Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани rhBMP-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние на иммунную систему тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Осидак, Егор Олегович

• Осидак, Егор Олегович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Осидак, Егор Олегович

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ 13

1.2. КОМПОНЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА КОСТИ И ИХ ФУНКЦИИ

15

1.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОСТНЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ 28

1.4. СПОСОБЫ УДЕРЖАНИЯ ФАКТОРОВ РОСТА В КОЛЛАГЕНОВЫХ ИМПЛАНТАТАХ И МЕХАНИЗМЫ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ 3О

1.5. ВОЗМОЖНЫЕ ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОЛЛАГЕНОВЫЕ МАТЕРИАЛЫ СОДЕРЖАЩИЕ БШВМР-2 И СПОСОБЫ ИХ ОЦЕНКИ 44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ 52

2.1 МАТЕРИАЛЫ 52

2.2 МЕТОДЫ 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 60

3.1 ТЕСТИРОВАНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ КРОЛИЧЬИХ АНТИТЕЛ К 1ШВМР-2 60

3.2 ТЕСТИРОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БШВМР-2 63

3.3 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БШВМР-2 В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ 66

3.4 ОПИСАНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ БЕЗ КОЛЛАГЕН-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ И БЕЗ ФИБРОНЕКТИНА 72

3.5 МЕТОД ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БШВМР-2 С КОЛЛАГЕНОМ 73

3.6 МЕТОД ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВБ1Я БШВМР-2 С ФИБРОНЕКТИНОМ 77

3.7 ВЫСВОБОЖДЕНИЕ RHBMP-2 ИЗ КОЛЛАГЕНОВЫХ НОСИТЕЛЕЙ

IN VIVO 82

3.8 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ К RHBMP-2 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС 83

3.9 ОЦЕНКА ТКАНЕВЫХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВОГО ГИДРОГЕЛЯ С RHBMP-2 И ФИБРОНЕКТИНОМ IN VIVO

84

ГЛАВА 4. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ 91

4.1. ВВЕДЕНИЕ 91

4.2 КАЧЕСТВЕННОЕ ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ 92

4.3 ПОСТУЛАТЫ МОДЕЛИ 92

4.4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМЫ УРАВНЕНИЙ 95

4.5 ЧИСЛЕННОЕ РЕШЕНИЕ 97

4.6 СРАВНЕНИЕ РЕШЕНИЯ МОДЕЛИ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ДАННЫМИ 97

4.7 ОБСУЖДЕНИЕ 100 ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102

5.1 РОЛЬ ФИБРОНЕКТИНА В КОНТРОЛИРУЕМОМ ВЫСВОБОЖДЕНИИ RHBMP-2 ИЗ КОЛЛАГЕНОВОГО ИМПЛАНТАТА. 102

5.2 АДЕКВАТНАЯ ПРЕЗЕНТАЦИЯ RHBMP-2 ПОЗВОЛЯЕТ УМЕНЬШИТЬ КОЛИЧЕСТВО ИСПОЛЬЗУЕМОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА. 103

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ 106

ГЛАВА 7. ЛИТЕРАТУРА 107

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани rhBMP-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние на иммунную систему»

Актуальность проблемы;

Костная ткань является одной из немногих тканей организма взрослого человека, которая может спонтанно восстанавливаться при полученном повреждении, если размер дефекта не превысит критического (от 1 см ). В противном случае, в результате полученной травмы (например, переломы позвонков) или болезни (например, остеохондроз позвоночника или дегенеративное заболевание межпозвонкового диска) самостоятельная регенерация костной ткани без оперативного вмешательства становится невозможной. Для ускоренного восстановления поврежденной костной ткани в зоне регенерации необходимо продолжительное время поддерживать достаточную концентрацию биологически активных соединений - факторов роста. Группа костных морфогенетических белков (Bone Morphogenic Proteins, BMP) регулирует регенерацию костной ткани [Зайцев и др., 2009]. ВМР-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных клеток в хондрогенные и остеогенные клетки, а также способствует пролиферации остеобластов [Chen et. al., 2004]. Рекомбинантный ВМР-2 человека (rhBMP-2) используется в клинике при лечении костных повреждений с 2000 года [Boden et. al., 2000]. С момента создания рекомбинантных факторов роста, их использование в клинической практике вызывало обеспокоенность у врачей в связи с возможной индукцией иммунного ответа при их введении в организм [Poynton et. al., 2002]. При оценке иммуногенности rhBMP-2 необходимо учитывать свойства этого фактора роста, отличающие его от других терапевтических рекомбинантных белков. Например, большинство терапевтических рекомбинантных белков используются при полном отсутствии или низкой экспрессии нативной формы данного белка в организме, a rhBMP-2 были разработаны специально для индукции остеогенеза при спондилодезе [White et. al., 2007]. Таким образом, rhBMP-2 должны действовать локально, в месте имплантации композита, чтобы индуцировать формирование новой костной ткани в месте повреждения костной ткани, в то время как другие терапевтические рекомбинантные белки действуют системно. Рекомбинантный ВМР-2, как и

любой другой рекомбинантный человеческий белок, является антигеном [Hwang et al., 2009]. Поэтому в клинике, при оценке иммуногенности rhBMP-2 важно следить за наличием гуморального ответа на данный рекомбинантный белок [Schellekens Н, 2002], так как наличие циркулирующих антител может привести к подавлению терапевтической активности вводимого rhBMP-2. Особенно следует опасаться возникновения гиперчувствительности организма к конкретному белковому препарату. Этот относительно редкий тип ответа ассоциирован преимущественно с применением биофармацевтических препаратов, содержащих рекомбинантные белки бактериального происхождения, к которым относится rhBMP-2. Из данных литературы известно, что при клиническом использовании рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 (rhBMP-2) в 6% случаях с помощью ИФА были обнаружены антитела к ВМР-2 [Govender et al., 2002]. На сегодняшний день клиническое значение наличия гуморального иммунного ответа на экзогенные формы rhBMP-2 остается неясным, однако, при обнаружении циркулирующих антител специфичных к rhBMP-2, лечение с использованием данного белка настоятельно рекомендуется прекратить [Poynton et. al., 2002].

Желательно, чтобы действие факторов роста в зоне регенерации было локальным, ограниченным местом аппликации композита. Концентрация ростовых факторов, поддерживаемая продолжительное время в зоне регенерации, должна быть достаточной для активирующего воздействия на клетки. Однако, при этом общее количество белка, выделяемого из композита, должно быть минимальным, чтобы избежать запуска иммунной реакции на уровне целого организма.

Для улучшения фармакодинамических свойств препаратов rhBMP-2 существует потребность в разработке контролируемых систем доставки и замедленного высвобождения этого белка. Для локализации и продолжительности воздействия рекомбинантного rhBMP-2 в клиниках США используют коллагеновую губку, при этом доза местно вводимого в организм пациента rhBMP-2 в среднем составляет около 12 мг [Hsu et. al., 2008]. При этом следует

отметить, что в 1 кг кости находится около 1 мкг ВМРэ [Ьиу1еп а1., 1989], а у взрослого человека массой 100 кг на долю костной ткани приходится около 15 кг, таким образом, общее количество ВМРз во всей костной ткани у взрослого человека не превышает 15 мкг, что в тысячу раз меньше количества гЬВМР-2, применяемого при лечении. А так как гЬВМР-2 применяют в локальной области, то это соотношение увеличивается еще в несколько раз. Емкость коллагеновой губки по отношению к гЬВМР-2 невелика, поэтому использование избыточного количества гЬВМР-2, не связанного с коллагеном, приводит к быстрому высвобождению 30-50% рекомбинантного белка в первые дни после имплантации [На1ёаг е1. а1., 2009]. Это, вероятно, и является одной из основных причин, приводящих к возникновению серьезных побочных эффектов, наблюдаемых в ряде случаев при использовании остеопластических материалов, содержащих гИВМР-2. К таким эффектам относятся, в частности, отмеченные в различных исследованиях эктопическое образование костной ткани в спинномозговом канале при заднем поясничном межтеловом спондилодезе; остеолиз, и, как следствие, потеря фиксации имплантата [Сап^ее е1. а1., 2011]; отек тканей шеи и горла и дисфагия при шейном спондилодезе; возникновение сильной воспалительной реакции в месте перелома, а также наличие циркулирующих антител к ВМР-2 [Аго е1. а1., 2011]. Появление антител к ВМР-2 в организме пациента опасно с точки зрения возможности возникновения аутоиммунных реакций и системного иммунного ответа при повторном применении материалов, содержащих данный белок [Роуп1;оп е1;. а1., 2002].

