. Chem. -1992.-V. 267.-P. 25652-25655.

84. Kornberg A., Lieberman I., Simms E.S. Enzymatic synthesis and properties of 5-phosphoryt>osylpyrophosphate // J. Biol. Chem.-1955.-V. 215.-P. 389-420.

85. Lesch M., Nyhan W.L. A familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function //Am. J. Med.-V. 36.-P. 561-570.

86. Lomax C.A., Woods R.A. Prototrophic regulatory mutants of adenylosuccinate synthetase in yeast// Nature.-1970.-V. 229, №4.-P. 116.

87. MantsalaP., Zalkin H. Nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae

88. ADE4 encoding glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase II J. Biol. Chem.-1984.-V. 259.-P. 8478-8484.

89. Messenguy F., Scherens B. Induction of «General Control» and thermotolerance in cdc mutants of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.-1990.-V. 224, N 2.-P. 257-263.

90. Miller P.F., Hinnebusch A.G. Cis-acting sequences involved in the translational control of GCN4 expression// Biochimica et Biophysica Acta.-1990.-V. 1050.-P. 151-154.

91. Mirande M., Martinez R., Cirakoglu B., Latreille M.-T., Waller J.P. The yeast lysyl-tRNA synthetase gene: evidence for general amino acid control of its expression and domain structure of the encoded protein// Yeast.-1988.-V. 4 (spec.issue) -P. 346.

92. Moehle C.M., Hinnebusch A.G. Association of RAP1 binding sites with stringent control of ribosomal protein gene transcription in S. cerevisiae/l Mol. Cell. Biol.-1991 .-V. 11, N 5.-P. 2723-2735.

93. Momose H., Nishikawa H., Shiio I. Regulation of purine nucleotide synthesis in Bacillus subtilis. 1. Enzyme repression by purine derivatives.// J. Biochem.-1966.-V. 187.-P. 373-379.

94. Moscatelli F., Gariboldi M., Panzeri L. The transcriptional factor PH02 binds in vitro to the centromeric region CDE11H Abstracts of 15th Int. Conf. on yeast genetics and molecular biology. Yeast.-1990.-V. 6 (spec.issue).-P. 60.

95. Mosch H.-H., Graf R., Schidheini T., Braus G. Three GCN4 responsive elements act synergistically as upstream and as TATA-like elements in the yeast TRP4 promoter// EMBO J.-1990. V. 9, N 9.-P. 2951-2957.

96. Mosch H.-H., Scheier B., Lahti R., Mantsala P., Braus G.H. Transcriptional activation of yeast nucleotide biosynthetic gene ADE4 by GCN4H J. Biol. Chem.-1991.-V. 266, N 30.-P. 20453- 20456.

97. Myasnikov A.N., Sasnauskas K.V., Janulaitis A.A., Smirnov M.N. // The Saccharomyces cerevisiae ADE1 gene: structure, overexpression and possible regulation by general amino acid control//Gene.-1991. -V. 109, N 1.-P. 143-147.

98. Myasnikov A.N., Smirnov M.N. General amino-acid control system may be involved in regulation of purine biosynthesis in yeast// Yeast.-1988.-V.4 (spec.issue)-P. 412.

99. Myers A.M., Tzagoloff A., Kinney D.M., Lusty C.J. Yeast shuttle and integrative vectors with multople cloning sites suitable for construction of LacZ fusions//Gene.-1986.-V. 45.-P. 299-310.

100. Neuhard J., Nygaard P. Purines and pyrimidines. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F.C.-ASM press, Washington DC.-1987.-P. 445- 473.

101. Oakley M.G., Dervan P.B. Structural motif of the GCN4 DNA binding domain characterized by affinity cleaving// Science.-1990. -V. 248.-P. 847-850.

102. Oliviero S., Robinson G.S., Struhl K., Spiegelman B.M. Yeast GCN4 as probe for oncogenesis by AP-1 transcription factors: transcriptional activation through AP-1 sites is not sufficient for cellular transformation// Genes " Dev.-1992.-P. 1799-1809.

103. Paravicini G., Mosch H.-H., Schmidheini T., Braus G. The general control activator protein GCN4 is essential for a basal level of AR03 gene expression in Saccharomyces cerevisiae/l Mol. Cell. Biol.-1989.-V. 1.-P. 144-151.

104. Pellman D., McLaughlin M.E., Fink G.R. Function of the TATA element at HIS4II Nature.-1990.-V. 348.-P. 82-86.

105. Pinson B., Sagot I., Borne F., Gabrielsen O.S., Daignan-Fornier B. Mutations in the yeast Myb-like protein Baslp resulting in discrimination between promoters in vivo but not in vitro II Nucleic Acids Res.-1998.-V. 26, №17.-P. 3977-3985.