Цель исследования - оценка иммунологических и физиологических реакций организма, возникающих при имплантации коллагенового носителя с гЬВМР-2, а также обеспечение контролируемого высвобождения г1гВМР-2 из имплантируемого коллаген-содержащего материала.

Для этого необходимо было решить следующие задачи: 1) Разработать тест-систему для определения концентрации г1гВМР-2 в плазме крови с целью оценки скорости высвобождения фактора роста из коллагенового носителя.

2) Исследовать влияние плазмы крови на диссоциацию комплекса коллаген-rhBMP-2.

3) Описать процесс контролируемого высвобождения rhBMP-2 из коллагенового носителя с помощью математической модели.

4) Разработать экспериментальную модель для изучения выхода rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля in vitro и in vivo.

5) Определить наличие/отсутствие антител к rhBMP-2 у крыс при имплантации коллагенового носителя с rhBMP-2.

6) Описать физиологические реакции организма на коллагеновый носитель с rhBMP-2 при подкожной имплантации.

Научная новизна:

Впервые обнаружено и экспериментально доказано, что фибронектин плазмы крови человека вытесняет связанный rhBMP-2 из комплекса с коллагеном в составе гидрогеля, тем самым регулируя скорость высвобождения rhBMP-2 из имплантата.

Разработана математическая модель, описывающая механизм контролируемого высвобождения rhBMP-2 из коллагенового геля фибронектином плазмы крови, продемонстрировано, что скорость высвобождения rhBMP-2 зависит от скорости проникновения фибронектина внутрь геля.

С учетом полученных данных создан новый вариант носителя для факторов роста костной ткани, представляющий собой коллаген-фибронектиновый гель. С помощью разработанной ИФА тест-системы исследована кинетика высвобождения rhBMP-2 из данного носителя. С помощью гистологических методов установлено, что rhBMP-2 в составе коллаген-фибронектинового носителя не вызывает иммунных реакций и индуцирует эктопический остеогенез на 42 день при подкожной имплантации.

Разработана методика, позволяющая оценивать гуморальный иммунный ответ, возникающий у пациентов при использовании rhBMP-2 с любыми типами носителей.

Практическая значимость работы:

Предложенная модель конкурентного вытеснения факторов роста из коллагенового носителя позволяет оптимизировать системы, обеспечивающие контролируемое высвобождение гЬВМР-2, уменьшить количество используемого фактора роста и избежать стадии быстрого начального высвобождения гЬВМР-2 из коллагенового носителя. Результаты модели позволяют предложить новые варианты носителей, обеспечивающих контролируемое высвобождение не только гЬВМР-2, но и других факторов роста. Данные носители можно будет применять в различных областях тканевой инженерии как в научно-исследовательских целях, так и в прикладных.

Разработанная «сэндвич» ИФА тест-система определения концентраций гЬВМР-2 в плазме/сыворотке крови человека и животных найдет широкое применение в лабораториях, разрабатывающих новые формы полимерных носителей для контролируемой доставки гЬВМР-2.

С помощью разработанной методики количественной оценки циркулирующих антител к гЬВМР-2 в крови у пациентов возможно проведение быстрого скрининга пациентов для дальнейшего принятия решения о возможности продолжать лечение с использованием гЬВМР-2.

Внедрение результатов работы:

Разработаны методические рекомендации «Оценка эффективности удержания гЪВМР-2 в полимерных носителях методом иммуноферментного анализа», предназначенные для научно-исследовательских институтов биотехнологического профиля, утвержденные на заседании Совета по внедрению научных достижений в практику ФБГУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России от 10 октября 2013 г., протокол № 27.

Положения выносимые на защиту:

1. Разработаны основы технологии, обеспечивающие подавление иммунной реакции организма на рекомбинантный фактор роста костной ткани ВМР-2,

включаемый в имплантат в составе коллагенового гидрогеля, за счет контролируемого продолжительного высвобождения фактора.

2. В качестве основного компонента плазмы крови, ответственного за высвобождение гЬВМР-2 из комплекса с коллагеном идентифицирован фибронектин, мультидоменный димерный гликопротеин.

3. Разработан метод иммуноферментного анализа для количественной оценки эффективности удержания г11ВМР-2 в составе имплантируемого гидрогеля.

4. Показана эффективность подавления иммунной реакции организма при замедленном высвобождении г1гВМР-2 из имплантируемого коллагенового гидрогеля при включении в него фибронектина.

5. Испытан на животных новый коллагеновый матрикс для имплантации, содержащий фибронектин и фактора роста гЬВМР-2, обеспечивающий такое контролируемое высвобождение этого фактора, при котором стимулируется рост костной ткани, но не происходит выработки антител на гЬВМР-2.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Международная интернет-конференция «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012), XII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2012), II Международная научная интернет-конференция «Математическое и компьютерное моделирования в биологии и химии. Перспективы развития» (Казань, 2013), VI Ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2013), XIII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2013), I Национальный конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2013).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 публикации в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК и 6 - тезисы в трудах

конференций.

Структура диссертации:

Диссертация состоит из 8 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Теоретическая модель», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 195 цитируемых источников, в том числе 2 на русском языке.

Глава 1. Обзор Литературы

Исследования регенерации костной ткани проводились еще в конце 19-го века [1]. Уже тогда костную ткань относили к тканям, обладающим высоким потенциалом регенерации. Полвека спустя было получено первое доказательство того, что инъекция в мышцу экстракта из костной ткани способна индуцировать эктопический остеогенез [2]. Однако основополагающее открытие было сделано в 1965 году американским ученым Уристом, который доказал, что активным компонентом деминерализованного костного матрикса, способным вызывать образование новой кости, является группа белков, которые он назвал костными морфогенетическими белками (ВMPs, bone morphogenetic proteins) [3]. Это открытие привело к интенсивному исследованию данных белков в последующие 40 лет [4, 5, 6, 7]. К настоящему времени идентифицировано около 20 видов BMP. Наиболее полно изучены применительно к регенерации кости факторы ВМР-2 и ВМР-7. Доказано, что ВМР-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных клеток в хондрогенные и остеогенные клетки, а также способствует пролиферации остеобластов [8]. Ранее основным источником ВМР-2 был деминерализованный костный матрикс, при этом из 1 кг кости выделялось около 1 мкг белка [9]. Определение нуклеотидной последовательности гена ВМР-2 [10] позволило создать рекомбинантные аналоги человеческого костного морфогенетического белка 2 (rhBMP2), синтезируемого в клетках эукариот и в микробиологических продуцентах [11; 12, 13].

Множество работ опубликованных в 1990-е годы продемонстрировали роль рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 (rhBMP-2) в индукции остеогенеза на различных животных моделях. Однако все же остались вопросы, касающиеся выбора оптимальной дозы, носителя и безопасности применения данного белка [14]. Многообещающие результаты, полученные на мелких лабораторных животных [15], частично оправдались в клинических исследованиях [16-18].

Первые клинические исследования rhBMP-2 были выполнены при спондилодезе позвоночника в 2000-2002 [19,20]. После которых стало понятно, что точно предсказать возможные побочные эффекты нельзя, поскольку rhBMP-2 является многофункциональным фактором роста [14,21]. Согласно Poynton и Lane [21], к возможным побочным эффектам, которые могут возникнуть при использовании rhBMP-2, относятся: чрезмерный, неконтролируемый рост костной ткани; неуправляемая активность остеокластов, которая может привести к повреждению остеопластического материала, потере фиксации и т.д.; возникновение антител к rhBMP-2, способных инактивировать как rhBMP-2, так и нативный белок; возникновение болей в прилежащих областях, потеря функциональности. Несмотря на все это, в 2002 году американским управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) было одобрено применение rhBMP-2 в составе коллагенового носителя для спондилодеза позвоночника и регенерации обширных повреждений костной ткани. Большинство исследований, спонсированных коммерческими организациями, проведенных в период с 2000 по 2005 год не выявило никаких побочных эффектов, связанных с применением rhBMP-2 [19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28]. При этом, в некоторых работах в крови пациентов было отмечено наличие циркулирующих антител к rhBMP-2 до 6% случаев [20, 22, 28].

Однако, начиная с 2006 года, были получены данные, детально описывающие осложнения ассоциированные с клиническим применением rhBMP-2. В 40% случаев осложнения возникали при переднешейном спондилодезе; при переднем поясничном межтеловом спондилодезе случаев потери фиксации имплантата, возникновения воспалительных реакций, ретроградной эякуляции было зафиксировано больше в группе, где использовался rhBMP-2, нежели чем в контрольной группе без использования rhBMP-2; при заднем поясничном межтеловом спондилодезе были зафиксированы радикулит, эктопический остеогенез, остеолиз; а риск возникновения побочных явлений при заднелатеральном спондилодезе составил 15-20% [29]. В июне 2008 года FDA было сделано общественное уведомление, что при использовании rhBMP-2 при

шейном спонднлодезе в течение первых двух недель после операции могут возникать побочные явления опасные для жизни: отек тканей шеи и горла, приводящих к сжатию дыхательных путей; в некоторых случаях возникновение дисфагии и потери способности разговаривать [30].

Таким образом, можно сформулировать условия применения гЬВМР-2 и других рекомбинантных факторов роста, при которых возможно минимизировать возникающие побочные явления: 1) ростовые факторы должны действовать локально, преимущественно в той области, где необходимо восстановить повреждённую ткань; 2) для достижения терапевтического эффекта поддержание эффективной концентрации факторов роста в зоне регенерации должно быть продолжительным; 3) при этом общее количество белка, выделяемого из композита, должно быть минимальным, чтобы избежать запуска иммунной реакции на уровне целого организма. Возможность длительного локального поддержания необходимой концентрации ростовых факторов обеспечивается включением их в носители, которые обеспечивают замедленное высвобождение данных белков, предпочтительным является носитель сделанный из коллагена [31].

Понимание процессов, происходящих при регенерации/ремоделлинге костной ткани, при которых осуществляется непрерывное контролируемое высвобождение эндогенных факторов роста, в том числе и ВМР-2, из внеклеточного матрикса кости, позволит создать универсальный носитель для рекомбинантных факторов роста, обеспечивающий адекватную презентацию рекомбинантных белков микроокружению.

1.1. Тканевая инженерия

Тканевая инженерия (регенеративная медицина) обеспечивает контроль процесса регенерации тканей человека и животных посредством управления биологическим микроокружением [32]. Как правило, регенерация тканей во взрослом организме схожа с процессом развития тканей у эмбрионов. Основной задачей регенерации является поддержание целостности и функциональности

тканей. Понимание процессов, возникающих при регенерации тканей, таких как взаимодействие внеклеточного матрикса и клеток с помощью «сигнальных» молекул, посылаемых матриксом, позволит создать системы, обеспечивающие контролируемую доставку биологически активных молекул, факторов роста. Так как факторы роста осуществляют передачу сигнала от внеклеточного матрикса к клеткам, то адекватная презентация факторов роста может ускорить регенерацию поврежденных тканей.

Методы, применяемые в тканевой инженерии, можно разбить на три категории: (I) непосредственная инъекция клеток в нужную ткань, (II) имплантация клеток после того, как они были объединены в трехмерном матриксе; (III) использование объемного носителя для доставки сигнальных молекул совместно с клетками или без них. К таким сигнальным молекулам относятся белковые факторы роста, которые могут обеспечить миграцию, рост и дифференцировку клеток. Точный контроль над ними в области повреждения позволяет управлять процессом регенерации тканей. Как правило, носители, используемые для доставки факторов роста и клеток, повторяют состав и структуру биологических тканей, которые необходимо восстановить.

Биологические ткани представляют собой композитный материал, основными компонентами которого являются клетки, внеклеточный матрикс и внеклеточная жидкость с растворёнными в ней молекулами. Клетки, обеспечивающие функциональность и жизнеспособность тканей, являются лишь одним из элементов, определяющим структуру и свойства ткани. В большинстве тканей многоклеточных организмов клетки окружены внеклеточным матриксом - сетью связанных между собой макромолекул. Внеклеточный матрикс обеспечивает целостность тканей, образует твёрдый каркас, внутри которого клетки могут перемещаться и взаимодействовать друг с другом, а также включать в себя факторы роста [33]. Третьим компонентом ткани является внеклеточная жидкость, которая заполняет пространство между молекулами матрикса и клетками и является средой, в которой могут перемещаться растворённые молекулы — питательные вещества, продукты метаболизма, факторы роста,

участвующие в коммуникации между клетками и остальным организмом, и т. д. [34,35].

Тип ткани определяется по двум признакам: по типу клеток, находящихся в структуре ткани, и по белковому и молекулярному составу и структуре внеклеточного матрикса. Так, например, во многих скелетных тканях, именно внеклеточный матрикс определяет механические свойства, обеспечивающие правильное функционирование данного типа ткани. В таких тканях, как, например, хрящ, сухожилие, кость, внеклеточный матрикс образует высокоспециализированные структуры. В любой ткани основная функция матрикса — обеспечивать механическую поддержку и обеспечивать клеткам данной ткани, характерную пространственную структуру и микроокружение. С другой стороны, молекулы, входящие в состав матрикса, также могут секретироваться самими клетками ткани. Поэтому состав и структура полимерной сети внеклеточного матрикса определяются активностью клеток ткани и влияют на функционирование клеток [34]. Таким образом, одной из основных задач современной тканевой инженерии является создание трехмерного матрикса, повторяющего состав и структуру внеклеточного матрикса тканей.

1.2. Компоненты внеклеточного матрикса кости и их функции

В состав внеклеточного матрикса входит большое количество белков с различной структурой и функциями, но при этом они обладают определенными общими свойствами. Большинство белков внеклеточного матрикса являются мультидоменными белками, каждый из которых имеет различную или схожую доменную организацию. Домены определяют как гомологичные участки белковых последовательностей, формирующих отдельный структурно-функциональный элемент в молекуле белка. Комбинация различных доменов, входящих в состав белков внеклеточного матрикса, обеспечивает их мультифункциональность. Как правило, несколько доменов в белке действуют согласованно, кооперативно. На сегодняшний день информацию о доменах можно найти в специальных базах данных, таких как PROSITE, SMART и

CDART.

Белки внеклеточного матрикса разделяются на три группы - гликопротеины, протеогликаны и коллагены.

1.2.1. Коллагены

Коллаген - основной структурный элемент соединительной ткани, который составляет каркасную основу внеклеточного матрикса. Коллаген распространен в интерстициальной ткани практически всех паренхимальных органов [36]. Главная черта, характерная для всех молекул коллагена - жесткая трехцепочечная спиральная структура. Три полипептидные цепи коллагена, называемыми альфа-спиралями, скручены в одну спираль, образующую молекулу коллагена длиной около 300 нм и толщиной 1,5 нм [37]. На данный момент идентифицированно 28 типов коллагенов [38]. Коллагены I, II и III типов являются основными коллагенами соединительной ткани.

В зависимости от структуры и организации коллагеновой молекулы выделяют несколько групп коллагенов: фибриллообразующие, фибриллассоциированные, сетеобразующие, коллагены, образующие якорные фибриллы, трансмембранные коллагены, коллагены базальных мембран и др. (см. Таблицу 1).

Таблица 1.

Различные типы коллагенов и их семейства [36].

Тип Молекулярный состав Гены (локализация генов) Распределение в тканях

Фибриллообразующие коллагены

1 [al(I)]2a2(I) COLI AI (17q21.31-q22) COLIА2 (7q22.1) кости, кожа, связки, сухожилия, роговица

II [<xl(II)]3 COL2A1 (12ql3.11 -ql3.2) хрящ, стекловидное тело, пульпозное ядро

Тип Молекулярный состав Гены (локализация генов) Распределение в тканях

III [а1(Ш)]3 СОЬЗА1 (2ц31) кожа, стенки сосудов, большая часть тканей вместе с коллагеном I типа (исключение -кость)

V а1(У), а2(У), аЗ(У) СОЬ5А1 (9ц34.2-ц34.3) СОГ5А2 (2ц31) СОЬ5АЗ (19р 13.2) легкие, роговица, кости, плодные оболочеки; вместе с коллагеном типа I.