106. Ptashne M. How eukaryotic transcription activators work // Nature.-1988.-V 335.-N 6192.-P. 683-689.

107. Reichert U., Winter M. Gene dosage effects in polyploid strains of Saccharomyces cerevisiae containing gua-1 wild type and mutant alleles // J. Bacterid.-1975.-V. 124.-P. 1041-1045.

108. Roberts S. et al. Interaction between an acidic activator and transcriptional activation // Nature.-1993.- V. 363.-N 6430. P. 741-744.

109. Rolfes R.J., Hinnebusch A.G. Translation of the yeast transcriptional activator GCN4 is stimulated by purine limitation: implication for activation of the protein kinase GCN2/I Mol. Cell. Biol.-1993.-V. 13, N 8.-P. 5099-5111.

110. Rolfes R.J., Zalkin H. Purification of the Escherichia coli purine regulon repressor and identificatio of compressors.//J. Bacteriol.-1990.-V. 172.-P. 56375642.

111. Ruby S.W., Szostak J.M., Murray A.W. Cloning regulated yeast genes from a pool of lacZ fusions.// Methods Enzymol.-1983.-V. 101.-P. 235-269.

112. Ruis H., Schuller C. Stress signaling in yeast// BioEssays.-1995.-Vol. 17, № 11.-P. 959-965

113. Sambrook J., Fritschand E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manuel, 2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York.

114. Sanger F., Niklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-V. 74.-P. 5463-5467.

115. Sahota A., Ranjekar P.K., Alfonzo J., Lewin A.S., Taylor M.W. Mutants of Saccharomyces cerevisiae deficient in adenine phosphoribosyltransferase // Mutation Res.-1987.-V. 180.-P. 81-87.

116. Sellers J.W., Vincent A.C., Struhl K. Mutations that define the optimal half-site for binding yeast GCN4 activator protein and identify an ATF/CREB-like repressor that recognizes similar DNA sites// Mol. Cell. Biol.-1990.-V. 10, N 10. -P. 5077-5086.

117. Schnell N. Krems B„ Entian K.D. The PARI (YAP1/SNQ3) gene of Saccharomyces cerevisiae, a c-jun homologue, is involved in oxygen metabolism// Curr. Genetics.-1992.-V. 21 .-P. 269-273.

118. Schuldiner O., Yanover C., Benvenisty N. Computer analysis of the entire budding yeast genome for putative targets of the GCN4 transcription factor // Curr. Genet. -1998.-V. 33.-P. 16-20.

119. Shattoo B.B., Sherman F. Selection of Iys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of a-aminoadipate. // Genetics.-1979. -V. 93. -P. 51-65

120. Silver, J. M., Eaton N. R. Functional blocks of the AD1 and AD2 mutants of Saccharomyces cerevisiae. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V. 34. P. 301-305

121. Skvirsky R.C., Greenberg M.L., Myers P.L., Greer H. A new negative control gene for amino acid biosynthesis in S. cerevisiae II Curr. Genet.-1986.-V. 10.-P. 495-501.

122. Sorger P.K., Pelham H.R.B. Yeast heat shock factor is an essential DNA-binding protein that exhibits temperature-dependent phosphorylation // Cell.-1988.-V. 54.-P. 855-864.

123. Springer C., Kunzler M., Balmelli T., Braus G.H. Amino acid and adenine cross-pathway regulation act throught the same 5'-TGACTC-3' motif in the yeast HIS7 promoter II J. Biol. Chem.-1997.-V. 271.-P. 29637-29643.

124. Stone R.L., Aimi J., Barshop B.A., Jaeken J., Van den Berghe G. et al. A mutation in adenylosuccinate lyase associated with mental retardation and autistic features // Nature Genetics.-1992.-V. 1.-P. 59-63.

125. Stotz A., Linder P. The ADE2 gene from Saccharomyces cerevisiae: sequence and new vectors.//Gene.-1992.-V. 95.-P. 91-98.

126. Struhl K. Molecular mechanisms of transcriptional regulation in yeast //Annu. Rev. Biochem. 1989.-N 58.- P. 1051-1077.

127. Struhl K Yeast GCN4 transcriptional activator protein// Transcriptional regulation. Cold Spring Harbor Lab Press.-1993. P. 833-859.

128. Sze J.-Y., Wootner M., Jaehning J.A., Kohlhaw G.B. In vitro transcriptional activation by a metabolic intermediate:Activation by Leu3 depends on isopropylmalate // Science.-1992.-V. 258.-P. 1143-1145.

129. Takeuchi T., Miyahara K., Hirata D., Miyakawa T. Mutational analysis of Yaplp protein, an AP-1like transcriptional activator of Saccharomyces cerevisiae // FEBS lett.-1997.-V. 416.-P. 339-343.