XI а!(XI), а2(Х1), аЗ(Х1) СОЫ1А1 (1р21) С01Л1А2 (6р21.3) СОЫ 1АЗ=СОЬ2А1 хрящ, стекловидное тело

Коллаген базальных мембран

IV [а1(1У)]2 а2(1У); а1-аб СОЬ4А1 (13ц34) СОЬ4А2 (13ц34) СОЬ4АЗ (2ц36 - ц37) СОЬ4А4 (2Ч36 - ц37) СОЬ4А5 ^22.3) СОЬ4А6 (Хр22.3) базальные мембраны

Микрофибриллярный коллаген

VI а!(VI), а2(У1), аЗ(У1) СОЬ6А1 (2Ц22.3) СОЬ6А2 (2Ц22.3) СОЬбАЗ (2я37) дерма, хрящ, плацента, легкие, стенки сосудов, межпозвоночные диски

Коллаген образующий якорные фибриллы

VII [а!(УП)]з СОЬ7А1 (Зр21.3) кожа, слизистые оболочки полости рта и шейки матки

Тип Молекулярный состав Гены (локализация генов) Распределение в тканях

Сетеобразующие коллагены

VIII [а1(У111)]2а2(У111) СОЬ8А1 (3я12-ч13.1) СОЬ8А2 (1р34.3 - р32.3) десцементова оболочка

X [а!(Х)]з СОЫОА1 (6ц21 - ц22.3) гипертрофированный хрящ

Фибриллассоциированные коллагены

IX а! (IX), а2(1Х), аЗ(1Х) СОЬ9А1 (6ц 13) СОЬ9А2 (1 рЗЗ - р32.2) хрящ, роговица, стекловидное тело

XII [а1(ХП)]з СОЫ2А1 (6я12-я13) надхрящница, связки, сухожилия

XIV [а1(Х1У)]3 СОЬЬ9А1 (8ц23) дерма, сухожилия, стенки сосудов, плацента, легкие, печень

XIX [а1(Х1Х)]3 СОЬЬ19А1 (6я12-я14) рабдомиосаркома человека

XX [а1(ХХ)]з эпителий роговицы, кожа эмбриона

XXI [а!(ХХ1)]3 СОЬ21А1 (6р12.3 -11.2) стенки сосудов

Трансмембранные коллагены

XIII [а1(ХШ)]з СОЫЗА1 (10я22) эпидермис, волосяной фолликул, легкие, печень

XVII [а! (XVII)] з СОЫ7А1 (10ц24.3) кожно-эпидермальные соединения

Мультиплексины

Тип Молекулярный состав Гены (локализация генов) Распределение в тканях

XV [al(XV)]3 COL 15Al (9q21 - q22) почки, поджелудочная железа

XVI [al(XVI)]3 COL16A1 (1р34) амниотический мешок

XVIII [al(XVIII)]3 COL18A1 (21q22.3) легкие, печень

1.2.1.1. Коллаген I типа - основной компонент внеклеточного матрикса кости

Коллаген I типа - это наиболее распространенный и изученный тип коллагена. Более 90% белков кости составляет коллаген I типа, также он обширно представлен в сухожилиях, коже, связках, роговице и многих интерстициальных соединительных тканей, за исключением лишь гиалинового хрящя, мозга и стекловидного тела. Этот тип коллагена, как и другие фибриллобразующие коллагены, способен формировать высокоорганизованные супрамолекулярные агрегаты, фибриллы, с характерной супраструктурой (рис. 1). В электронном микроскопе фибриллу можно узнать по характерной поперечной исчерченности с периодом в 70 нм (О-период) [39].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Осидак, Егор Олегович, 2014 год

Глава 7. Литература

(1) Senn N. On the healing of aseptic bone cavities by implantation of antiseptic decalcified bone // Am J Med Sci. 1889. Vol. 98. P. 219-243.

(2) Levander G. A study of bone regeneration //Surg Gynecol Obstet. 1938. Vol. 67. P. 705-714.

(3) Urist M.R. Bone: formation by autoinduction // Science. 1965. Vol. 150. 893 - 899.

(4) Sampath T.K., Reddi A.H. Dissociative extraction and reconstitution of extracellular matrix components involved in local bone differentiation // Proc Natl Acad Sci USA. 1981. Vol. 78. P. 7599-7603.

(5) Reddi A.H. Cell biology and biochemistry of endochondral bone development // Coll Relat Res. 1981. Vol. 1. P. 209-226.

(6) Reddi A.H, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts in adolescent rats // Proc Natl Acad Sci USA. 1972. Vol. 69. P. 1601-1605.

(7) Reddi A.H., Anderson W.A. Collagenous bone matrix-induced endochondral ossification hemopoiesis // J Cell Biol. 1976. Vol. 64. No.3. P. 557-72.

(8) Chen.D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins // Growth Factors. 2004. Vol. 22. No. 4. P. 233-241.

(9) Luyten F.P., Cunningham N.S., Ma S. et al. Purification and partial amino acid sequence of osteogenin, a protein initiating bone differentiation // J Biol Chem. 1989. Vol. 264. No. 23. P. 13377-80.

(10) Wozney J.M., Rosen V., Celeste A.J. et al. Novel Regulators of Bone Formation: Molecular Clones and Activities // Science. 1988. Vol. 242. P. 1528-1534

(11) ISRAEL D.I., Nove J., Kerns K.M. et al. Expression and Characterization of Bone Morphogenetic Protein-2 in Chinese Hamster Ovary Cells // Growth Factors. 1992. Vol.

7. P. 139-150

(12) Zhang, H., Wu, J., Zhang, Y., et al. Optimized procedure for expression and renaturation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 at high protein concentrations // Molecular Biology Reports. 2009. Vol. 37. No. 7. P. 3089-3095.

(13) Шарапова H. E., Котнова А. П., Галушкина 3. M., и др. // Молекулярная биология. 2010. Т44. №6. С. 1036-1044

(14) Martin G.J., Boden S.D„ Marone M.A„ et al. Posterolateral intertransverse process spinal arthrodesis with rhBMP-2 in a nonhuman primate: important lessons learned regarding dose, carrier, and safety // J Spinal Disord. 1999. Vol. 12. P. 179-86.

(15) Hollinger J.О., Schmitt J.M., Buck D.C., et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 and collagen for bone regeneration // J. Biomed. Mater. Res. 1998. Vol. 43. P. 356-364.

(16) Gautschi O.P., Frey S.P., Zellweger R., Bone morphogenetic proteins in clinical applications // ANZ J. Surg. 2007. Vol. 77. P. 626-631.

(17) Giannoudis P.V., Dinopoulos H.T., BMPs: options, indications, and effectiveness //J. Orthop. Trauma. 2010. Vol. 24 (Suppl. 1).P. 9-16.

(18) Einhorn Т. A., Clinical applications of recombinant human BMPs: early experience and future development // J. Bone Joint Surg. Am. 2003. Vol. 85-A (Suppl. 3). P. 8288.

(19) Boden S.D., Zdeblick T.A., Sandhu H.S., et al. The use of rhBMP-2 in interbody fusion cages. Definitive evidence of osteoinduction in humans: a preliminary report // Spine. 2000. Vol. 25. P. 376-81.

(20) Boden S.D., Kang J., Sandhu H., et al.. Use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 to achieve posterolateral lumbar spine fusion in humans: a prospective, randomized clinical pilot trial: 2002 Volvo Award in clinical studies // Spine. 2002. Vol. 27. P. 2662-73.

(21) Poynton A.R., Lane J.M. Safety profile for the clinical use of bone morphogenetic proteins in the spine // Spine. 2002. Vol. 27. P. 40-48.

(22) Burkus J.K., Gornet M.F., Dickman C.A., et al. Anterior lumbar interbody fusion using rhBMP-2 with tapered interbody cages // J Spinal Disord Tech. 2002. Vol. 15. P. 337-49.

(23) Burkus J.K., Transfeldt E.E., Kitchel S.H., et al. Clinical and radiographic outcomes of anterior lumbar interbody fusion using recombinant human bone morphogenetic protein-2 // Spine. 2002. Vol. 27. P. 2396^08.

(24) Burkus J.K., Sandhu H.S., Gornet M.F., et al. Use of rhBMP-2 in Combination with Structural Cortical allografts surgery: clinical and radiographic outcomes in anterior lumbar spinal fusion // J Bone Joint Surg Am. 2005. Vol. 87. P. 1205-12.

(25) Burkus J.K., Heim SE, Gornet M.F., Zdeblick T.A. Is INFUSE bone graft superior to autograft bone? An integrated analysis of clinical trials using the LT-CAGE lumbar tapered fusion device // J Spinal Disord Tech. 2003. Vol. 16. P. 113-22.

(26)Baskin D.S., Ryan P., Sonntag V., et al. A prospective, randomized, controlled cervical fusion study using recombinant human bone morphogenetic protein-2 with the CORNERSTONE-SR allograft ring and the ATLANTIS anterior cervical plate // Spine. 2003. Vol. 28. P. 1219-24; discussion 1225.

(27) Haid R.W., Branch C.L., Alexander J.T., et al. Posterior lumbar interbody fusion using recombinant human bone morphogenetic protein type 2 with cylindrical interbody cages // Spine J .2004. Vol. 4 P. 527-538. discussion 538-9.

(28) Govender S., Csimma C., Genant H.K., et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures: a prospective, controlled, randomized study of four hundred and fifty patients // J Bone Joint Surg Am. 2002. Vol. 84. P. 2123-2134.

(29) Carragee E.J., Hurwitz E. L., Weiner В. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned // The Spine Journal. 2011. Vol. 11. No. 6. P. 471-491.

(30) Center for Devices and Radiological Health. Public Health Notifications (Medical devices)—FDA Public Health Notification: life-threatening complications associated with recombinant human bone morphogenetic protein in cervical spine fusion. URL. http://www.fda.gov/MedicalDevices/Safetv/AlertsandNotices/PublicHealthNotifications /ucm062000.htm. Accessed March 1, 2011.

(31) Осидак E.O., Осидак M.C., Ахманова M.A., и др. // Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 2012. т. LVI, No 5-6. С. 102-113

(32) Lanza R.P., Langer R.S., Vacanti J. Principles of tissue engineering. Amsterdam // The Netherlands: Elsevier Academic Press. 2007.

(33) Hynes, R.O. The Extracellular Matrix: Not Just Pretty Fibrils // Science. 2009. Vol. 326. No. 5957. P. 1216-1219

(34) Cowin S.C., Doty S.B. Tissue mechanics // Springer Verlag, 2007

(35) Swartz M.A., Fleury M.E. Interstitial flow and its effects in soft tissues // Biomedical Engineering. 2007. Vol. 9, no. 1. P. 229.

(36) Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens—structure, function, and biosynthesis // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. Vol. 55. P. 1531-1546

(37) Nimni M.E., Harkness R.D., Molecular structures and functions of collagen, in: M.E. Nimni (Ed.), Collagen Vol. I - Biochemistry, CRC Press, Boca Raton, FL, 1988, pp. 1-79.

(38) Velt G., Kobbe В., Keene D.R., et al. Collagen XXVIII, a novel von Willebrand factor A domain-containing protein with many imperfections in the collagenous domain //J Biol Chem. 2006. Vol. 281. No. 6. P. 3494-504.

(39) Hulmes D.J., Miller A. Molecular packing in collagen. 11 Nature. 1981. Vol. 293. P. 234-239.

(40) Fleischmajer R., MacDonald E.D., Perlish J.S., et al. Dermal collagen fibrils are hybrids of type I and type III collagen molecules // J. Struct. Biol. 1990. Vol. 105. P. 162- 169.

(41) Niyibizi C., Eyre D.R. Bone type V collagen: chain composition and location of a trypsin cleavage site // Connect. Tissue Res. 1989. Vol. 20. P. 247 - 250.

(42) Ramirez F., Rifkin D.B. Extracellular microfibrils: contextual platforms for TGFbeta and BMP signaling // Curr. Opin. Cell Biol. 2009. Vol. 21. P. 616- 622.

(43) MFS; OMIM- 154700. URL. http://www.omim.org/entry/154700

(44) CCA; OMIM-121050. URL. http://www.omim.org/entry/121050

(45) Ramirez F., Dietz H.C. Marfan syndrome: from molecular pathogenesis to clinical treatment //Curr. Opin. Genet. Dev. 2007. Vol. 17. P. 252-258.

(46)Nistala H., Lee-Arteaga S., Smaldone S., et al. Fibrillin-1 and -2 differentially modulate endogenous TGF-beta and BMP bioavailability during bone formation // The Journal of Cell Biology. 2010. Vol.190. No. 6. P. 1107-1121.

(47) Hynes R. Fibronectins. Springer. New York. 1990.

(48) Mosher D. Fibronectin. Academic. San Diego. 1989.

(49) George E.L., Georges-Labouesse E.N., Patel-King R.S., et al. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin // Development. 1993. Vol. 119. P. 1079-1091

(50) Ni H., Yuen P.S., Papalia J.M., et al. Plasma fibronectin promotes thrombus growth and stability in injured arterioles // Proc Natl Acad Sci USA . 2003. Vol. 100. P. 24152419.

(51) Engvall E., Ruoslahti E., Miller E.J. Affinity of fibronectin to collagens of different genetic types and to fibrinogen // J Exp Med. 1978. Vol. 147. P. 1584-1595.

(52) Pankov R., Yamada K.M. Fibronectin at a glance // J Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 3861-3863

(53) Williams M.J., Phan I., Harvey T.S., et al. Solution structure of a pair of fibronectin type 1 modules with fibrin binding activity // J Mol Biol. 1994. Vol. 235. P. 13021311.

(54) Cho J,. Mosher D.F. Enhancement of thrombogenesis by plasma fibronectin cross-linked to fibrin and assembled in platelet thrombi // Blood. 2006. Vol. 107. P. 35553563.

(55) Magnusson M.K., Mosher D.F. Fibronectin: structure, assembly, and cardiovascular implications. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998. Vol. 18. P. 1363-1370.

(56) Barkalow F.J., Schwarzbauer J.E. Localization of the major heparin-binding site in fibronectin. J Biol Chem. 1991. Vol. 266. P. 7812-7818.

(57) Sharma A., Askari J.A., Humphries M.J., et al. Crystal structure of a heparin- and

integrin-binding segment of human fibronectin // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 14681479.

(58) Rahman S., Patel Y., Murray J., et al. Novel hepatocyte growth factor (HGF) binding domains on fibronectin and vitronectin coordinate a distinct and amplified Met-integrin induced signalling pathway in endothelial cells // BMC Cell Biol. 2005. Vol. 6. No.l. P. 8.

(59) Wijelath E.S., Rahma S., Namekata M., et al. Heparin-II domain of fibronectin is a vascular endothelial growth factor-binding domain: enhancement of VEGF biological activity by a singular growth factor/matrix protein synergism // Circ. Res. 2006. Vol. 99. P. 853.

(60)Bolander M.R., Young M.F., Fisher L.W., et al. Osteonectin cDNA sequence reveals potential binding regions for calcium and hydroxyapatite and shows homologies with both a basement membrane proteins (SPARC) and a wine proteinase inhibitor (ovomucoid) // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. Vol. 85. No. 9. P. 2919 - 23.

(61) Sodek J., Zhu B., Huynh M.H., et al. Novel functions of the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/SPARC // Connect Tissue Res. 2002. Vol. 43. No. 2-3. P. 308-19

(62) Wang K.X., Denhardt D.T. Osteopontin: role in immune regulation and stress responses // Cytokine Growth Factor Rev. 2008. Vol. 19. No. 5-6. P. 333^15.

(63) Franzen A., Heinegard D. Isolation and characterisation of two sialoproteins present only in bone calcified matrix // Biochem. J. 1985.,Vol. 232. P. 715 - 724.

(64) Reinholt F.P., Hultenby K., Oldberg A., Heinegard D. Osteopontin - a possible anchor of osteoclasts to bone // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. Vol. 87. No. 12. P. 4473-5.

(65) Choi S.T., Kim J.H., Kang E.J., et al. Osteopontin might be involved in bone remodelling rather than in inflammation in ankylosing spondylitis // Rheumatology (Oxford). 2008. Vol. 47. No. 12. P. 1775-9.

(66) Bianco P., Fisher L.W., Young M.F., et al. Expression of bone sialoprotein (BSP)in human developing skeletal and nonskeletal tissues as revealed by immunostaining and in situ hybridization // Calcif Tissue Int. 1991. Vol. 49. P. 421-426.

(67) Bianco P., Riminucci M., Silvestrini G., et al. Localization of bone sialoprotein (BSP)to Golgi and post-Golgi secretory structures in osteoblasts and to discrete sites in early bone matrix // J Histochem Cytochem. 1993. Vol. 41. P. 193- 203.

(68) Aumaillay M., Gyraud . Structure and biological activity of the extacellular matrix // J. Mol. Med. 1998. Vol.76. P. 253-265.

(69) Wendel M., Sommarin Y., Heinegard D. Bone matrix proteins isolation and characterization of a novel cell-binding keratin sulfate proteoglycan (osteoadherin) from bovine bone // J. Cell Biol. 1998. vol. 141. No.3. P. 839-847.

(70) Heinegard D., Larsson T., Sommarin Y., et al. // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 13866-13872.

(71) Matsushima N., Ohyanagi T., Tanaka T., et al. // Proteins. 2000. Vol. 38. P. 210225.

(72) Svensson L., Aszodi A., Reinholt F. P., et al. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 9636-9647.

(73) Hedbom E., Heinegard D. Interaction of a 59-kDa connective tissue matrix protein with collagen I and collagen II // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 6898-6905.