130. Tavernakis M., Thireos G. Transcriptional interference caused by GCN4 overexpression reveals multiple interactions mediating transcriptional activation // Mol. Gen. Genet. -1995.-V. 247.-P. 571-578.

131. Tavernakis M., Thireos G. The DNA target sequence influences the dependence of the yeast transcriptional activator Gcn4 on co-factors II Mol. Cell. Biol. -1997.-V. 253.-P. 766-769.

132. Tibbetts A.S., Appling D.R. Saccharomyces cerevisiae expresses two genes encoding isozymes of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase // Arch. Biochem. Biophys. -1997.-V. 340, №2.-P. 195-200.

133. Tice-Baldwin K., Fink G.R., Arndt K.T. BAS1 has a Myb motif and activates HIS4 transcription only in combination with BAS2II Science.-1989.-V. 246, N 4932.-P. 931-935.

134. Ugolini S., Bruschi C.V. The red/white colony color assay in the yeast Saccharomyces cerevisiae: epistatic growth advantage of white ade8-18, ADE2 cells over red ADE2 cells II Curr. Genet. -1996.-V. 30.-P. 485-492.

135. Verdier J.-M. Regulatory DNA-binding proteins in yeast: An overview// Yeast.-1990.-V. 6, N 4.-P. 271-297.

136. Vogel K., Horz W., Hinnen A. The two positively acting regulatory proteins PH02 and PH04 physically interact with PH05 upstream activation region // Mol. Cell. Biol. -1989.-V. 9.-P. 2050-2057.

137. Vogt P.K., Bos T.J. Jun: oncogene and transcription factor// Advances in cancer research.-1990.-V. 55.-P. 1-35.

138. Vogt P.K., Bos T.J., Doolittle R.F. Homology between the DNA-binding domain of the GCN4 regulatory protein in yeast and the carboxyl-terminalregion of protein coded for by oncogene JUN II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-V. 84, N 10.-P. 3316-3319.

139. White M.A., Dominska M., Petes T.D. Transcription factors are required for the meiotic recombination hotspot at the HIS4 locus in Saccharomyces cerevisiaeII Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993.-V. 90. P. 6621-6625.

140. Woods R.A., Roberts D.G., Freidman T., Jolly D., Filpula D. Hypoxanthine: Guanine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.-1983.—P. 407-412.

141. Woods R.A., Roberts D.G., Stein D.S., Filpula D. Adenine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol.-1984.-V. 130.-P. 2629-2637.

142. Wyngaarden J.B., Holmes E.W. Molecular nature of enzyme regulation in purine biosynthesis II In: Ciba Foundation Symposium 48 «Purine and pirimidine metabolism». Elsevier, 1977.- P. 43-64.

143. Yoshida K., Kuromitsu Z., Ogawa N., Oshima Y. Mode of expression of the positive regulatory genes PH02 and PH04 of the phosphatase regulon in S. cerevisiae.il Mol. Gen. Genet.-1989.-V. 217. N 1.-P. 31-39

144. Yuryev A., Corden J.L. A Saccharomyces cerevisiae gene encoding a potential adenine phosphoribosyltransferase//Yeast.-1994.-V. 10, №5.-P. 659662.

145. Zalkin H., Dixon J.E. De novo purine nucleotide biosynthesis // Progress in Nucleic Acids Res. and Mol. Biol.-1992,- V. 42,-P. 259-287.

146. Zhang L., Guarente L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins // EMBO J.-1995.-V. 164.-P. 313-320.

147. PvuII .Nsil .Clal !.NcoI .AccI1.Г-1-1-г1 I Ml1 I «, I '1. T I I I I г1. EcoRV Ncol EcoRI .Hpal1. JJ1. HPT1500 1000 1500 2000 2500 i ' ' ' I I 1 IIIII1I 1II IIIII1IIL1. К 1 2 3 4 51500 1200

148. Рис. 34. Схема инактивации гена НРТ1.

149. Рис. 35. Схема инактивации гена АРТ1.

150. Фрагмент ДНК 1500 п.н. соответствует нормальной аллели гена АРТ1. 2 фрагмента 1090 и 1050 п.н. соответствует дизрупции.

151. Dral .Kpnl ! -Bgiii j iXhoII1. URA31. Nsil1. Clal1. I I1. EcoRI1. Hpal1. SphI .StuI1. Xbal PstI .Dral I I I1. Dral .Dral1. Clal i .AsuII JLL1. EcoRI Aval Spel1. Kpnl .Hindlll1. AAH11000200030001. T—=——---—;--—-—------1. К 1 2 3 ;3000 "21¥I