(74) Waddington R.J., Roberts H.C., Sugars R.V., et al. Differential roles for small leucine-rich proteoglycans in bone formation // Eur. Cell. Mater. 2003. vol. 6. No. 3. P. 12-21.

(75) Reddi A.H. Bone and cartilage differentiation // Curr.Opin.Genet.Dev. 1994. Vol. 4. P. 737-744

(76) Sampath T.K., Reddi A.H. Homology of bone-inductive proteins from human, monkey, bovine and rat extracellular matrix // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1983. Vol. 80. P. 6591-6595.

(77)Wang E.A., Rosen V., D'Alessandro J.S. Recombinant human bone morphogenetic induces bone formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 2220-2224.

(78) Sampath T.K., Lashka K.E., Doctor J.S., et al. Drosophila transforming growth factor b superfamily proteins induce endochondral bone formation in mammals // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 6004-6008.

(79) Lyons K.M., Pelton R.W., Hogan B.L.M.Organogenesis and pattern formation within the mouse: RNA distribution patterns suggest a role for bone morphogenetic proteins // Development. 1990. Vol. 109. P. 833-844.

(80) Rifkin D.B. Latent transforming growth factor-beta (TGF-beta) binding proteins: orchestrators of TGF-beta availability // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. P. 7409-12.

(81) Dijke P. ten, Arthur H. M. Extracellular control of TGFbeta signalling in vascular development and disease // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. Vol. 8. No. 11. P. 857-69.

(82) Gregory K.E., Ono R.N., Charbonneau N.L., et al. The prodomain of BMP-7 targets the BMP-7 complex to the extracellular matrix // J Biol Chem. 2005. Vol. 280. P. 27970-27980.

(83) Sengle G., Ono R.N., Lyons K.M., et al. A new model for growth factor activation: type II receptors compete with the prodomain for BMP-7 // J Mol Biol. 2008. Vol. 381. P. 1025-1039.

(84) Noth U., Rackwitz L., Steinert A.F., et al. Cell delivery therapeutics for musculoskeletal regeneration // Adv. Drug Deliv. Rev. 2010. Vol. 62. P. 765-783.

(85) Ladewig K. Drug delivery in soft tissue engineering // Expert Opin. Drug Deliv. 2011. Vol. 8. P. 1175-1188.

(86) King W.J, Krebsbach P.H, Growth factor delivery: How surface interactions modulate release in vitro and in vivo // Adv Drug Deliv Rev. 2012. Vol. 64. No. 12. P. 1239-562.

(87)Nagai N., Kumasaka N., Kawashima T., et al. Preparation and characterization of collagen microspheres for sustained release of VEGF // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2010. Vol. 21. No. 6. P. 1891-1898.

(88) Zhao Y., Zhang J., Wang X., et al. The osteogenic effect of bone morphogenetic protein-2 on the collagen scaffold conjugated with antibodies // J. Control. Release. 2010. Vol. 141. P. 30-37.

(89) Nillesen S. T. M., Geutjes P. J., Wismans R., et al. Increased angiogenesis and blood vessel maturation in acellular collagen-heparin scaffolds containing both FGF2 and VEGF // Biomaterials,. 2007. Vol. 28. No. 6. P. 1123-1131.

(90) Kim H., Valentini R., Retention and activity of BMP-2 in hyaluronic acid-based scaffolds in vitro // J Biomed Mater Res. 2001. Vol. 59. P. 573-584.

(91) Koch S., Yao C., Grieb G., et al. Enhancing angiogenesis in collagen matrices by covalent incorporation of VEGF // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2006. Vol. 17. P. 735741.

(92) Bentz H., Schroeder J.A., Estridge T.D. Improved local delivery of TGF-beta2 by binding to injectable fibrillar collagen via difunctional polyethylene glycol // J. Biomed. Mater. Res. 1998. Vol. 39. P. 539-548.

(93) Lin C.C., Metters A.T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. Vol. 58. P. 13791408.

(94) Rosenblatt J., Rhee W., Wallace D. The effect of collagen fiber size distribution on the release rate of proteins from collagen matrices by diffusion // J. Control. Release. 1989. Vol. 9. P. 195-203.

(95)Ramanujan S., Pluen A., McKee T.D., et al. Diffusion and Convection in Collagen Gels: Implications for Transport in the Tumor Interstitium // Biophysical Journal. 2002. Vol. 83. No. 3.P. 1650-1660.

(96)Phillips R.J., A hydrodynamic model for hindered diffusion of proteins and micelles in hydrogels // Biophysical Journal. 2000. Vol. 79. No. 6. P. 3350-3370.

(97)Wallace D. G., Rosenblatt J., Collagen in drug delivery and tissue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. Vol. 55. No. 12. P. 1631-1649.

(98) Ungaro F., Biondi M., d'Angelo I., et al. Microsphere-integrated collagen scaffolds for tissue engineering: effect of microsphere formulation and scaffold properties on protein release kinetics // J Control Release. 2006. Vol. 113. No.2. P. 128-36.

(99) Hsu H.P., Zanella J.M., Peckham S.M., et al. Comparing ectopic bone growth induced by rhBMP-2 on an absorbable collagen sponge in rat and rabbit models // J. Orthop. Res. 2006. Vol. 24. No. 8. P. 1660-1669.

(100) Lee K.Y., Peters M.C., Anderson K.W., et al. Controlled growth factor release from synthetic extracellular matrices //Nature. 2000. Vol. 408. No.6815. P. 998-1000.

(101) Ахманова M.A., Модель транспорта макромолекул в биологической ткни при циклической деформации, Диссертация к.ф.-м.н. 2011

(102) Chandran P.L., Barocas V.H. Microstructural mechanics of collagen gels in confined compression: Poroelasticity, viscoelasticity, and collapse. // J Biomech Eng. 2004. Vol. 126. P. 152-166.

(103) Berthold A., Cremer K., Kreuter J., Collagen microparticles: carriers for glucocorticosteroids // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 1998. Vol. 45. P. 23-29.

(104) Sieron A., Louneva N., Fertala A. Site-specific interaction of bone morphogenetic protein 2 with procollagen II // Cytokine. 2002. Vol. 18. No. 4. P. 214-221.

(105) Nillesen S.T., Geutjes P.J., Wismans R., et al. Increased angiogenesis and blood vessel maturation in acellular collagen-heparin scaffolds containing both FGF2 and VEGF //Biomaterials. 2007. Vol. 28. P. 1123-1131.

(106) Kim H., Valentini R. Retention and activity of BMP-2 in hyaluronic acid-based scaffolds in vitro // J Biomed Mater Res. 2001. Vol. 59. P. 573-584.

(107) Lienemann P.S., Lutolf M.P., Ehrbar M. Biomimetic hydrogels for controlled biomolecule delivery to augment bone regeneration // Advanced Drug Delivery Reviews. 2012. Vol. 64. No. 12. P.1078-1089.

(108) Zhao Y., Zhang J., Wang X., et al. The osteogenic effect of bone morphogenetic protein-2 on the collagen scaffold conjugated with antibodies // J. Control. Release. 2010. Vol. 141. P. 30-37.

(109) Chen B., Lin H., Wang J., et al. Homogeneous osteogenesis and bone regeneration by demineralized bone matrix loading with collagen-targeting bone morphogenetic protein-2 //Biomaterials. 2007. Vol 28. No. 6. P. 1027-1035.

(110) Lin N., Li X., Song T., et al. The effect of collagen-binding vascular endothelial growth factoron the remodeling of scarred rat uterus following full-thickness injury // Biomaterials. 2012. Vol. 33. P. 1801-1807.

(111)Wissink M.J., Beernink R., Scharenborg N.M., et al. Endothelial cell seeding of (heparinized) collagen matrices: effects of bFGF preloading on proliferation (after low density seeding) and pro-coagulant factors // J. Control. Release. 2000. Vol. 67. P. 141— 155.

(112) Princz M.A., Sheardown H. Heparin-modified dendrimer cross-linked collagen matrices for the delivery of basic fibroblast growth factor (FGF-2) // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2008. Vol. 19. P. 1201-1218.

(113) Wang, N. X., von Recum, H. A., Affinity-Based Drug Delivery // Macromol. Biosci. 2011. Vol. 11. P. 321-332.

(114)Wissink M.J., Beernink R., Pieper J.S., et al. Binding and release of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices // Biomaterials. 2001. Vol. 22. P. 2291-2299.

(115) Schroeder-Tefft J.A, Bentz H., Estridge T.D. Collagen and heparin matrices for growth factor delivery // J Control Release. 1997. Vol. 48. No. 1. P. 29-33.

(116) Singh M.A. Fundamental study of electrostatic effects on release of polypeptides from collagen hydrogels, Ph. D. Thesis, University of Maryland, Baltimore, MD, 1994.

(117) Singh M., Rosenblatt J. Polypeptide delivery from collagen: electrostatic effects // Proc. Int. Symp. Control. Release Bioact. Mater. 1993. Vol. 20. P. 107-108.

(118) Ramesh D. Vijaya, Sehgal P.K., Dhar S.C. In vitro interaction of bleomycin with collagen - equilibrium dialysis technique // Indian J. Biochem. Biophys. 1989. Vol. 26. P. 196-198.

(119)Friess W. Collagen - biomaterial for drug delivery // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 1998. Vol. 45. No. 2. P. 113-136.

(120) Wang A.Y., Shirley L., Yu-Chuan L. Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis //Biomacromolecules. 2008. Vol. 9. No. 10. P. 29292936.

(121) Takeda Y., Tsujigiwa H., Nagatsuka H., et al. Regeneration of rat auditory ossicles using recombinant human BMP-2/collagen composites // J Biomed Mater Res A. 2005. Vol. 73. No. 2. P.133-41.

(122) Côté M-F, Laroche G., Gagnon E., et al. Denatured collagen as support for a FGF-2 delivery system: physicochemical characterizations and in vitro release kinetics and bioactivity // Biomaterials. 2004. Vol. 25. P. 3761-72.

(123) Maehara H., Sotome S., Yoshii T., et al. Repair of large osteochondral defects in rabbits using porous hydroxyapatite/collagen (HAp/Col) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) // J Orthop Res. 2010. Vol. 28 P. 677-86.

(124) Geiger M, Li R.H, Friess W. Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2 // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. Vol. 55. No. 12. P. 1613-1629.

(125) Gomes S., Leonor I., Mano J., et al. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering // Progress in Polymer Science. 2012. Vol. 37. No. l.P. 1-17.

(126) Censi R., Di Martino P., Vermonden T., et al. Hydrogels for protein delivery in tissue engineering // J Control. Release. 2012. Vol. 161. No. 2. P. 680-692.

(127) Aro H.T., Govender S., Patel A.D., et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2: a randomized trial in open tibial fractures treated with reamed nail fixation // J. Bone Joint Surg. Am. 2011. Vol. 93. P. 801-808.

(128)Vaccaro A.R., Lawrence J.P., Patel T., et al. The safety and efficacy of OP-1 (rhBMP-7) as a replacement for iliac crest autograft in posterolateral lumbar arthrodesis: a longterm (>4 years) pivotal study // Spine. 2008. Vol. 33. P. 2850-2862.

(129) Wilson J.J., Matsushita O., Okabe A., et al. A bacterial collagen-binding domain with novel calcium-binding motif controls domain orientation // The EMBO Journal. 2003. Vol. 22. P. 1743 - 1752.

(130) Yang Y., Zhao Y., Chen B., et al. Collagen-binding human epidermal growth factor promotes cellularization of collagen scaffolds // Tissue Eng. Part A. 2009. Vol. 15. P. 3589-3596.

(131)Nishi N., Matsushita O., Yuube K., et al. Collagen-binding growth factors: Production and characterization of functional fusion proteins having a collagen-binding domain // Proc Natl Acad Sci. 1998. Vol. 95. No. 12. P. 7018-7023.

(132) Ishikawa T., Terai H., Yamamoto T., et al. Delivery of a growth factor fusion protein having collagen-binding activity to wound tissues // Artificial Organs. 2001. Vol. 27. No. 2. P. 147-154.

(133) Boyce S.T., Stompro B.E., Hansbrough J.F. Biotinylation of implantable collagen for drug delivery // J. Biomed. Mater. Res. 1992. Vol. 26. P. 547-553.

(134) Stompro B.E., Hansbrough J.F., Boyce S.T. Attachment of peptide growth factors to implantable collagen // J. Surg. Res. 1989. Vol. 46. P. 413-421.

(135) Bentz H., Schroeder J.A., Estridge T.D. Improved local delivery of TGF-beta2 by binding to injectable fibrillar collagen via difunctional polyethylene glycol // J. Biomed. Mater. Res. 1998. Vol. 39. P. 539-548.

(136)Koch S., Yao C., Grieb G., et al. Enhancing angiogenesis in collagen matrices by covalent incorporation of VEGF // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2006. Vol. 17. P. 735741.

(137) Gao T., Kousinioris N., Winn S.R., et al. Enhanced retention of rhBMP-2 in vivo by thermoreversible polymers // Materwiss Werksttech. 2001. Vol. 32. No. 12. P. 953961.

(138)Timpl R. Immunology of the collagens, in: K.A. Piez, A.H. Reddi (Eds.) Extracellular Matrix Biochemistry. Elsevier. New York. 1984. P. 159-190

(139) Steffen C., Timpl R., Wolff I. Immunogenity and specificity of collagen. V. Demonstration of three different antigenic determinants on calf collagen // Immunology. 1968. Vol. 15. P. 135- 144.

(140) Ellingsworth L.R., DeLustro F., Brennan J.E. The human response to reconstituted bovine collagen // J. Immunol. 1986. Vol. 136. P. 877 - 882.

(141) Chvapil M., Kronentahl R.L., Winkle W. Et al. Medical and surgical applications of collagen, in: D.A. Hall, D.S. Jackson (Eds.). International Review of Connective Tissue Research. Academic Press, New York. 1973. pp. 1-61.

(142) Knapp T.R., Luck E., Daniels J.R. Behaviour of solubilised collagen as a bioimplant // J. Surg. Res. 1977. Vol. 23. P. 96- 105.

(143) DeLustro F., Condell R.A., Nguyen M.A., et al. A comparative study of the biologic and immunlogic response to medical devices derived from dermal collagen // J. Biomed. Mater. Res. 1986. Vol. 20. P. 109 - 120.

(144) Meade K.R., Silver F.H. Immunogenicity of collagenous implants // Biomaterials. 1990. Vol. 11. P. 176-180.

(145) Abraham L.C., Zuena E., Perez-Ramirez B., et al. Guide to collagen characterization for biomaterial studies // J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2008. Vol. 87. No.l.P. 264-85.

(146) Piez K.A. Molecular and aggregate structures of the collagens, in: K.A. Piez, A.H. Reddi (Eds.), Extracellular Matrix Biochemistry. Elsevier. New York. 1984. P. 1-40.

(147) Gilbert D.L. Collagen macromolecular drug delivery systems. Ph. D. Thesis. University of Utah, UT. 1988.

(148) Keefe J., Wauk L., Chu S., et al. Clinical use of injectable bovine collagen:a decade of experience // Clinical materials. 1992. Vol. 9. P. 155 -162.

(149)Kehrl J.H., Wakefield L.M., Roberts A.B., et al. Production of transforming growth factor beta by human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth // J. Exp. Med. 1986. Vol. 163. P. 1037-50.

(150) Cerwenka A., Bevec D., Majdic O., et al. TGF-(3 1 is a potent inducer of human effector T cells. // J. Im- munol. 1994. Vol. 153. P. 4367-77.

(151) Suda T., Zlotnik A. In vitro induction of CD8 expression on thymic pre-T cells. II.

Characterization of CD3~CD4~CD8 alpha + cells generated in vitro by culturing

CD25+CD3" CD4 CD8 thymocytes with T cell growth factor-beta and tumor necrosis factor- alpha // J. Immunol. 1992. Vol.149. P. 71-76

(152) Snapper C.M, Waegell W., Beernink H., et al.. Transforming growth factor-beta 1 is required for secretion of IgG of all subclasses by LPS-activated murine B cells in vitro // J. Immunol. 1993. Vol. 151. P. 4625-36.

(153) Holder M.J, Knox K., Gordon J. Factors modifying survival pathways of germinal center B cells. Glucocorticoids and transforming growth factor-beta, but not cyclosporin A or anti-CD 19, block surface immunoglobulin-mediated rescue from apoptosis // Eur. J. Immunol. 1992. Vol. 22. P. 2725-28.

(154) Lomo J., Blomhoff H.K., Beiske K., et al. TGF-p 1 and cyclic AMP promote apoptosis in resting human B lymphocytes // J. Immunol. 1995. Vol. 154. P. 1634-43.

(155) Bogdan C., Nathan C. Modulation of macrophage function by transforming growth factor beta, interleukin- 4, and interleukin-10 // Ann. NY Acad. Sci. 1993. Vol. 685. P. 713-39.

(156) Wahl S.M, Hunt D.A, Wakefield L.M, et al. Transforming growth factor type beta induces monocyte chemotaxis and growth factor production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P.5788-92.

(157) Wiseman D.M, Polverini P.J, Kamp D.W, et al. Transforming growth factor-beta (TGF p ) is chemotactic for human monocytes and induces their expression of angiogenic activity // Biochem. Bio- phys. Res. Commun. 1988. Vol. 157. P. 793-800.

(158) McCartney-Francis N., Mizel D., Wong H., et al. TGF-|3 regulates production of growth factors and TGF- (3 by human peripheral blood monocytes // Growth Factors. 1990. Vol. 4. P. 27-35.

(159) Welch G.R., Wong H.L., Wahl S.M. Selective induction of Fc gamma RIII on human monocytes by transforming growth factor-beta // J. Immunol. 1990. Vol. 144. P. 3444-48.

(160)Fargeas C., Wu C.Y., Nakajima T., et al. Differential effect of transforming growth factor beta on the synthesis of Thl- and Th2-like lymphokines by human T lymphocytes // Eur. J. Immunol. 1992. Vol. 22. P. 2173-76.

(161) Turner M., Chantry D., Katsikis P., et al. Induction of the interleukin 1 receptor antagonist protein by transforming growth factor-beta // Eur. J. Immunol. 1991. Vol. 21. P. 1635-39.

(162)Huse K., Bakkebo M., Oksvold M.P., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit CD401/IL-21-induced Ig production in human B cells: differential effects of BMP-6 and BMP-7 // Eur. J. Immunol. 2011. Vol. 41. No. 11. P. 3135-45.

(163) Kersten C., Dosen G., Myklebust J.H., et al. BMP-6 inhibits human bone marrow B lymphopoiesis-upregulation of Idl and Id3 // Exp Hematol. 2006. Vol. 34. P. 72-81.

(164) Kersten C., Sivertsen E.A., Hystad M.E., et al. BMP-6 inhibits growth of mature human B cells; induction of Smad phosphorylation and upregulation of Idl. BMC // Immunol. 2005. Vol. 6. P. 9.

(165) Hjertner O., Hjorth-Hansen H., Borset M., et al.. Bone morphogenetic protein-4 inhibits proliferation and induces apoptosis of multiple myeloma cells // Blood. 2001. Vol. 97. P. 516-522.

(166) Ro T.B., Holt R.U., Brenne A.T., et al. Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells // Oncogene. 2004. Vol. 23. P. 3024-3032.

(167) Cejalvo T., Sacedon R., Hernandez-Lopez C., et al. Bone morphogenetic protein-2/4 signalling pathway components are expressed in the human thymus and inhibit early T-cell development //Immunology. 2007. Vol. 121. P. 94-104.

(168) Graf D., Nethisinghe S., Palmer D.B., et al. The developmental^ regulated expression of twisted gastrulation reveals a role for bone morphogenetic proteins in the control of T cell development // J Exp Med. 2002. Vol. 196. P. 163-171.

(169) Hager-Theodorides A.L., Outram S.V., Shah D.K., et al. Bone morphogenetic protein 2/4 signaling regulates early thymocyte differentiation // J Immunol. 2002. Vol. 169. P. 5496-5504.

(170)Varas A., Sacedon R., Hidalgo L., et al. Interplay between BMP4 and IL-7 in human intrathymic precursor cells // Cell Cycle. 2009. Vol. 8. P. 4119-4126.

(171) Sivertsen E.A., Huse K., Hystad M.E., et al. Inhibitory effects and target genes of bone morphogenetic protein 6 in Jurkat TAg cells // Eur J Immunol. 2007. Vol. 37. P. 2937-2948.

(172) Varas A., Martinez V.G., Hernandez-Lopez C., et al. Role of BMP signalling in peripheral CD4+ T cell proliferation // Imm. 2009. Vol. 28. P. 125-130.

(173) Cunningham N.S, Paralkar V., Reddi A.H. Osteogenin and recombinant bone morphogenetic protein 2B are chemotactic for human monocytes and stimulate transforming growth factor beta 1 mRNA expression // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. Vol. 89. P. 11740-11744.

(174) Perron J.C., Dodd J. ActRIIA and BMPRII type II BMP receptor subunits selectively required for Smad4-independent BMP7-evoked chemotaxis // PLoS One. 2009. Vol.4. P. 8198.

(175) Pluchino S., Zanotti L., Brambilla E., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function // PLoS One. 2009. Vol. 4. P. 5959.

(176) Li R.H., Wozney J.M. Delivering on the promise of bone morphogenetic proteins // Trends Biotechnol. 2001. Vol. 19. P. 255-265.

(177) Hollinger J.O., Schmitt J.M., Buck D.C., et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 and collagen for bone regeneration // J. Biomed. Mater. Res. 1998. Vol. 43. P. 356-364.

(178) Gautschi O.P., Frey S.P., Zellweger R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications //ANZ J. Surg. 2007. Vol. 77. P. 626-631.

(179) Giannoudis P.V., Dinopoulos H.T., BMPs: options, indications, and effectiveness // J. Orthop. Trauma 24 (Suppl. 1). 2010. S9-S16.

(180) Einhorn T.A. Clinical applications of recombinant human BMPs: early experience and future development // J. Bone Joint Surg. Am. 85-A (Suppl. 3). 2003. P. 82-88.

(181) Hsu W.K, Wang J.C. The use of bone morphogenetic protein in spine fusion // Spine J.2008. Vol 8. P. 419-25.

(182) Jones A.L, Bucholz R.W, Bosse M.J, et al. Recombinant human BMP-2 and allograft compared with autogenous bone graft for reconstruction of diaphyseal tibial

fractures with cortical defects. A randomized, controlled trial // J Bone Jt Surg Am. 2006. Vol. 88. P. 1431-41.

(183)Haidar Z.S, Hamdy R.C, Tabrizian M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part B: delivery systems for BMPs in orthopaedic and craniofacial tissue engineering // Biotechnol Lett. 2009. Vol. 31. P. 1825-35.

(184) Gautschi O.P, Frey S.P, Zellweger R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications // ANZ J Surg .2007. Vol.77. P. 626-31.

(185)Julka A., Shah A.S., Miller B.S. Inflammatory response to recombinant human bone morphogenetic protein-2 use in the treatment of a proximal humeral fracture: a case report // J Shoulder Elbow Surg. 2012. Vol. 21. P. 12-6.

(186) MacDonald K.M., Swanstrom M.M., McCarthy J.J., et al. Exaggerated inflammatory response after use of recombinant bone morphogenetic protein in recurrent unicameral bone cysts // J Pediatr Orthop. 2010. Vol. 30. P. 199-205.

(187) Aro H.T, Govender S., Patel A.D., et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2: a randomized trialin open tibial fractures treated with reamed nail fixation // J Bone Jt Surg Am. 2011. Vol. 93. P. 801-8.

(188) Porter S., Human immune response to recombinant human proteins // Journal of pharmaceutical sciences. 2000. Vol. 90. No. 1. P. 1-11.

(189) Hwang C.J., Vaccaro A.R., Lawrence J.P., et al. Immunogenicity of bone morphogenetic proteins // J Neurosurg Spine. 2009. Vol. 10. P. 443-451.

(190)Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Hisochem. Cytochem. 1974. Vol. 22. P. 1084 - 1091.

(191) Martino, M. M., and Hubbell, J. A. The 12th-14th type III repeats of fibronectin function as a highly promiscuous growth factor-binding domain // The FASEB Journal. 2010.Vol. 24. P. 4711-4721.

(192) Dessau W., Adelmann B.C., TimpLR., et al. ^identification of the sites in collagen alpha-chains that bind serum anti-gelatin factor // Biochem. J. 1978. Vol. 169. P. 55 -59.

(193) Graff J.M., Thies R.S., Song J.J., et al. Studies with a Xenopus BMP receptor suggest that ventral mesoderm-inducing signals override dorsal signals in vivo // Cell. 1994. Vol. 79. No. 1. P. 169-179.

(194) Ingham K.C., Brew S.A., Isaacs B.S. Interaction of fibronectin and its gelatin-binding domains with fluorescent-labeled chains of type I collagen // J Biol Chem. 1988. Vol. 263. No. 10. P. 4624 - 8.

(195) Ramanujan S., Pluen A., McKee T.D., et al. Diffusion and Convection in Collagen Gels: Implications for Transport in the Tumor Interstitium // Biophysical Journal. 2002. Vol. 83. P. 1650-1661.